CN108164579A - 一种从重楼的地上部分提取分离重楼皂苷h的方法 - Google Patents

Abstract

一种从重楼的地上部分提取分离重楼皂苷H的方法，包括以下步骤：步骤S1、将重楼药材的地上部分粉碎，用70%乙醇回流提取，合并提取液，真空浓缩，滤过；步骤S2、将步骤S1的上清液上大孔吸附树脂柱，用30%乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用70%乙醇洗脱，将70%乙醇洗脱液合并，浓缩；步骤S3、将步骤S2的粗提取物与硅胶拌样后进行硅胶柱层析，采用乙酸乙酯：乙醇=3:1进行洗脱，将含有重楼皂苷H成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；步骤S4、将步骤S3的重楼皂苷H粗品用60%甲醇溶解，上ODS柱洗脱，弃去洗脱液，再用70%甲醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸仪减压浓缩。该方法使废弃的重楼地上部分得以再度利用，且采用的提取溶剂毒性小，工艺简便可行，适用于工业化大生产。

Description

一种从重楼的地上部分提取分离重楼皂苷H的方法

技术领域

本发明属于药用植物活性成份的提取技术领域，具体涉及一种从重楼药材的地上部分中提取分离重楼皂苷H的方法。

背景技术

重楼为百合科，属多年生草本植物，全世界共有27种，我国有25种，其中有19种分布于我国西南地区，多以根茎入药，是我国常用的传统中药，被历年版《中国药典》收载，《中国药典》2015年版收载重楼品种为七叶一枝花Paris polyphylla Smith Var. chinensis(Franch.) Hara和云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.的干燥根茎。重楼，味苦，性微寒，归肝经，有小毒，具有消肿止痛，清热解毒，息风定惊等功效，可用于跌打损伤，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，惊风抽搐等症。

重楼药材中主要含有甾体皂苷类化合物，目前已报道了近90个，根据结构类型主要分为偏诺甾体皂苷(pennogenin saponins)和薯蓣甾体皂苷(diosgenin saponins)，以及C-22内酯甾体皂苷、孕甾烷皂苷(pregnane saponins)和呋甾烷型甾体皂苷(furostanolsaponins)等，大多数甾体皂苷具有较强的药理和生理活性，具有抗肿瘤、止血、抗菌、消炎、镇痛、镇静、抑制血管生成、免疫调节、抗氧化、保护肝脏与肾脏等功效，临床方面重楼皂苷广泛应用于治疗肿瘤、泌尿系统感染和妇科血症等各类疾病的治疗。

近年来，许多学者对重楼皂苷的药理活性和临床应用进行深入而广泛的研究，为重楼皂苷的综合开发和利用开辟更广阔的前景。但由于重楼药材生产年限长，为贵重药材，药典收载用药部位为根茎，重楼药材的地上部分当做废料处理，所以受重楼药材资源的限制，影响了重楼皂苷的综合开发和利用。

重楼皂苷H是重楼皂苷的主要有效成分之一，也是重楼药材和含重楼药材制剂质量主要控制的有效成分之一，具有较好的止血活性，对妇科血症有较好的疗效。

重楼皂苷H的分离、制备主要来自于重楼药材化学成分分离和鉴定。目前主要采用半制备方法，以氯仿、甲醇或乙腈等溶剂为洗脱剂，最后通过多次甲醇结晶得到，所得最终产品易存在甲醇等有机溶剂残留。另外，由于氯仿、甲醇和乙腈溶剂毒性都比较大，易挥发，长时间使用对人体伤害也比较大，且对环境污染也比较严重，限制了其在工业上的大量使用，目前只适用于少量重楼皂苷H样品制备，不适宜规模化生产、制备重楼皂苷H。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从重楼的地上部分提取分离重楼皂苷H的方法，以解决现有从重楼药材中分离制备重楼皂苷H时所用的有机溶剂毒性大、对环境污染严重，无法规模化生产的技术难题。

为实现上述目的，本发明是采用如下技术方案实现的：

本发明经过多年研究发现，重楼药材地上部分重楼皂苷H的含量较高，因此，本发明打破传统采用重楼药材的根茎作为用药部位，将重楼药材的地上部分当做废料处理的观点，改为从废料（重楼药材的地上部分）提取分离重楼皂苷H，使重楼药材得到最大限度的应用。

本发明提供的一种从重楼的地上部分提取分离重楼皂苷H的方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、将干燥后的重楼药材的地上部分粉碎为粗粉，加入重量为重楼药材地上部分重量4-6倍，体积百分浓度为70%的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3h，提取温度为60-70℃，提取液经过滤，合并提取液，然后真空浓缩成含醇量30%~50%溶液，滤过，得滤液；

