CN108689969B - 一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法 - Google Patents

一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，将溶于乙醇水溶液的乳香粗提物采依次用石油醚、二氯甲烷萃取，将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，将3:1洗脱的第1、2个流份通过C18吸附树脂色谱进行梯度洗脱。将C18柱的70％MeOH部位的第4个流份制备得到化合物Ⅰ；将C18柱的80％MeOH部位的第1个流份制备得到化合物Ⅱ；将3:1洗脱的第5个流份再通过C18吸附树脂色谱进行洗脱。将C18柱的70％MeOH部位的第2个流份制备得到化合物Ⅲ；将1:1洗脱的第3个流份制备得到化合物Ⅳ。所得化合物Ⅰ和Ⅱ具有抗炎活性，而且毒性低，具有良好的抗炎药物应用前景。

Description

一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法
技术领域
本发明涉及香木兰烷型二萜类化合物及其制备方法技术领域，具体涉及从乳香中提取的香木兰烷型二萜类化合物及提取方法。
背景技术
乳香为橄榄科乳香属植物卡氏乳香树Boswellia carterii Birdw.及同属植物鲍达乳香树Boswellia bhawdajiana Birdw.及野乳香树Boswellia neglecta M.Moore等的树脂，主产于索马里、埃塞俄比亚等地。中医认为其辛散温通，能活血行气、通经止痛、消肿生肌，临床上常用于治疗气血凝滞、心腹疼痛、痈疫肿毒、跌打损伤、痛经、产后瘀阻等。现代研究表明乳香具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等药理作用，是一种具有广泛开发前景的植物药。
本发明通过研究乳香的香木兰烷型二萜类成分，并对所获得的该类成分进行抗炎活性筛选，旨在获得显效的活性香木兰烷型二萜类化合物。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的从乳香中分离纯化出香木兰烷型二萜类化合物的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种香木兰烷型二萜类化合物，为化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ或化合物Ⅳ，其化学结构为：
Figure BDA0001661183280000011
优选的，化合物Ⅰ或化合物Ⅱ。
本发明的目的之二是提供一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为3:1的第1个流份Ⅰ和第2个流份Ⅰ合并后通过C18吸附树脂色谱，依次采用60％(体积)甲醇、70％(体积)甲醇进行第二次梯度洗脱，每个第二次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V′，每V′/4作为一个流份Ⅱ；
(5)采用C18柱将70％(体积)甲醇的第4个流份Ⅱ以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅰ，其中，检测波长为237nm；
所述化合物Ⅰ的结构式为
Figure BDA0001661183280000021
尤其是，V：V′为50：(32±0.1)。
本发明的目的之三是提供一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为3:1的第1个流份Ⅰ和第2个流份Ⅰ合并后通过C18吸附树脂色谱，依次采用60％(体积)甲醇、70％(体积)甲醇、80％(体积)甲醇进行第二次梯度洗脱，每个第二次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V′，每V′/4作为一个流份Ⅱ；
(5)采用C18柱将80％(体积)甲醇的第1个流份Ⅱ以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅱ，其中，检测波长为280nm；
所述化合物Ⅱ的结构式为
Figure BDA0001661183280000031
尤其是，V：V′为50：(32±0.1)。
本发明的目的之四是提供一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为3:1的第5个流份Ⅰ合并后通过C18吸附树脂色谱，依次采用60％(体积)甲醇、70％(体积)甲醇进行第二次梯度洗脱，每个第二次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V′，每V′/4作为一个流份Ⅱ；
(5)采用C18柱将70％(体积)甲醇的第2个流份Ⅱ以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅲ，其中，检测波长为240nm；
所述化合物Ⅲ的结构式为
Figure BDA0001661183280000032
尤其是，V：V′为50：(40±0.1)。
本发明的目的之五是提供一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1→1:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为1:1的第3个流份Ⅰ采用C18柱以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅳ，其中，检测波长为240nm；
