CN105307665B - 治疗性组合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含有蜂胶和环糊精的医药组合物，包括抗胃肠癌组合物。还提供了使用这类组合物的方法，特别是治疗或预防胃肠癌以及使胃肠癌对疗法重新敏感。

Description

治疗性组合物和其用途
技术领域
本发明涉及用于治疗和预防消化道癌的组合物。特别地，本发明涉及含有蜂胶和环糊精的抗消化道癌组合物，包括包含一种或多种蜂胶提取物的抗消化道癌组合物。特别预期包含蜂胶和γ-环糊精，例如欧洲蜂胶和γ-环糊精的抗消化道癌组合物，以及这类组合物治疗或预防诸如结肠直肠癌、胃癌以及咽喉癌的消化道癌的用途。
背景技术
粗蜂胶是由蜜蜂从收集自植物来源(诸如芽和汁液)的树脂产生的树脂状物质，其与蜂蜡混合。取决于植物来源，粗蜂胶的颜色可以从黄色变化至棕色乃至几乎黑色。蜂蜡通常通过使用乙醇提取而与蜂胶分离，在乙醇中蜡不可溶，但树脂状化合物高度可溶。存在许多类型的蜂胶，这是基于树脂化合物的植物来源、和地理区域。最为熟知的蜂胶类型是“欧洲”蜂胶，其中树脂化合物是由蜜蜂主要从杨树并且在较小程度上从桦树和柳树的叶和芽渗出物获得；和“巴西绿”蜂胶，其主要由蜜蜂从酒神菊树的叶渗出物获得。产自新西兰的蜂胶可以被归类为“欧洲”的，因为其组成广泛地匹配其它欧洲蜂胶(Markham等,1996.新西兰蜂胶中的主要有机成分的HPLC和GC-MS鉴别(HPLC and GC-MS identification of themajor organic constituents in New Zealand propolis)Phytochemistry,42(1):205-211)。已经报导了粗蜂胶和来源于蜂胶的提取物具有抗细菌、抗真菌以及抗病毒活性。还已经调查了其治疗几种类型的癌症，特别是乳癌的用途。
存在于蜂胶树脂中的抗癌成分的鉴别和验证由于树脂的复杂和多组分性质而具有挑战性。在巴西绿蜂胶中，抗癌活性主要归因于阿特匹林C(artepillan C)，而在欧洲蜂胶树脂中，抗癌活性主要归因于咖啡酸苯乙酯(CAPE)，一种二羟基肉桂酸酯；和白杨素，一种糖苷配基类黄酮，参看例如Sawicka等(2012)“蜂胶的抗癌活性(The anticanceractivity of propolis)”,Folia Histochemica et Cytobiologica,50(1),25-37。
结肠直肠癌据报导分别是来自发达国家的女性和男性中的第二大和第三大最常见癌症。结肠直肠癌在发达国家中更为普遍-美国、澳大利亚、欧洲以及新西兰具有最高比率-其发病率比发展中国家高多达10倍。虽然手术可以是有效的，但早期检测对于积极的手术结果是关键的。其它疗法主要针对寿命延长和姑息护理，因为当前化学疗法和放射疗法治疗原发性肿瘤或在淋巴结外部的转移的功效有争论。
咽喉癌，也称作食管癌、咽癌或喉癌，包涵在咽、鼻咽、口咽、下咽部、喉(喉头)或扁桃体的组织中发展的肿瘤。用于咽喉癌的疗法包括手术、放射疗法或化学疗法。用于咽喉癌的治疗可以损伤咽喉并且可能导致患者饮食、呼吸以及睡眠的方式改变。
胃癌是世界上癌症相关死亡的第二大最常见原因。诊断常常延迟，因为症状在疾病的早期可能不出现。用以去除胃的手术(胃切除术)是可以治愈胃癌的唯一治疗。在手术之后的化学疗法和辐射疗法可以改善治愈的机率。
因此，需要抗消化道癌组合物，包括适合用于治疗或预防结肠直肠癌、胃癌以及咽喉癌的那些和能够支持抗消化道癌活性的维持或加强抗消化道癌活性的那些。
本发明的一个目的在于提供用于治疗或预防结肠直肠癌、胃癌以及咽喉癌的抗消化道癌组合物，包括稳定的抗消化道癌组合物，或至少为公众提供有用的选择。
发明内容
因此，在第一个方面，本发明涉及一种抗消化道癌组合物，其包含蜂胶和环糊精，并且特别是γ环糊精。
在一个实施方案中，抗消化道组合物是抗结肠直肠癌组合物。在另一个实施方案中，抗消化道组合物是抗胃癌组合物。在另一个实施方案中，抗消化道组合物是抗咽喉癌组合物。
在另一个方面，本发明涉及一种医药组合物，其包含蜂胶和γ-环糊精、基本上由蜂胶和γ-环糊精组成、或由蜂胶和γ-环糊精组成。在一个实施方案中，这种组合物用于维持或改善肠道健康。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种用于维持或改善肠道健康的医药组合物，这种组合物包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成。
在一个实施方案中，蜂胶是蜂胶树脂。在一个实施方案中，树脂是蜂胶树脂并且环糊精是γ-环糊精。
在另一个方面，本发明涉及一种治疗或预防受试者中的消化道癌的方法，这种方法包括将有效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物施用于有需要的受试者。
在另一个方面，本发明涉及一种在受试者中抑制消化道肿瘤形成、抑制消化道肿瘤生长、抑制消化道肿瘤转移或者治疗或预防消化道癌的方法，这种方法包括将有效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物独立、同时或依序施用于有需要的受试者。
本发明的另一个方面涉及一种诱导受试者中的一种或多种赘生性消化道细胞的凋亡的方法，这种方法包括将有效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物施用于有需要的受试者。
在一个实施方案中，凋亡是消化道肿瘤细胞，诸如结肠直肠、胃或咽喉肿瘤细胞的凋亡。
本发明的另一个方面涉及一种调节受试者中的一种或多种赘生性消化道细胞的增殖的方法，这种方法包括将有效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物施用于有需要的受试者。
举例来说，在一个实施方案中，调节是减少。因此，本发明涉及一种减少受试者中的一种或多种赘生性消化道细胞的增殖的方法，这种方法包括将有效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物施用于有需要的受试者。
在一个实施方案中，增殖是消化道肿瘤细胞，诸如结肠直肠、胃或咽喉肿瘤细胞的增殖。
本发明的另一个方面涉及一种增加受试者对消化道癌疗法的反应性的方法，其包括向受试者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物。
本发明的另一个方面涉及一种增加受试者中的消化道肿瘤对消化道癌疗法的敏感性的方法，其包括向受试者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物。
在另一个方面，本发明涉及一种使对治疗具抗性的一种或多种消化道癌细胞重新敏感的方法，这种方法包括将有效量的包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物施用于一种或多种消化道癌细胞。
在一个实施方案中，消化道癌细胞包含存在于受试者中的肿瘤。在一个实施方案中，消化道癌细胞是结肠直肠癌细胞。在另一个实施方案中，消化道癌细胞是胃癌细胞。在另一个实施方案中，消化道癌细胞是咽喉癌细胞。
本发明还涉及一种至少部分逆转罹患消化道癌的受试者中的赘生性细胞对消化道癌疗法的抗性的方法，这种方法包括向受试者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物。
本发明进一步涉及一种完全或部分逆转负荷消化道癌的患者对消化道癌疗法的抗性的方法，这种方法包括向所述患者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物的步骤。
在另一个方面，本发明提供了一种使负荷消化道癌的患者中对使用消化道癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤重新敏感的方法，所述方法包括向所述患者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物的步骤。
在一个实施方案中，一种或多种肿瘤对消化道癌疗法具抗性或者预测具抗性或变成抗性，这是由于在一种或多种肿瘤内或在患者内一个或多个癌前细胞存活信号传导路径的活化增加，包括例如在来自患者的样品，诸如组织样品、肿瘤活检体、或血液或血浆样品内AKT、JNK或JAK/STAT信号传导路径中的一者或多者的活化增加。
在一个实施方案中，本发明提供了一种钝化或抑制在一种或多种肿瘤内或在患者内一个或多个癌前细胞存活信号传导路径的方法。举例来说，本发明涉及一种钝化或抑制在一种或多种肿瘤内AKT、JNK或JAK/STAT信号传导路径中的一者或多者的方法。
在一个实施方案中，一种或多种肿瘤对消化道癌疗法具抗性或者预测具抗性或变成抗性，这是由于在肿瘤内AKT、JNK或JAK/STAT信号传导路径中的一者或多者的活化增加。
在一个实施方案中，本发明提供了一种防止肿瘤对原发性消化道癌疗法变成抗性的方法，其中这种抗性至少部分由例如在肿瘤内AKT、JNK或JAK/STAT信号传导路径中的一者或多者的活化增加来介导。
在一个实施方案中，肿瘤对使用化学治疗剂的治疗具抗性。
在一个实施方案中，消化道癌是结肠直肠癌。在另一个实施方案中，消化道癌是胃癌。在另一个实施方案中，消化道癌是咽喉癌。
在另一个方面，本发明涉及一种改善肠道健康的方法，这种方法包括向有需要的受试者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物；并且特别是蜂胶和γ-环糊精，例如欧洲蜂胶和γ-环糊精。
在另一个方面，本发明提供了一种协同组合物，其包含蜂胶和γ-环糊精。在一个实施方案中，组合物是协同治疗性组合物。在一个实施方案中，组合物提供协同治疗作用。
在一个实施方案中，蜂胶和γ-环糊精提供大于单独任一者的作用或大于单独任一者的相加作用的协同治疗作用。举例来说，对诱导凋亡、消化道癌细胞存活或增殖、对疗法重新敏感、治疗或预防消化道癌、或受试者或肿瘤对治疗方法的反应性存在更大作用。在一个实施方案中，蜂胶和γ-环糊精允许在适当时共同施用或依序施用的消化道癌疗法的施用在剂量方面或在施用时长方面减小或增大。
本发明的另一个方面涉及蜂胶和环糊精的用途，其用于制造达成如本文所描述的目的的组合物。
本发明的另一个方面涉及蜂胶和γ-环糊精与至少一种额外治疗剂的用途，其用于制造达成如本文所描述的目的的组合物。
本发明的另一个方面涉及包含蜂胶和γ-环糊精的复合物与至少一种额外治疗剂的用途，其用于制造达成如本文所描述的目的的组合物，其中这种组合物经过配制以提供蜂胶和γ-环糊精复合物与至少一种额外治疗剂的独立、同时或依序施用。
本发明的另一个方面涉及一种组合物，其包含蜂胶和γ-环糊精、基本上由蜂胶和γ-环糊精组成、或由蜂胶和γ-环糊精组成。
本发明的另一个方面涉及一种产品，其包含蜂胶和γ-环糊精、基本上由蜂胶和γ-环糊精组成、或由蜂胶和γ-环糊精组成，任选地与一种或多种、两种或更多种或者三种或更多种额外治疗剂一起作为组合制剂用于达成如本文所描述的目的的同时、独立或依序使用。
本发明的另一个方面涉及一种本发明组合物，其用于治疗或预防消化道癌。
以下实施方案可以涉及上述方面中的任一者。
在各种实施方案中，环糊精是γ-环糊精，或环糊精以包含γ-环糊精的环糊精的组合存在。
在一个实施方案中，环糊精是化学改性的环糊精。
在一个实施方案中，蜂胶作为蜂胶提取物或级分存在于抗消化道癌组合物中。
在一个实施方案中，存在于抗消化道癌组合物中的蜂胶不含蜡。举例来说，已经使用本领域中已知的提取工艺使蜂胶脱蜡。
在一个实施方案中，蜂胶是“欧洲”或“杨树”蜂胶。举例来说，“欧洲”蜂胶至少部分来源于杨树、桦树、落叶松或柳树的一种或多种种类的芽和叶渗出物。在另一个实施方案中，蜂胶是“巴西绿”蜂胶。举例来说，“巴西”蜂胶至少部分由蜜蜂从酒神菊树的叶渗出物获得。
在一个实施方案中，组合物包含约1.0wt％至约99wt％蜂胶。在一个替代性实施方案中，组合物包含约1.0wt％至约99wt％蜂胶树脂。
在各种实施方案中，组合物包含约1wt％至约99wt％蜂胶、约1wt％至约25wt％蜂胶、约1wt％至约30wt％蜂胶、约5wt％至约25wt％蜂胶、约5wt％至约30wt％蜂胶、约5wt％至约99wt％蜂胶、约10wt％至约25wt％蜂胶、约10wt％至约30wt％蜂胶、约10wt％至约99wt％蜂胶、约15wt％至约25wt％、约15wt％至约30wt％、约15wt％至约99wt％、约20wt％至约25wt％、约20wt％至约30wt％、约20wt％至约99wt％、或约25wt％蜂胶、或约30wt％蜂胶。
在各种实施方案中，组合物包含约1wt％至约99wt％蜂胶树脂、约1wt％至约25wt％蜂胶树脂、约1wt％至约30wt％蜂胶树脂、约5wt％至约25wt％蜂胶树脂、约5wt％至约30wt％蜂胶树脂、约5wt％至约99wt％蜂胶树脂、约10wt％至约25wt％蜂胶树脂、约10wt％至约30wt％蜂胶树脂、约10wt％至约99wt％蜂胶树脂、约15wt％至约25wt％、约15wt％至约30wt％、约15wt％至约99wt％、约20wt％至约25wt％、约20wt％至约30wt％、约20wt％至约99wt％、或约25wt％蜂胶树脂、或约30wt％蜂胶树脂。
在一个实施方案中，组合物中的蜂胶被完全包封于环糊精内。
在一个实施方案中，组合物中蜂胶与环糊精的摩尔比不大于约1:1。
在一个实施方案中，欧洲蜂胶包含咖啡酸苯基醚酯(CAPE)。在一个实施方案中，欧洲蜂胶包含白杨素。在一个实施方案中，欧洲蜂胶包含咖啡酸。在一个实施方案中，欧洲蜂胶包含咖啡酸苯甲酯。在一个实施方案中，欧洲蜂胶包含短叶松素。在一个实施方案中，欧洲蜂胶包含松属素。在一个实施方案中，欧洲蜂胶包含高良姜素。
在各种实施方案中，欧洲蜂胶包含CAPE、白杨素、高良姜素、松属素、短叶松素、咖啡酸苯甲酯以及咖啡酸中的两者或更多者的任何组合。
在一个实施方案中，欧洲蜂胶具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500g/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约1000mg/g的CAPE浓度。
在一个实施方案中，欧洲蜂胶具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约1000mg/g的松属素浓度。
在一个实施方案中，欧洲蜂胶具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约1000mg/g的高良姜素浓度。
在一个实施方案中，欧洲蜂胶具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约1000mg/g的白杨素浓度。