步骤S2、将步骤S1得到的滤液的上清液上大孔吸附树脂柱，先用重量为重楼药材地上部分重量2-4倍，体积百分浓度为30%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用重量为重楼药材地上部分重量2-4倍，体积百分浓度为70%的乙醇洗脱，将70% 的乙醇洗脱液合并，浓缩，即得富含重楼皂苷H的粗提取物；

步骤S3、将步骤S2得到的粗提取物与重量为粗提取物1.5-2倍的100~200目硅胶拌样后，上100~200目硅胶柱，进行硅胶柱层析，采用乙酸乙酯：乙醇=3:1进行洗脱，将含有重楼皂苷H成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干，得到重楼皂苷H粗品；

步骤S4、将步骤S3得到的重楼皂苷H粗品用体积百分浓度为60%的甲醇溶解，然后上ODS柱，先用60%甲醇洗脱，弃去洗脱液，再用70%甲醇洗脱，收集洗脱液，采用旋转蒸仪50℃减压浓缩至近干；

步骤S5、将步骤S4析出的沉淀用纯净水洗涤3次，所得沉淀部分真空干燥箱干燥处理，干燥温度为40-50℃，干燥时间为2-4h，即得含量大于98%的重楼皂苷H。

本发明的优点和有益效果为：

（1）本发明提供的从重楼药材的地上部分中提取分离重楼皂苷H的方法充分利用采收时一直被当做非药用部位舍弃的重楼药材地上部分，使废弃的资源得以再度利用，变废为宝，不仅弥补重楼药材市场缺口大的技术难题，还大大降低了重楼皂苷H的制备成本，具有较高的社会经济效益。

（2）与现有技术相比，本发明提取分离重楼皂苷H时所采用的提取溶剂为乙醇、甲醇、乙酸乙酯和水，毒性小，工艺简便可行，适用于工业化大生产，且所用溶剂易回收、可反复使用，对环境污染较小，所得最终产物经水洗后基本不含有机溶剂残留，所得的重楼皂苷H纯品为下一步药物的研发和应用奠定了基础。

附图说明

图1 为重楼皂苷H的质谱图。

图2 为重楼皂苷H的氢谱图。

图3 为重楼皂苷H的氢谱放大图之一。

图4 为重楼皂苷H的氢谱放大图之二。

图5 为重楼皂苷H的碳谱图。

图6 为重楼皂苷H的碳谱放大图之一。

图7 为重楼皂苷H的碳谱放大图之二。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

仪器与试药

仪器：BRUKER AV-500M型核磁共振仪（德国，布鲁克）；安捷伦6410型四级杆质谱仪（安捷伦科技有限公司）；Sartorius QUINTIX313-1CN型万分之一电子天平（Sartorius公司）；Sartorius MSE125s型十万分之一电子天平（Sartorius公司）。

试药与试剂：重楼地上部分药材（产地：云南维西县）；乙醇、甲醇、乙酸乙酯为分析纯；水为超纯水；大孔树脂HPD-100（河北沧州宝恩化工有限公司）；ODS柱（40~63μm,德国默克公司）。

实施例1

一种从重楼的地上部分提取分离重楼皂苷H的方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、将干燥后的重楼药材的地上部分粉碎为粗粉（10 kg），加入重量为重楼药材地上部分重量4-6倍（约50L），体积百分浓度为70%的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3h，提取温度为60-70℃，提取液经过滤，合并提取液，然后真空浓缩成含醇量30%~50%溶液，滤过，得滤液；

步骤S2、将步骤S1得到的滤液的上清液上大孔吸附树脂柱（5.0kg ，柱内径为15cm），先用重量为重楼药材地上部分重量2-4倍（约30 L），体积百分浓度为30%的乙醇洗脱（目的是去除叶绿素等杂质），弃去洗脱液；再用重量为重楼药材地上部分重量2-4倍（约30 L），体积百分浓度为70%的乙醇洗脱，将70% 的乙醇洗脱液合并，浓缩，即得富含重楼皂苷H的粗提取物，重量为48 g，纯度约30%；所述的大孔树脂为弱极性或非极性的聚苯乙烯型树脂，型号为D101、X-5、HPD-100或D1300；

步骤S3、将步骤S2得到的粗提取物与重量为粗提取物1.5-2倍（约80 g）的100~200目硅胶拌样后，上100~200目硅胶柱（1 kg；柱内径为8 cm），进行硅胶柱层析，采用乙酸乙酯：乙醇=3:1进行洗脱（目的是去除黄酮类以及部分甾体皂苷等杂质），洗脱剂用量约40 L，将含有重楼皂苷H成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干，得到重楼皂苷H粗品，重量为15g，纯度约80-90%；