所述化合物Ⅳ的结构式为
Figure BDA0001661183280000041
本发明的目的之六是提供一种上述香木兰烷型二萜类化合物在制备抗炎药物中的应用，尤其是化合物Ⅰ、Ⅱ在制备抗炎药物中的应用。
本发明的有益效果：
上述从乳香中分离纯化的新颖香木兰烷型二萜类化合物及其制备方法，乳香为原料，来源广泛，制备工艺简单，经济、安全，得率高，所得的4个化合物中的化合物Ⅰ、Ⅱ具有抗炎活性，具有良好的药用前景。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为boscartol K的HRESIMS；
图2为boscartol K的1H NMR；
图3为boscartol K的13C NMR；
图4为boscartol K的CD谱；
图5为boscartol L的HRESIMS；
图6为boscartol L的1H NMR；
图7为boscartol L的13C NMR；
图8为boscartol L的CD谱；
图9为boscartol M的HRESIMS；
图10为boscartol M的1H NMR；
图11为boscartol M的13C NMR；
图12为boscartol M的CD谱；
图13为boscartol N的HRESIMS；
图14为boscartol N的1H NMR；
图15为boscartol N的13C NMR；
图16为boscartol N的CD谱；
图17为boscartol K的IC50曲线；
图18为boscartol L的IC50曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本申请中记载的“％(体积)乙醇”是指乙醇水溶液中乙醇的体积百分比，“％(体积)甲醇”是指甲醇水溶液中甲醇的体积百分比。
正如背景技术所介绍的，现有技术无法从乳香中提取结构新颖的香木兰烷型二萜类化合物，从而难以对结构新颖的香木兰烷型二萜类化合物进行抗炎活性筛选，基于此，本申请提出了一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法。
本申请的一种实施方式，提供了一种香木兰烷型二萜类化合物，为化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ或化合物Ⅳ，其化学结构为：
Figure BDA0001661183280000051
Figure BDA0001661183280000061
优选的，化合物Ⅰ或化合物Ⅱ。通过实验发现，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ具有抗炎活性。
本申请的一种分离纯化的实施方式，提供了一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为3:1的第1个流份Ⅰ和第2个流份Ⅰ合并后通过C18吸附树脂色谱，依次采用60％(体积)甲醇、70％(体积)甲醇进行第二次梯度洗脱，每个第二次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V′，每V′/4作为一个流份Ⅱ；
(5)采用C18柱将70％(体积)甲醇的第4个流份Ⅱ以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅰ，其中，检测波长为237nm；
所述化合物Ⅰ的结构式为
Figure BDA0001661183280000062
尤其是，V：V′为50：(32±0.1)。
优选的，步骤(1)采用的乳香药材的质量与步骤(3)每个梯度洗脱液的总体积的体积比为1:1，g/mL。
优选的，步骤(1)采用的乳香药材粉碎至200～300目。
优选的，步骤(1)中去除溶剂的方法为依次进行减压旋蒸、冷冻干燥。
优选的，步骤(2)中去除溶剂的方法为减压旋蒸浓缩。
优选的，步骤(5)中流动相的流速为3±0.1mL·min-1。
本申请的另一种分离纯化的实施方式，提供了一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为3:1的第1个流份Ⅰ和第2个流份Ⅰ合并后通过C18吸附树脂色谱，依次采用60％(体积)甲醇、70％(体积)甲醇、80％(体积)甲醇进行第二次梯度洗脱，每个第二次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V′，每V′/4作为一个流份Ⅱ；
(5)采用C18柱将80％(体积)甲醇的第1个流份Ⅱ以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅱ，其中，检测波长为280nm；
所述化合物Ⅱ的结构式为
Figure BDA0001661183280000071
尤其是，V：V′为50：(32±0.1)。
优选的，步骤(1)采用的乳香药材粉碎至200～300目。
优选的，步骤(1)中去除溶剂的方法为依次进行减压旋蒸、冷冻干燥。
优选的，步骤(2)中去除溶剂的方法为减压旋蒸浓缩。
优选的，步骤(5)中流动相的流速为3±0.1mL·min-1。
本申请的第三种分离纯化的实施方式，提供了一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为3:1的第5个流份Ⅰ合并后通过C18吸附树脂色谱，依次采用60％(体积)甲醇、70％(体积)甲醇进行第二次梯度洗脱，每个第二次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V′，每V′/4作为一个流份Ⅱ；