在一个实施方案中，欧洲蜂胶具有大于约1mg/g、约1.5mg/g、约2mg/g、约2.5mg/g、约3mg/g、约3.5mg/g、约4mg/g、约4.5mg/g、约5mg/g、约5.5mg/g、约6mg/g、约7.5mg/g、约10mg/g、约15mg/g、约20mg/g、约25mg/g、约30mg/g、约40mg/g、约50mg/g、约75mg/g、约100mg/g、约125mg/g、约150mg/g、约175mg/g、约200mg/g、250mg/g、约300mg/g、约350mg/g、约400mg/g、约450mg/g、约500mg/g、约550mg/g、约600mg/g、约650mg/g、约700mg/g、约750mg/g、约800mg/g、约850mg/g、约900mg/g、约950mg/g、直至约1000mg/g的咖啡酸苯甲酯浓度。
在各种实施方案中，组合物包含咖啡酸苯基醚酯(CAPE)、咖啡酸、松属素、咖啡酸苯甲酯、白杨素、高良姜素以及短叶松素中的一者或多者。
在例示性实施方案中，组合物是已经添加有CAPE、咖啡酸、松属素、咖啡酸苯甲酯、白杨素、高良姜素以及短叶松素中的一者或多者的组合物。
在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的CAPE浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。
在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的松属素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。
在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的高良姜素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。
在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的白杨素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。
在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的短叶松素浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。
在一个实施方案中，组合物具有大于约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或999mg/g的咖啡酸浓度，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约1至约5、约1至约10、约2至约20、约5至约20、约5至约25、约10至约25、约10至约40、约15至约100、或约20至约999mg/g)。
在各种实施方案中，组合物包含至少一种额外治疗剂或与至少一种额外治疗剂独立、同时或依序施用，这至少一种额外治疗剂优选地是抗肿瘤剂，这种抗肿瘤剂优选地选自抗肿瘤食物因子、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在各种实施方案中，消化道癌疗法、治疗剂或抗肿瘤剂有效诱导凋亡，例如，诱导一种或多种消化道癌细胞或一种或多种赘生性细胞的凋亡。
在一个实施方案中，消化道癌疗法、治疗剂或抗肿瘤剂是丁酸盐或丁酸盐的来源。
在另一个实施方案中，丁酸盐是通过用肠或结肠菌群消化环糊精而产生。
在一个实施方案中，组合物是消费品。
在一个实施方案中，组合物是食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养产品、医疗食品、营养制剂、药物或医药品。
在各种实施方案中，组合物可以经过配制以供经口、局部或肠道外施用。
在一个实施方案中，组合物包含一种或多种额外抗消化道癌药剂。
在一个实施方案中，组合物是医药组合物。
在各种实施方案中，化学治疗剂选自包含以下的群组：有丝分裂抑制剂，诸如长春花生物碱，包括长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、长春氟宁(vinflunine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)，紫杉烷，包括多烯紫杉醇(docetaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、奥他赛(ortataxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)以及替司他赛(tesetaxel)，以及埃博霉素(epothilone)，诸如伊沙匹隆(ixabepilone)；拓扑异构酶I抑制剂，诸如拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、喜树碱(camptothecin)、鲁吡替康(rubitecan)以及贝洛替康(belotecan)，拓扑异构酶II型抑制剂，包括安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)以及替尼泊苷(teniposide)，蒽环霉素(anthracycline)，诸如阿柔比星(aclarubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、戊柔比星(valrubicin)以及佐柔比星(zorubicin)，以及蒽二酮(anthracenedione)，诸如米托蒽醌(mitoxantrone)和匹杉群(pixantrone)；抗代谢物，包括二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)，胸苷酸合成酶抑制剂，诸如雷替曲塞(raltitrexed)和培美曲塞(pemetrexed)，腺苷脱氨酶抑制剂，包括喷司他丁(pentostatin)，卤化或核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)以及氟达拉滨(fludarabine)，硫嘌呤，包括硫鸟嘌呤和巯基嘌呤，胸苷酸合成酶抑制剂，包括氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、替加氟(tegafur)、卡莫氟(carmofur)以及氟尿苷(floxuridine)，DNA聚合酶抑制剂，诸如阿糖胞苷(cytarabine)，核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如吉西他滨(gemcitabine)，低甲基化剂，包括阿扎胞苷(azacitidine)和地西他滨(decitabine)，以及核糖核苷酸还原酶抑制剂，诸如羟基脲；细胞周期非特异性抗肿瘤剂，包括烷化剂，诸如氮芥，包括二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、曲洛磷胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、泼尼莫司汀(prednimustine)、苯达莫司汀(bendamustine)、乌拉莫司汀(uramustine)、雌莫司汀(estramustine)，亚硝基脲，包括卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)以及链脲菌素(streptozocin)，烷基磺酸酯，包括白消安(busulfan)、甘露舒凡(mannosulfan)以及曲奥舒凡(treosulfan)，氮丙啶，包括卡波醌(carboquone)、塞替哌(thioTEPA)、三亚胺醌(triaziquone)以及三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，类烷化剂，包括铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、奈达铂(nedaplatin)、四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)、赛特铂(satraplatin)，肼，诸如丙卡巴肼(procarbazine)，三氮烯，诸如达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲蜜胺(altretamine)以及二溴甘露醇(mitobronitol)，以及链霉素，诸如放线菌素(actinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunomycin)、丝裂霉素(mitomycin)以及普卡霉素(plicamycin)；光敏剂，包括氨基酮戊酸、氨基酮戊酸甲酯、乙丙昔罗(efaproxiral)，以及卟啉衍生物，诸如卟吩姆钠(porfimer sodium)、他拉泊芬(talaporfin)、替莫卟吩(temoporfin)以及维替泊芬(verteporfin)；酶抑制剂，包括法尼基转移酶抑制剂，诸如替吡法尼(tipifarnib)，周期素依赖性激酶抑制剂，诸如阿伏西地(alvocidib)和赛利昔布(seliciclib)，蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米(bortezomib)，磷酸二酯酶抑制剂，诸如阿那格雷(anagrelide)，IMP脱氢酶抑制剂，诸如噻唑呋林(tiazofurine)，脂氧合酶抑制剂，诸如马索罗酚(masoprocol)，以及PARP抑制剂，诸如奥拉帕尼(olaparib)；受体拮抗剂，诸如内皮素受体拮抗剂，包括阿曲生坦(atrasentan)，视黄素X受体拮抗剂，诸如贝沙罗汀(bexarotene)和睾内酯(testolactone)；以及其它化学治疗剂，包括安吖啶、曲贝替定(trabectedin)，视黄素，诸如阿利维甲酸(alitretinoin)和维甲酸(tretinoin)，三氧化二砷，天冬酰胺消耗剂，诸如天冬酰胺酶或培门冬酶、塞来昔布(celecoxib)、秋水仙胺(demecolcine)、伊利司莫(elesclomol)、依沙芦星(elsamitrucin)、依托格鲁(etoglucid)以及氯尼达明(lonidamine)。
预期，提及本文所公开的数字的范围(例如，1至10)还合并了提及在那个范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9以及10)以及在那个范围内的有理数的任何范围(例如，2至8、1.5至5.5以及3.1至4.7)，并且因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围特此明确公开。这些仅仅是特定预期的实例，并且在所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合被认为在本申请中以类似方式明确陈述。
在本说明书中，在已经提及专利说明书、其它外部文献或其它信息来源的情况下，这一般是出于提供用于论述本发明的特征的内容的目的。除非另有特别规定，否则提及这类外部文献不应被解释为承认这类文献或这类信息来源在任何管辖区中是先有技术，或形成本领域中的公知常识的一部分。
本发明还可以广泛地说在于本申请的说明书中个别地或共同地提及或指示的部分、要素以及特征，所述部分、要素或特征中的两者或更多者的任何或所有组合，并且在本文所提到的特定整体具有在本发明所涉及的领域中的已知等效物的情况下，这类已知等效物被视为并入本文中，如同个别地阐述一样。
附图说明
图1.示出如实施例1中所描述使用欧洲蜂胶-环糊精复合物、CAPE富集的欧洲蜂胶-环糊精、欧洲蜂胶酊剂以及未改性的环糊精的DLD-1试验的汇总数据的图形。1A在这个图形中，较高条形代表试验中级分的较高活性(抑制％)，反之亦然。1B这个图形呈现了包含蜂胶的样品的功效％(其中功效％＝抑制％/蜂胶浓度)，和所鉴别的样品的抑制％，如实施例1中所描述。
图2.本发明组合物中的CAPE对比纯CAPE的功效的比较。功效呈现为相对抑制(抑制％/测试培养基中的有效浓度)对比有效浓度。高值等同于高功效。
图3.CAPE、欧洲蜂胶环糊精复合物、丁酸盐以及其混合物对HCT-116和HCT-116-R细胞的凋亡相对于阴性对照(仅细胞)的作用。
具体实施方式
本发明是基于发现包含蜂胶和环糊精并且特别是γ环糊精的组合物，例如包含欧洲蜂胶和γ-环糊精的组合物，具有抗消化道癌功效(包括增强的功效)和预防活性。本发明的医药组合物，例如本发明的抗消化道癌组合物，增强蜂胶的活性和物理化学特性。本发明的营养组合物，例如本发明的肠道健康组合物，也增强存在于组合物中的蜂胶的活性和物理化学特性。
因此，只要抗消化道癌组合物经过配制以适合施用于哺乳动物受试者，例如，其由对人体安全的物质组成，那么其可以用于制造抗消化道癌医药组合物和药物，以及营养组合物、消费品，诸如饮料、食品等等。
此外，因为本发明的组合物的实施方案的抗消化道癌活性维持持久的时段，所以可以减小组合物的施用剂量或频率，或提供更高功效，或两者。
短语本发明的“抗消化道癌组合物”或“具有抗消化道癌活性的组合物”(在本文中可互换使用)涵盖任何种类的组合物。实例包括含有蜂胶和环糊精的抗消化道癌组合物或含有含蜂胶物质和环糊精的抗消化道癌组合物。特别预期增强单独的蜂胶或环糊精中所观测到的任何抗消化道癌活性的协同组合物。抗消化道癌组合物可以是抗结肠直肠癌、抗胃癌或抗咽喉癌组合物。
术语“和/或”可以意指“和”或者“或”。
术语“癌症”和“癌性”指的是哺乳动物中通常特征为异常或不受调控的细胞增殖、细胞存活、细胞运动、赘生性和/或致瘤性的生理病状。癌症和癌症病理学可以与以下相关联：例如，转移、干扰邻近细胞的正常功能、释放异常水平的细胞因子或其它分泌产物、抑制或加剧发炎或免疫反应、瘤形成、初癌、恶性肿瘤、侵入周围或远端组织或器官(诸如淋巴结)，等等。特定地包括结肠直肠癌、胃癌、咽喉癌以及癌前病状，其可以包括上皮肿瘤、非上皮肿瘤、癌瘤、腺癌、胃淋巴瘤、类癌肿瘤、间质肿瘤或鳞状细胞癌，例如原位癌瘤以及侵入性结肠直肠癌、胃癌或咽喉癌。
如本说明书中所用的术语“包含”意指“至少部分由……组成”。当解释在本说明书中包括那个术语的陈述时，在每个陈述中以那个术语为开端的特征全部需要存在，但其它特征也可以存在。诸如“包含了”和“包含有”的相关术语以相同的方式加以解释。
“有效量”是赋予治疗作用所需的量。用于动物和人类的剂量的相互关系(基于每平方米体表的毫克数)由Freireich等(1966)描述。体表面积可以从受试者的身高和体重近似地确定。参看例如Scientific Tables,Geigy Pharmaceuticals,Ardley,New York,1970,537。如本领域的技术人员所认识到，有效剂量也有变化，这取决于施用途径、赋形剂使用等等。
