CN105218442A

CN105218442A - 一种新的吡啶酮类生物碱及其制备方法

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Publication number: CN105218442A
Application number: CN201510589208.6A
Authority: CN
Inventors: 白皎; 裴月湖; 华会明; 李占林; 陈刚; 卞西清
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: CN105218442B

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及植物内生真菌<i>Trametes</i><i>？trogii</i>？发酵产物中提取分离的一种新的吡啶酮类生物碱及其在制备肿瘤细胞抑制剂中的应用。该化合物具有式I化学结构式，实验研究表明，它对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60和人乳腺癌细胞MCF-7具有较好的生长抑制作用，且其制备方法简单易行，重现性好，有利于对其进行进一步的药理和临床研究，开发其在制备肿瘤细胞抑制剂中的应用。

Description

一种新的吡啶酮类生物碱及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及从透骨草植物内生真菌Trametestrogii发酵产物中提取分离得到的一种新的吡啶酮类生物碱和制备方法及其在制备肿瘤细胞抑制剂中的用途。

背景技术

吡啶酮类生物碱是微生物特有的次级代谢产物，其主要从真菌中分离得到。本发明所涉及的化合物是由聚酮和氨基酸(亮氨酸、甘氨酸)通过乙酸途径形成的。该类化合物尚未有文献报道其抗肿瘤、抗菌等活性。且本发明所涉及的吡啶酮类生物碱迄今在国内外尚未见有相关专利或文献报道。

发明内容

本发明提供一种从透骨草植物内生真菌Trametestrogii(该菌株已保存在沈阳药科大学中药学院-80℃冰箱)发酵产物中提取分离得到的一种新的吡啶酮类生物碱和制备方法及其在制备肿瘤细胞抑制剂中的用途。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明是从植物内生菌次级代谢产物中寻找具有抗肿瘤活性的物质，对由中国各地区采集得到的微生物(细菌、真菌和放线菌)菌株进行筛选，发现真菌Trametestrogii发酵提取物具有较好的肿瘤细胞生长抑制活性，进而对该菌株进行大量培养发酵和代谢产物的系统分离，首次从中得到了本发明的化合物，并通过各种波谱手段鉴定其结构为吡啶酮类生物碱，如式I所示：

本发明还提供所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的制备技术方案包括如下步骤：

将分离自长白山透骨草植物内生真菌Trametestrogii进行大量发酵，发酵产物经过滤得到发酵液和菌丝体。发酵液经浓缩后，用乙酸乙酯萃取；菌丝体用80％-90％丙酮水溶液超声提取，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取。将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取物合并后，经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:4-100:6的洗脱物再经二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:3-100:4洗脱，洗脱物再经SephadexLH-20凝胶柱色谱，用甲醇洗脱，并经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积配比为60:40-50:50的甲醇-水溶液为流动相洗脱，得式I化合物。

其中，生产菌的发酵培养为：植物内生真菌Trametestrogii经复苏后，从斜面转移到装有培养液[培养基组成：甘露醇1.5-2.5％；葡萄糖1.5-2.5％；酵母膏0.3-0.6％；蛋白胨0.8-1.5％；KH₂PO₄0.05-0.08％；MgSO₄·7H₂O0.03-0.05％；玉米浆0.1-0.2％；自来水配制]的三角瓶中，于25-30℃摇床上160-180rpm振荡培养2-3天后作为种子培养液。然后将种子液按5-10％的接种量接种到含有新鲜、灭菌的真菌4号(培养基组成如上)液体培养基的三角瓶中，在室温条件下静置培养,获得发酵培养液。