(5)采用C18柱将70％(体积)甲醇的第2个流份Ⅱ以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅲ，其中，检测波长为240nm；
所述化合物Ⅲ的结构式为
Figure BDA0001661183280000081
尤其是，V：V′为50：(40±0.1)。
优选的，步骤(1)采用的乳香药材粉碎至200～300目。
优选的，步骤(1)中去除溶剂的方法为依次进行减压旋蒸、冷冻干燥。
优选的，步骤(2)中去除溶剂的方法为减压旋蒸浓缩。
优选的，步骤(5)中流动相的流速为3±0.1mL·min-1。
本申请的第四种分离纯化的实施方式，提供了一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，
(1)将乳香药材粉碎后用95±0.5％(体积)乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于20±0.1％(体积)乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1→1:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为1:1的第3个流份Ⅰ采用C18柱以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅳ，其中，检测波长为240nm；
所述化合物Ⅳ的结构式为
Figure BDA0001661183280000091
优选的，步骤(1)采用的乳香药材粉碎至200～300目。
优选的，步骤(1)中去除溶剂的方法为依次进行减压旋蒸、冷冻干燥。
优选的，步骤(2)中去除溶剂的方法为减压旋蒸浓缩。
优选的，步骤(5)中流动相的流速为3±0.1mL·min-1。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
所述化合物Ⅰ～Ⅳ的制备方法，步骤如下：
(1)取5kg乳香药材，粉碎至200～300目，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h、1h、1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得乳香乙醇粗提物；
(2)将步骤1中乙醇粗提物适量20％乙醇-水超声打散，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水萃取段。
(3)将步骤2中所得二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为石油醚(PE)-乙酸乙酯(EtOAc)(100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1→1:1)，每个梯度洗脱5000mL，每1000mL为1个接收体积；
(4)将PE-EtOAc(3:1)洗脱的第1、2个流份再通过C18吸附树脂色谱，依次用60％、70％、80％、90％、100％MeOH/H2O进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3200mL，每800mL为1个接收体积，得到各洗脱部位。将C18柱的70％MeOH部位的第4个流份用CH3CN/H2O(38:62,v/v)进行制备(流速：3mL min-1；检测波长：237nm)得到化合物Ⅰ(6mg)；
(5)将C18柱的80％MeOH部位的第1个流份用CH3CN/H2O(38:62,v/v)进行制备(流速：3mL min-1；检测波长：280nm)得到化合物Ⅱ(5.2mg)；
(6)将PE-EtOAc(3:1)洗脱的第5个流份再通过C18吸附树脂色谱，依次用60％、70％、80％、100％MeOH/H2O进行洗脱，每个梯度洗脱4000mL，每1000mL为1个接收体积，得到各洗脱部位。将C18柱的70％MeOH部位的第2个流份用CH3CN/H2O(38:62,v/v)进行制备(流速：3mL min-1；检测波长：240nm)得到化合物Ⅲ(7mg)；
(7)将PE-EtOAc(1:1)洗脱的第3个流份用CH3CN/H2O(38:62,v/v)进行制备(流速：3mL min-1；检测波长：240nm)得到化合物Ⅳ(8mg)。
结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Agilent 5973N质谱仪和Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，NMR谱的测定，所得核磁数据见表1～2，鉴定4个新香木兰烷型二萜类化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的结构：
