JP7166965B2

JP7166965B2 - ｂＦＧＦ発現増強用組成物

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Publication number: JP7166965B2
Application number: JP2019045690A
Authority: JP
Inventors: 友美坂井; 知倫渡邉; 健史澤野
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2039-03-13
Also published as: JP2020147517A

Description

本発明は、ｂＦＧＦの発現増強作用を有する組成物に関する。

ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）は、線維芽細胞の増殖を著しく促進する蛋白質として見出された。その後、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて線維芽細胞の増殖を促進するのみならず、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、上皮細胞などの種々の細胞に対してもその増殖や遊走、分化に対する促進作用を有することが明らかにされてきた。また、ｉｎｖｉｖｏにおいても、強力な血管新生作用を有することが明らかになってきた。ｂＦＧＦはこのような薬理作用を持つことから、難治性皮膚潰瘍の治療剤として開発が進められ、臨床研究において優れた治療効果と安全性が確認され、現在、市販されている。また、ｂＦＧＦは骨組織に対しても有用な作用を示し、骨折治癒を促進することなどが知られている。

一方、近年ｂＦＧＦと視神経系細胞の関係が注目されている。
網膜において視神経細胞は、グリア細胞の一種である多数のミュラー細胞に包まれて存在しており、ミュラー細胞は、神経シナプスを包み込んで保護するとともに、ｂＦＧＦや脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）といった網膜中の細胞を保護する物質を産生する。そして、ｂＦＧＦは遺伝性網膜ジストロフィーにおける視細胞障害からの保護、光刺激からの視細胞の保護、網膜色素上皮細胞の貪食促進などの作用を発揮し、視細胞変性を抑制することがいわれている。眼に入った光の受容を主な機能とする視細胞を保護しその機能を維持することは、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識等の維持・向上に寄与する。また、視細胞の機能障害が発症要因となる加齢黄斑変性や網膜色素変性の予防にも効果が期待される。特許文献１には、網膜神経死の防止及び眼疾患の治療としてｂＦＧＦ又はＦＧＦ－５を投与することが記載されている。
しかしこの治療方法は、投与に当たって外科的な手術と併用しなければならないなど大きな問題がある。

特許文献２には、ミュラー細胞に作用する物質として、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド：Ｐｉｔｕｉｔａｒｙａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を投与して、網膜の主要なグリア細胞（神経膠細胞）であるミュラー細胞の内因性生理活性因子ＩＬ－６（インターロイキン－６）の産生を促進し、間接的に、視神経を形成する網膜神経節細胞（ＲＧＣ：ＲｅｔｉｎａｌＧａｎｇｌｉｏｎＣｅｌｌ）の細胞死を抑制、遅延させることができる治療剤が開示されている。

一方、フラボノールの一種であるガランギンは、プロポリス中から分離されている（特許文献３～４）。ガランギンには、抗炎症効果、活性酸素消去酵素の発現促進効果（特許文献５）、肝虚血再灌流障害の緩和効果、アルツハイマーの原因であるβアミロイドタンパク質前躯体（ＡＰＰ）のＢＡＣＥ阻害剤としての用途（特許文献６）などが知られている。
ガランギンの視覚系への作用としては、糖尿病網膜症における血液網膜関門の機能障害の緩和が報告されているが、ガランギンのミュラー細胞や視神経系への作用は知られていない。

国際公開第９９／４５９５２号特開２００６－３０６７７０号公報特開２００４－１５９５６３号公報特開２００４－１６１６６４号公報特開２００７－３２６７９９号公報国際公開第２０１３／１４２３７０号

本発明者らは、多数の天然物や化合物のミュラー細胞に対する作用を研究する過程で、網膜中のミュラー細胞に作用してｂＦＧＦの発現を促進する効果を有する物質を見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は、網膜中のミュラー細胞に作用し、ミュラー細胞のｂＦＧＦの発現を促進する組成物を提供することを課題とする。

本発明は、以下の構成からなる。
（１）ガランギンを有効成分として含有する、ｂＦＧＦの発現増強用組成物。
（２）ガランギンを有効成分として含有する、視覚機能改善用の組成物。

