CN101914128B

CN101914128B - 醉鱼草苷iv的制备方法及其产品和应用

Info

Publication number: CN101914128B
Application number: CN2010102585346A
Authority: CN
Inventors: 陈月圆; 李典鹏; 文永新; 黄永林; 吴建璋; 卢凤来; 刘金磊
Original assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Current assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: CN101914128A

Abstract

本发明公开了一种醉鱼草苷Ⅳ的制备方法及其产品和应用。其中醉鱼草苷Ⅳ的制备方法是取细风轮菜水提，提取液过滤后经大孔树脂柱粗分，水洗后用体积浓度为30％～50％的低碳醇洗脱，再用体积浓度为80％～100％低碳醇洗脱；收集体积浓度为80％～100％低碳醇的洗脱液，浓缩至浸膏，所得浸膏经硅胶、C18柱色谱分离，即得。与现有技术相比，本发明方法简单易控。本发明还公开了醉鱼草苷Ⅳ在制备治疗或预防肝纤维化的药中的应用。本发明以HSC-T6细胞为靶细胞，试验结果表明醉鱼草苷Ⅳ可通过抑制HSC-T6细胞增殖、降低细胞Hyp分泌及诱导细胞凋亡，从而达到抗肝纤维化的作用，且毒性低。

Description

醉鱼草苷IV的制备方法及其产品和应用

技术领域

本发明涉及中草药中活性成分的提取方法，具体涉及细风轮菜中活性成分醉鱼草苷Ⅳ的制备方法及其产品和应用。

背景技术

肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，表现为细胞外基质(ECM)大量合成、分泌，而降解绝对或相对不足，使ECM在肝脏内弥漫沉积。其起始于肝细胞坏死，随之是炎症反应、纤维生成介质释放、肝星状细胞激活，最终以肝脏结缔组织成分的合成与降解明显失去平衡。各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，其中25％～40％最终发展为肝硬化甚至肝癌。目前认为导致肝硬化的肝纤维化过程是可以被阻断和逆转的，因此在治疗慢性肝病的同时，积极治疗肝纤维化是防止肝硬化发生的重要治疗措施，不仅能减轻肝脏损害程度，而且能防止肝硬化的发生。近几十年来，人们一直在寻找治疗或预防肝纤维化的药物，并已开发出一些治疗肝纤维化的药物，化学药物有秋水仙碱和氧化苦参碱等；中药有丹参注射液、软肝片等；生物制品有干扰素、促肝细胞生长素等。但这些药物由于副作用或使用效果不佳等原因，未能达到令人满意的治疗效果。因此，研究和开发新型抗肝纤维化的药物十分需要。

细风轮菜(Clinopodium gracile(Benth.)Matsum.)为唇形科风轮菜属植物，别名塔花、瘦风轮、野薄荷等。天然资源丰富，具有清热解毒、活血功效，用于白喉，咽喉肿痛，肠炎，痢疾，乳腺炎，雷公藤中毒，外用治过敏性皮炎等。日本学者对该植物进行了化学成分的研究(Chem.Pharm.Bull.，1993，41(7)：1270-1274)，采用水提取、提取液过大孔树脂柱、先水洗后用50％甲醇洗脱再用纯甲醇洗脱，甲醇洗脱液浓缩成浸膏，浸膏采用制备HPLC的方法，柱子为ODS型号，流动相为乙腈∶水(30∶70～40∶60，梯度洗脱)，从该植物中分离得到醉鱼草苷Ⅳ，得出其分子式为C₄₈H₇₈O₁₈，分子量为942，化学名称为(3β，4α，16β)-13，28-Epoxy-16，23-dihydroxyolean-1-en-3-yl-3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-fucopyranoside)}，结构式如下式所示：

但该学者并未对其活性进行研究。

也有韩国学者从国外特有植物(pleurospermum kamtschaticum)中分离得到了醉鱼草苷IV，同时研究了其在抑制NO、PGE2和TNF-α因子方面具有显著抗炎效果，同时其也被发现在醋酸扭体、热板致痛有明显镇痛作用(Bri JPharm，2006，148(2)：216-225)。此外，该团队也采用poloxamer-407、TritonWR-1339、高胆固醇饮食等作为诱导剂，醉鱼草苷IV具有显著的抑制高胆固醇血症和高脂血症，其效果与普罗布考相当(J Ethno，2007，112(2)：255-261)。但关于醉鱼草苷IV在抗肝纤维化药理活性，对肝纤维细胞的增殖活性干预作用未见报道及专利公开。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种醉鱼草苷Ⅳ的制备方法，该方法得到的产品，以及醉鱼草苷Ⅳ在制备治疗或预防肝纤维化的药中的应用。