化合物Ⅰ：boscartol K，无色油状物，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 355.1933[M+Na]+(calcd for C20H28O4，355.1880),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅰ的分子式为C20H28O4。1H NMR谱显示3个甲基信号：1.18(3H,s,Me-11)，1.04(3H,s,Me-14)，1.81(3H,t,J＝1.5Hz,Me-20)，2个连氧氢信号：δH 3.30(1H,t,J＝3.2Hz,H-15)，5.10(1H,overlapped,H-16)，2个末端双键烯氢信号：δH 4.66(2H,d,J＝4.8Hz,H2-12)，1个烯氢信号：δH 7.28(1H,t,J＝1.5Hz,H-17)。13C NMR和HSQC、HMBC谱显示化合物Ⅰ共有20个碳原子，包括3个甲基，5个亚甲基(其中δC 106.6(C-12)与烯碳一致)，7个次甲基(其中δC 148.3(C-17)与羰基共轭烯碳一致，δC 76.4(C-15)和82.9(C-16)与连氧碳一致)和5个季碳(其中δC 174.2(C-19)与酯羰基一致，δC 153.7(C-10)和129.5(C-18)与取代烯碳一致，δC 79.4(C-4)与连氧碳一致)。比较化合物Ⅰ和boscartol I的1H和13C NMR数据，发现两者结构类似，主要的区别在于boscartol I的C-15位无OH取代，而化合物Ⅰ的C-15位有OH取代，通过C-15位的化学位移及HMBC相关信号：H-15与C-6，C-7，Me-14，C-16，C-17相关；H-16与C-13，C-15，C-17，C-18，C-19相关；Me-14与C-6，C-7，C-15相关，可进一步证明此结论。化合物Ⅰ的相对构型通过NOESY相关和耦合常数确定。在NOESY谱中，H-1与H-6，H-7相关；H-5与OH-4，Me-14相关；Me-11与H-6，H-7相关，以及H-5/H-1的耦合常数为10.8Hz，H-5/H-6的耦合常数为10.8Hz，表明H-1，H-6，H-7，Me-11为α构型，H-5，OH-4，Me-14为β构型。化合物Ⅰ中C-16的绝对构型通过CD谱中233nm处Cotton效应为Δε+7.74确定16R的绝对构型。此外，NOESY谱显示H-15与Me-14和H-16相关，以及H-15/H-16的耦合常数为2.4Hz，表明H-15和H-16为β构型。综上所述，化合物Ⅰ的结构确定为：(1R,4S,5S,6R,7R,13R,15S,16R)-4β,15α-dihydroxy-15-(3-methylfuran-2(5H)-one)aromadendr-10(12)-ene，命名为boscartol K，具体表征结果见图1～4。
化合物Ⅱ：boscartol L，无色油状物，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 331.1840[M-H]-(calcd for C20H28O4，331.1915),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅱ的分子式为C20H28O4。比较化合物Ⅱ和Ⅰ的1H NMR和13C NMR谱数据，发现两者结构类似，区别在于两者C-15位所连取代基不同，化合物Ⅱ中C-15所连取代基结构为5-methylfuran-3(2H)-one，而化合物Ⅰ中C-15位所连取代基结构为3-methylfuran-2(5H)-one结构。通过化合物Ⅱ中碳谱化学位移δC 206.4(C-17)，δC 178.3(C-19)和HMBC相关信号进一步证明以上结论。在HMBC谱中，H-15与C-6，C-7，C-16，C-17，Me-14相关；H-16与C-13，C-18，C-19相关；H-18与C-16，C-17，C-19相关；Me-19与C-17，C-18，C-19相关。化合物Ⅱ的NOESY谱显示的相关信号与化合物Ⅰ一致，表明化合物Ⅱ的C-1，C-4，C-5，C-6，C-7，C-13，C-15和C-16的相对构型与化合物Ⅰ一致。通过CD谱中230.5nm处Cotton效应为Δε+5.35确定16R的绝对构型。综上所述，化合物Ⅱ的结构确定为：(1R,4S,5S,6R,7R,13R,15S,16R)-4β,15α-dihydroxy-15-(5-methylfuran-3(2H)-one)aromadendr-10(12)-ene，命名为boscartol L，具体表征结果见图5～8。
化合物Ⅲ：boscartol M，无色油状物，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 327.1941[M+Na]+(calcd for C19H28O3，327.1931),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅲ的分子式为C19H28O3。比较化合物Ⅲ和Ⅰ的1H NMR和13C NMR谱数据，发现两者结构类似，区别在于两者C-15位所连取代基不同，化合物Ⅲ中C-15所连取代基结构为but-3-en-2-one(δH-16 6.89，δC-16149.7；δH-17 6.15，δC-17 129.6；δC-18 198.5；δMe-19 2.19，δMe-19 27.3)，而化合物Ⅰ中C-15位所连取代基结构为3-methylfuran-2(5H)-one结构。通过HMBC谱中：H-16与C-13，C-15，C-17，C-18相关；H-17与C-13，C-15，C-16，C-18相关；Me-19与C-17，C-18相关；H-15与C-6，C-7，C-13，Me-14，C-16，C-18相关，和C-16(δC 149.7)、C-17(δC 129.6)、C-18(δC198.5)、C-19(δC27.3)的碳谱化学位移值，进一步证明化合物Ⅲ中C-15所连取代基结构为but-3-en-2-one。