KR102447448B1 - 석류 유래 세포외 소포체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 석류(Punica granatum)에서 유래된 세포외 소포체 및 이의 용도에 관한 것으로, 석류로부터 유래된 항암 활성을 가지는 세포외 소포체, 상기 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 석류 유래 세포외 소포체는 암 세포 내로 침투가 가능하고 암 세포의 증식, 침윤, 이동 등을 효과적으로 억제하는 등 우수한 항암 활성을 가져 효과적인 항암 조성물로 제공될 수 있다.

Description

석류 유래 세포외 소포체 및 이의 용도{POMEGRANATE DERIVED EXTRACELLULAR VESICLES AND USE THEREOF}

본 발명은 석류(Punica granatum)에서 유래된 세포외 소포체 및 이의 용도에 관한 것이다.

암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 1983년 이후로 한국인의 사망원인 중 1위의 질병으로 연간 약 10만명 이상이 진단되고 있으며, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다.

특히, 유방암은 여성에게 발병률이 가장 높은 암으로, 2015년 중앙암등록본부의 통계에 의하면 국내 유방암 환자 수는 전체 암 발생 환자의 약 7.7%로 발병률 5위를 차지한다. 유방암을 발생시키는 위험 요인은 매우 다양하며, 대표적으로 유전, 호르몬, 방사선 등이 있고 난소암 대장암 경험자일수록 위험성이 높아진다.

최근 의학적 발달로 수술적 치료, 방사선 치료, 항암 치료 등 방법이 다양하게 향상되어 유방암의 5년 상대 생존율이 92.7%로 생존율이 높음에도 불구하고 환자들은 재발에 대한 두려움과 치료과정에서 겪는 신체적ㆍ사회 심리적 증상들로 인해 삶의 질이 저하될 수 있다.

유방암은 발병했을 때의 힘든 치료방법과 치료 후의 삶의 질의 저하 따라 항암제를 통해 치료하는 기존의 화학요법과 또는 유방부분절제술(유방보존술)과 유방전절제술과 같은 수술적 치료, 고 에너지의 방사선을 이용하여 종양을 치료하는 방서선 치료와 달리 부작용이 적으면서 인체에 미치는 고통을 최소화하는 암 예방 및 치료 요법을 개발하는 데 사람들의 관심이 증가되었다. 그에 따라 자연에서 쉽게 얻을 수 있고 부작용은 적고 암을 효율적으로 치료할 수 있는, 식물 유래의 천연 물질들에 많은 관심을 가지게 되었다.

세포외 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)는 세포 활동 중에 나오는 물질로, 10⁹분의 1m 크기를 가진 나노소포체라고도 한다. 세포외 소포체는 엑소좀(exosomes), 미세소포(microvesicles), 세포 자살체(apoptotic bodies)로 3가지 군으로 구분된다. 엑소좀의 기원은 내포작용 경로(endocytic pathway)로, 크기는 30-100 nm이며, 다세포 진핵 생명체의 혈액, 오줌 등 체액과 진핵세포를 배양한 배양액에서 관찰할 수 있다. 미세소포의 기원은 원형질막(plasma membrane)으로, 크기는 50-1,000 nm이다. 세포 자살체의 기원도 원형질막이며, 크기는 500-2,000 nm 크기이다. 이러한 나노소포체를 통해 질병의 진단, 예후, 치료 등 다양한 임상 연구가 진행되고 있다.

최근에는 식품에서 나노소포체들이 분비된다는 보고가 있고, 이때 분비되는 나노소포체는 생리 활성 역할뿐만 아니라 약물 매개체로 안전하게 사용된다고 알려져 있다. 하지만, 석류에서 분비되는 나노소포체의 항암 효과에 대해서는 아직 보고된 바 없다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0036146호 (2012.04.17 공개)

본 발명의 목적은 천연물 유래 세포외 소포체를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포외 소포체를 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포외 소포체의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 석류(Punica granatum)로부터 유래된, 항암 활성을 가지는 세포외 소포체(extracellular vesicle)를 제공한다.