本发明所述的醉鱼草苷Ⅳ的制备方法，它是取细风轮菜干药材水提，提取液经大孔树脂柱粗分，水洗后用体积浓度为30％～50％的低碳醇洗脱，再用体积浓度为80％～100％低碳醇洗脱；收集体积浓度为80％～100％低碳醇的洗脱液，浓缩至浸膏，所得浸膏经硅胶、C18柱色谱分离，即得。

上述醉鱼草苷Ⅳ的制备方法，具体包括以下步骤：

1)提取：取细风轮菜干药材，加水煎煮提取1～3次，过滤，合并提取液；

2)吸附洗脱：提取液过大孔树脂柱，水洗至流出液无色，然后用体积浓度为30％～50％的低碳醇洗柱至流出液为浅黄色，再用体积浓度为80％～100％的低碳醇洗柱，收集体积浓度为80％～100％低碳醇的洗脱液A，减压浓缩至浸膏；

3)分离纯化：浸膏用适量甲醇溶解，加硅胶拌匀、烘干，用硅胶干法上柱，洗脱剂洗脱，薄层层析检测，收集洗脱液B；洗脱液B再经C18柱层析，用体积浓度为30％～80％的甲醇洗脱，薄层层析检测，收集洗脱液C；其中，所述的洗脱剂为氯仿∶甲醇∶水的体积比＝6～8∶2～4∶0.5～1的混合溶剂，或者是氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水的体积比＝35～45∶15～25∶30～40∶2～4的混合溶剂；

4)结晶：洗脱液C浓缩，重结晶，即得醉鱼草苷Ⅳ。

为了减少大孔树脂的堵塞，可将提取液先用80～100目滤布粗滤，再用离心机离心分离，所得上清液再过大孔树脂柱。所述离心机的转速可为500～4000r/min。

上述方法中，

所述低碳醇为甲醇、乙醇或丙醇。

大孔树脂的型号为D101、AB-8、HPD100、HPD400或HP-20。

步骤1)中，水的加入量为干药材重量的3～10倍，每次提取的时间为0.5～3.0h；提取之前可先将药材粉碎，以有利于活性成分的提出，粉碎的粒度以10～200目为好。

步骤2)中，水的用量一般是柱体积的3～10倍；体积浓度为30％～50％的低碳醇的用量一般是柱体积的3～8倍；体积浓度为80％～100％的低碳醇的用量为柱体积的3～8倍。

步骤3)中，溶解浸膏用的甲醇的体积浓度为80％～100％，优选100％。

步骤4)中，结晶所用的溶剂为体积浓度为30％～50％的甲醇、乙醇或丙酮。

本发明还包括由上述方法制备得到的醉鱼草苷Ⅳ。

本发明还包括醉鱼草苷Ⅳ在制备治疗或预防肝纤维化的药中的应用。

用于治疗或预防肝纤维化的药物组合物，其中含有治疗有效量的醉鱼草苷Ⅳ和药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明醉鱼草苷Ⅳ的制备方法简单易控，得率高。此外本发明对已知化合物醉鱼草苷Ⅳ发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，本发明以HSC-T6细胞为靶细胞，试验结果表明醉鱼草苷Ⅳ可通过抑制HSC-T6细胞增殖、降低细胞Hyp分泌及诱导细胞凋亡，从而达到抗肝纤维化的作用，且毒性低；可做成胶囊、片剂、冲剂、注射剂等剂型。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用上述方法制得的醉鱼草苷Ⅳ进行抗肝纤维化药理试验。

肝星状细胞(HSC)在肝纤维化病理过程中起着十分关键的作用，HSC的增殖和活化是肝纤维化发生的细胞学基础，是各种病因肝纤维化发生的共同中心环节。通过观察药物对HSC细胞功能和形态的影响来研究药物抗肝纤维化的作用机制是近年来开展的一项新技术，更可用于抗肝纤维化药物的筛选。

一、醉鱼草苷Ⅳ的制备：同实施例2。

二、醉鱼草苷Ⅳ对HSC-T6细胞增殖的影响

将冷冻保存于超低温冰箱中的HSC-T6复苏后接种于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液中，37℃、5％CO₂条件下培养。当细胞呈单层致密状时，0.25％胰蛋白酶消化后传代。每次试验均在呈指数生长的细胞中进行。