如本文所用的蜂胶“提取物”或“级分”适合用于本发明中，条件是其至少保留蜂胶所展现的一种或多种抗消化道癌活性。这类功能提取物或功能级分可以具有比粗蜂胶更大或更小的活性。在一个实例中，功能提取物或功能级分所具有的粗蜂胶的生物活性中的一者或多者可以在比粗蜂胶中所发现的更大或更小的程度下存在于功能提取物或功能级分中。在另一个实例中，功能提取物或功能级分所具有的粗蜂胶的生物活性中的每一者在比粗蜂胶中所发现的更大或更小的程度下存在于功能提取物或功能级分中。在另一个实例中，可能需要提供如下功能提取物或功能级分：其中粗蜂胶的生物活性中的一者或多者得以维持或在比粗蜂胶中所发现的更大的程度下存在，但粗蜂胶的一种或多种其它生物活性不存在或在比粗蜂胶中所发现的更小的程度下存在。这类功能提取物的实例包括本文实施例中所描述的抗消化道癌酊剂。
用以确定由蜂胶引发的一种或多种生物作用的方法和试验在本领域中众所周知并且实例描述于本文中，并且这类方法和试验可以用于鉴别或验证蜂胶的一种或多种功能提取物或功能级分。举例来说，蜂胶增加细胞中的一种或多种致瘤性状(诸如本文实施例中所描述的那些)的能力的试验可负责鉴别蜂胶的一种或多种功能提取物或功能级分。
如本文所用的“蜂胶”涵盖由蜜蜂从任何植物来源产生的蜂胶。在一个实施方案中，蜂胶是“欧洲”蜂胶。“欧洲”蜂胶也以不同名称已知，诸如“杨树”蜂胶。举例来说，蜂胶主要来源于杨树并且在较小程度上来源于桦树、落叶松或柳树的一种或多种种类的芽和叶渗出物。蜂胶已经基于植物来源被分类为七大类(Sforcin和Bankova,2011.蜂胶：存在开发新药物的潜力吗？(Propolis:is there a potential for the development of newdrugs？)J.Ethnopharmacology,133:253-260.)。这些种类是来自欧洲、北美洲、南美洲南部、新西兰的“杨树蜂胶”；“巴西绿蜂胶”，其含有阿特匹林C；来自俄罗斯的“桦树蜂胶”；来自古巴、巴西、墨西哥的“红蜂胶”；来自希腊、西西里岛、克里特岛、马耳他并且富含源自针叶树的双萜的“地中海蜂胶”；来自古巴和委内瑞拉的“克鲁西(Clusia)蜂胶”；以及来自冲绳、中国台湾、印尼的“太平洋蜂胶”，其含有‘普林斯(propolins)’。
来自各个国家的欧洲型蜂胶中所报导的例示性化合物和化合物浓度呈现于下表1中，连同巴西绿蜂胶的比较实例一起。这些化合物适用于例如鉴别作为欧洲型蜂胶的蜂胶的来源，或表征和鉴别适合用于本发明中的蜂胶。已经报导了巴西绿蜂胶不含欧洲型蜂胶的类黄酮和咖啡酸酯化合物特征中的任一者。
Figure GDA0003102884580000181
如本领域的技术人员应了解，蜂胶的身份并且在某些情况下对特定用途(包括本发明中的用途)的适宜性可以通过蜂胶组成的分析来确定。特定化合物(包括本文所论述的化合物)-经常被称作“标志化合物”的存在和量允许确定蜂胶的特定来源，例如欧洲蜂胶与巴西蜂胶相比对特定用途的适宜性。在本发明的某些实施方案中，在配制本发明的组合物之前，分析一种或多种标志化合物的存在或量作为初步定级步骤。
当关于具有抗消化道癌活性的药剂，诸如本发明组合物或本发明组合物的组分使用时，短语“保留抗消化道癌活性”以及其语法等效物和派生词欲意指药剂仍然具有适用的抗消化道癌活性。优选地，所保留的活性为原始活性的至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约35％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、以及约90％至约100％)。本发明的例示性组合物能够支持其所包含的抗消化道癌药剂的适用抗消化道癌活性的维持，并且可以被称为保留抗消化道癌活性，理想地直至在本文所预期的方法中利用。
当关于本发明组合物或本发明组合物的组分使用时，短语“增强抗消化道癌活性”以及其语法等效物和派生词欲意指当存在于组合物中时，等效量或浓度的抗消化道癌药剂与不存在组合物的情况下药剂(诸如分离的药剂)的抗消化道癌活性相比具有增加的抗消化道癌活性。优选地，增强的活性为原始活性的至少约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％或更高，并且适用范围可以在这些值中的任一者之间选择(例如，约105％至约200％、约120％至约200％、约140％至约200％、约150％至约200％、约180％至约200％、以及约190％至约200％)。在某些实施方案中，本发明的组合物可以展现增强的抗消化道癌活性，即，展现单独蜂胶或单独环糊精的抗消化道癌活性的至少约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％或更高。类似地，本发明的优选组合物能够支持增强的抗消化道癌活性的维持，并且可以被称为保留增强的抗消化道癌活性，理想地直至使用本文所预期的方法而利用。在不希望受任何理论约束的情况下，增强的活性(包括增强的活性维持)据信是本发明组合物的各种组分之间协同作用的结果。
如本文所用的术语“稳定”当关于本发明的组合物使用时，意指组合物能够支持抗消化道癌活性，优选地超过两小时、超过三小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、20小时、超过一天、优选地约两天、约三天、约四天、优选地约五天、更优选地约六天、优选地一周、两周、三周、一个月或更长时间。应了解，在某些实施方案中，稳定的组合物包括具有抗消化道癌活性持续长于单独的蜂胶或环糊精的时段的那些。
术语“经口施用”包括经口、经颊、经肠以及胃内施用。
术语“肠道外施用”包括(但不限于)局部(包括施用于任何真皮、表皮或粘膜表面)、皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内以及肿瘤内(包括任何直接施用于肿瘤)施用。
术语“医药学上可接受的载剂”欲指代可以作为本发明组合物的组分施用于受试者的载剂，包括(但不限于)赋形剂、稀释剂或助剂。优选的载剂并不降低组合物的活性，并且当以足以递送有效量的蜂胶或其提取物或者另一种抗消化道癌药剂(当施用时)的剂量施用时是无毒的。
在名词之后的术语“(s)”涵盖单数或复数形式，或两者。
术语“受试者”欲指代动物，优选哺乳动物，更优选哺乳动物的伴侣动物或人类。优选的伴侣动物包括猫、狗以及马。其它哺乳动物受试者包括农业动物，包括马、猪、绵羊、山羊、母牛、鹿或家禽，或实验动物，包括猴、大鼠或小鼠。
术语“治疗”和其派生词应以其最宽泛的可能情形来解释。这个术语不应被视为暗示治疗受试者直至完全恢复。因此，“治疗”广泛地包括将受试者的疾病进程或症状维持于实质上静态的水平下，增加受试者的恢复速率，改善和/或预防症状的发作或特定病状的严重性，或延长患者的生活质量。术语“治疗”还广泛地包括维持敏感个体的良好健康状况以及建立疾病预防的持久力。
本发明的例示性用途
本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防结肠直肠癌、与结肠直肠癌细胞相关的赘生性病症，以及结肠直肠癌、结肠直肠癌治疗和相关病症的症状。结肠直肠癌是影响大肠，特别是结肠和直肠的赘生性病状-因此，其通常被称作结肠癌或肠癌。风险因素包括年龄、膳食(特别是脂肪、酒精或红肉的高摄入量)、男性性别、肥胖、吸烟以及缺乏锻炼。
结肠直肠癌起源于消化道的结肠或直肠中的上皮细胞，并且最通常与Wnt-APC-β-连环蛋白信号传导路径中的缺陷相关联。在可能的情况下，优选的治疗是可以治愈的完全手术去除。如果转移已经发生并且癌症已经进入淋巴结，那么已经报导了化学治疗剂氟尿嘧啶或卡培他滨增加预期寿命。考虑使用的其它化学治疗剂包括氟尿嘧啶、卡培他滨、UFT、甲酰四氢叶酸、伊立替康或奥沙利铂，以及这些药剂的组合。然而，在癌症更广泛扩散的情况下，或当不可能进行手术时，治疗一般集中于姑息护理和延长预期寿命。辐射与化学疗法的组合可以被考虑用于直肠癌，但放射疗法由于肠的放射敏感性而通常并不用于结肠癌中。
在某些实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗或预防胃癌、与胃癌细胞相关的赘生性病症，以及胃癌、胃癌治疗和相关病症的症状。
胃癌是从胃的任何部分产生的赘生性病状。因为大多数患者呈现有晚期疾病，所以预后不良。风险因素包括年龄、膳食(特别是烟熏食品、咸鱼、腌肉以及泡菜的高摄入量)、吸烟、男性性别，以及自体免疫萎缩性胃炎或肠化生的历史。
约90％的胃癌是在胃粘膜的腺上皮中起源的腺癌。其它类型包括淋巴瘤(MALTomas或MALT淋巴瘤)以及类癌和间质肿瘤。在可能的情况下，优选的治疗是胃的全部或一部分和周围淋巴结的完全手术去除。胃癌对化学治疗剂并不特别敏感，然而，包括氟尿嘧啶、卡培他滨、BCNU(卡莫司汀)、甲基-CCNU(司莫司汀)和阿霉素(亚德里亚霉素)、丝裂霉素C、顺铂以及泰索帝(taxotere)的化学治疗剂已经用于姑息护理方案中。辐射与化学疗法的组合有时用于治疗胃癌。
在某些实施方案中，本发明还涉及至少部分逆转罹患消化道癌的受试者中的赘生性细胞对消化道癌疗法的抗性的方法，或完全或部分逆转负荷消化道癌的患者对消化道癌疗法的抗性的方法，或使负荷消化道癌的患者中对使用消化道癌疗法的治疗具抗性或者预测具抗性或变成抗性的一种或多种肿瘤重新敏感的方法，所述方法包括向所述患者施用包含蜂胶和环糊精、基本上由蜂胶和环糊精组成、或由蜂胶和环糊精组成的组合物的步骤。
在一个实施方案中，一种或多种肿瘤对消化道癌疗法具抗性或者预测具抗性或变成抗性，这是由于在一种或多种肿瘤内或在患者内一个或多个癌前细胞存活信号传导路径的活化增加，包括例如在来自患者的样品，诸如组织样品、肿瘤活检体、或血液或血浆样品内AKT、JNK或JAK/STAT信号传导路径中的一者或多者的活化增加。
消化道癌的发作和发展中所牵涉的癌前细胞存活信号传导路径在本领域中是已知的。
本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防咽喉癌、与咽喉癌细胞相关的赘生性病症，以及咽喉癌、咽喉癌治疗和相关病症的症状。
咽喉癌，也称作食管癌、咽癌或喉癌，包涵在咽、鼻咽、口咽、下咽部、喉(喉头)或扁桃体的组织中发展的肿瘤。约90％的咽喉癌是起源于这些区域的粘膜内衬(上皮)的鳞状细胞癌。风险因素包括膳食(特别是酒精的高摄入量)、吸烟、使用无烟烟草、咀嚼槟榔以及暴露于环境致癌物，包括镍精炼、纺织纤维以及木工的职业暴露。
最常见疗法是肿瘤的手术切除和辐射疗法。化学治疗剂可以用于联合手术和/或辐射中。药剂包括太平洋紫杉醇、卡铂、西妥昔单抗(cetuximab)、泰索帝以及多烯紫杉醇。
本发明的方法和组合物还可以用于维持或改善肠道健康。
稳固的肠道健康与肠舒适、抵抗感染性疾病以及预防慢性消化道疾病相关联。
这包括治疗或预防与不良肠道健康、低免疫力以及消化道发炎相关的病状。举例来说，本发明的方法和组合物适用于治疗或预防发炎性肠病、肠易激综合症、环境性肠病、感染性腹泻以及消除或减轻内脏痛。
蜂胶和包含蜂胶的物质
蜂胶在新西兰和其它地方可获得，通常呈树脂状粘性固体。蜂胶可以获自储存有所产生的蜂胶的蜂箱，例如以评估蜂胶含量。本领域的技术人员应认识到，为了用于本发明中，可以将蜂胶加工成适合于例如与环糊精混合的形式，同时维持生物活性成分。通常，将蜂胶或其提取物加工成细颗粒形式或浓酊剂。将活性蜂胶或其提取物制备成颗粒形式或浓酊剂的各种方法是已知的。最通常地，使用乙醇或乙醇/水混合物提取粗蜂胶以产生稀酊剂。与粗蜂胶相关联的蜡在最好的情况下难溶于溶剂并且因此大多不会被提取。可以通过冷却稀酊剂并且然后沉降、过滤或离心来去除任何提取的蜡。然后可以通过溶剂的部分至完全蒸发来浓缩酊剂以得到浓酊剂，任选地继之以冷冻干燥以得到粉末。或者，可以对酊剂进行喷雾干燥以得到粉末。可以通过使用本领域中已知的方法，诸如使用例如尺寸排阻基质或反相基质的色谱法(诸如HPLC)，或超临界分级来制备级分。用于这样的色谱工艺中的典型溶剂是乙醇或另一种水混溶性醇。
在一个实施方案中，蜂胶或浓蜂胶酊剂与增强蜂胶特性的其它化合物组合，例如，增强配制或施用的简易性，或增强抗消化道癌活性，或增强蜂胶中所存在的一种或多种抗消化道癌活性的稳定性的化合物。额外化合物的实例是改善蜂胶的治疗效益的那些。特别预期添加有存在于蜂胶中并且特别是欧洲蜂胶中的一种或多种化合物的例示性组合物，包括诸如CAPE、咖啡酸、松属素、咖啡酸苯甲酯、白杨素、高良姜素、短叶松素以及短叶松素-3-乙酸酯的生物活性化合物。在其它实例中，包括额外化合物以改善或维持组合物的生理效益，例如，可以添加甘露糖醇以增强所得组合物的利尿特性。替代地或另外，可以添加诸如赋形剂和/或推进剂的其它化合物以改善组合物的给药、可制造性或递送特性。
在特定预期的实施方案中，将任选地添加有一种或多种额外化合物的脱蜡蜂胶树脂与环糊精混合，并且干燥混合物。进行混合物的进一步加工，例如，以获得能够与组合物的其它组分即时混合、易压片或易施用于受试者的粒度分布。
在典型实施方案中，例如，通过加热以杀死可能天然地存在于蜂胶中的细菌、原生动物、酵母、真菌以及其它生物体来对蜂胶或蜂胶树脂进行灭菌。
环糊精和包含环糊精的物质
环糊精是由形成环形结构的吡喃葡萄糖环单元组成的环状分子。环糊精分子的内部是疏水的并且外部是亲水的，使得环糊精分子可溶于水。可溶性的程度可以经由取代环糊精外部的羟基而改变。类似地，内部的疏水性可以经由取代而改变，不过内部的疏水性质一般允许在空腔内容纳相对疏水的客体。一个分子容纳于另一个分子内被称为复合，并且所得产物被称作包结复合物。环糊精通常参考构成分子的单体单元的数目来鉴别，其中α-环糊精包含六个单体单元，β-环糊精包含七个单体单元，并且γ-环糊精包含八个单体单元。已经描述了较大环糊精分子，包括含有32个1,4-无水吡喃葡萄糖苷单元的充分表征的环糊精。
环糊精分子可以便利地通过例如化学改性，例如以改变其物理化学特性中的一者或多者而衍生。环糊精衍生物的实例包括甲基化环糊精、磺丁基环糊精、麦芽糖基环糊精、羟丙基环糊精以及其盐。本领域的技术人员应认识到，环糊精的各种衍生物可以适用于特定目的，例如，环糊精的某些衍生物对于施用于人类受试者是不可接受的，但适用于工业用途。
构成本发明的抗消化道癌组合物的环糊精可以商购，或可以独立地通过本领域的技术人员所熟知的方法来制备。本领域的技术人员将显而易见，用于施用于受试者的抗消化道癌组合物中的环糊精，例如用于制造本发明的饮料、食品或医药品的环糊精，应对人体安全，并且优选地是医药学上可接受的环糊精。
在特定预期的实施方案中，使用γ-环糊精或包含γ-环糊精的组合。在这类实施方案中，如本文的实施例中所呈现，实质上增强抗消化道癌活性。可以配制包含γ-环糊精的这类组合物以提供增强的口感或适口性，例如，包含γ-环糊精和蜂胶的组合物展现掩盖蜂胶中所存在的任何令人不快的味道的更强趋势。
适合用于本发明中的环糊精可以获自商业来源，或可以独立地通过本领域中熟知的方法来制备，诸如通过酶法转化从淀粉制备。在某些实施方案中，使用CAVAMAX W8 FOOD，一种由Wacker AG商业供应的γ-环糊精。
本发明的组合物