본 발명은 상기의 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기의 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 석류 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 제조된 석류 분쇄물을 250 내지 750 g에서 5 내지 15분간 1차 원심분리하는 단계; 상기 1차 원심분리하여 수득한 상층액을 1,000 내지 3,000 g에서 10 내지 30분간 2차 원심분리하는 단계; 상기 2차 원심분리하여 수득한 상층액을 5,000 내지 15,000 g에서 15 내지 45분간 3차 원심분리하는 단계; 및 상기 3차 원심분리하여 수득한 상층액을 50,000 내지 150,000 g에서 1 내지 3시간 4차 원심분리하여 펠렛을 수득하는 단계;를 포함하는 석류(Punica granatum) 유래 세포외 소포체 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 석류 유래 세포외 소포체는 암 세포 내로 침투가 가능하고 암 세포의 증식, 침윤, 이동 등을 효과적으로 억제하는 등 우수한 항암 활성을 가진다. 이에, 상기 석류 유래 세포외 소포체를 암 질환 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 석류 유래 세포외 소포체를 이용함으로써, 섭취 및 보관이 보다 용이하며, 많은 양의 석류를 섭취하지 않더라도 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있는 장점이 있다.

도 1은 석류에서 나노소포체를 분리하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체의 크기를 분석한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체의 농도에 따른 유방암 세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체의 농도에 따른 유방암 세포의 침윤에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체의 농도에 따른 유방암 세포의 이동 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체가 유방암 세포 내에 침투함을 나타낸 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체 내 엘라그산(ellagic acid)의 함량을 분석한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 석류로부터 분리한 나노소포체가 유방암 세포의 증식, 침윤, 이동 등을 효과적으로 억제함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항암 활성을 가지는 세포외 소포체(extracellular vesicle)를 제공한다.

상기 세포외 소포체는 석류(Punica granatum)로부터 유래된 것일 수 있다.

본 명세서에서, "석류(Punica granatum)"는 석류나무의 열매로, 지름 6~8cm에 단단하고 노르스름한 껍질이 감싸고 있으며, 과육 속에는 많은 종자가 있다. 껍질에는 타닌, 종자에는 갱년기 장애에 좋은 천연식물성 에스트로겐이 들어있고, 열매와 껍질 모두 고혈압·동맥경화 예방에 좋으며, 부인병·부스럼에 효과가 있다고 알려져 있다.

상기 석류는 석류 껍질, 과육, 종자 또는 이의 혼합 부위일 수 있고, 바람직하게는 과육 또는 이의 혼합 부위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "세포외 소포체(extracellular vesicle, EV)"는 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭으로, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미하며, 나노소포체(nanovesicle)로도 정의될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포외 소포체는 엑소좀(exosomes), 미세소포(microvesicles)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 세포외 소포체는 평균 입경이 50 내지 300 nm인 나노소포체일 수 있으며, 바람직하게는 평균 입경이 100 내지 200 nm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 세포외 소포체는 초원심분리(ultracentrifugation), 밀도구배원심분리(density gradient centrifugation), 초미세여과(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리(microfluidics-based isolation), 침전(exosome precipitation), 총 엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전(polymer based precipitation) 등의 방법을 사용하여 석류로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는 상기 세포외 소포체는 석류를 원심분리하여 얻은 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 세포외 소포체는 석류 분쇄물을 250 내지 750 g에서 5 내지 15분간 1차 원심분리하고, 상기 1차 원심분리로 수득한 상층액을 1,000 내지 3,000 g에서 10 내지 30분간 2차 원심분리하며, 상기 2차 원심분리로 수득한 상층액을 5,000 내지 15,000 g에서 15 내지 45분간 3차 원심분리하고, 상기 3차 원심분리로 수득한 상층액을 50,000 내지 150,000 g에서 1 내지 3시간 4차 원심분리하여 수득한 것으로, 상기 4차 원심분리하여 수득한 원심분리물 중 상층액을 제외한 펠렛일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 석류 분쇄물은 석류를 인산완충용액(PBS)에 넣어 분쇄한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 석류 착즙물, 추출물 등으로 직접 제조한 것일 수 있으며, 또는 상업적으로 판매하는 석류 분쇄물, 석류 착즙물 또는 추출물 등을 구매한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기에 따라 수득된 세포외 소포체는 엘라그산(ellagic acid), 클래스 III 키티나아제(class III chitinase), 지질 전달 단백질(lipid transfer protein) 및 칼콘 합성효소(chalcone synthase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "엘라그산(ellagic acid)"은 과일 또는 채소에서 발견되는 천연 식물성 페놀로, 식물체 내에서는 전구물질인 엘라기탄닌(ellagitannin) 형태 존재한다. 항산화, 항바이러스, 항돌연변이, 항암 기능을 가지는 것으로 보고되어 있다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 석류 유래 세포외 소포체에서 석류의 주요 성분인 엘라그산이 포함되어 있음을 확인하였고, 상기 석류 유래 세포외 소포체의 항암 작용에 영향을 주는 성분으로 판단될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포외 소포체는 암 세포 내로 침투할 수 있고, 암 세포의 증식, 이동 또는 침윤을 억제하는 항암 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 세포외 소포체가 유방암 세포 또는 폐암 세포에서 세포 내로 침투함을 확인하였고, 상기 암 세포의 증식, 침윤 및 이동을 유의하게 억제함을 확인할 수 있었다.

