KR100597784B1

KR100597784B1 - 비형 간염 치료제 조성물

Info

Publication number: KR100597784B1
Application number: KR1020030100118A
Authority: KR
Inventors: 정태호; 정종찬; 김혜옥
Original assignee: 정태호; 정종찬; 김혜옥
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2003-12-30
Publication date: 2006-07-10
Also published as: KR20050070505A

Abstract

본 발명은 필란투스(Phyllanthus) 속 식물인 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria) 추출물 중의 코리라진(Corilagin), 브레비폴린 카르복실산(Brevifolin carboxylic acid) 및 안토시아닌(Anthocyanin)을 포함하는 B형 간염 치료제 조성물에 관한 것으로, 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌의 4 내지 6:2 내지 3:0.5 내지 1.5의 혼합물을 포함하는 B형 간염 치료제 조성물은, 단독 사용시에 비해 DNA-폴리머라제 억제 작용이 우수하며, 오리의 B형 간염(DHBV) 치료 효과가 있을 뿐 아니라 만성 B형 간염 환자들을 치료하여 HBeAb를 유도할 수 있고, 또한, 본 발명의 조성물은 경구용 제제 및 주사제로도 제형화할 수 있으며, 조성물 각 성분인 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌은 진주초 뿐만 아니라 다른 몇 종류 식물에서 추출할 수도 있고 화학적 합성도 가능하다는 장점이 있다.

코리라진, 브레비폴린 카르복실산, 안토시아닌, 비형 간염, 진주초.

Description

비형 간염 치료제 조성물{COMPOSITION FOR TREATING HEPATITIS B}

도 1은 필란투스 우리나리아로부터 추출한 안토시아닌의 확인을 위한 매스 스펙트럼으로, 도 1a는 표준품 안토시아닌, 도 1b는 추출한 안토시아닌의 매스 스펙트럼이다.

본 발명은 필란투스(Phyllanthus) 속 식물인 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria) 추출물 중의 코리라진(Corilagin), 브레비폴린 카르복실산(Brevifolin carboxylic acid) 및 안토시아닌(Anthocyanin)을 포함하는 B형 간염 치료제 조성물에 관한 것이다.

사람에게 특이적으로 급만성 간염을 유발시키는 전염성 B형 간염 바이러스 (HBV, Hepatitis B virus)는 헤파드나비리대(Hepadnaviridae) 바이러스로서 잠복기는 60 내지 110 일 정도이며 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90 내지 95 %는 감염으로부터 완전히 회복된다. 그러나, 감염에서 회복되지 않은 환자의 경우에는 HBV DNA가 사람 간세포의 게놈 DNA에 동화되어 만성 활동성 간염, 간경변, 간암 등으로 발전하게 된다.

HBV 보유자는 전세계적으로 약 2억에 달하며 이중 80 %가 아시아와 태평양 지역에 집중되어 있고, 특히 한국 인구의 7 %가 혈중에 B형 간염 지표인 HBV 표면항원(HBsAg)을 갖고 있다. 다행히, 1981년 이후 HBV 백신이 개발되어 예방접종이 되고 있으므로, 1981년 이후의 출생자들에서는 HBV 보유자 수가 현저하게 감소되고 있다.

HBV의 중요한 발생 경로는 모체로부터 신생아로의 수직형 감염으로, 신생아에서 HBe 항원이 양성인 모체로부터 태반을 통해 HBV 감염되는 경우는 매우 드물지만 출산 도중 또는 태반의 손상을 통하여 HBV 자체에 노출되기도 하고, 태반을 통한 HBe 항원의 감작으로 인해 이후에 HBV에 대한 면역적 결합이 유발되기도 하여, 일단 감염이 성립되면 만성적 보유자 또는 만성 간염 상태가 될 확률이 높아지는 것이다. 따라서, HBV 감염의 중요 경로인 수직형 감염을 예방하기 위하여 HBV 보유자인 여성이 20 세 전에 치유되거나 적어도 혈중 HBe 항원이 소실되어야 한다.

한편, 1981년 이전의 출생자로서 이미 만성 간염 상태에 있는 사람들은 적절한 치료를 계속적으로 받아서 병발하는 간경화증과 간암을 예방하여야 할 것이다. B형 간염에서 간경화증과 간암이 유발되는 가장 중요한 원인은 B형 간염 바이러스로 인한 간실질세포의 파괴에 있으므로, 치료의 가장 중요한 핵심은 바이러스의 퇴치에 있는 것이다. 1971년 Dane 등에 의해 HBV가 발견된 후, 많은 항바이러스 치료제가 연구되었으나, 20세기까지 비교적 보편성 있게 사용되고 있는 치료제로는 α-인터페론, 라미부딘(Lamivudine, (-)2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine), 그리고 티모신 (Thymosin) 등이 있으나, 아직도 만족할만한 수준에는 미치지 못하고 있다.

본 발명자 등은 일찌기 필란투스(Phyllanthus) 속 식물의 추출물을 포함하는 B형 간염 치료제를 개발하여 대한민국 특허 제149,986호로 등록받았고, 그 후 일본 특허 제3,249,136호, 영국 특허 제2,331,460호 및 싱가폴 특허 제63,944호로서 등록받은 바 있다. 또한, 이 특허 제품은 1999년부터 2003년까지 대한민국 식품의약품안전청의 규정에 따라 제3상 임상시험을 실시하여 2003년 6월 헤파가드 (Hepaguard^R)라는 약품명의 일반의약품으로 출시되어 B형 간염 환자의 치료에 사용되고 있다. 헤파가드는 부작용 없이 만성 B형 간염 활동성 간염 환자들을 치료하여 만 1년만에 25 %의 환자들에서 혈청 중 HBV-DNA를 음성화하였으며, HBe 항체 (HBeAb)를 유도하였다. 그러나 헤파가드 역시 HBeAb를 100 % 유도하는 치료 달성에는 미달하였다. 한편, 1998년의 필란투스 식물 추출물의 B형 간염 치료 예비시험시 1 예의 환자에서 HBs항체(HBsAb)를 유도한 바 있다.