本发明的例示性抗消化道癌组合物包括粉末，其在混合蜂胶酊剂与环糊精，然后添加水并且均化组合物，并且然后喷雾干燥或冷冻干燥之后获得。本发明的其它例示性抗消化道癌组合物包括溶液，包括例如蜂胶酊剂与环糊精混合并且然后分散于水中的那些，蜂胶或含蜂胶物质和环糊精独立地溶解或分散于水中并且然后例如通过捏合而混合的那些，以及进一步地，蜂胶粉末或树脂首先溶解于其可溶的另一种有机溶剂(诸如丙二醇、乙酸乙酯、异丙醇)中，并且所得溶液与环糊精混合，然后添加至水中并且例如通过捏合进一步混合，并且然后通过本领域中已知的方式，诸如喷雾或冷冻干燥而干燥的那些。在某些实施方案中，如上文所描述的制备成粉末的抗消化道癌组合物可能是优选的，例如，这是因为其相比如上文所描述而制备的抗消化道癌组合物的溶液可以维持更强的抗消化道癌活性或可以维持抗消化道癌活性持续更长的时段。
本发明的蜂胶和环糊精的含量可以处于任何水平下，只要实现预期的抗消化道癌活性即可。
在不希望受任何理论约束的情况下，申请者相信，当蜂胶与环糊精的摩尔比不大于1:1时组合物中的蜂胶将被完全包封。
在一些实施方案中，在本发明的组合物中蜂胶与环糊精的摩尔比可以超过1:1。在这类组合物中，过量的蜂胶将不被环糊精包封。
一般已知的其它抗消化道癌物质可以与本发明的抗消化道癌组合物组合，这取决于组合物所投入的应用。
在不希望受任何理论约束的情况下，申请者相信，在本发明的例示性组合物中所观测到的增强的抗消化道癌活性可以至少部分归因于蜂胶(特别是当以蜂胶形式存在时)与γ-环糊精之间的协同性。此外，在不希望受任何理论约束的情况下，申请者认可，例示性组合物的其它组分，诸如存在于蜂胶中的多酚，在达成所观测到的增强的抗消化道癌活性方面可以存在一定作用。
适合施用于受试者的组合物可以被配制成食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养产品、医疗食品、营养制剂、医疗用品、医疗装置、药物或医药品。适当的配方可以由本说明书的技术和教导有关的技术人员来制备。
在一个实施方案中，本发明涉及蜂胶和γ环糊精，任选地与至少一种抗消化道癌药剂的用途，其用于制造食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养产品、医疗食品、营养制剂、医疗装置、医疗用品、药物或医药品。在一个实施方案中，组合物经过配制以供经口施用。在另一个实施方案中，组合物经过配制以供肠道外(包括局部)施用。在某些实施方案中，组合物用于诱导凋亡、治疗或预防消化道癌、维持或改善肠道健康，或如上文所描述的一种或多种其它用途。
在一个实施方案中，组合物呈粉末、片剂、囊片、丸剂、硬或软胶囊或糖锭的形式。
在一个实施方案中，组合物呈香包、可分散粉末、颗粒、悬浮液、酏剂、液体、饮料的形式，或可以添加至食品或饮料中的任何其它形式，包括例如水或果汁。在一个实施方案中，组合物是肠内产品、固体肠内产品或液体肠内产品。
在一个实施方案中，组合物呈乳膏、软膏、糊剂、包括滴眼剂或滴耳剂的滴液、吸入剂或可吸入组合物、敷料、垫片或喷雾的形式。
在一个实施方案中，组合物进一步包含防止或减少组合物在储存期间或在施用之后降解的一种或多种成分(诸如抗氧化剂)。
在一个实施方案中，适用于本文中的组合物包括能够携带一种或多种环糊精的任何可食用消费产品。当组合物包含作为至少一种额外抗消化道癌药剂的类蛋白质因子时，可食用消费产品是能够携带蛋白质的产品。适合的可食用消费产品的实例包括烤焙物、粉末、液体、糖果产品、复原的水果产品、小吃棒、食物棒、牛奶什锦棒、涂抹酱、沙司、蘸料；乳产品，包括冰淇淋、酸乳酪以及干酪；饮料，包括乳基和非乳基饮料(诸如牛奶饮料，包括奶昔，和酸乳饮料)；奶粉；运动或营养补充剂，包括乳基和非乳基运动或营养补充剂；食品添加剂，诸如蛋白质撒剂；以及膳食补充产品，包括每日补充片剂。在这个实施方案内，适用于本文中的组合物还可以是呈粉末或液体形式的婴儿配方。适用于本文中的适合营养组合物可以按类似形式提供。特别预期另外包含牛奶或一种或多种牛奶产品或牛奶组分的组合物，诸如牛奶蛋白、乳清蛋白、初乳、乳脂，或者牛奶或一种或多种牛奶产品或牛奶组分的任何级分，诸如乳脂级分、牛奶蛋白级分、乳清蛋白级分、初乳级分等等。
适用于本文中的组合物可以进一步包括其它因子，诸如钙、锌、镁、硒、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K2、复合碳水化合物；可食用或烹调油，包括棕榈、橄榄、大豆、芥花、玉米、向日葵、红花、花生、葡萄籽、芝麻、坚果、杏仁、腰果、榛子、澳洲坚果、美洲山核桃、阿月浑子以及胡桃；以及其它可食用物，包括阿萨伊(acai)、苋菜、杏、摩洛哥坚果(argan)、朝鲜蓟、鳄梨、巴巴苏(babassu)、山嵛(ben)、黑加仑籽、琉璃苣籽、婆罗洲脂坚果(borneotallow nut)、瓢葫芦、印度葫芦、角豆荚(长角豆)、羽叶棕榈、芫荽籽、月见草、亚麻荠、大麻、木棉籽、扁柄草、池花籽、芥菜、秋葵籽(木槿籽)、紫苏籽、佩基(pequi)、松果、罂粟籽、梅仁、南瓜籽、藜麦、盏金花、米糠、茶(山茶)、蓟、西瓜籽或小麦胚芽油；或其组合。
适用于本文中的组合物可以经过配制以允许通过任何所选途径施用于受试者，这种途径包括(但不限于)经口或肠道外(包括局部、皮下、肌肉内以及静脉内)施用。本领域的技术人员应了解，施用于受试者的途径将通常考虑到施用组合物的目的-例如，在施用本发明的医药组合物以治疗微生物疾病或病症的情况下，将通常在考虑微生物疾病或病症的性质下选择施用途径。
一般来说，对于经口施用，适用于本文中的膳食(例如，食品、食品添加剂或食品补充剂)、营养或医药组合物可以由技术人员根据已知的配制技术来配制。
因此，根据本发明适用的医药组合物可以用针对预定施用途径和标准医药惯例而选择的适当医药学上可接受的载剂(包括赋形剂、稀释剂、助剂以及其组合)来配制。参看例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编,Mack Publishing Co.,1980。
虽然优选的施用途径是经口，但应了解，任何施用模式可能适合于本发明的任何组合物，包括通过多种途径施用，包括用于不同药剂的不同途径。因此，还预期本发明的任何组合物的吸入(经鼻或经颊吸入)以及经阴道和经直肠施用。还预期本发明的任何组合物的髓内、硬膜外、关节内以及胸膜内施用。还预期本发明的组合物，任选地与至少一种额外抗消化道癌因子的施用，这是通过第一施用途径，伴随着通过第二施用途径独立、同时或依序施用一种或多种其它药剂，包括一种或多种其它抗消化道癌药剂；例如，经口施用本发明的组合物，伴随着局部施用至少一种额外抗消化道癌药剂。
本发明的组合物还可以被配制成剂型。适用于本文中的剂型可以作为粉末、液体、片剂或胶囊经口施用。适合的剂型视需要可以含有额外试剂，包括乳化剂、抗氧化剂、调味剂或着色剂，或具有肠溶包衣。适合的肠溶包衣是已知的。包围活性成分的肠溶包衣防止活性成分在胃中释放，但允许在剂型已经离开胃之后释放。适用于本文中的剂型可以适于活性组分的立即、延迟、修饰、持续、脉冲或控制释放。适合的配方视需要可以含有额外药剂，包括乳化剂、抗氧化剂、调味剂或着色剂。
胶囊可以含有任何标准医药学上可接受的物质，诸如明胶或纤维素。片剂可以根据常规程序通过压缩活性成分与固体载剂和润滑剂的混合物来配制。固体载剂的实例包括淀粉和糖膨润土。活性成分还可以按含有粘合剂(例如，乳糖或甘露糖醇)、常规填充剂以及压片剂的硬壳片剂或胶囊的形式施用。医药组合物还可以经由肠道外途径施用。肠道外剂型的实例包括活性剂的水溶液、等渗盐水或5％葡萄糖，或其它熟知的医药学上可接受的赋形剂。熟习本领域者所熟知的增溶剂可以用作医药赋形剂以供递送抗消化道癌药剂。
可注射剂型可以被配制成液体溶液或悬浮液。还可以制备固体形式，其适合于在注射之前呈液体中的溶液或液体中的悬浮液。还可以乳化剂型。蜂胶或包含蜂胶的物质和环糊精或包含环糊精的物质以及至少一种额外抗消化道癌因子(当存在时)可以与载剂混合，这些载剂诸如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等，以及其组合。
可以制备持续释放制剂，其合并有蜂胶和环糊精。持续释放制剂的适合实例包括含有蜂胶和环糊精以及至少一种额外抗消化道癌药剂(当存在时)的固体疏水聚合物的半渗透基质。基质可以呈成形物品的形式，例如，薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(参看US 3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，以及可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球体)。
包含蜂胶和环糊精以及至少一种额外抗消化道癌药剂(当存在时)的局部配方可以使用用于这类应用的已知载剂制备成洗剂、乳膏、软膏、糊剂或油膏。这类配方可以直接施用，例如直接施加至伤口上、喷至手术部位上等等，或可以间接施加，诸如通过浸渍于绷带或敷料中或喷至手术设备、敷料等等上。
本发明还涉及一种肠道外单位剂型，其包含蜂胶和环糊精，任选地与至少一种额外治疗剂一起。
在各种实施方案中，至少一种额外治疗剂是抗生素，诸如氨基糖苷，诸如阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramicin)或巴龙霉素(paromomycin)；袢霉素(ansamycin)，诸如格尔德霉素(geldanamycin)或除莠霉素(herbimycin)；碳头孢烯(carbacephem)，诸如氯碳头孢(loracarbef)；碳氢霉烯(carbapenem)，诸如厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亚胺培南/西司他丁(imipenem/cilastatin)，或美罗培南(meropenem)；头孢菌素(cephalosporin)(第一代)，诸如头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑林(cefazolin)、噻孢霉素(cefalotin)或头孢噻吩(cefalothin)，或头孢氨苄(cefalexin)；头孢菌素(第二代)，诸如头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)或头孢呋辛(cefuroxime)；头孢菌素(第三代)，诸如头孢克肟(cefixime)、头孢地尼(cefdinir)、头孢妥仑(cefditoren)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)或头孢曲松(ceftriaxone)；头孢菌素(第四代)，诸如头孢吡肟(cefepime)；头孢菌素(第五代)，诸如头孢托罗(ceftobiprole)；糖肽，诸如替考拉宁(teicoplanin)或万古霉素(vancomycin)；大环内酯，诸如阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、三乙酰竹桃霉素(troleandomycin)、泰利霉素(telithromycin)或壮观霉素(spectinomycin)；单胺菌素(monobactam)，诸如氨曲南(aztreonam)；青霉素，诸如阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲氧西林(meticillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素、哌拉西林(piperacillin)或替卡西林(ticarcillin)；多肽，诸如杆菌肽(bacitracin)、粘杆菌素(colistin)或多粘菌素b(polymyxin b)；喹诺酮(quinolone)，诸如环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)或氧氟沙星(ofloxacin)；磺酰胺，诸如磺胺米隆(mafenide)、磺酰胺基柯衣汀(sulfonamidochrysoidine)(古语词)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、对氨基苯磺酰胺(sulfanilimide)(古语词)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、磺胺异恶唑(sulfisoxazole)、甲氧苄啶(trimethoprim)或甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)(复方新诺明(co-trimoxazole))(tmp-smx)；四环素(tetracycline)，诸如地美环素(demeclocycline)、强力霉素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、氧四环素(oxytetracycline)、四环素；其它药剂，诸如胂凡纳明(arsphenamine)、氯霉素(chloramphenicol)、克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin)、乙胺丁醇(ethambutol)、磷霉素(fosfomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、呋喃唑酮(furazolidone)、异烟肼(isoniazid)、利奈唑胺(linezolid)、甲硝唑(metronidazole)、莫匹罗星(mupirocin)、呋喃妥英(nitrofurantoin)、平板霉素(platensimycin)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、喹奴普丁/达福普丁(quinupristin/dalfopristin)、利福平(rifampicin，在美国是rifampin)、甲砜霉素(thiamphenicol)、替硝唑(tinidazole)、氨苯砜(dapsone)、氯法齐明(clofazimine)；或环脂肽，诸如达托霉素(daptomycin)，甘氨四环素(glycylcycline)，诸如替加环素(tigecycline)，或恶唑烷酮，诸如利奈唑胺(linezolid)。