步骤S4、将步骤S3得到的重楼皂苷H粗品用体积百分浓度为60%的甲醇溶解，然后上ODS柱( 1kg；柱内径为8cm)，先用60%甲醇5L洗脱（目的是去除其他甾体皂苷等杂质），弃去洗脱液，再用70%甲醇5L洗脱，收集洗脱液，采用旋转蒸仪50℃减压浓缩至近干，得到重楼皂苷H；

步骤S5、将步骤S4析出的沉淀用纯净水洗涤3次，每次100ml，所得沉淀部分真空干燥箱干燥处理，干燥温度为40℃，干燥时间为4h，即得含量大于98%的重楼皂苷H，产量为8.5 g。

重楼皂苷H的结构鉴定，详见图1至图7：

重楼皂苷H，白色结晶（甲醇），分子式为C₄₄H₇₀O₁₇，CAS登记号：81917-50-2；ESI-MS m/z：871.3 [M+H]⁺； 893.4[M+Na]⁺; [M+COOH]^-。

¹H-NMR (C₅D₅N，500 MHz) δ: 0.67 (3H，br s，CH₃-27)，0.95(3H， s， CH₃-18)，1.07 (3H，s，CH₃-19)，1.22 (3H，d， J = 5.5 Hz， CH₃-21)， 1.76 (3H，d，J = 4.5 Hz，CH₃-Rha)， 4.93 (1H，d，J = 6.0 Hz，Glc-H-1)，5.92 (1H，s，Ara-H-l)，6.28 (1H，s，Rha-H-1)，5.28 (1H， brs， H-6)。

¹³C-NMR (C₅D₅N，125 MHz) δ: 37.6 (C-1)，30.5 (C-2)，78.1 (C-3)，39.0 (C-4)， 140.8 (C-5)，122.0 (C-6)， 32.5 (C-7)， 31.8 (C-8)，50.3 (C-9)， 37.2 (C-10)，21.0 (C-11)， 32.1 (C-12)， 45.2 (C-13)，53.1 (C-14)，32.4 (C-15)，90.1 (C-16)，90.2 (C-17)， 17.2 (C-18)，19.5(C-19)，44.8 (C-20)，9.8 (C-21)， 109.6 (C-22)，32.1(C-23)， 28.8 (C-24)，30.5 (C-25)， 66.8 (C-26)，17.3 (C-27)， Glc: 100.1 (C-1′)，77.4 (C-2′)，77.7 (C-3′)，76.7 (C-4′)，77.0 (C-5′)，61.5 (C-6′)， Rha: 101.9 (C-1″)，72.5 (C-2″)，72.8 (C-3″)，74.2 (C-4″)， 69.5 (C-5″)， 18.7 (C-6″)，Ara: 109.8(C-1′′′)，82.7 (C-2′′′)，78.1 (C-3′′′)，86.7 (C-4′′′)，62.5 (C-5′′′)。其NMR数据与文献[景松松，王颖，李雪娇，黄璐琦，肖培根，高文远. 黑籽重楼化学成分及其抗肿瘤活性研究[J]. 中草药，2017，48(6)：1093-1098.]中的数据基本一致。

Claims (1)

1.一种从重楼的地上部分提取分离重楼皂苷H的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤S1、将干燥后的重楼药材的地上部分粉碎为粗粉，加入重量为重楼药材地上部分重量4-6倍，体积百分浓度为70%的乙醇，回流提取2～3次，每次1～3h，提取温度为60-70℃，提取液经过滤，合并提取液，然后真空浓缩成含醇量30%~50%溶液，滤过，得滤液；

步骤S2、将步骤S1得到的滤液的上清液上大孔吸附树脂柱，先用重量为重楼药材地上部分重量2-4倍，体积百分浓度为30%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用重量为重楼药材地上部分重量2-4倍，体积百分浓度为70%的乙醇洗脱，将70% 的乙醇洗脱液合并，浓缩，即得富含重楼皂苷H的粗提取物；

步骤S3、将步骤S2得到的粗提取物与重量为粗提取物1.5-2倍的100~200目硅胶拌样后，上100~200目硅胶柱，进行硅胶柱层析，采用乙酸乙酯：乙醇=3:1进行洗脱，将含有重楼皂苷H成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干，得到重楼皂苷H粗品；

步骤S4、将步骤S3得到的重楼皂苷H粗品用体积百分浓度为60%的甲醇溶解，然后上ODS柱，先用60%甲醇洗脱，弃去洗脱液，再用70%甲醇洗脱，收集洗脱液，采用旋转蒸仪50℃减压浓缩至近干；

步骤S5、将步骤S4析出的沉淀用纯净水洗涤3次，所得沉淀部分真空干燥箱干燥处理，干燥温度为40-50℃，干燥时间为2-4h，即得含量大于98%的重楼皂苷H。