이에, 상기 세포외 소포체는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명은 상기 석류 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 세포외 소포체가 0.001 내지 50 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 암 세포 내로 침투하여 암 세포의 증식, 이동 또는 침윤을 억제함으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 암은 유방암, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 신장암, 방광암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 자궁암, 난소암, 후두암, 전립선암, 갑상선암, 두부 또는 경부암, 뇌암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 석류 유래 세포외 소포체의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등으로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 상세하게는 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 사용될 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 주사제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 항산화제를 더 첨가할 수 있다. 상기 항산화제로는 티아민(thiamin, 비타민 B1), 리보플라빈(riboflavin, 비타민 B2), 나이아신(niacin, 비타민 B3), 판토펜산(pantothenic acid, 비타민 B5), 피리독신(pyridoxine, 비타민 B6) 및 코발라민(cobalamin, 비타민 B12) 등의 비타민 B군의 화합물과 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 암 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여될 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 암 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 석류 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 암 세포 내로 침투하여 암 세포의 증식, 이동 또는 침윤을 억제함으로써 암을 예방 또는 개선할 수 있다.

상기 암은 유방암, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 신장암, 방광암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 자궁암, 난소암, 후두암, 전립선암, 갑상선암, 두부 또는 경부암, 뇌암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 명세서에서, "건강기능식품"이란, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 포함하며, 영양 공급 외에도 본 발명의 목적상 암의 예방, 개선, 생체 방어, 면역, 회복 등의 생체 조절 기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다.

본 발명에 따른 건강기능식품은 암의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.

상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품첨가물공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초 추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 세포외 소포체의 유효 용량은 암의 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 암의 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.

또한, 본 발명은 석류 유래 세포외 소포체의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은 석류 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 제조된 석류 분쇄물을 250 내지 750 g에서 5 내지 15분간 1차 원심분리하는 단계; 상기 1차 원심분리하여 수득한 상층액을 1,000 내지 3,000 g에서 10 내지 30분간 2차 원심분리하는 단계; 상기 2차 원심분리하여 수득한 상층액을 5,000 내지 15,000 g에서 15 내지 45분간 3차 원심분리하는 단계; 및 상기 3차 원심분리하여 수득한 상층액을 50,000 내지 150,000 g에서 1 내지 3시간 4차 원심분리하여 펠렛을 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서, 석류 분쇄물을 제조하는 단계는 석류를 세척한 후 인산완충용액(PBS)에 넣어 분쇄하거나 착즙함으로써, 수행될 수 있다.

상기 제조방법에 있어서, 상기 1차 내지 4차의 원심분리는 1회 수행되거나 또는 2회 이상 반복하여 수행될 수 있으며, 특히 상기 3차 원심분리 단계는 1회 수행되거나 또는 2회 내지 5회 반복하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 제조방법은 1차 이상의 원심분리 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 1차 원심분리 단계는 500 g 에서 10분 동안 1회 수행되고, 상기 2차 원심분리 단계는 상기 1차 원심분리 단계에서 수득한 상층액을 2,000 g에서 20분 동안 1회 수행되며, 상기 3차 원심분리 단계는 상기 2차 원심분리 단계에서 수득한 상층액을 10,000 g에서 30분씩 2회 수행되고, 상기 4차 원심분리 단계는 상기 3차 원심분리 단계에서 수득한 상층액을 100,000 g로 2시간 동안 1회 수행됨으로써, 석류 유래 세포외 소포체를 제조하였다.

상기와 같은 제조방법을 통해 항암 활성이 우수하며, 입자 크기가 균일한 고순도의 석류 유래 세포외 소포체를 효과적으로 수득할 수 있다.