본 발명자 등은 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria) 추출물 중의 HBV 복제 억제작용 물질의 규명에 노력하였으며, 이에 따라 코리라진(Corilagin)과 브레비폴린 카르복실산(Brevifolin carboxylic acid), 그리고 안토시아닌(Anthocyanin)을 분리하게 되었다. 그리고, 이들 성분 각각의 B형 간염 치료제로서의 가능성을 검토한 결과, 코리라진과 브레비폴린 카르복실산은 HBV-DNA 폴리머라제 (polymerase)의 작용을 억제하며, 오리형 B형 간염을 치료할 수 있음을 알게 되었다. 또한, 안토시아닌은 HBV-DNA 폴리머라제에 대한 직접 작용은 경미하였으나, 플라보노이드 유도체로서 면역력 보존에 유리함이 밝혀져 있다(미야이찌; 최신식물성 분분석연구법: 하로가와서점, 일본, 동경, 1963).

본 발명의 목적은 필란투스(Phyllanthus) 속 식물인 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria) 추출물 중의 코리라진(Corilagin), 브레비폴린 카르복실산 (Brevifolin carboxylic acid) 및 안토시아닌(Anthocyanin)을 일정 성분 비율로 함유함으로써, B형 간염 바이러스(HBV)의 복제를 억제하여 B형 간염 치료 효과가 우수한 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 코리라진(Corilagin), 브레비폴린 카르복실산(Brevifolin carboxylic acid) 및 안토시아닌(Anthocyanin)의 4 내지 6:2 내지 3:0.5 내지 1.5의 혼합물을 포함하는 B형 간염 치료제 조성물을 제공한다.

여기에서, 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌의 혼합 비율은 5:2.5:1인 것이 바람직하고, 이들 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌은 각각 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria)로부터 얻어질 수 있다.

본 발명에서는 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria) 추출물로부터 코리라진, 브레비폴린 카르복실산, 및 안토시아닌 등 3 종의 물질을 분리 정제하였으며, 이들을 4 내지 6:2 내지 3:0.5 내지 1.5의 혼합물, 바람직하게는 5:2.5:1.0의 비율로 혼합한 조성물이 가장 안전하고도 수용성이며, 시험관 내에서 DNA-폴리머라제 억제 작용이 있음을 확인하였다. 또한, 이들 혼합 조성물은 단독 사용시에 비해 오 리의 B형 간염(DHBV) 치료 성적이 우수하였으며, 3 인의 만성 B형 간염 환자들을 치료하여 HBeAb를 유도할 수 있음을 알게 되었다.

본 발명에 따른 조성물은 헤파가드와 달리 캅셀이나 정제로 제형화하는 것이 가능할 뿐 아니라, 특히 급성환자에게는 주사제로 사용할 수도 있다. 더우기, 본 발명 조성물의 성분인 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌은 진주초 뿐만 아니라 다른 몇 종류 식물에서 추출할 수도 있고 화학적 합성도 가능하다는 장점이 있다.

본 발명의 B형 간염 치료제 조성물의 구성 성분인 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시안의 화학식 등과 진주초로부터의 추출 과정을 다음에 기술한다.

(1) 코리라진(Corilagin): C₂₇H₂₂O₁₈, MW 634.460

상기 코리라진은 필란투스(Phyllanthus) 속 식물 뿐 아니라 그 외 몇 가지 식물, 즉 가자(Terminalia chebula Retz)나, 소목(Caesalpinia sappan L.) 등으로 부터 추출하여 얻을 수 있다.

본 발명에서는 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria)의 수성 에탄올 추출물을 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피하고, 발색시약으로 FeCl₃ 2% 에탄올 용액으로 박막 크로마토그래피하여 강하게 발색하는 분획을 얻고, 이 분획에 대하여 역상 칼럼 크로마토그래피를 3 내지 4 회 반복 수행하여 코리라진을 얻었다.

(2) 브레비폴린 카르복실산(Brevifolin carboxylic acid): C₁₃H₈O₈, MW 291.201

브레비폴린 카르복실산은 코리라진의 추출과 마찬가지로 필란투스 (Phyllanthus) 속 식물로부터 추출할 수 있다.

본 발명에서는 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria)의 수성 에탄올 추출물을 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피하고, 발색시약으로 FeCl₃ 2% 에탄올 용액으로 박막 크로마토그래피하여 강하게 발색하는 분획을 얻고, 이 분획에 대하여 역상 칼럼 크로마토그래피를 3 내지 4 회 반복 수행하여 브레비폴린 카르복실산을 얻었다.

(3) 안토시아닌(Anthocyanin): C₁₅H₁₁O₅Cl·H₂O, MW 324

안토시아닌은 자연에 존재하는 각종 식물의 꽃, 열매, 그리고 잎 등에 존재하는 색소이다.

본 발명에서는 위 두 성분들과 마찬가지로 진주초(珍株草, Phyllanthus urinaria)의 수성 에탄올 추출물로부터 안토시아닌을 얻었다.