此外，在NOESY谱中，H-1与H-6，H-7相关；H-5与Me-14相关；H-6与H-1，Me-11，H-15相关；Me-11与H-1，H-6，H-7，H-15，H-16相关；H-15与H-6，H-7，H-17相关，以及H-5/H-1的耦合常数为10.8Hz和H-5/H-6的耦合常数为10.8Hz，确定C-1，C-4，C-5，C-6，C-7和C-13的构型与化合物Ⅰ和Ⅱ一致。化合物Ⅲ中C-16的绝对构型通过CD谱中237nm处Cotton效应为Δε+10.84确定15R的绝对构型。此外，NOESY谱显示H-16与Me-11、Me-19、H-15相关；H-17与Me-14、H-15相关；Me-19与Me-11相关，以及H-16/H-17的耦合常数为16.0Hz，确定16E的构型。综上所述，化合物Ⅲ的结构确定为：(1R,4S,5R,6R,7S,15R,16E)-4β-hydroxy-15-(3-oxo-1-butenyl)-aromdendr-10(12)-en，命名为boscartol M，具体表征结果见图9～12。
化合物Ⅳ：boscartol N，无色油状物，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 327.1986[M+Na]+(calcd for C19H28O3，327.1931),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅳ的分子式为C19H28O3。比较化合物Ⅳ和Ⅲ的1H NMR和13C NMR谱数据，发现两者结构极其类似，区别在于C-15位氢和碳的化学位移，化合物Ⅳ中为δH低场位移Δδ+0.16，δC高场位移Δδ-1.4，表明化合物Ⅳ为化合物Ⅲ的C-15位构型异构体。通过比较化合物Ⅳ和Ⅲ的NOESY谱发现两者C-1，C-4，C-5，C-6，C-7和C-13的构型一致。通过CD谱中230nm处Cotton效应为Δε-4.85确定15S的绝对构型。综上所述，化合物Ⅳ的结构确定为：(1R,4S,5R,6R,7R,15S,16E)-4β-hydroxy-15-(3-oxo-1-butenyl)-aromdendr-10(12)-en，命名为boscartol N，具体表征结果见图13～16。
表1.化合物Ⅰ～Ⅳ的1H NMR光谱数据(DMSO-d6,δppm,J,Hz)
Figure BDA0001661183280000121
aThe 1H NMR data were recorded in DMSO-d6at 600MHz.bThe 1H NMR datawere recorded in DMSO-d6at 400MHz.
表2.化合物Ⅰ～Ⅳ的13C NMR光谱数据(100MHz,DMSO-d6,δppm)
Figure BDA0001661183280000122
Figure BDA0001661183280000131
aThe 13C NMR data were recorded in DMSO-d6at 600MHz.bThe 3C NMR datawere recorded in DMSO-d6at 400MHz.
药理学实验：
1、实验材料
细胞株：RAW264.7小鼠巨噬细胞。
试剂与仪器：化合物Ⅰ～Ⅳ均由本课题组从乳香中分离得到；DMEM培养基(美国corning公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；MTT(美国Sigma公司)；青链霉素混合液(100×)(北京索莱宝科技有限公司)；LPS(美国Sigma公司)；Griess试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。
细胞培养箱(美国Thermo scientific)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)；多功能酶标仪(法国Tecan公司)；96孔细胞培养板(美国corning公司)。
2、试验方法
细胞复苏：采用快融法复苏细胞。取出液氮中冻存的细胞后，立即置37℃水浴中快速融化，避免冰晶缓慢损伤细胞。待融解后迅速转入到完全培养基(含10％FBS及1％青链霉素混合液)中培养，次日换液。
细胞培养：DEME完全培养基(含10％FBS及1％青链霉素混合液)中培养RAW264.7细胞，在培养箱(37℃，5％CO2)培养至细胞覆盖率达90％以上时传代，生长状态良好的细胞用于实验研究。
化合物对细胞的毒性：用MTT法进行评价，取RAW264.7小鼠巨噬细胞，计数，接种到96孔细胞培养板中(2×105/孔)，培养24h。实验分为阴性对照组，LPS组，给药组和阳性对照组(地塞米松)，阴性对照组中只加入培养基，LPS组中只加入1μg/mL的LPS，阳性对照组中加入1μg/mL的LPS和20μM的地塞米松，给药组中加入1μg/mL的LPS和20μM的待测样品。每孔加入新鲜配置的含5.0mg/mL MTT的无血清培养基，37℃下继续培养4h后，除去上清夜。每孔加入150μL DMSO溶解formazan沉淀。在Perkin Elmer EnSpire型酶标仪上测定570nm处的光密度值。