또한, 상기 제조방법은 상기 원심분리 방법 외에도, 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총 엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당 기술분야에 널리 알려진 분리 또는 정제 방법을 추가로 더 포함하여 진행할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예 1> 석류에서 분리된 나노소포체의 특성 분석

<실험 방법>

1. 석류의 나노소포체 분리

본 발명의 실험에 사용된 석류는 조지아스내추럴 석류주스(AROMAPRODUCT LTD 제조)로, 석류 씨앗을 제외한 석류 100%를 그대로 착즙한 주스를 사용하였다.

도 1은 석류에서 나노소포체를 분리하는 방법을 개략적으로 나타낸 것으로, 이를 참조하면, 무게를 일정하게 맞춘 후 원심분리기를 이용하여 500 g에서 10분 동안 1회 돌려준 후, 상층액을 새로운 50 mL 코니컬 튜브로 옮겨 2,000 g에서 20분 동안 1회 돌려주었고, 다시 상층액을 새로운 50 mL 코니컬 튜브에 옮겨 담아 10,000 g에서 30분씩 2회 돌린 후, 다시 새 튜브에 상층액을 담고 100,000 g로 2시간 돌려준 후 상층액을 버리고 남은 나노소포체 펠렛(pellet)은 건조시킨 뒤, 1 mL의 1× PBS를 넣어서 녹여주었다.

2. 나노 입자 추적 분석 (NTA; Nano particle Tracking Analysis)

Malvern의 NanoSight를 이용하여 석류에서 분리한 나노소포체(Extracellular Vesicles, EVs)를 분석하였다. 나노 입자 추적 분석(NTA)은 현탁액(liquid suspension) 내 직경 50 nm ~ 1000 nm 범위의 특정의 나노소포체의 크기 및 농도를 측정하였다.

3. 석류 나노소포체 단백질 정량

석류의 나노소포체 단백질은 1× RIPA 용액을 넣어서 파쇄한 후에 비신코닌산(bicinchoninic acid, BCA, Termo Fishers)법으로 단백질을 정량하였다.

4. 유방암 세포 배양

MDA-MB-231 유방암 세포는 ATCC 세포주에서 분양 받았다. MDA-MB-231 유방암 세포는 배양을 위해 DMEM 배지, 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum)과 1% 항생제를 첨가하여 5% CO₂ 및 37℃의 인큐베이터에서 배양을 하였다. 세포는 미디어를 2-3일마다 교환하였다.

5. 세포 증식 분석 (MTT assay)

MDA-MB-231 유방암 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰당 세포수가 2.5×10⁴ cells/mL가 되도록 넣고 플레이트에 붙을 수 있도록 DMEM 성장 배지에서 약 24시간 동안 배양했다. 그러고 나서 그 성장 배지는 제거하고 석류 나노소포체를 0, 10, 50, 100μg/mL 농도 조건으로 처리하였다. 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양기 내에서 약 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각 웰당 40μL의 PBS에 2 mg/mL의 MTT를 녹인 용액을 넣고 37℃ 배양기에 2시간 동안 방치하였다. 다음으로 MTT 용액을 제거하고 웰당 100μL의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 형성된 포르마잔(formazan)을 녹였다. 완전히 용해된 포르마잔의 흡광도를 ELISA-reader (Bio-Rad Lab- oratories Inc., Hercules, CA, USA)로 595 nm에서 측정하였다.

6. 세포 이동 분석 (Migration assay)

MDA-MB-231 유방암 세포를 6 웰에 1 mL을 넣고 5% CO₂ 및 37℃인 인큐베이터에서 배양하였다. 세포를 상처(wound) 낸 다음 세포의 치유(healing)를 현미경으로 관찰하였다.

7. 세포 침윤 분석 (Invasion assay)

재수화(Rehydration)된 8μm 포어(pore) 크기의 폴리카보네이트 막(polycarbonate membrane)이 도포된 인서트(insert)에 무 혈청 배지(serum free medium)에 부유된 MDA-MB-231 유방암 세포를 300μL 넣고 바깥쪽 챔버(chamber)에 10% FBS를 함유한 배지를 500μL 처리하여 막의 바깥 챔버에는 세포의 침투를 유도하는 영양분이 풍부한 환경을 조성하였다. MDA-MB-231 유방암 세포에 양성대조군인 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 100 ng/mL의 농도로 처리하고 석류 나노소포체를 농도별로 처리한 뒤 37℃에서 24시간 배양하였다. 그 후 침투되지 않은 세포를 제거한 뒤, 세포 염색 용액(cell stain solution)으로 침투된 막 바깥쪽 세포를 염색하였다. 염색된 세포를 수를 측정하였다.