본 발명에 따른 B형 간염 치료제 조성물은 합성 또는 진주초로부터 추출하여 얻은 코리라진(Corilagin), 브레비폴린 카르복실산(Brevifolin carboxylic acid) 및 안토시아닌(Anthocyanin)을 4 내지 6:2 내지 3:0.5 내지 1.5, 바람직하게는 5:2.5:1의 비율로 혼합하여 제조할 수 있으며, 통상의 산제, 과립제, 캅셀제, 정제, 액제 및 주사제 등의 제법에 따라 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 B형 간염 치료제 조성물은 성인의 경우 1 일 2∼200 ㎎/㎏의 양을 1∼3 회에 나누어 경구 투여하거나, 1 일 1∼180 ㎎/㎏의 양을 비경구 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예: 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌의 추출

(1) 코리라진 및 브레비폴린 카르복실산의 추출

건조된 필란투스 우리나리아(Phyllanthus urinaria) 1000 g을 세절하여 10 ℓ의 30% 에탄올 용액으로 60 ℃에서 4 시간 동안 추출하고, 감압하에 농축하여 스프레이 건조(spray dry) 방식으로 분말 상태의 추출물 100 g을 얻었다. 이 추출물을 물에 녹여 세파덱스 LH-20 칼럼(45cm D×90 cm L)(Sigma사, 미국)에 로딩하고 물로 충분히 용출시킨 후, 메탄올의 함량을 20%, 40%, 60%, 80%, 100%로 서서히 높이면서 용출시켜 500 ㎖씩 분획하여 각각 분획 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ로 명명하였다. 각 분획은 일단 냉동 건조하여 시험관 저면부의 침전물 형성 여부를 확인하고 침전물의 일부를 취하여 박막 크로마토그라피를 실시하였다. FeCl₃ 2% 에탄올 용액을 사용하여 탄닌산의 유무와 그 함량 정도를 반정량적으로 조사하였다. 그 결과 분획 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ에서 탄닌산의 존재를 확인할 수 있었다. 분획 Ⅱ에서는 FeCl₃에 대한 반응이 미약하였으며, 분획 Ⅲ과 분획 Ⅳ에서 FeCl₃에 대한 반응이 비교적 강하였다.

① 코리라진 분획

분획 Ⅲ을 메탄올-물에 용해시켜 MCI-겔 CHP20P(미쯔비시화학사, 일본), 토요펄 HW 40F(Sigma사, 미국) 및 RP-18(Merck사, 독일) 칼럼을 사용한 역상 칼럼 크로마토그래피(물:메탄올=50:50)를 수행하여 화합물 분획 Ⅲ(P-3) 3.0g을 얻었다. 이 화합물의 화학 분석 결과, 하기의 특성을 갖는 코리라진으로 확인되었다:

백색분말, H₂O에 가용

FeCl₃ 시험: 청남색

mp: 211∼212 ℃

[α]_D ²⁵-230.2 °(c=0.9, MeOH)

화학식: C₂₇H₂₂O₁₈

MW: 634.460

Negative FAB-MS m/z: 633(M-H)^-

NMR 상의 제 분석치:

¹H-NMR(아세톤-d₆): δ4.96(1H, t, J=8Hz, glc-3), 4.84(1H, t, J=8Hz, glc-4), 4.47(1H, br s, glc-5), 4.15-4.08(3H, m, glc-5,6), 6.38(1H, d, J=2Hz, glc-1), 6.71, 6.84[각각, hexahydroxydiphenoyl(HHDP) H], 7.13(2H, s, galloyl H)

¹³C-NMR(acron-d₆): δ62.2(glc-6), 64.3, 68.9, 70.6, 75.6(glc-2,3,4,5), 94.0(glc-1), 108.0(HHDP-3), 109.8(HHDP-3'), 110.8(glc2,6), 115.8, 116.4 (HHDP-1.1'), 120.7 (galloyl-1), 125.5, 125.6(HHDP-2.2'), 136.6, 137.1(HHDP-5.5'), 139.2(galloy1-4), 144.7, 144.9, 145.3 (HHDP-4,4',6,6'), 145.8(galloyl-3,5), 165.0, 167.1, 165.8(COO)

Mr 634; FAB-MS: neg. ion: 633 [M-H]^-, pos. ion: 635 [M+H]⁺, [α]_D-226 ° (EtOH; c 0.8), 2a [α]_D-21.3 °(EtOH; c 0.3).

② 브레비폴린 카르복실산 분획

분획Ⅳ 또한 분획 Ⅲ과 같이 메탄올-물에 용해시켜 MCI-겔 CHP20P(미쯔비시화학사, 일본), RP-18(Merck사, 독일) 칼럼을 사용한 역상 칼럼 크로마토그래피(물:메탄올=50:50)를 수행하여 화합물 분획 Ⅳ(P-4) 1.0 g을 얻었다. 이 화합물의 화학 분석 결과, 하기의 특성을 갖는 브레비폴린 카르복실산으로 확인되었다:

황색 결정성 분말

MW: 292.2

mp > 300 ℃

[α]_D ¹³-3.0 °(c=0.4, H₂O-아세톤)

Negative FAB-MS m/z: 291 (M-H)^-, 247 (M-COOH)^-.

¹H-NMR(아세톤-d₆+D₂O) ppm: 2.58(1H, d, J=19Hz, H-5), 3.09 (1H, dd, J=7, 19Hz, H-5), 4.56 (1H, dd, J=7Hz, H-4), 7.45 (1H, s, H-3')

¹³C-NMR(아세톤-d₆+D₂O) ppm: 38.4 (C-4), 42.1 (C-5), 109.4 (C-3'). 114.8 (C-1'), 116.4 (C-2'), 140.0 (C-5'), 140.9 (C-3), 144.3 (C-6'), 147.2 (C-4'), 150.2 (C-2), 161.7 (C-7'), 174.9 (C-6), 194.7 (C-1)

Mr 292; FAB-MS: neg. ion: 291 [M-H]^-, pos. ion: 293 [M+H]⁺

IR v_max cm^-1: 3440, 1705, 1625, 1605

(2) 안토시아닌의 추출

건조된 필란투스 우리나리아(Phyllanthus urinaria)의 30% 에탄올 추출물 20 g에 메탄올 200 ㎖와 HCl 2 ㎖를 가하여 혼합하고 10 시간 정치하였다. Whatman No.1 여지를 사용하여 여과하고 여액에 붉은색 침전물이 발생할 때까지 에틸에테르를 서서히 계속 첨가하였다(200 ㎖ 소요). 붉은 침전물을 다시 메탄올에 용해시키고 실리카겔 7730(sigma사)에 흡착시킨 후 에틸에세테이트:헥산=1:1의 혼합액을 사용하여 용출하는 과정 중에 붉은(紅色, Red purple) 부위를 분취하였다. 분취된 부위는 분무 건조(spray dry)하여 500 ㎎의 안토시아닌을 얻었다.