本発明により、ガランギンを有効成分とするミュラー細胞のｂＦＧＦの発現を促進する組成物が提供される。また本発明の組成物はミュラー細胞のｂＦＧＦの発現を促進するため、網膜における視細胞を保護し、その機能を維持することで、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識、視野、視力（特に夜間視力）等の維持・向上に寄与する。また、視細胞の機能障害が発症要因となる加齢黄斑変性や網膜色素変性の予防にも効果が期待される。さらに、網膜の複合的な機能の障害が要因となって起こるピント調節能の低下や、眼精疲労の症状の改善にも効果をもたらす可能性がある。このため視覚機能改善の目的で使用できる。またガランギンはプロポリス中に含有されており、長期間の摂取経験があり、安全性も高い。ガランギンあるいはガランギンを含有する組成物の経口摂取により、外科的手術よりも非侵襲的かつ安全性の高い方法で網膜中のｂＦＧＦを増加させることができる。

ガランギンがミュラー細胞のｂＦＧＦの発現を促進することを示すグラフである。

本発明について具体的に説明する。
なお、本発明でいう「組成物」とは、ガランギンを含有し、網膜中のミュラー細胞のｂＦＧＦの発現を促進するものをいう。「組成物」には食品、医薬品、健康食品、動物用飼料を包含する。
また本発明でいう視覚機能改善とは、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識、視野、視力（特に夜間視力）、ピント調節能の維持・向上、加齢黄斑変性や網膜色素変性、遺伝性網膜疾患の予防および症状緩和、眼精疲労の予防および改善をいう。

ガランギン（Ｇａｌａｎｇｉｎ）とは、２－フェニル－３，５，７－トリヒドロキシ－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（２－ｐｈｅｎｙｌ－３，５，７－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ－４Ｈ－１－ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ－４－ｏｎｅ）であり、プロポリスや薬用植物エキスに含まれる。ガランギンは下記の化学式１で表すことができる。

ガランギンは、前記のとおり、プロポリスに多く含有されているが、カレーの香辛料の一つとして使用されているガランガル（Ａｌｐｉｎｉａｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）の根茎に多く含まれている。本発明には、これらの物質から適宜公知の抽出方法を組み合わせて抽出した抽出物を用いることができる。また公知の有機化学合成法（ｄｅＳｏｕｚａＲＦ，ｅｔａｌ，．ＳｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍＡｃｔａＡＭｏｌＢｉｏｍｏｌＳｐｅｃｔｒｏｓｃ．２００５Ｊｕｌ；６１（９）：１９８５－９０．、ＳａｔｏＳ，ｅｔａｌ，．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ．２００６Ｊｕｎ１２；３４１（８）：９６４－７０．）により得ることができる。

さらに得られた合成物や抽出物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてガランギンの純度を高めてもよい。
上記合成や抽出により得られるガランギンは、医薬品上又は食品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば、粗精製物であってもよい。
具体的には、抽出としては、水、熱水、アルコール水等の水及び／又は有機溶剤等の極性及び非極性溶剤を用いて行うことが挙げられる。また、分離精製としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等を用いて行うことが挙げられる。

ガランギンは、網膜のミュラー細胞に作用し、ｂＦＧＦの発現を促進することができる。従って、ガランギンは、網膜内の視細胞に保護的に作用し、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識、視野、視力（特に夜間視力）、ピント調節能の維持・向上、加齢黄斑変性や網膜色素変性、遺伝性網膜疾患の予防および症状緩和、眼精疲労の予防および改善などの効果を示す。したがって当該症状若しくは疾患を予防、改善又は治療するための食品・飲料、化粧品、医薬部外品、医薬品等として使用可能である。そして、ガランギンは、これらの作用を示す飲食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品等として利用することができる。

ガランギンを食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。

また、ガランギンを含有する組成物をサプリメントや医薬品として使用する場合、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形成形剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。

ガランギンを含有する製剤は、一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。この場合、本発明に用いられるこれら植物又はその抽出物の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性基剤、鎮痛消炎剤、鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、ホルモン剤、ビタミン類、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。

本発明のガランギンを含有する組成物は、特に限定されるものではないが、好ましくはガランギンとして通常全組成の０．００００１～９９．５質量％の範囲で配合される組成物とする。

実施例、試験例を示し、本発明についてさらに説明する。
＜実施例１．ｂＦＧＦ発現促進作用＞
（１）初代ミュラー細胞の調製
初代ミュラー細胞は次の方法で調製した。
７日齢のＳＤラット１０匹から網膜を単離した。単離した網膜は、ＰＢＳ（－）で５倍希釈したトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）にＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した溶液１０ｍＬ中で、３７℃で３０分間静置した。