8. MMP-9 (Matrix metallopeptidase 9) ELISA 분석

MMP-9 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, 효소결합면역흡착검사, R&D system) 실험은 항체(또는 항원)에 효소를 표지하고 효소 활성을 업체의 프로토콜을 이용해서 실험하였다.

9. DID 라벨링(labelling)

MDA-MB-231 유방암 세포를 8 웰 챔버 슬라이드에 1×10⁴ cells/well로 깔고 DMEM 성장배지에서 약 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각 웰에 DID 라벨링된 석류 나노소포체를 처리한 다음, 24시간 뒤에 배지를 제거하고 PBS로 세척한 뒤 70% 에탄올 처리를 하였다. DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindol) 염색을 마치고 현광 현미경으로 석류 나노소포체가 세포로 침투되었는지 확인하였다.

10. 프로테오믹스(proteomics) 분석

석류 나노소포체를 트립신 완충액 (500 ng/μL trypsin, 50mM ammonium bicarbonate)을 처리하여 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이 후 5% 포름산(formic acid)을 첨가하여 트립신의 작용을 중지시킨 후, 25 mM TEABC(triethylammonium bicarbonate)와 ACN(acetonitrile)을 이용하여 펩타이드를 추출하였다. 추출된 펩타이드들은 감압건조기를 이용하여 완전히 건조시켰고, 분석 직전에 A 완충액 (0.1% formic acid)에 녹여 질량분석기로 분석하였다. 질량분석기로 얻은 데이터는 Mascot Distiller를 이용하여 피크 리스트(mgf 파일)로 변환하였다. mgf 파일을 Mascot (Matrix Science; version 2.2.1) 프로그램을 이용하여 단백질을 동정하였다.

11. HPLC 분석

석류 나노소포체는 에탄올을 1:1로 희석하여 10분간 초음파 추출한 후, 15,000 rpm으로 원심분리하여, 0.2μm syringe filter로 여과한 뒤, Agilent 1100 Series로 분석하였다.

12. 통계처리

3 가지 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료 농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.

<실험 결과>

1. 석류 나노소포체 크기 확인

도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체의 크기를 분석한 그래프로, 이를 참조하면, 상기 도 1에 따라 분리한 석류의 나노소포체의 나노입자추적분석(NTA)한 결과, 직경 173nm의 나노소포체의 크기를 확인할 수 있었다.

2. 석류 나노소포체의 유방암 세포 생존 억제 효과 확인

도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체의 농도에 따른 유방암 세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.

석류 나노소포체가 MDA-MB-231 유방암 세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 농도별로 처리를 하여 MTT assay을 통해 관찰한 결과, 도 3과 같이, 석류 나노소포체를 각각 0, 10, 50, 100μg으로 24시간 처리하였을 때, 각각 농도별 세포 생존율은 100, 86, 80, 77%로 대조군에 비해 10μg의 농도에서부터 농도 의존적으로 세포 생존에 대하여 유의적인 감소를 나타내었다.

따라서 석류 나노소포체가 MDA-MB-231 유방암 세포에 10μg의 농도 의존적으로 세포 사멸을 유도함을 확인할 수 있고, 이는 석류 나노소포체가 유방암 세포에 농도 의존적으로 세포 생존율을 감소시킨 것과 같은 결과로 나타나, 이러한 결과를 통해 석류 나노소포체가 암 세포에 억제 효과를 보이는 것으로 판단할 수 있다.

3. 석류 나노소포체의 유방암 세포 침윤 억제 효과 확인

도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체의 농도에 따른 유방암 세포의 침윤에 미치는 영향을 나타낸 그래프로, 이를 참조하면, 석류 나노소포체를 각각 0, 10, 50, 100μg으로 24시간 처리하였을 때, 농도 의존적으로 MDA-MB-231 유방암 세포의 침윤이 감소하는 것으로 나타났다.

따라서 석류 나노소포체가 MDA-MB-231 유방암 세포에 농도 의존적으로 세포 침윤을 억제함을 확인할 수 있고, 이러한 결과를 통해 석류 나노소포체가 암 세포에 억제 효과를 보이는 것으로 판단할 수 있다.