在其它实施方案中，至少一种额外治疗剂是抗真菌剂，诸如多烯抗真菌剂，诸如纳他霉素(natamycin)、龟裂霉素(rimocidin)、菲律宾菌素(filipin)、制霉菌素(nystatin)、两性霉素B(amphotericin B)、坎狄辛(candicin)；咪唑，诸如咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、联苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)或噻康唑(tioconazole)；三唑，诸如氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、雷夫康唑(ravuconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、伏立康唑(voriconazole)或特康唑(terconazole)；噻唑，诸如阿巴芬净(abafungin)；烯丙胺，诸如特比萘芬(terbinafine)、阿莫罗芬(amorolfine)、萘替芬(naftifine)或布替萘芬(butenafine)；棘白菌素(echinocandin)，诸如阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)或米卡芬净(micafungin)；其它药剂，诸如苯甲酸、环匹罗司(ciclopirox)、托萘酯(tolnaftate)、十一碳烯酸、氟胞嘧啶(flucytosine)或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素(griseofulvin)、卤普罗近(haloprogin)以及碳酸氢钠；或替代物，诸如蒜素、茶树油、香茅油、碘、柠檬草、橄榄叶、橙油、玫瑰草油、广藿香、柠檬香桃木、印楝籽油、椰子油、锌或硒。
或者，药剂选自本文所描述的那些中的任一者。
可以在体外与体内评价根据本发明适用的组合物的功效。参看例如下文的实施例。简单地说，在一个实施方案中，可以测试组合物例如在体外抑制赘生性细胞增殖的能力。对于体内研究，可以将组合物馈送至或注射至动物(例如，小鼠)中，并且然后评估其对消化道癌细胞存活、增殖、转移，或者消化道癌或相关疾病或病症的一种或多种症状的作用。基于这些结果，可以确定适当剂量范围、频率以及施用途径。
适用于本文中的组合物可以单独使用，或与一种或多种其它抗消化道癌药剂或者一种或多种额外治疗剂组合使用。抗消化道癌药剂或额外治疗剂可以是或包含食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、食品组分、饮料组分、膳食补充剂、营养产品、医疗食品、营养制剂、医疗装置、医疗用品、药物或医药品。抗消化道癌药剂或额外治疗剂优选地有效削弱一种或多种赘生性疾病或病症或者一种或多种赘生性疾病或病症的症状中的一者或多者，或以其它方式向其所施用的受试者赋予效益。优选的治疗剂包括治疗性食物因子、免疫原性或免疫刺激剂、伤口愈合剂等等。
应了解，上文所列的额外抗消化道癌药剂或治疗剂(基于食物的与医药剂)也可以在根据本发明的方法中采用，在此其与适用于本文中的组合物独立、同时或依序施用。
如应了解，所施用的组合物的剂量、施用时段以及一般施用方案可以因受试者而异，这取决于如下变量：诸如受试者的症状的严重性、所治疗的病症的类型、所选择的施用模式，以及受试者的年龄、性别和/或一般健康状况。然而，作为一般实例，每次施用或每天，施用约1毫克至约5000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，施用1毫克至约4000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，施用1毫克至约3000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，施用1毫克至约2000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，施用1毫克至约1000毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物，优选地约50至约1000毫克/公斤，优选地每天。在一个实施方案中，施用约0.05毫克至约250毫克/公斤体重的适用于本文中的组合物。
在各种实施方案中，每次施用或每天，施用足够的组合物以递送约0.001毫克至约50毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约40毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约30毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约20毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约10毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约5毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约1毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约0.5毫克/公斤体重的蜂胶、约0.001毫克至约0.1毫克/公斤体重的蜂胶，或约0.001毫克至约0.05毫克/公斤体重的蜂胶。
应了解，施用可以包括单次剂量，诸如单次日剂量，或施用许多不连续的分次剂量可能是适当的。应了解，本领域的一般技术人员将能够在没有过度实验的情况下，考虑到那个技术和本公开来确定对于给定病状的有效给药方案(包括施用剂量和时序)。
本发明还涉及一种膳食、营养或口服医药组合物，其包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：与环糊精组合的蜂胶或包含蜂胶的物质。在某些实施方案中，组合物基本上由约1至99wt％蜂胶或包含蜂胶的物质和约1至99wt％环糊精组成。举例来说，组合物基本上由约10至80wt％蜂胶或包含蜂胶的物质和约20至90wt％环糊精组成。在另一个实例中，组合物基本上由约20至40wt％蜂胶和约60至80wt％环糊精组成。
本发明还涉及一种膳食、营养或口服医药组合物，其包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：被环糊精包封的蜂胶或包含蜂胶的物质。在某些实施方案中，组合物基本上由约1至30wt％蜂胶或包含蜂胶的物质和约70至99wt％环糊精组成。举例来说，组合物基本上由约10至25wt％蜂胶或包含蜂胶的物质和约75至90wt％环糊精组成。在另一个实例中，组合物基本上由约20至30wt％蜂胶和约70至80wt％环糊精组成。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含蜂胶或蜂胶级分。在一个实施方案中，组合物包含至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或99重量％蜂胶或蜂胶级分，并且适用范围可以选自这些值中的任一者(例如，约1至约25重量％、约1至约30重量％、约5至约30重量％、约15至约30重量％、约20至约30重量％、约25至约30重量％、约10至约50重量％、约15至约50重量％、约40至约99重量％、约45至约99重量％、约50至约99重量％、约55至约99重量％、约60至约99重量％、约65至约99重量％、约70至约99重量％、约75至约99重量％、约80至约99重量％、约85至约99重量％、约90至约99重量％、或约95至约99重量％)。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含环糊精，优选γ-环糊精。在一个实施方案中，组合物包含至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99重量％环糊精，并且适用范围可以选自这些值中的任一者(例如，约1至约99重量％、约5至约99重量％、约10至约99重量％、约15至约99重量％、约20至约99重量％、约25至约99重量％、约30至约99重量％、约35至约99重量％、约40至约99重量％、约45至约99重量％、约50至约99重量％、约55至约99重量％、约60至约99重量％、约65至约99重量％、约70至约99重量％、约75至约99重量％、约80至约99重量％、约85至约99重量％、约90至约99重量％、或约95至约99重量％)。
当与另一种抗消化道癌药剂或治疗剂组合使用时，适用于本文中的组合物和其它抗消化道癌药剂或治疗剂的施用可以是同时或依序的。同时施用包括施用包含所有组分的单一剂型或实质上同时施用独立剂型。依序施用包括根据不同时程施用，优选地使得提供适用于本文中的组合物和其它治疗剂的时段有重叠。
另外，预期根据本发明的组合物可以用额外活性成分来配制，这些活性成分可以在特定情况下对受试者有益。举例来说，可以使用靶向疾病过程的相同或不同方面的治疗剂。
因此，本发明的“包含抗消化道癌组合物的食品和饮料”可以用于一般食品和健康食品。因为本发明的抗消化道癌组合物掩盖了蜂胶的味道，所以其可以作为粉末或呈粉末形式被食用。抗消化道癌组合物可以用作蛋糕、饼干、曲奇、巧克力、甜品以及其它糖食(包括水果糖或口香糖)的成分或原料。本发明的组合物可以添加至水中作为饮料，可以用作诸如牛奶、茶、咖啡、热巧克力等饮料的甜味剂，并且作为果汁饮料、运动饮料等的成分或原料。
现在将参考以下实施例来描述本发明的例示性抗消化道癌组合物和用于制备这类组合物的方法。
实施例
实施例1
这个实施例描述了包含蜂胶和环糊精的本发明组合物的制备和表征。
复合物CD1
使用包含23.1重量％蜂胶固体的蜂胶的乙醇酊剂(不含蜡，由Manuka Health供应)制得包含27质量％蜂胶固体的蜂胶-γ环糊精复合物。将6.16kgγ环糊精(CAVAMAX W8，由Wacker AG供应)与9.50kg蜂胶酊剂在不锈钢罐中用手混合直至获得均质的糊状棕色液体。然后分4步添加12.3kg水，并且然后以6000rpm均化所得混合物1小时。然后在连续搅拌下分4步再添加30.43kg水。然后对这种溶液进行喷雾干燥以得到细黄色粉末。复合物CD1的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。
复合物CD2
使用复合物CD1的相同程序来制造添加有CAPE的蜂胶-γ环糊精复合物，但具有以下修改。将12g固体CAPE(由Sigma Aldrich供应，纯度>97％)与9.5kg含有23.1重量％固体的蜂胶混合直至完全溶解。然后将添加有CAPE的蜂胶酊剂与γ环糊精、然后与水混合，并且然后如上文进行喷雾干燥。复合物CD2的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。这种组成包含复合物CD1的两倍浓度的CAPE。
复合物CD3
使用包含25.0重量％蜂胶固体的蜂胶的乙醇酊剂(不含蜡，由Manuka Health供应)制得包含24质量％蜂胶固体的蜂胶-γ环糊精复合物。将300gγ环糊精(CAVAMAX W8，由Wacker AG供应)与375g蜂胶酊剂在玻璃容器中用手混合直至获得均质的糊状棕色液体。然后分4步添加1350g水，并且然后以6000rpm均化所得混合物1小时。然后将溶液添加至冷冻干燥器托盘中，并且放置于压力送风机的前面直至通过蒸发损失600g质量。然后冷冻残余溶液过夜，随后冷冻干燥以得到浅黄色的易压碎粉末。复合物CD3的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。
复合物CD4
使用包含19重量％蜂胶固体的蜂胶的丙二醇溶液(不含蜡，由Manuka Health供应)制得包含19质量％蜂胶固体的蜂胶-γ环糊精复合物。在60℃下将300gγ环糊精(CAVAMAX W8，由Wacker AG供应)与1350g水混合直至完全溶解。在连续搅拌下将375g蜂胶的丙二醇溶液逐步添加至混合物中。添加所有溶液之后，在60℃下再高速搅拌混合物一小时。然后将溶液倾倒至冷冻干燥器托盘上，空气冷却至室温，并且然后冷冻过夜，随后冷冻干燥以得到黄色的易压碎粉末。复合物CD4的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。
复合物CD5：
使用包含50.0重量％蜂胶固体的蜂胶的乙醇酊剂(不含蜡，由Manuka Health供应)制得包含29质量％蜂胶固体的蜂胶-γ环糊精复合物。将7kg浓蜂胶酊剂与9.5kgγ环糊精(CAVAMAX W8，由Wacker AG供应)在不锈钢碗中分步混合。当已经将所有酊剂添加至环糊精中时，使用行星式搅拌器上的打蛋器附件再混合所得糊状物一小时。然后分4步添加50.1kg水以得到黄色溶液。当添加所有水时，然后再搅拌溶液一小时。然后将溶液称重至冷冻干燥器托盘上，并且然后放置于气流冷冻器中。当托盘内含物完全冷冻时，将托盘转移至冷冻干燥器并且然后冷冻干燥以得到黄色的易压碎粉末。复合物CD5的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。
复合物CD6：
使用含有40.3重量％蜂胶固体的蜂胶的乙醇酊剂(不含蜡，由Manuka Health供应)制得含有21质量％蜂胶固体的蜂胶-γ环糊精复合物。将6.35kg浓蜂胶酊剂缓慢并连续地添加至含有8.13kgγ环糊精(CAVAMAX W8，由Wacker AG供应)的不锈钢碗中，同时用附接至行星式搅拌器的K型混合器搅拌。当已经将所有酊剂添加至环糊精中时，再混合所得糊状物/粉末半小时。然后从碗中移出糊状物，将搅拌器换成打蛋器，并且然后将60.0kg水添加至碗中。重新开始混合，并且半连续地添加糊状物/粉末。当添加所有糊状物/粉末时，然后再搅拌溶液一小时。将所得分散体转移至托盘中，然后在40℃下加热过夜以驱散一些水并且还诱导包封的蜂胶以糊状沉淀物形式沉降。然后从托盘的顶部小心地倾倒出稀溶液，然后将糊状物称重至冷冻干燥器托盘上，并且然后将这些托盘放置于气流冷冻器中。当托盘内含物完全冷冻时，将托盘转移至冷冻干燥器并且然后冷冻干燥以得到黄色的易压碎粉末。复合物CD6的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。
复合物CD7：
使用含有40.3重量％蜂胶固体的蜂胶的乙醇酊剂(不含蜡，由Manuka Health供应)制得含有约22质量％NZ蜂胶固体的蜂胶-α环糊精复合物。将10.91g浓蜂胶酊剂与12.92gα环糊精(CAVAMAX W6，由Wacker AG供应)在不锈钢碗中用手分步混合。当已经将所有酊剂添加至环糊精中时，再混合所得糊状物半小时。然后通过使用实验室规模的食品搅拌器上的打蛋器附件混合不锈钢碗的内含物分4步添加96.3g水。当添加所有水时，然后再搅拌溶液一小时。然后将充分混合的溶液的整体添加至玻璃圆底烧瓶中，然后在丙酮-干冰浴中手动旋转直至烧瓶内含物完全冷冻。然后将烧瓶转移至实验室规模的冷冻干燥器并且然后冷冻干燥以得到浅黄色的易压碎粉末。复合物CD7的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。
复合物CD8：