将HSC-T6以1×10⁵/ml接种于96孔板，培养12h后，换含40、20、10、5、2.5μg/ml醉鱼草苷Ⅳ的培养液，每个浓度设5个复孔。继续培养20h后，各孔加入MTT 20μl，继续培养4h，吸出全部液体，加入100μlDMSO，微量振荡器上振荡5min，于酶标仪双波长(570nm，630nm)比色。抑制率＝(对照孔-给药孔)/对照孔×100％。实验结果见表1。

表1 醉鱼草苷Ⅳ对HSC-T6细胞增殖的影响

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果表明：醉鱼草苷Ⅳ各剂量组均可不同程度地抑制HSC-T6的增殖，且呈明显的量效关系。其中，80、40、20μg/ml的吸光度均数与空白对照组比较，具有显著的抑制作用。

三、醉鱼草苷Ⅳ对细胞毒性的影响

将HSC-T6以1×10⁵/ml接种于12孔板，培养12h后，换含20、14、9.8、6.86μg/ml醉鱼草苷Ⅳ及6.25μg/ml秋水仙碱的培养液，每个浓度设4个复孔。继续培养24h后，吸取上清液，采用乳酸脱氢酶(LDH)测试盒测定上清液中LDH含量。实验结果见表2。

表2 醉鱼草苷Ⅳ对HSC-T6细胞毒性的影响

药物剂量(μg/ml) LDH含量(U/ml)

20 828.66±144.96

14 704.05±69.94

9.8 693.15±122.24

6.86 601.25±211.26

秋水仙碱(6.25) 1582.55±341.75**

空白对照 658.88±22.39

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果表明：给予醉鱼草苷Ⅳ 20、14、9.8、6.86μg/ml后，细胞上清液中LDH含量与空白对照组比较，无统计学，说明药物在此浓度下对细胞无毒。而秋水仙碱组与空白对照组比较，具有显著性差异，证明秋水仙碱毒性较大。

四、醉鱼草苷Ⅳ对细胞上清液羟脯氨酸含量的影响

将HSC-T6以1×10⁵/ml接种于12孔板，培养12h后，换含20、14、9.8、6.86μg/ml醉鱼草苷Ⅳ及6.25μg/ml秋水仙碱的培养液，每个浓度设4个复孔。继续培养24h后，吸取上清液，采用羟脯氨酸测试盒测定上清液中羟脯氨酸(Hyp)的含量。实验结果见表3。

表3 醉鱼草苷Ⅳ对HSC-T6细胞Hyp的影响

药物浓度(μg/ml) 羟脯氨酸含量(μg/ml)

20 27.66±1.16**

14 28.24±2.34**

9.8 28.47±1.05**

6.86 30.39±3.91

秋水仙碱(6.25) 25.56±1.51**

空白对照 34.47±1.83

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果表明，醉鱼草苷Ⅳ20、14、9.8μg/ml三个浓度及秋水仙碱对细胞分泌Hyp具有显著的抑制作用，与空白组比较，具有统计学意义。

五、醉鱼草苷Ⅳ对细胞凋亡的影响

实验步骤：

①将HSC-T6细胞以1×10⁵/ml接种于50ml培养瓶中，分为空白对照组、秋水仙碱阳性组、醉鱼草苷Ⅳ 20、14、9.8、6.86μg/ml组，每组1瓶。12h后，细胞贴壁生长良好。换含各药物的培养液，继续培养24h。

②采用流式细胞术测定药物对细胞凋亡的影响。实验结果见表4。

表4 醉鱼草苷Ⅳ对HSC-T6凋亡的影响

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果表明：20、14、9.8μg/ml的醉鱼草苷Ⅳ皂苷及秋水仙碱对HSC-T6具有显著的诱导凋亡作用。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：醉鱼草苷Ⅳ的制备

1)取细风轮菜干药材1.1kg，粉粹至10目，加入原料重量5倍的水煎煮提取2h，过滤得提取液；

2)提取液上HP-20大孔树脂柱，用8倍柱体积去离子水洗，然后用5倍柱体积的50％(v/v)甲醇洗脱，再用5倍柱体积的100％(v/v)甲醇洗脱，收集100％(v/v)甲醇洗脱的洗脱液A，减压回收甲醇，得浸膏；

3)浸膏用适量甲醇100％(v/v)溶解至透亮溶解拌硅胶，干法上硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶水的体积比＝7∶3∶0.5的混合溶剂洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液B；洗脱液B浓缩成浸膏后上C18柱，用50％(v/v)的甲醇洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液C；