수득한 안토시아닌은 UV/VIS 크로마토그래피와 MSD-TC 매스 스펙트럼 분석을 통하여 안토시아닌임을 확인하였다. 도 1a 및 1b는 필란투스 우리나리아로부터 추출한 안토시아닌의 확인을 위한 매스 스펙트럼으로 도 1a는 표준품 안토시아닌, 도 1b는 추출한 안토시아닌의 매스 스펙트럼이다.

효과시험예 1: HBV-DNA 폴리머라제 활성도 억제능 측정

코리라진, 브레비폴린, 그리고 안토시아닌은 증류수를 사용하여 용해시켰으며, 각 성분들 단독 및 5:2.5:1 혼합물에 대하여 시험관 속에서의 HBV-DNA 폴리머라제 활성도를 다음과 같이 측정하였다:

HBV 입자가 함유된 혈청 0.2 ㎖를 0.01M 트리스-염산(pH 7.4)과 0.15M NaCl 이 포함된 용액 2.3 ㎖와 혼합한 후, 4 ℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 30%(w/v) 수크로즈, 0.01M 트리스-염산(pH 7.4), 0.15M NaCl, 0.001M EDTA, 0.1% 2-머캅토에탄올(ME) 및 1 ㎎ 소혈청 알부민(BSA) 용액에 연층하여 4 ℃에서 50,000 rpm으로 4시간 동안 원심분리하였다. 상층을 제거한 후 펠렛을 25 ㎕의 0.01M 트리스-염산(pH 7.4), 0.15M NaCl, 1% NP-40, 0.1% 2-ME 및 1 ㎎ BSA이 포함된 용액 2.5 ㎖에 연층한 후 4 ℃에서 50,000 rpm으로 4 시간 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 펠렛을 0.01M 트리스-염산(pH 7.4), 0.15M NaCl, 1% NP-40, 및 0.1% 2-ME이 포함된 용액 25 ㎕에 녹이고, 코리라진, 브레비폴린 카르복실산, 안토시아닌 및 이들의 5:2.5:1 혼합물의 여러 가지 농도의 용액 25 ㎕와 중합효소 혼합액[0.2M 트리스-염산(pH 7.4), 0.08M MgCl₂, 0.24M NH₄Cl, 1mM dATP, 1mM dTTP, 0.0025nM ³H-dCTP 및 0.0025nN ³H-dGTP(두 가지 모두 비활성 21Ci/mM)] 25 ㎕를 가하여 혼합한 후 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응액을 와트만 3 ㎜ 여과지에 점적한 후 15% 트리클로로아세트산과 90% 에탄올로 세척하고 공기중에서 건조시킨 다음 액체 신틸레이션 계측기(Packard사, 미국)로 방사능을 측정하여 DNA 중합효소 활성의 억제 정도를 평가하였다.

다음 표 1은 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌 단독과, 이들을 5:2.5:1 비율로 혼합한 조성물의 여러 가지 농도에서의 HBV-DNA 폴리머라제 억제 작용을 보여주는 것이다.

작용물질	작용농도 (㎍/ml)
	6	12	25	50	100
	(%) HBV-DNA 폴리머라제 억제 정도
코리라진 (1)	23.2	50.4	80.4	100	-
코리라진 (1)	±5.4	±6.2	±7.3	-	-
브레비폴린 카르복실산 (2)	7.2	12.2	25.4	60.6	100
브레비폴린 카르복실산 (2)	±2.3	±3.8	±6.2	±4.0
안토시아닌 (3)	1.2	3.4	7.8	8.4	9.8
안토시아닌 (3)	±0.2	±0.5	±2.6	±2.8	±2.9
(1)+(2)+(3) 혼합물(5:2.5:1)	30	60	100	100	-
(1)+(2)+(3) 혼합물(5:2.5:1)	±4.4	±4.8

위 표 1에서 보듯이, 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌을 5:2.5:1의 비율로 혼합 사용하였을 경우 각 물질 단독 사용시에 비하여 현저히 좋은 결과를 나타내는 것을 알 수 있다.

효과시험예 2: 백서를 이용한 독성시험

정상 백서에 본 발명의 조성물을 12 주간 경구 투여하였을 경우의 간 기능 검사를 실시하였다.

구체적으로, 백서 20 마리를 대조군과 시험군으로 나누고, 대조군에는 생리 식염수를, 시험군에는 본 발명 조성물의 0.1% 수용액을 각각 12주 동안 자유롭게 섭취시켰다. 본 발명 조성물 투여 전과 12주 후, 백서를 에테르로 마취시치고 쇄골하 정맥에서 혈액을 채취하여 즉시 혈청을 분리하였으며, 트랜스아미나제와 알칼라인 포스파타제, 및 빌리루빈을 측정하기 전까지 -40 ℃에서 보관하였다.