次いで、ピペッティング操作により網膜組織を分散させ、２，４００ｒｐｍの回転数、室温で５分間遠心した。遠心後、分散溶液の上清を吸引除去し、１０％ＦＢＳ（ｂｉｏｓｅｒａ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｍＬに懸濁した。
懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に通した後、細胞数を計測し、４．２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう前記の培地に希釈した。
Ｔ－７５細胞培養用フラスコ（住友ベークライト）に１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した（培養０日目）。
培養３日目に、培地を吸引除去し、新しい培地２０ｍＬに交換し、再び３７℃、５％ＣＯ_２環境下でさらに培養した。

培養７日目に、Ｗｅｉ－ＴａｏＳｏｎｇらの方法（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ２０１３；６（６）：７７８－７８４）に準じて、ミュラー細胞を純化した。
培養８日目に、ミュラー細胞を剥がし、４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう前記の培地に懸濁し、９６ｗｅｌｌｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｐｌａｔｅ（ＦＡＬＣＯＮ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。

（２）ガランギンのｂＦＧＦ発現促進効果の確認
ミュラー細胞のｂＦＧＦ発現促進効果は、上記のミュラー細胞を用いて次のとおり実施した。
ガランギン（Ｇａｌａｎｇｉｎ）は、市販の試薬を用いて、（ＣＡＹＭＡＮ社：純度９８％以上）ＤＭＳＯで溶解し使用した。

培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地１００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で９０分間培養し、ミュラー細胞を血清飢餓状態に置いた。ガランギンを１５μＭの濃度になるように添加し、１８０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ９６ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。
ＲＮＡ調製の際、ＤＮａｓｅＩＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。

約４０ｎｇの調製したＲＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。ｂＦＧＦの発現量はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙを用いて、次の方法で定量した。
１μＬのｃＤＮＡとラットｂＦＧＦＴａｑｍａｎｐｒｏｂｅ、ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を所定の割合で混合し、計１０μＬとなるようにＰＣＲｇｒａｄｅｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］×４５サイクルの反応条件で測定を行った。

内在性コントロールにはラットｇａｐＤＨＴａｑｍａｎｐｒｏｂｅ（Ｔａｑｍａｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓａｙｓ）を用い、上記と同様の反応条件で測定を行った。測定により得られたＣｔ値からｇａｐＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。

ＰＣＲに使用したＴａｑｍａｎｐｒｏｂｅの製品情報、仕様は以下のとおりである。Ｇａｐｄｈ：ＡｐｐｉｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓＡｓｓａｙＩＤ：Ｒｎ０１４６２６６２＿ｇ１（Ｄｙｅ：ＶＩＣ，Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）
ｂＦＧＦ：ＡｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓＡｓｓａｙＩＤ：Ｒｎ００５７０８０９＿ｍ１（Ｄｙｅ：ＦＡＭ，Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）

（３）結果
図１に示すとおり、ミュラー細胞は、ガランギンの添加により、明らかにｂＦＧＦの発現が促進された。
ミュラー細胞が分泌するｂＦＧＦは、光刺激からの視細胞保護効果が確認されており、さらに視細胞が障害を受けた後に視細胞のｂＦＧＦをはじめとするＦＧＦ受容体の発現が急激に亢進するため、ｂＦＧＦは視細胞保護機構に重要な役割を担っていることが示唆されている。
さらに脱落した視細胞外節を貪食、消化することにより視細胞のターンオーバーに重要な役割を果たしている網膜色素上皮細胞は、ｂＦＧＦにより貪食が促進されるが、視細胞の変性、色素上皮細胞の貪食能の低下は、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識、視野、視力（特に夜間視力）、ピント調節能の低下、眼精疲労等の症状につながって、加齢黄斑変性、網膜色素変性といった網膜変性疾患の原因にもなる。
したがって、本試験によってガランギンがミュラー細胞のｂＦＧＦの発現促進を行なうことが明らかになったため、これらの障害による視覚機能の維持や改善、網膜疾患の予防や症状緩和にガランギンが有効であることが明らかとなった。

Claims

ガランギンを有効成分として含有する、ｂＦＧＦの発現増強用組成物（但し、プロポリス抽出物を含むものを除く）。