4)洗脱液C浓缩至干，用50％(v/v)的甲醇重结晶，得到白色针状晶体4.4g，即为醉鱼草苷Ⅳ。

实施例2：醉鱼草苷Ⅳ的制备

1)取细风轮菜干药材1.0kg，粉粹至50目，加入原料重量5倍的水煎煮提取3h，过滤得提取液；

2)提取液上HPD100大孔树脂柱，用8倍柱体积去离子水洗，然后用8倍柱体积的50％(v/v)乙醇洗脱，再用8倍柱体积的95％(v/v)乙醇洗脱，收集95％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液A，减压回收甲醇，得浸膏；

3)浸膏用适量甲醇100％(v/v)溶解至透亮溶解拌硅胶，干法上硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水的体积比＝40∶20∶35∶3的混合溶剂洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液B；洗脱液B浓缩成浸膏后上C18柱，用80％(v/v)的甲醇洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液C；

4)洗脱液C浓缩至干，用50％(v/v)的甲醇重结晶，得到白色针状晶体4.8g，即为醉鱼草苷Ⅳ。

实施例3：醉鱼草苷Ⅳ的制备

1)取细风轮菜干药材1.0kg，粉粹至200目，加水煎煮提取2次，第一次提取2h(水的加入量为干药材重量的6倍)，第二次提取1h(水的加入量为干药材重量的3倍)，合并提取液；

2)提取液先用80目滤布粗滤，再经离心机离心分离(1000r/min)，收集上清液；

2)上清液上AB-8大孔树脂柱，先用4倍柱体积去离子水洗，然后用8倍柱体积的35％(v/v)甲醇洗脱，再用4倍柱体积的90％(v/v)甲醇洗脱，收集90％(v/v)甲醇洗脱的洗脱液A，减压回收甲醇，得浸膏；

3)浸膏用适量甲醇80％(v/v)溶解至透亮溶解拌硅胶，干法上硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶水的体积比＝6∶4∶0.5的混合溶剂洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液B；洗脱液B浓缩成浸膏后上C18柱，用35％(v/v)的甲醇洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液C；

4)洗脱液C浓缩至干，用40％(v/v)的乙醇重结晶，得到白色针状晶体4.5g，即为醉鱼草苷Ⅳ。

实施例4：醉鱼草苷Ⅳ的制备

1)取细风轮菜干药材1.0kg，粉粹至20目，加水煎煮提取2次，第一次提取3h(水的加入量为干药材重量的10倍)，第二次提取0.5h(水的加入量为干药材重量的1倍)，合并提取液；

2)提取液先用100目滤布粗滤，再经离心机离心分离(2000r/min)，收集上清液；

2)上清液上D101大孔树脂柱，先用去离子水洗流出液至无色，然后用40％(v/v)甲醇洗树脂柱至流出液为浅黄色，再用3倍柱体积的80％(v/v)乙醇洗脱，收集80％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液A，减压回收甲醇，得浸膏；

3)浸膏用适量甲醇90％(v/v)溶解至透亮溶解拌硅胶，干法上硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水的体积比＝35∶25∶35∶4的混合溶剂洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液B；洗脱液B浓缩成浸膏后上C18柱，用40％(v/v)的甲醇洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液C；

4)洗脱液C浓缩至干，用30％(v/v)的丙酮重结晶，得到白色针状晶体4.2g，即为醉鱼草苷Ⅳ。

实施例5：醉鱼草苷Ⅳ的制备

1)取细风轮菜干药材1.0kg，加水煎煮提取3次，第一次提取1h(水的加入量为干药材重量的3倍)，第二次提取1h(水的加入量为干药材重量的3倍)，第三次提取0.5h(水的加入量为于药材重量的2倍)，合并提取液；

2)提取液上HPD400大孔树脂柱，用5倍柱体积去离子水洗，然后用6倍柱体积的45％(v/v)丙醇洗脱，再用8倍柱体积的85％(v/v)丙醇洗脱，收集85％(v/v)丙醇洗脱的洗脱液A，减压回收甲醇，得浸膏；

3)浸膏用适量100％(v/v)甲醇溶解至透亮溶解拌硅胶，干法上硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶水的体积比＝8∶3∶1的混合溶剂洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液B；洗脱液B浓缩成浸膏后上C18柱，用60％(v/v)的甲醇洗脱，TLC薄层检测，收集洗脱液C；

4)洗脱液C浓缩至干，用50％(v/v)的乙醇重结晶，得到白色针状晶体5.5g，即为醉鱼草苷Ⅳ。

Claims

1.醉鱼草苷IV在制备治疗或预防肝纤维化的药中的应用。

2.用于治疗或预防肝纤维化的药物组合物，其中含有治疗有效量的醉鱼草苷IV和药学上可接受的载体。