혈청 중의 GOT(glutamic oxalacetic transaminase) 활성도는 레이트만 등의 방법(Reitman and Frankel, Am. J. Clin. Pathol., 28: 56, 1957)에 따라 측정하였다. 즉, 37 ℃에서 5분 동안 방치한 기질액인 L-아스파라긴과 α-케토글루타르산에 표준액 또는 혈청 0.2 ㎖를 가하고 37 ℃에서 60분간 반응시킨 후, 여기에 2,4-디니트로페닐히드라진 용액 1 ㎖씩을 가하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 이 반응액 에 발색 시약인 0.4N NaOH 10 ㎖를 가하여 잘 혼합하고 실온에서 10분 동안 방치한 다음 분광광도계(Gilford 2600)를 이용하여 505 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 Karmen 단위/㎖로 나타낸다.

혈청 중 GPT(glutamic pyruvic transaminase) 활성도는 다음과 같이 측정하였다. 구체적으로, 37 ℃에서 5분 동안 방치한 기질액인 D,L - 알라닌 및 α-케토글루타르산 표준액 또는 혈청 0.2 ㎖를 가하고 37 ℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 여기에 2,4-디니트로페닐히드라진 용액 1 ㎖씩을 가하여 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 이 반응액에 발색 시약인 0.4N NaOH 10 ㎖를 가하여 잘 혼합하고 실온에서 10분 동안 방치한 다음 분광광도계(Gilford 2600)를 이용하여 505 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 Karmen 단위/㎖로 나타낸다.

혈청 중 알칼라인 포스파타제의 활성도는 킹 암스트롱의 방법(King Armstrong, J. Clin. Pathol., 7: 322, 1954)에 따라 측정하였다. 구체적으로, 알칼리성 완충액에 포함된 기질 용액(페닐인산-2-나트륨)을 37 ℃에서 5분 동안 방치한 후 표준액 또는 혈청 50 ㎕를 가하고 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이 반응액에 발색 시약을 넣어 실온에서 10분 이상 방치한 후 500 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 Karmen 단위/㎖로 나타낸다.

혈청 빌리루빈은 미카엘슨(Michaelson) 변법에 의해 알칼라인 아조 빌리루빈을 디아조 시약과 반응할 수 있는 형태로 바꾸고, 여기에 디아조 시약을 넣어 생성된 알칼라인 아조 빌리루빈을 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 g/㎖로 표시한다.

또한, 병리조직학적 검사를 위해, 시험이 종료된 직후의 백서를 에테르로 마취하고 개복하여 육안으로 병변을 확인한 다음, 부분적인 가엽절제 수술을 실시하여 얻은 간 조직을 중성 포르말린에서 고정하고 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 검정하였다. 모든 측정치는 t-test에 따라 통계 처리하였으며 대조군과 비교하여 그 유의성을 검정하였다.

이상의 검사 결과를 다음 표 2에 나타낸다.

실험 동물군	체중변화		트랜스아미나제				알칼라인포스파타제		빌리루빈		조직학적 소견
	체중변화		SGPT		SGOT		알칼라인포스파타제		빌리루빈
	전	후	전	후	전	후	전	후	전	후
대조군	200 ±6.5	236 ±9.3	36.4 ±2.21	37.6 ±2.12	24.7 ±2.12	30.6 ±2.26	82.5 ±3.24	80.3 ±3.87	0.1 ±0.02	0.1 ±0.02	정상
시험군	200 ±6.5	242 ±9.4	32.6 ±2.12	36.8 ±2.52	28.3 ±2.11	26.6 ±2.41	80.5 ±3.80	78.4 ±3.62	0.1 ±0.02	0.1 ±0.02	정상

위 표 2에서 보듯이, 본 발명 조성물의 0.1% 수용액이 투여된 시험군은 대조군에 비하여 유의적인 변화를 나타내지 않았으며, 조직학적 소견으로도 이상을 발견할 수 없었다. 또한, 동 기간 중 체중의 상승 정도도 대조군과 시험군에서 유의적인 차이가 없었다.

효과시험예 3: 마우스를 이용한 경구투여시의 급성 독성 시험

실험 동물로는 ICR 계통의 특정 병원균 부재(SPF) 마우스 수컷(4주령, 평균 체중 18 g, 20 마리)과 암컷(4주령, 평균체중 17 g, 20 마리)을 경북대학교 의과대학 동물실에서 입수하였으며, 7일 동안 순화시킨 후 일반 증상을 관찰하여 건강한 마우스를 사용하였다. 이때 마우스는 온도 23 ℃, 상대습도 50±10%, 환기 횟수 10 ∼20회/시간, 조명 시간 12 시간 및 조도 150∼300 Lux로 설정된 경북대학교 의과대학 동물실에서, 방사선(2.0 Mrad)으로 멸균된 실험 동물용 고형사료(제일사료주식회사)와 자외선 살균된 상수도수를 자유 섭취시켰다.

마우스를 아래 표 3과 같이 대조군, 100 ㎎/㎏ 투여군, 그리고 200 ㎎/㎏ 투여군의 3개 군으로 나누고 4시간 동안 절식시킨 후, 생리 식염수(대조군), 생리 식염수에 본 발명의 조성물 100 ㎎/㎏과 200 ㎎/㎏에 해당되는 양을 각각 녹인 것을 경구 투여용 존데와 1 ㎖용 주사관을 이용하여 위에 직접 투여하였다.

동물군	성별	동물수(마리수)	본 발명 조성물 투여량
대조군	수컷	5	0
대조군	암컷	5	0
100 ㎎/㎏ 투여군	수컷	5	100
100 ㎎/㎏ 투여군	암컷	5	100
200 ㎎/㎏ 투여군	수컷	5	200
200 ㎎/㎏ 투여군	암컷	5	200

투여 후 6 시간 동안에는 매시간 마다, 그리고 투여 익일부터 14일까지는 매일 1회 이상씩 일반 증상의 변화, 중독 증상 및 사망 동물의 유무를 관찰하였다. 그 결과 대조군, 100 ㎎/㎏ 투여군 및 200 ㎎/㎏ 투여군 모두에게 일반 증상의 변화, 중독 증상 및 사망 동물이 관찰되지 않았다.