4. 석류 나노소포체의 유방암 세포 이동 억제 효과 확인

도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체의 농도에 따른 유방암 세포의 이동 정도를 나타낸 것으로, 이를 참조하면, 석류 나노소포체를 각각 0, 10, 100μg으로 24시간 처리하였을 때, 농도 의존적으로 MDA-MB-231 유방암 세포의 이동이 감소하는 것으로 나타났다.

따라서 석류 나노소포체가 MDA-MB-231 유방암 세포에 농도 의존적으로 세포 이동을 억제함을 확인할 수 있고, 이러한 결과를 통해 석류 나노소포체가 암 세포에 억제 효과를 보이는 것으로 판단할 수 있다.

5. 석류 나노소포체의 유방암 세포 내재화(internalization) 효과 확인

도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체가 유방암 세포 내에 침투함을 나타낸 이미지로, 이를 참조하면, 석류 나노소포체를 DID 라벨링한 후 24시간 처리하였을 때 MIA-MB-231 유방암 세포의 세포질로 이동하는 것이 확인되었다.

따라서 석류 나노소포체가 MBA-MD-231 유방암 세포에 침투하는 것을 통해, 석류 나노소포체가 암 세포에 억제 효과를 보이는 것으로 판단할 수 있다.

6. 석류 나노소포체의 단백질 동정(identification)

석류 나노소포체를 트립신 소화(trypsin digestion)를 통해서 펩타이드를 만든 후에 프로테오믹스 분석을 하였다. 그 결과, 하기 표 1과 같이 15개의 단백질들을 석류 나노소포체에서 동정을 하였다. 클래스 III 키티나아제(class III chitinase) 단백질은 키틴의 β-1,4-클리코시드 결합(β-1,4-glycosidic bond)을 분해하는 효소로 석류에 금속 저장 용량(metal storage capacity)을 제공하는 것으로 알려져 있다. 이 효소가 나노소포체에 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 지방 단백질을 이동하는 지질 전달 단백질(lipid transfer protein)도 동정하였다. 칼콘 합성효소(chalcone synthase)는 식물에 많이 존재하며, 플라보노이드 생합성(flavonoid biosynthesis) 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질들이 석류 나노소포체에 존재하는 것을 알 수 있었다.

7. 석류 나노소포체에서 엘라그산(ellagic acid) 함량 확인

도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 석류 나노소포체 내 엘라그산의 함량을 분석한 그래프로, HPLC 분석을 통해서 석류 나노소포체 내 엘라그산을 분석한 결과, 도 7과 같이, 석류 나노소포체는 엘라그산을 함유하고 있었으며, 3개의 석류 나노소포체 시료에서 각각 61. 5502, 62.05329 및 61.61564 mg/L의 엘라그산을 포함하고 있음을 확인할 수 있었다. 석류의 주요 성분인 엘라그산이 나노소포체에도 포함하고 있음을 알 수 있었으며, 아주 중요한 발견이라고 사료된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (12)

1. 석류(Punica granatum)로부터 유래된 항암 활성을 가지는 세포외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포외 소포체는,
   석류 분쇄물을 250 내지 750 g에서 5 내지 15분간 1차 원심분리하고, 상기 1차 원심분리로 수득한 상층액을 1,000 내지 3,000 g에서 10 내지 30분간 2차 원심분리하며, 상기 2차 원심분리로 수득한 상층액을 5,000 내지 15,000 g에서 15 내지 45분간 3차 원심분리하고, 상기 3차 원심분리로 수득한 상층액을 50,000 내지 150,000 g에서 1 내지 3시간 4차 원심분리하여 수득한 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포외 소포체는,
   평균 입경이 50 내지 300 nm인 나노소포체인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포외 소포체는,
   암 세포 내로 침투하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포외 소포체는,
   암 세포의 증식, 이동 또는 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포외 소포체는,
   엘라그산(ellagic acid), 클래스 III 키티나아제(class III chitinase), 지질 전달 단백질(lipid transfer protein) 및 칼콘 합성효소(chalcone synthase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 암은,
   유방암, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 신장암, 방광암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 자궁암, 난소암, 후두암, 전립선암, 갑상선암, 두부 또는 경부암, 뇌암 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
10. 석류(Punica granatum)로부터 유래된 세포외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
11. 삭제
12. 삭제

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