抗炎活性：取RAW264.7小鼠巨噬细胞，计数，接种到96孔细胞培养板中(2×105/孔)。采用含有10％牛胎血清、1％青链霉素混合液的DMEM培养基，将细胞在37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中贴壁24h。实验分为阴性对照组，LPS组，给药组和阳性对照组(地塞米松)，阴性对照组中只加入培养基，LPS组中只加入1μg/mL的LPS，阳性对照组中加入1μg/mL的LPS和五个不同浓度的地塞米松，给药组中加入1μg/mL的LPS和五个不同浓度的待测样品，五个浓度梯度分别为：20、10、5、2.5、1.25μM。取出上清液60μL,加入Griess试剂10分钟后，用酶标仪在波长570nm处测定各化合物的OD值，重复测定3次，计算相应的NO生成抑制率和IC50值。
3、实验结果
从上述实验结果可以看知，化合物Ⅰ～Ⅳ对LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞的NO释放均表现出抑制作用，其IC50分别为2.22、1.10、8.72和6.20μM，MTT法测得化合物Ⅰ～Ⅳ浓度为20μM时对RAW264.7细胞的抑制率为5.5％、2.1％、15.1％和29.0％。对照药地塞米松的IC50分别为2.0μM。从以上数据看，化合物Ⅰ和Ⅱ对RAW264.7小鼠巨噬细胞的IC50值小于或率高于对照药地塞米松，且细胞毒性低，具有明显的抗炎活性(IC50曲线见图17和18)，而化合物Ⅲ和Ⅳ对RAW264.7小鼠巨噬细胞的IC50值高于对照药地塞米松，且细胞毒性高，不具有抗炎活性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种香木兰烷型二萜类化合物，其特征是，为化合物Ⅰ、化合物Ⅱ，其化学结构为：
Figure FDA0002362780250000011
2.一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，其特征是，
(1)将乳香药材粉碎后用体积含量为95±0.5％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于体积含量为20±0.1％乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为3:1的第1个流份Ⅰ和第2个流份Ⅰ合并后通过C18吸附树脂色谱，依次采用体积含量为60％甲醇、体积含量为70％甲醇进行第二次梯度洗脱，每个第二次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V′，每V′/4作为一个流份Ⅱ；
(5)采用C18柱将体积含量为70％甲醇的第4个流份Ⅱ以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅰ，其中，检测波长为237nm；
所述化合物Ⅰ的结构式为
Figure FDA0002362780250000012
3.一种分离纯化乳香中香木兰烷型二萜类化合物的方法，其特征是，
(1)将乳香药材粉碎后用体积含量为95±0.5％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2±0.1h、1±0.1h、1±0.1h，合并滤液，去除溶剂，得乳香粗提物；
(2)将乳香粗提物均匀分散于体积含量为20±0.1％乙醇中，依次采用石油醚、二氯甲烷进行萃取分别获得石油醚萃取段、二氯甲烷萃取段，将二氯甲烷萃取段中的溶剂去除获得二氯甲烷萃取物；
(3)将二氯甲烷萃取物溶解于二氯甲烷中，通过硅胶色谱柱进行第一次梯度洗脱，梯度洗脱液为石油醚与乙酸乙酯的混合液，石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比依次为：100:0→100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→3:1，每个第一次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V，每V/5作为一个流份Ⅰ；
(4)将石油醚与乙酸乙酯的梯度体积比为3:1的第1个流份Ⅰ和第2个流份Ⅰ合并后通过C18吸附树脂色谱，依次采用体积含量为60％甲醇、体积含量为70％甲醇、体积含量为80％甲醇进行第二次梯度洗脱，每个第二次梯度洗脱液的总体积均相同，记为V′，每V′/4作为一个流份Ⅱ；
(5)采用C18柱将体积含量为80％甲醇的第1个流份Ⅱ以乙腈和水体积比为38:62的溶液作为流动相进行制备，获得化合物Ⅱ，其中，检测波长为280nm；
所述化合物Ⅱ的结构式为
Figure FDA0002362780250000021
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征是，步骤(1)采用的乳香药材的质量与步骤(3)每个梯度洗脱液的总体积的比值为1:1g/mL。
5.如权利要求2或3所述的方法，其特征是，步骤(1)采用的乳香药材粉碎至200～300目。
6.如权利要求2或3所述的方法，其特征是，步骤(1)中去除溶剂的方法为依次进行减压旋蒸、冷冻干燥；步骤(2)中去除溶剂的方法为减压旋蒸浓缩。
7.如权利要求2或3所述的方法，其特征是，步骤(5)中流动相的流速为3±0.1mL·min-1。
8.一种香木兰烷型二萜类化合物在制备抗炎药物中的应用，其特征是，该香木兰烷型二萜类化合物为化合物Ⅰ，其化学结构为：
Figure FDA0002362780250000031
9.一种香木兰烷型二萜类化合物在制备抗炎药物中的应用，其特征是，该香木兰烷型二萜类化合物为化合物Ⅱ，其化学结构为：
Figure FDA0002362780250000032
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