또한, 투여 전과 투여 후 1, 3, 7 및 14 일째에 체중을 측정하였는데, 그 결과 대조군, 100 ㎎/㎏ 투여군 및 200 ㎎/㎏ 투여군 간 뚜렷한 체중 변화의 차이가 없었다.

다음에, 모든 생존 동물을 CO₂ 가스로 마취시키고 개복하여 발혈 치사시킨 후 육안으로 모든 내부 장기를 관찰하였다. 그 결과, 대조군, 100 ㎎/㎏ 투여군 및 200 ㎎/㎏ 투여군 모두에서 이상 소견이 관찰되지 않았다.

효과시험예 4: 오리 B형 바이러스 간염의 치료 효과

1980년 Mason 등(J. Virol., 36: 829-836, 1980)이 북경 오리의 간염 바이러스가 사람의 B형 간염 바이러스와 구조적으로나 생물학적으로 깊은 연관성이 있음을 보고하였으며, Robinxon(Ann. N. Y. Acad. Sci., 354: 371-378, 1980)은 북경 오리의 간염 바이러스(Duck Hepatitis B Virus, DHBV)가 사람의 B형 간염 바이러스와 같은 계열의 헤파드나바이러스(hepadnavirus임)을 밝혔다. 1987년에 Venkateswaran과 Blumberg 등(Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 274-278, 1987)은 오리의 B형 바이러스 간염을 치료할 수 있는 약제가 사람의 B형 바이러스 간염 치료제 개발(J. Med. Virology, 32: 212-218, 1990)

(1) 실험동물

본 실험에서는 White Pekin Duck(Ans domesticus)을 사용하였다. 오리가 알에서 깨어난 후 즉시 오리 B형 간염 바이러스(Duck hepatitis B Virus, DHBV)가 혈청 1 ㎖ 당 4 ±10⁹ 완전 바이러스 입자(complete virus particles)가 함유된 오리 혈청 257 ㎕씩을 족정맥에 주사하였다. 오리 간염 바이러스 접종 3주 후 족정맥에서 혈액을 채취하고, PCR(polymerase chain reaction) 법으로 오리 B형 간염 바이러스 DNA가 양성으로 나타난 오리, 즉 B형 간염 바이러스 보균 오리를 본 실험에 사용하였다.

(2) 투여 경로

본 발명 조성물의 치료 효과는 정맥주사로 실험하였다. 즉, 생후 3주된 B형 간염 바이러스 보균 오리를 대조군과 투여군으로 나누어 각 군당 10마리씩 배정하고, 체중 1 ㎏당 8.5 mg의 양을 4주 동안 족 정맥내에 투여하였으며, 대조군에 대해서는 생리적 식염수를 같은 양으로 주사하였다.

(3) PCR 법에 의한 오리 B형 간염 바이러스의 검출

바이러스 접종 후 3주일 째의 오리 혈청 60 ㎕에 GTC 용액(6M guanidium isothiocyanate, 5mM sodium citrate, 0.5% sarkosyl, 0.1M 2-mercaptoethanol) 540 ㎕, 3M 아세트산 나트륨(pH 5.0) 50 ㎕, 및 TES-포화된 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1, vol/vol/vol) 600 ㎕를 가하여 혼합한 후 실온에서 10,000 rpm으로 5분간 원침하였다. 상층을 다른 시험관에 덜어내고 동량의 TES-포화된 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 용액을 가하여 혼합한 후 원심분리하였다. 상층액을 취한 후 글리코겐 1 ㎕, 이소프로판올 0.6배 양을 가하여 -20 ℃에서 1시간 이상 방치하였다. 원침한 후 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하고 증류수에 녹여 PCR에 사용하였다.

프라이머는 Shanghai DHBV 콜론의 염기 배열 중 direct repaeat 영역에서 설정하여 DNA 합성기로 만들었다(antisense: 5`-GACCGCCTGATTGGACGGCT-3`, sense: 5`-TCTAAAGATCTTTTGCATC-3`). 분리한 DNA에 PCR 완충액, 1 mM의 각 dNTP, 20 pmol의 antisense 및 sense 프라이머, 그리고 0.5 단위의 Taq DNA 폴리머라제를 첨가하여 92 ℃ 30초, 37 ℃ 1분, 72 ℃ 2분으로 조정된 자동온도변환장치(Thermocycler)에서 40주기를 반응시켰다. 증폭된 DNA 5 ㎕를 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)가 함유된 2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 40분간 전기영동(100 volt)한 후 자외선 조사로 300 bp 위치의 형광띠를 확인하고 염색된 gel을 폴라로이드 카메라로 촬영하였다. 그 결과, 오리 B형 간염 바이러스를 주입한 전 동물의 혈청에서 DHBV-DNA, 즉 오리형 B형 간염 바이러스가 양성으로 나타났다.