使用含有40.3重量％蜂胶固体的蜂胶的乙醇酊剂(不含蜡，由Manuka Health供应)制得含有约22质量％NZ蜂胶固体的蜂胶-β环糊精复合物。将10.06g浓蜂胶酊剂与12.81gα环糊精(由Sigma Chemicals供应)在不锈钢碗中用手分步混合。当已经将所有酊剂添加至环糊精中时，再混合所得糊状物半小时。然后通过使用实验室规模的食品加工器上的打蛋器附件混合不锈钢碗的内含物分4步添加98.4g水。当添加所有水时，然后再搅拌溶液一小时。然后将充分混合的溶液的整体添加至玻璃圆底烧瓶中，然后在丙酮-干冰浴中手动旋转直至烧瓶内含物完全冷冻。然后将烧瓶转移至实验室规模的冷冻干燥器并且然后冷冻干燥以得到浅黄色的易压碎粉末。复合物CD8的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。
复合物CD9：
使用含有40.0重量％蜂胶固体的蜂胶的丙二醇溶液(不含蜡，由Polenectar,Brazil供应)制得含有约20质量％巴西绿蜂胶固体的蜂胶-γ环糊精复合物。在实验室规模的食品加工器的不锈钢碗中将8.13gγ环糊精(CAVAMAX W8，由Wacker AG供应)溶解于60.0g水中。当环糊精完全溶解时，在搅拌下使用实验室规模的食品加工器上的打蛋器附件将6.35g巴西绿蜂胶的丙二醇溶液逐滴添加至溶液中。当添加所有蜂胶溶液时，然后再搅拌溶液半小时。然后将充分混合的溶液的整体添加至玻璃圆底烧瓶中，然后在丙酮-干冰浴中手动旋转直至烧瓶内含物完全冷冻。然后将烧瓶转移至实验室规模的冷冻干燥器并且然后冷冻干燥以得到浅绿色的易压碎粉末。复合物CD9的类黄酮和羟基肉桂酸含量示于表2中。
表2：环糊精复合物的CAPE和类黄酮组成(毫克/克复合物)
Figure GDA0003102884580000381
Figure GDA0003102884580000391
实施例2
这个实施例描述了本发明组合物的抗结肠癌功效的评估。使用增殖试验在结肠癌腺癌细胞系DLD-1中进行这项研究。
材料和方法
如通过MTT试验所评估，评估下表3中所示的测试样品调节人类结肠直肠腺癌细胞(DLD-1)的生存力和增殖的能力。在研究中除了未补充的细胞对照(阴性对照)之外，还包括阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)。将所有样品标准化至200μg/ml总固含量。
因此，使DLD-1结肠癌细胞暴露于：
·最初含有25质量％固体蜂胶，然后在测试溶液中稀释以得到200μg/ml总固含量的酊剂。这种酊剂用于制造环糊精包封的蜂胶样品
·环糊精蜂胶(γ-环糊精包封的25％蜂胶酊剂)，来自实施例1中的表2的CD1
·环糊精蜂胶+CAPE(γ-环糊精包封的25％蜂胶酊剂，其中添加CAPE以使CAPE的浓度相对于酊剂加倍)，来自实施例1中的表2的CD2
·单独的γ-环糊精(CAVAMAX W8 foodγ环糊精)
·作为阳性对照的7.50ng/ml 5-氟尿嘧啶
对每份重量的样品分析所有环糊精包封的样品和单独的γ-环糊精，并且因此至多含有50μg/ml总固含量作为蜂胶。
表3：测试样品
Figure GDA0003102884580000392
测试材料和测试方法的描述
使人类结肠直肠腺癌上皮细胞系从冷冻储存中复活，并且在测试和参考样品存在下培养。细胞的培养条件是由细胞供应者(ATCC)所描述的那些。然后对培养物进行MTT试验以确定样品对细胞增殖的影响。
方法是基于以下所报导的程序：
Smolka,AJ,Goldenring,JR,Gupta,S以及Charles E Hammond,CE.由吡咯里嗪衍生物ML 3000抑制胃H,K-ATPase活性和胃上皮细胞IL-8分泌(Inhibition of gastric H,K-ATPase activity and gastric epithelial cell IL-8 secretion by thepyrrolizine derivative ML 3000).(2004).BMC Gastroenterology.4:4。
Chailler,P和Menard,D(2005).展现屏障功能、祖细胞以及前酶原性特征的人类胃上皮(HGE)细胞系的建立(Establishment of Human Gastric Epithelial(HGE)CellLines Exhibiting Barrier Function,Progenitor,and PrezymogenicCharacteristics).Journal of Cellular Physiology 202:263-274。
Trainer,D.L.,Kline,T.,McCabe,F.L.,Faucette,L.F.,Field,J.,Chaikin,M.,Anzano,M.,Rieman,D.,Hoffstein,S.,Li,D-J.,Gennaro,D.,Buscarino,C.,Lynch,M.,Poste,G.以及Greig,R.(1988).人类结肠直肠癌细胞系中的生物表征和癌基因表达(Biological characterization and oncogene expression in human colorectalcarcinoma cells lines).International Journal of Cancer 41:287-296。
样品制备
将测试项目以下表中所给出的浓度溶解于15％乙醇(ETOH)/汉克斯平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution，HBSS)中。
表4：这个方案中所用的测试样品的浓度
Figure GDA0003102884580000401
50倍稀释样品#4以得到2mg/mL固含量的工作储备溶液。
样品#2、#3以及#5是粉末。通过称重2mg并且溶解于1ml 15％ETOH/HBSS中来制备工作储备溶液。
实验程序
测试系统的表征
1.人类结肠直肠腺癌细胞(ATCC CCl-221，DLD-1)。
2.青霉素-链霉素溶液：含10000单位/毫升青霉素、10mg/ml链霉素的0.9％NaCl(Sigma目录号P-0781)。储存于-20℃下。
3.DMEM培养基(Invitrogen目录号12100-046)。储存于-20℃下。
4.胰蛋白酶-EDTA溶液：0.25％胰蛋白酶/EDTA，Invitrogen目录号15400054(×10，于储备液中)。
5.磷酸盐缓冲盐水(PBS)(由TBL制备)。
6.汉克斯平衡盐溶液(HBSS)(GIBCO目录号14185-052)。储存于4℃下。
7.胎牛血清(GIBCO目录号10091-148)。储存于-20℃下。
8.MTT试剂：100mg/小瓶(SIGMA目录号M-2128)，以10mg/ml溶解于PBS中并且储存于-20℃下。在PBS中制备5mg/ml MTT溶液并且储存于4℃下作为工作溶液。
9.MTT裂解缓冲液：10％十二烷基硫酸钠(SDS)/45％二甲基甲酰胺(将20g SDS溶解于100ml双蒸馏水(DDW)中，并且将90ml二甲基甲酰胺添加至SDS溶液中)。用冰醋酸将pH调整至4.7，并且添加DDW直至200ml的最终体积。
10. 5-氟尿嘧啶(5-FU)(Sigma目录号F-6627)。以150ng/ml和75ng/ml制备两种工作溶液，溶解于15％乙醇/HBSS中。最终浓度为7.50ng/ml和3.75ng/ml。
培养基制备
用于繁殖结肠直肠腺癌(DLD-1)细胞的培养基是补充有青霉素-链霉素溶液(10毫升/升)的DMEM。在即将使用之前添加FBS以得到10％w/v。
细胞培养
1.使获自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection USA)的人类结肠直肠腺癌细胞(DLD-1)从冷冻储存中复活。
2.在使用上文所描述的培养基(参看培养基制备)进行初始繁殖之后，如下使用胰蛋白酶-EDTA对培养物进行次培养。去除培养基并且添加5ml胰蛋白酶-EDTA溶液，并且在37℃下孵育5分钟或直至所有细胞都已经脱落。通过添加等体积的DMEM培养基来中和胰蛋白酶，并且在4℃下使培养物以300g(1200rpm)离心5分钟。
3.倾析上清液，并且使细胞团块再悬浮于培养基DMEM、FBS(10％)、青霉素(100单位/毫升)、链霉素(100μg/ml)中。在37℃下于5％CO2/95％空气中培养细胞。
4.在达到汇合之后，如上文2中所描述使用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱落并且离心。
5.弃去上清液，并且如上文3中所描述以7.5×104个细胞/毫升使细胞再悬浮于DMEM和补充物中。需要23ml总体积的细胞悬浮液。
6.如下文的板布局中所指示，向96孔板的每个孔中添加180μl细胞(13,550个细胞/孔)或培养基。将板在5％CO2/95％空气中于37℃下孵育8小时，这足以允许细胞强有力地附着。
7.如上文的图表中所指示，向每个孔中添加20μl测试样品或阳性对照中的每一者。向标记为‘培养基’或‘仅细胞’的孔中添加20μl 15％ETOH/HBSS。以6个重复测定来评估每个样品，而以9个重复测定(组合的三重测定)来评估所有三个板上的对照。
8.每个孔中的总体积为200μl。
9.将板在37℃下于5％CO2/95％空气中孵育19小时。
细胞增殖试验
1.在孵育完成时，将20μl MTT工作溶液(5mg/ml)添加至所有孔中，并且在37℃下于5％CO2/95％空气中孵育2小时。
2.然后添加100μl MTT裂解缓冲液，并且将板在37℃下在振荡器上于5％CO2/95％空气中孵育3小时，继而移液以破碎并溶解晶体直至完全溶解。使板以1200rpm离心10分钟以使任何剩余的不可溶物质成团。将200μl等分试样从每个孔转移至新的96孔板中。在570nm下用VersaMax微板读取器读取板。
3.结果表示为与仅细胞对照相比在样品存在下培养的细胞的增殖百分比。从所有孔扣除作为背景读数的空白读数。
结果和讨论
对照和测试样品对细胞增殖的影响的汇总呈现于表5和图1中。
表5：测试样品对DLD-1细胞增殖的影响
Figure GDA0003102884580000431
NS＝不显著。
在储备细胞培养物的生长期间所观测到的细胞的相对快速增殖速率允许细胞与测试样品的孵育时间缩减至8小时。如在与MTT反应之后对照培养物的色彩强度(平均OD570nm＝0.7047)所评估，这证实相当令人满意。以六个重复测定分析每个样品。在六个样品内存在良好的一致性，使得所有重复测定的SEM在预期限度内并且所有六个都用于计算平均吸光度值。对于对照(阴性与阳性)，九个重复测定是充分一致的以用于统计学评价。
CD1环糊精蜂胶复合物
200μg/ml环糊精蜂胶复合物是结肠癌细胞增殖的统计上显著的抑制剂。其使增殖减少23.9％。
CD2环糊精蜂胶+CAPE
200μg/ml制剂环糊精蜂胶+CAPE作为细胞生长的抑制剂也是统计上显著的。其使增殖减少28.2％。
25％蜂胶酊剂
200μg/ml浓度的25％蜂胶酊剂是结肠癌生长的统计上显著的抑制剂。其使增殖减少24.9％。
CAVAMAX W8 Foodγ-环糊精
在200μg/ml下，CAVAMAX W8 Foodγ-环糊精对细胞增殖产生不显著的影响，仅减少9.1％。
在这项研究中，7.5ng/ml 5-氟尿嘧啶对生长产生不显著的6.7％抑制。这是意想不到的。基于先前的研究，预期在这种浓度下，将记录统计上显著的减少。
以等效质量为基础对测试材料进行上文所描述的试验。因此，对于测试材料的最终浓度为200μg/mL的原生蜂胶酊剂，整个200μg包含蜂胶固体。环糊精复合物至多含有25％蜂胶，并且因此200μg中仅50μg包含蜂胶。如图1中清楚可见并且如上文所观测，观测到原生蜂胶(酊剂除外)和蜂胶/γ-环糊精组合物的大致相同活性。因此，这个数据表明，本发明的蜂胶/γ-环糊精组合物的这个实施例与原生蜂胶相比在这个试验中展现约四倍的活性，这是因为复合物中蜂胶固体的含量仅为50μg/mL(参看图1B)。
下表6和图1B示出了每个含蜂胶样品的功效％，其中功效％＝抑制％/样品中蜂胶的浓度。
表6.测试样品的功效
样品 抑制％ [有效蜂胶] 功效
蜂胶/CD复合物 23.9 50 47.8
蜂胶/CD+CAPE复合物 28.2 50 56.4
蜂胶酊剂 24.9 200 12.45
CD 9.1 0 -
本申请者还注意到，使存在于环糊精复合物中的CAPE的量加倍仅略微增加生物活性，这表明在这种浓度下的CAPE对增殖没有很大影响。
这些数据支持了本发明组合物与蜂胶相比的增强功效。在不希望受任何理论约束的情况下，本申请者提出这可能归因于由蜂胶和环糊精组合物展现的对结肠直肠细胞增殖的意想不到的协同作用。
实施例3
这个实施例示出了环糊精包封的蜂胶与CAPE、白杨素以及高良姜素的纯标准相比的有效性。针对实施例2中所用的相同的人类结肠直肠腺癌细胞系DLD-1测试所有样品。
材料和方法
测试方法和实验程序与实施例2中所用的那些相同。CAPE、高良姜素以及白杨素标准以高于99％的纯度获自Sigma-Aldrich。CAPE、白杨素以及高良姜素浓度在表7中给出。
表7：CAPE、白杨素以及高良姜素的测试浓度
Figure GDA0003102884580000451
除非表8中有指定，在200μg/ml的孔浓度下测试以下样品。
结果和讨论
表8：环糊精复合物和纯化合物对DLD-1细胞增殖的影响
Figure GDA0003102884580000452
Figure GDA0003102884580000461
如表8中所示，CAPE、白杨素以及高良姜素标准在200μg/ml的浓度下全部是DLD-1增殖的统计上显著的抑制剂。当这些化合物以低得多的浓度存在于环糊精复合物中时，增殖也是显著的。相对抑制(抑制％与浓度的比率)对比测试物质浓度示于图2中。
结果显示，含有这三种化合物的蜂胶包封于环糊精中大大增加其活性。
实施例4
这个实施例展示了本发明的组合物环糊精包封的蜂胶诱导人类结肠直肠癌细胞系HCT-116的凋亡，以及加强丁酸盐在这种人类结肠直肠癌细胞和对丁酸盐具抗性的癌细胞系HCT-116R中的凋亡作用的能力。丁酸是由肠菌群通过可溶性纤维的消化而产生。
材料和方法
细胞培养物和化学品
人类结肠直肠细胞系HCT-116获自美国菌种保藏中心(Rockville,MD)。如先前在Bordonaro M,Lazarova DL,Sartorelli AC.由Wnt信号传导活化β-连环蛋白介导组蛋白脱乙酰酶抑制剂的作用(The activation of beta-catenin by Wnt signaling mediatesthe effects of histone deacetylase inhibitors).Exp Cell Res.2007；313:1652-66(包括其中的参考文献)中所描述，丁酸盐抗性细胞系是从HCT-116通过在渐增浓度的丁酸盐中培养亲本细胞而得到。