(4) 혈청 중 오리 B형 간염 바이러스 DNA 측정

오리 혈청 15 ㎕에 동량의 2M NaCl을 가하고 30초 동안 가볍게 진탕한 후, 30 ㎕의 1N NaOH를 가하여 실온에서 10분 동안 마이크로플레이트 진탕기 (microplate shaker)로 진탕하였다. 니트로셀룰로스(Nitrocellulose) 필터를 20X SSC(1X SSC: 0.15M NaCl, 0.015M 구연산나트륨, pH 7.0) 용액에 10분 이상 적신 후 도트-블롯(dot-blot) 장치에 설치하고 흡입 펌프를 연결한 다음 상기 혼합액을 필터에 가하였다. 60 ㎕의 0.5M Tris-HCl, 2.5M NaCl 용액을 가하여 세척한 후 니트로셀룰로스 필터를 도트-블롯 장치에서 들어내어 3MM 와트만지에 얹어 37 ℃에서 30분 동안 건조시키고, 이어서 진공 오븐에서 80 ℃로 2시간 처리하였다. 처리된 필터를 prehybridization 용액(50% 포름아미드, 5X SSC, 5X Denhardt's solution, 초음파처리된 연어 정액 DNA 100 ㎍)에 넣어 42 ℃에서 3시간 prehybridization한 후 hybridization용 플라스틱 백에 넣고 적당량의 hybridization 완충액(50% 포름알데히드, 5X SSC, 5X Denhardt's solution, 연어 정액 DNA (20 ㎍/㎖))를 가한 후 DHBV-DNA 프로브(probe)를 섞고 42 ℃에서 하룻밤 동안 hybridization을 실시하였다. DHBV-DNA 프로브로는 pBR322에 클로닝된 3 kb의 DHBV-DNA(일본 시마네의대에서 제공)를 사용하였다. 즉, 프로브 DNA 500 ng에 dATP, dGTP, TTP, ³²P-dCTP(3000 Ci/mmol), DNA 폴리머라제를 섞어 실온에서 2시간 반응시키고 동위원소가 부착된 DNA를 세파덱스 50 컬럼(Sephadex 50 column)으로 정제하여 DHBV-DNA 프로브로 사용하였다.

Hybridization한 필터를 세척액(2X SSC, 0.2% SDS)으로 실온에서 10분씩 3차례 세척하고, 다른 세척액(0.1X SSC, 0.1% SDS)으로 50 ℃에서 30분씩 4차례 세척한 후, 이를 건조시켜 Kodak XAR-5 필름에 감광시켰다. 결과는 표준 DHBV-DNA의 감광강도와 비교하여 반정량하였다.

(5) 혈청 중 오리 B형 간염 바이러스의 DNA 폴리머라제 측정 방법

오리 혈청 0.1 ㎖를 0.01M 트리스-염산(pH 7.4)과 0.15M NaCl이 포함된 용액 2.4 ㎖와 혼합한 후, 4 ℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 2.5 ㎖의 30%(w/v) 수크로즈, 0.01M 트리스-염산(pH 7.4), 0.15M NaCl, 0.001M EDTA, 0.1% 2-머캅토에탄올(ME) 및 1 ㎎ 소혈청 알부민(BSA) 용액에 연층하여 Spino SW 50.1 rotor로 4 ℃에서 50,000 rpm으로 4 시간 동안 원심분리하였다. 상층을 제거한 후 펠렛을 50 ㎕의 0.01M 트리스-염산(pH 7.4), 0.15M NaCl, 1% NP-40 및 0.1% 2-ME 용액에 녹이고, 중합효소 혼합액[0.2M 트리스-염산(pH 7.4), 0.08M MgCl₂, 0.24M NH₄Cl, 1mM dATP, 1mM dTTP, 0.0025nM ³H-dCTP 및 0.0025nN ³H-dGTP(두 가지 모두 비활성 21Ci/mM)] 25 ㎕를 가하여 혼합하였다. 혼합액을 37 ℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, 반응액을 와트만 글라스 섬유 필터로 여과하였다. 여과지를 15% 트리클로로아세트산과 90% 에탄올로 세척하고 90 ℃ 오븐에서 20분 동안 건조시킨 후 scintillation cocktail(toluene, PCP, POPOP) 3 ㎖를 가하여 액체 신틸레이션 계측기로 4분 동안 방사능을 측정하여 결과를 dpm으로 나타내었다.

(6) 혈청 중 트랜스아미나제(transaminase) 활성도 측정법

혈청 중 GOT 활성도의 측정은 Reitman-Frankel의 방법에 따랐다. 즉, 기질액인 L-아스파라긴과 α-케토글루타르산을 37 ℃에서 5분 동안 방치한 후 표준액과 측정할 혈청 0.2 ㎖씩을 가하여 37 ℃에서 60분 동안 반응시키고, 다시 2,4-디니트로페닐 히드라진 용액 1 ㎖씩을 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응시키고, 발색시약인 0.4N NaOH 10 ㎖를 넣고 잘 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후, 분광광도계(Gilford 2600 spectrophotometer)를 이용하여 505 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 Karmen 단위/㎖로 나타내었다.

혈청 중 GPT 활성도의 측정은 다음과 같이 시행하였다: 먼저, α-케토글루타르산을 37 ℃에서 5분 동안 방치한 후 표준액과 측정할 혈청 0.2 ㎖씩을 가하여 37 ℃에서 60분 동안 반응시키고, 다시 2,4-디니트로페닐 히드라진 용액 1 ㎖씩을 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응시키고, 발색시약인 0.4N NaOH 10 ㎖를 넣고 잘 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후, 분광광도계(Gilford 2600 spectrophotometer)를 이용하여 505 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 Karmen 단위/㎖로 나타내었다.

(7) 간장의 조직학적 검사

본 발명의 조성물을 투여하고 4주 후에 족 정맥으로부터 혈액을 채취하고 오 리를 희생시켰다. 간장을 절취하여 10% 포르말린 액에 고정한 다음 파라핀 절편을 제작하고 헤마톡실린-에오신 염색을 실시하여 일반적 병리조직학적 방법에 따라 검경을 실시하였다.

(8) 혈청 중 DHBV-DNA와 DHBV-DNA 폴리머라제 및 트랜스아미나제의 변동

본 발명의 조성물을 오리 체중 kg 당 8.5 ㎎을 주 3회 4주간 주사하였으며, 투여 전후의 혈청 중 DHBV-DNA와 DHBV-DNA 폴리머라제 및 트랜스아미나제의 변동을 측정하였다.