使结肠直肠细胞在具有10％胎牛血清和抗生素的α-MEM培养基中生长。蜂胶-环糊精复合物CD1中CAPE的浓度为1.79μg/100μg包封于环糊精中的蜂胶固体，或0.41μg/100μg环糊精复合物。在二甲亚砜中制备储备溶液，丁酸盐除外，其以1M浓度溶解于水中。
凋亡试验
在处理之前二十四小时，将结肠癌细胞以每孔100,000-120,000涂于24孔板中。将仅细胞的阴性对照与暴露于5mM丁酸盐的阳性对照、1.2μg/ml CAPE、5mM丁酸盐+1,2μg/mlCAPE、100μg/ml蜂胶-环糊精、或5mM丁酸盐+100μg/ml蜂胶-环糊精持续50小时的细胞相比较。收集所有细胞(浮动和附着的)并且使用PE膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I(BDBiosciences,#559763)针对凋亡和坏死标志进行染色。使用FACS Aria II和DiVa软件进行流式细胞术分析。凋亡百分比是凋亡细胞的数目除以所有分析细胞的数目并且乘以100。
统计学
所有数据呈现为来自至少三组独立实验的平均值±标准偏差。使用司徒登T检验(Student T-test)分析来确定统计差异的显著性。在P<0.05时，差异被视为显著的。
结果
丁酸盐对结肠癌细胞的凋亡作用由CAPE和蜂胶不同程度地加强。
利用HCT-116和HCT-R细胞来比较丁酸盐、CAPE和蜂胶-环糊精复合物以及丁酸盐与CAPE或蜂胶环糊精的组合的凋亡作用。在针对阴性对照标准化之后结果示于表9和图3中。
表9：纯化合物、蜂胶γ环糊精复合物CD1以及其与丁酸盐的混合物对HCT-116和HCT-116R细胞凋亡的作用
Figure GDA0003102884580000471
暴露于CAPE的HCT-116细胞相对于阴性对照的凋亡没有显著增加。尽管蜂胶-环糊精复合物仅具有约1/4的CAPE，但暴露于蜂胶-环糊精复合物CD1的HCT-116细胞相比阴性对照经历约8％的显著水平的凋亡(参看图3)。HCT-116细胞的丁酸盐处理相对于仅细胞引起35％凋亡。CAPE或蜂胶-环糊精与丁酸盐的组合增加丁酸盐所达成的HCT-116细胞的凋亡。CAPE与丁酸盐的组合相对于仅细胞引起52％凋亡(与单独的丁酸盐相比，P<0.05)。尽管仅具有1/4的CAPE，但蜂胶-环糊精与丁酸盐的组合相对于仅细胞引起58％凋亡(与单独的丁酸盐相比，P<0.05)。当用单独的丁酸盐(如预期)或单独的CAPE测试时，HCT-R细胞并不经历显著凋亡；然而，暴露于蜂胶-环糊精复合物相对于11％的阴性对照引起显著更高水平的凋亡，P<0.05。CAPE或蜂胶-环糊精与丁酸盐的组合使HCT-R细胞对丁酸盐的凋亡作用重新敏感。CAPE与丁酸盐的组合相对于对照引起12％凋亡(与单独的丁酸盐相比，P<0.05)。蜂胶-环糊精复合物与丁酸盐的组合相对于对照使凋亡进一步增至33％(与单独的丁酸盐相比，P<0.05)。
讨论
这个实施例显示，单独测试的咖啡酸苯乙酯(CAPE)和含有1/4量的CAPE的蜂胶-环糊精复合物对人类结肠癌细胞的凋亡发挥差别作用。蜂胶-环糊精组合物以比CAPE大得多的程度增加暴露于丁酸盐的结肠癌细胞的凋亡，CAPE在所用浓度下本身是无效的。此外，蜂胶-环糊精复合物在使丁酸盐抗性HCT-R细胞对丁酸盐诱导的凋亡重新敏感方面比CAPE更强效。
预期含有可由肠菌群消化的可溶性纤维的膳食将原位产生丁酸盐，并且结肠癌细胞可以对以这样的方式产生或通过其它方式施用的丁酸盐因长期暴露而变成抗性。这个实施例展示了在不存在与存在第二凋亡剂的情况下本发明的组合物调节原生与丁酸盐抗性结肠直肠癌细胞的凋亡的功效；并且本发明的组合物可以逆转结肠直肠细胞对由这类药剂诱导的凋亡的抗性。这些结果支持了本发明的组合物治疗和预防消化道癌的功效。
实施例5
这个实施例展示了本发明的组合物γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶抑制人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的能力。下文示出了用于实施例5至8的一般方法。
用于消化道癌抗增殖试验的材料和方法
如通过MTT试验所评估，评估如实施例1中所制备的样品CD5γ-环糊精调节人类结肠直肠腺癌细胞(DLD-1)、人类结肠癌细胞系(HCT-116)、人类胃癌细胞系(NCI-N87)以及人类食管鳞状细胞癌细胞系(KYSE-30)的生存力和增殖的能力。在研究中除了未补充的细胞对照作为阴性对照之外，还包括三种浓度的阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)。[我们包括用于比较的测试化合物吗？]
测试材料和测试方法的描述
使四种人类消化道癌细胞系从冷冻储存中复活并且在测试和参考样品存在下培养。然后对培养物进行MTT试验以确定样品对细胞生存力和增殖的影响。
方法是基于上述实施例2中所概述的程序。
样品制备
将测试样品和实施例5至8中的所有其它测试样品溶解于15％乙醇/汉克斯平衡盐溶液(ETOH)/HBSS中达到2mg/mL固含量的浓度。在试验中，样品的最终浓度为200μg/ml并且最终EtOH浓度为1.5％。
实验程序
测试系统的表征
1.人类结肠直肠腺癌细胞(ATCC CCl-221,DLD-1)(ATCC,Bethesda,MD,USA)
2.人类胃癌细胞(ATCC CRL-5822,NCI-N87)(ATCC,Bethesda,MD,USA)
3.人类食管鳞状细胞癌(ECACC,KYSE-30)(Sigma Aldrich,Auckland,NZ)
4.人类结肠癌细胞(ECACC HCT-116)(Sigma Aldrich,Auckland,NZ)
5.青霉素-链霉素溶液：含10000单位/毫升青霉素、10mg/ml链霉素的0.9％NaCl(Sigma目录号P-0781)。储存于-20℃下。
6.对于DLD-1细胞：DMEM培养基(Invitrogen目录号12100-046)。储存于4℃下。
7.对于NCI-N87细胞：经过修改以含有2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、4500mg/L葡萄糖以及1500mg/L碳酸氢钠的RPMI-1640培养基(Sigma R6504)。储存于4℃下。
8.对于KYSE-410细胞：经过修改以含有2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基(Sigma R6504)。储存于4℃下。
9.对于HCT-116细胞：经过修改以含有2mM L-谷氨酰胺的麦考伊氏5A培养基(McCoy's 5A medium)(Sigma M48792)。储存于4℃下。
10.胰蛋白酶-EDTA溶液：0.25％胰蛋白酶/EDTA，Invitrogen目录号15400054(×10，于储备液中)。
11.磷酸盐缓冲盐水(PBS)(由TBL制备)。
12.汉克斯平衡盐溶液(HBSS)(GIBCO目录号14185-052)。储存于4℃下。
13.胎牛血清(GIBCO目录号10091-148)。储存于-20℃下。
14.MTT试剂：100mg/小瓶(SIGMA目录号M-2128)，以10mg/mL溶解于PBS中并且储存于-20℃下。将在PBS中制备5mg/ml MTT溶液并且储存于4℃下作为工作溶液。
15.MTT裂解缓冲液：10％十二烷基硫酸钠(SDS)/45％二甲基甲酰胺(将20g SDS溶解于100mL双蒸馏水(DDW)中，并且将90mL二甲基甲酰胺添加至SDS溶液中)。用冰醋酸将pH调整至4.7，并且添加DDW直至200mL的最终体积。
16. 5-氟尿嘧啶(5-FU)(Sigma目录号F-6627)。将以19.5μg/ml、6.5μg/ml以及1.95μg/ml制备三种工作溶液，溶解于15％乙醇/HBSS中。最终浓度将为1.95μg/ml(15μM)、0.65μg/ml(5μM)以及0.195μg/ml(1.5μM)。
培养基制备
上文给出了用于繁殖细胞系中的每一者的培养基。每种培养基是遵循ATCC/ECACC说明书来制备并且补充有青霉素-链霉素溶液(10毫升/升)。在即将使用之前添加FBS(以10％)。
细胞培养
1.使获自美国菌种保藏中心或欧洲细胞培养中心(European Collection ofCell Cultures)的细胞系中的每一者从冷冻储存中复活。
2.在使用上文所描述的培养基(参看测试系统的表征和培养基制备)进行初始繁殖之后，使用胰蛋白酶-EDTA对培养物进行次培养。去除培养基并且添加5mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并且在37℃下孵育5分钟或直至所有细胞都已经脱落。通过添加等体积的相关培养基来中和胰蛋白酶，并且在4℃下使悬浮液以300g(1200rpm)离心5分钟。
3.倾析上清液，并且使细胞团块再悬浮于含有FBS(10％)、青霉素(100单位/毫升)、链霉素(100μg/ml)的相关培养基中。
4.在达到汇合之后，如上文2中所描述使用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱落并且离心。
5.弃去上清液，并且如上文3中所描述以1.0×104个细胞/毫升使细胞再悬浮于相关培养基和补充物中。需要约54ml总体积的每种细胞悬浮液。
6.如预定的板布局中所指示，向六个96孔板的每个孔中添加180μl细胞(1,800个细胞/孔)或培养基。将板在5％CO2/95％空气中于37℃下孵育约48小时以允许细胞附着。
7.如板布局所指示，向每个孔中添加20μl测试化合物或5-FU中的每一者。对于标记为‘培养基’或‘仅细胞’的阴性对照孔，添加20μl 15％ETOH/HBSS。以3或6个重复测定来评估每个样品或对照。
8.每个孔中的总体积为200μl。
9.将板在37℃下于5％CO2/95％空气中孵育24小时。
细胞增殖试验
1.在孵育完成时，将20μl MTT工作溶液(5mg/mL)添加至所有孔中，并且在37℃下于5％CO2/95％空气中孵育3-4小时。每隔30-60分钟监测板并且如果极少细胞显示晶体的存在，那么如下文步骤2中添加裂解缓冲液。
2.然后添加100μl MTT裂解缓冲液，并且将板在37℃下于5％CO2/95％空气中孵育过夜。使板以1200rpm离心10分钟以使任何剩余的不可溶物质成团。将200μl从每个孔转移至新的96孔板中。然后在550nm下用VersaMax微板读取器读取板。
3.从所有孔扣除作为背景读数的空白读数。结果表示为与仅细胞对照相比在样品存在下培养的细胞的增殖百分比。
4.使用VersaMax 96孔板读取器以比色法(在550nm下)评估细胞的增殖。
5.评估平均值的标准误差百分比并且如果SEM％>15，那么将去除极端界外值。将用独立的司徒登t检验(Student t-test)在α≤0.05下(存在和不存在界外值下)评估初步统计显著性。
关于测试方法的观测
在各种测试制剂和5-FU存在下进行几种癌细胞的培养持续48小时，届时在24小时后DLD-1和NCI-N87的阴性对照的细胞密度的目视观测表明生长并不如预期一样快。为了一致，将其它培养物的时间设定为相同的。
研究计划要求如果平均值的标准误差(SEM)百分比大于15％，那么从计算中删除重复测定当中的界外值。当样品是强拮抗剂时，吸光度值很小。因此，在这些当中的小变化意指当与较小抑制性样品相比较时，用百分比表示的从平均值的变异相对较大。这使得发生几乎完全抑制的一些界外值从分析中去除。
结果
CD5γ-环糊精的细胞增殖试验的结果示于表10中，连同三种浓度的阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)，和阴性对照(仅细胞与培养基并且没有测试化合物或阳性对照)的结果一起。在表中，OD是在570nm下测量的光密度；SEM是与所测量的平均光密度值相关的标准误差；p是测量经由司徒登t检验是统计上显著的概率值，此处被视为<0.05；刺激％是与阴性对照(测试化合物无活性)相比增殖的刺激百分比；抑制％是与阴性对照相比增殖的减少百分比，其中大数字指示测试化合物具有抗癌增殖潜力。
表10.CD5γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶对4种消化道细胞系的抗增殖活性
Figure GDA0003102884580000521
Figure GDA0003102884580000531
讨论
CD5γ-环糊精对四种细胞系中的三种具高度活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制73.0％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制79.3％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制32.7％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制70.5％。
抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶(5-FU)所达成的抑制程度，并且对于NCI-N87确实是优良的。结果展示，γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶对消化道癌具有广谱抗增殖活性。结果还确认了对实施例2至4中所展示的人类结肠腺癌细胞系DLD-1的抗癌活性以及对实施例4中所展示的人类结肠癌细胞系HCT-116的抗癌活性。
实施例6
这个实施例展示了本发明的组合物α-环糊精包封的欧洲型蜂胶抑制人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的能力。使用DLD-1、HCT-116、NCI-N87、KYSE-30的增殖试验进行这项研究。
按照实施例1制造试验中所用的200μg/ml浓度的α-环糊精包封的欧洲型蜂胶，测试物质CD6具有表2中所给出的组成。在实施例5中详细给出的相同测试程序也用于实施例6。
结果
α-环糊精包封的欧洲型蜂胶的抗增殖试验的结果示于表11中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例5相同并且因此不包括于表中。
表11.CD6α-环糊精包封的欧洲型蜂胶对4种消化道细胞系的抗增殖活性
细胞类型 平均OD(570nm) SEM P值(<0.05) 刺激％ 抑制％
DLD-1 0.158 0.0069 1.80E-09 0 61.67
HCT-116 0.2147 0.0157 9.30E-06 0 57.78
NCI-N87 0.3329 0.0068 1.80E-03 0 24.62
KYSE-30 0.3088 0.0071 1.90E-07 0 48.67
讨论
CD6α-环糊精对四种细胞系中的两种具中等活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制61.7％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制57.8％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制24.6％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制48.7％。
抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶(5-FU)所达成的抑制程度。结果展示，α-环糊精包封的欧洲型蜂胶对消化道癌具有广谱抗增殖活性，但活性低于γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶。
实施例7
这个实施例展示了本发明的组合物β-环糊精包封的欧洲型蜂胶抑制人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的能力。使用DLD-1、HCT-116、NCI-N87以及KYSE-30的增殖试验进行这项研究。
按照实施例1制造试验中所用的200μg/ml浓度的β-环糊精包封的欧洲型蜂胶，测试物质CD7具有表2中所给出的组成。在实施例5中详细给出的相同测试程序也用于实施例7。
结果
α-环糊精包封的欧洲型蜂胶的抗增殖试验的结果示于表12中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例5相同并且因此不包括于表中。
表12.CD7β-环糊精包封的欧洲型蜂胶对4种消化道细胞系的抗增殖活性
细胞类型 平均OD(570nm) SEM P值(<0.05) 刺激％ 抑制％
DLD-1 0.1547 0.005 7.40E-10 0 62.48
HCT-116 0.2563 0.0201 5.60E-05 0 49.6
NCI-N87 0.3451 0.0062 3.70E-03 0 21.85
KYSE-30 0.3438 0.003 4.40E-07 0 42.87
讨论
CD7β-环糊精对四种细胞系中的两种具中等活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制62.5％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制49.6％、人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖抑制21.8％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制42.9％。抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶(5-FU)所达成的抑制程度。
结果展示，β-环糊精包封的欧洲型蜂胶对消化道癌具有广谱抗增殖活性，但活性低于γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶。
实施例8
这个实施例展示了本发明的组合物γ-环糊精包封的巴西型蜂胶抑制人类结肠癌腺癌细胞系DLD-1、人类结肠癌细胞系HCT-116、人类胃癌细胞系NCI-N87以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的能力。使用DLD-1、HCT-116、NCI-N87以及KYSE-30的增殖试验进行这项研究。
按照实施例1制造试验中所用的200μg/ml浓度的γ-环糊精包封的巴西型蜂胶，测试物质CD8。在实施例5中详细给出的相同测试程序也用于实施例8。
结果
γ-环糊精包封的巴西绿型蜂胶的抗增殖试验的结果示于表13中。仅细胞(阴性对照)和5-FU阳性对照的结果与实施例5相同并且因此不包括于表中。
表13.CD8γ-环糊精包封的巴西绿型蜂胶对4种消化道细胞系的抗增殖活性
细胞类型 平均OD(570nm) SEM P值(<0.05) 刺激％ 抑制％
DLD-1 0.3347 0.0128 8.50E-05 0 18.82
HCT-116 0.3847 0.02 8.40E-03 0 24.34
NCI-N87 0.4566 0.0132 >0.05 3.39 0
KYSE-30 0.4733 0.012 4.80E-04 0 21.35
讨论
CD8γ-环糊精对四种细胞系中的三种具中等至弱活性，使得人类结肠腺癌细胞系DLD-1的增殖抑制18.8％、人类结肠癌细胞系HCT-116的增殖抑制24.3％以及人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖抑制21.3％。人类胃癌细胞系NCI-N87的增殖受到3.4％的刺激，但这种刺激不是显著的。
除了对NCI-N87没有观察到作用以外，抑制程度类似于使用已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶(5-FU)所达成的抑制程度。结果展示，γ-环糊精包封的巴西绿型蜂胶对消化道癌具有相对广谱的抗增殖活性，但活性比γ-环糊精包封的欧洲型蜂胶低得多。
实施例9
这个实施例提供了欧洲型NZ环糊精包封的蜂胶CD8与巴西绿环糊精包封的蜂胶CD9的抗食管癌活性的比较评估；以及亲本NZ蜂胶干固体与巴西绿蜂胶固体以及与单独的γ-环糊精的比较评估。使用人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖试验，使用实施例5中所概述的一般方法进行这项研究。NZ蜂胶与在实施例1中制造复合物CD8所用的相同。巴西绿蜂胶与在实施例1中制造复合物CD9所用的相同。NZ蜂胶含有5.81mg/gCAPE、20.92mg/g短叶松素、43.84mg/g短叶松素3乙酸酯、85.17mg/g松属素、27.60mg/g白杨素以及39.74mg/g高良姜素。巴西蜂胶含有8.36mg/g阿特匹林c、0.26mg/g咖啡酸以及4.31mg/g对香豆酸。
结果
对于所测试的化合物和蜂胶酊剂样品的KYSE-30细胞增殖试验的结果示于表14中，连同三种浓度的阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)，和阴性对照(仅细胞与培养基并且没有测试化合物或阳性对照)的结果一起。在表中，n是重复测定的数目；OD是在570nm下测量的光密度；SEM是与所测量的平均光密度值相关的标准误差；p是测量经由司徒登t检验是统计上显著的概率值，此处被视为<0.05(NS＝不显著)；抑制％是与阴性对照相比增殖的减少百分比，其中大数字指示测试化合物具有抗癌增殖潜力。
表14.环糊精包封的蜂胶CD8和CD9以及蜂胶干固体对食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的抗增殖活性
Figure GDA0003102884580000571
讨论
这个实施例显示，尽管仅含有约1/4的蜂胶干固体，但γ-环糊精包封的NZ蜂胶比亲本NZ蜂胶干固体(增殖抑制29.7％)更具活性(增殖抑制31.2％)。在最高测试浓度下活性类似于已知的抗癌剂5-氟尿嘧啶(5-FU)。结果极其类似于在实施例2中由γ-环糊精包封的NZ蜂胶和NZ蜂胶干固体对结肠癌细胞系DLD-1的增殖的抑制所发现的结果。单独的γ环糊精使增殖抑制8.8％。
这些数据支持了本发明组合物与蜂胶相比对于抗消化道癌的增强功效。在不希望受任何理论约束的情况下，本申请者提出这可能归因于由NZ蜂胶和环糊精组合物展现的对消化道癌细胞增殖的意想不到的协同作用。相比之下，巴西绿γ-环糊精蜂胶复合物具有与等效量的巴西绿蜂胶干固体大约相同水平的活性，并且对人类食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-30的增殖的活性仅稍高于γ环糊精本身。这些数据还显示，对于这种细胞系，欧洲型蜂胶是用于被环糊精包封的蜂胶的优选类型。
工业适用性
含有蜂胶或其提取物或级分和环糊精的本发明的抗消化道癌组合物可以用于包括食品和饮料、医疗装置、医疗用品、功能食品以及医药品的消费品中。使用这类组合物，例如治疗消化道癌和其症状的方法在医学领域中具有应用。

Claims (34)

1.一种蜂胶和环糊精的用途，其用于制造供以下使用的组合物：在受试者中抑制消化道肿瘤形成、抑制消化道肿瘤生长、抑制消化道肿瘤转移或者治疗或预防消化道癌；诱导受试者中的一种或多种赘生性消化道细胞的凋亡；增加受试者对消化道癌疗法的反应性；增加受试者中的消化道肿瘤对消化道癌疗法的敏感性；使受试者中对治疗具有抗性的一种或多种消化道癌细胞重新敏感；至少部分逆转罹患消化道癌的受试者中的赘生性细胞对消化道癌疗法的抗性；完全或部分逆转负荷消化道癌的患者对消化道癌疗法的抗性；或使负荷消化道癌的患者的一种或多种肿瘤对使用消化道癌疗法的治疗重新敏感，所述一种或多种肿瘤对所述使用消化道癌疗法的治疗具有抗性或者出现抗性或者所述一种或多种肿瘤被预测为对使用所述消化道癌疗法的治疗具有抗性或者出现抗性；其中
(a)所述蜂胶被完全包封于所述环糊精内，
(b)所述环糊精是γ-环糊精或化学改性的γ-环糊精，
(c)所述组合物具有1至5mg/g的咖啡酸苯基醚酯(CAPE)浓度且具有大于10mg/g的松属素浓度，以及
(d)所述消化道肿瘤是胃肿瘤或咽喉肿瘤且所述消化道癌是胃癌或咽喉癌。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含至少一种额外治疗剂。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述蜂胶是蜂胶提取物或级分。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述蜂胶提取物或级分是富含一种或多种多酚的蜂胶提取物或级分。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述蜂胶不含蜡。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述蜂胶是欧洲或杨树蜂胶。
7.如权利要求1或权利要求3所述的用途，其中所述组合物包含1.0wt％至50wt％蜂胶。
8.如权利要求1所述的用途，其中所述蜂胶是蜂胶树脂。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述组合物包含1.0wt％至50wt％蜂胶树脂。
10.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物包含10wt％至50wt％蜂胶。
11.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物包含10wt％至40wt％蜂胶。
12.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物包含10wt％至30wt％蜂胶。
13.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物包含15wt％至25wt％蜂胶。
14.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物包含15wt％至30wt％蜂胶。
15.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物包含15wt％至40wt％蜂胶。
16.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物包含15wt％至50wt％蜂胶。
17.如权利要求7所述的用途，其中所述组合物包含20wt％至30wt％蜂胶。
18.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含10wt％至50wt％蜂胶树脂。
19.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含10wt％至40wt％蜂胶树脂。
20.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含10wt％至30wt％蜂胶树脂。
21.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含15wt％至25wt％蜂胶树脂。
22.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含15wt％至30wt％蜂胶树脂。
23.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含15wt％至40wt％蜂胶树脂。
24.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含15wt％至50wt％蜂胶树脂。
25.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含20wt％至30wt％蜂胶树脂。
26.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含25wt％蜂胶树脂。
27.如权利要求9所述的用途，其中所述组合物包含30wt％蜂胶树脂。
28.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物中蜂胶与环糊精的摩尔比不大于1:1。
29.如权利要求6所述的用途，其中所述欧洲蜂胶具有大于5mg/g的高良姜素浓度。
30.如权利要求6所述的用途，其中所述欧洲蜂胶具有大于3.5mg/g的白杨素浓度。
31.如权利要求6所述的用途，其中所述欧洲蜂胶具有大于5mg/g的高良姜素浓度且具有大于3.5mg/g的白杨素浓度。
32.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含咖啡酸苯基醚酯(CAPE)、咖啡酸、松属素、咖啡酸苯甲酯、白杨素、高良姜素以及短叶松素-3-乙酸酯中的三者或更多者。
33.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物是已经添加有CAPE、咖啡酸、松属素、咖啡酸苯甲酯、白杨素、高良姜素以及短叶松素-3-乙酸酯中的一者或多者的组合物。
34.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物具有
(a)大于1mg/g的高良姜素浓度；
(b)大于1mg/g的白杨素浓度；
(c)大于1mg/g的短叶松素-3-乙酸酯浓度；或
(d)上面(a)至(c)中任意两项或多项的组合。
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