다음 표 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 오리의 B형 바이러스 감염증에 대하여 본 발명 조성물을 주 3회 4주 동안 투여한 결과, 전 동물에서 DHBV-DNA가 사라졌으며, DHBV-DNA 폴리머라제 활성도도 측정되지 않았다.

동물 (오리)	혈청 중 DHBV-DNA(㎍/㎖)
동물 (오리)	치료전	2주 치료후	4주 치료후
대조군	22.4±10.82	23.2±9.22	24.5±10.38
투여군	19.8±8.26	4.6±2.72	0

동물 (오리)	혈청 중 DHBV-DNA 폴리머라제 활성도 (dpm/㎖)
동물 (오리)	치료전	2주 치료후	4주 치료후
대조군	72.3±12.25	82.3±12.07	87.2±16.56
투여군	86.4±15.53	18.3±6.24	0

또한, 본 발명 조성물 투여 4주 후, 간의 조직학적 소견은 대조군(비치료군)에서도 미약한 정도였으나, 치료군에서는 정상조직 소견을 나타내었다. 혈청 중 트랜스아미나제 활성도의 측정치에 있어서도 시험기간 중 대조군과 치료군 모두 정상치를 나타내었다.

효과시험예 5: 만성 B형 바이러스성 간염 환자에 대한 치료 효과

(1) 증례 1. α-인터페론 등을 포함하는 각종 치료제를 사용하여 치료되지 못한 B형 만성 활동성 간염 환자(남자, 42세, 회사원)에게 본 발명 조성물 8.5 ㎎/㎏을 3회로 나누어 매일 경구 투여하였다. 3개월 후 HBeAb 양성이 유도되었다. 치료전과 치료기간 중 HBV-DNA와 트랜스아미나제의 변동을 다음 표 6에 나타낸다.

치료기간	HBV 감염의 혈청검사 소견					트랜스아미나제
치료기간	HBsAg	HBsAb	HBeAg	HBeAb	HBV-DNA (pg/㎖)	GOT	GPT
치료전	+	-	+	-	92.40	98	11
치료1개월	+	-	-	-	0	46	-
치료2개월	+	-	-	+	0	26	30

*HBV-DNA는 애보트(Abbott)사 방법으로 검사

(2) 증례 2. 각종 치료제로 HBe 항체(HBeAb)를 유도하지 못한 55세 남자 회사원(발병시기: 유아시절)에 대하여, 본 발명 조성물 8.5 ㎎/㎏을 매일 경구 투여하여 만성 지속성 간염을 치료하였다. 치료전과 치료기간 중 HBV-DNA와 트랜스아미나제의 변동을 다음 표 7에 나타낸다.

치료기간	HBV 감염의 혈청검사 소견					트랜스아미나제
치료기간	HBsAg	HBsAb	HBeAg	HBeAb	HBV-DNA (pg/㎖)	GOT	GPT
치료전	+	-	+	-	48	78	84
2개월 치료후	+	-	+	-	0	21	37
3개월 치료후	+	-	-	+	0	24	35
5개월 치료후	+	-	-	-	0	23	32
7개월 치료후	+	-	-	+	0	28	29
9개월 치료후	+	-	-	+	0	22	27
15개월 치료후	+	-	-	+	0

위 표 7에서 보듯이, 본 발명 조성물 3개월 투여후 HBeAb가 유도되었다. 그 후 재발은 없었다.

(3) 증례 3. 비활동성 간염상태에서 활동성 간염상태로 이행한 예.

B형 간염 바이러스 보유자의 가족력을 가진 52세의 회사원으로, 별 증상 없이 생활하던 중 간단한 수술 후에 간기능 검사상 활동성 만성 B형 간염으로 진단되어 화학요법 등을 피하고 본 발명 조성물 투여를 선택하였다. 본 발명 조성물 8.5 ㎎/㎏을 매일 경구 투여로 5개월 치료후 HBeAb가 유도되었으며, 7개월 치료후 일단 치료를 중단하였으나 치료 중단 6개월 후에도 HBeAb 양성, HBV-DNA 음성을 나타내었다. 치료전과 치료기간 중 HBV-DNA와 트랜스아미나제의 변동을 다음 표 8에 나타낸다.

치료기간	HBV 감염의 혈청검사 소견					트랜스아미나제
치료기간	HBsAg	HBsAb	HBeAg	HBeAb	HBV-DNA (pg/㎖)	GOT	GPT
6개월전	+	-	-	-	< 5.8	36	42
4개월전	+	-	+	-	48	98	102
2개월전	+	-	+	-	78	111	120
치료시작	+	-	+	-	87	136	142
2개월 치료후	+	-	+	-	32	92	198
4개월 치료후	+	-	±	+	<	42	63
6개월 치료후	+	-	-	+	0	32	42
8개월 치료후	+	-	-	+	0	28	43

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이상 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따른 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌의 일정 비율 혼합물을 포함하는 조성물은 단독 사용시에 비해 DNA-폴리머라제 억제 작용이 우수하며, 오리의 B형 간염(DHBV) 치료 효과가 있을 뿐 아니라, 만성 B형 간염 환자들을 치료하여 HBeAb를 유도할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 경구용 제제 및 주사제로도 제형화할 수 있으며, 조성물 각 성분인 코리라진, 브레비폴린 카르복실산 및 안토시아닌은 진주초 뿐만 아니라 다른 몇 종류 식물에서 추출할 수도 있고 화학적 합성도 가능하다는 장점이 있다.

Claims

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진주초(Phyllanthus urinaria)로부터 얻어진 코리라진(Corilagin), 브레비폴린 카르복실산(Brevifolin carboxylic acid) 및 안토시아닌(Anthocyanin)의 5:2.5:1의 혼합물을 포함하는 B형 간염 치료제 조성물.