式I化合物为黄色油状物质(甲醇),10％硫酸乙醇溶液(v/v)不显色。HR-ESI-MS中给出准分子离子峰[M+H]⁺m/z373.1752(calcd373.1763),结合其核磁共振波谱数据,确定式I化合物的分子式为C₂₀H₂₄N₂O₅(不饱和度为10)。化合物的UV谱图给出苯环和吡啶酮环片段的特征吸收峰(223,259和295nm)。化合物的IR谱图显示在3408,1746,1687,1638cm^-1处有吸收,提示该化合物结构中含有羟基，酰胺羰基以及苯环官能团。ECD(MeOH)λ_max[nm](△ε)：228(+20.6)；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)谱中,δ_Η12.94(1Η,s,13-NH)为-OCNHCO-质子信号；δ_Η7.35(3Η,d,J＝7.2Hz,H-2,4,6),7.41(2Η,t,J＝7.2Hz,H-3,5)为单取代苯环上的质子信号；δ_Η8.57(1H,s,H-19),6.53(1H,s,H-9)为两个烯氢质子信号；δ_Η6.58(1H,d,J＝5.6Hz,7-OH),5.12(1H,t,J＝4.8Hz,21-OH)为两个羟基氢信号；此外，还有一个连氧次甲基氢信号δ_Η5.94(1H,d,J＝5.6Hz,H-7)，两组连氧的亚甲基质子信号δ_Η3.47(2H,q,J＝4.8Hz,H-21),4.18(2H,m,H-20),一组异丁基质子信号δ_Η2.61(2H,d,J＝7.2Hz,H-15),2.08(1H,m,H-16),0.92(6H,d,J＝6.7Hz,H-17,18)。¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)谱中，给出20个碳信号,其中有3个羰基碳信号δ_C176.6(C-10),173.5(C-14),162.5(C-12)；10个sp²杂化碳信号δ_C154.8(C-8),149.4(C-19),140.3(C-1),128.6×2(C-3,5),128.1(C-4),126.9×2(C-2,6),119.7(C-9),115.6(C-11)；7个sp³杂化碳信号δ_C69.9(C-7),60.0(C-21),54.9(C-20),46.5(C-15),24.5(C-16),22.2×2(C-17,18)。

将式I化合物的¹H-NMR、¹³C-NMR信号通过HSQC、HMBC和¹H-¹HCOSY谱进行归属。HMBC谱中，δ_Η7.41(2Η,t,J＝7.2Hz,H-3,5)与δ_C140.3(C-1),126.9×2(C-2,6)相关，δ_Η7.35(2Η,d,J＝7.2Hz,H-2,6)与δ_C128.6×2(C-3,5),128.1(C-4),69.9(C-7)相关，δ_Η7.35(1Η,d,J＝7.2Hz,H-4)与δ_C128.6×2(C-3,5)相关，δ_Η5.94(1H,d,J＝5.6Hz,H-7)与δ_C140.3(C-1),126.9×2(C-2,6)相关，提示存在苄基片段；δ_Η6.53(1H,s,H-9)与δ_C154.8(C-8),115.6(C-11)相关，δ_Η8.57(1H,s,H-19)与δ_C176.6(C-10),154.8(C-8)相关，提示存在吡啶酮环片段；δ_Η5.94(1H,d,J＝5.6Hz,H-7)与δ_C154.8(C-8),119.7(C-9)相关，δ_Η6.53(1H,s,H-9)与δ_C69.9(C-7)相关，确定苄基连在吡啶酮环C-8位上。根据¹H-¹HCOSY谱，δ_Η6.58(1H,d,J＝5.6Hz,7-OH)与δ_Η5.94(1H,d,J＝5.6Hz,H-7)相关，可以确定羟基直接连在苄基饱和碳上；δ_Η4.18(2H,m,H-20)与δ_Η3.47(2H,q,J＝4.8Hz,H-21)相关，δ_Η5.12(1H,t,J＝4.8Hz,21-OH)与δ_Η3.47(2H,q,J＝4.8Hz,H-21)相关，提示存在羟乙基片段；此外，HMBC谱中，δ_Η8.57(1H,s,H-19)与δ_C54.9(C-20)相关，δ_Η4.18(2H,m,H-20)与δ_C154.8(C-8),149.4(C-19)相关，确定羟乙基连接在吡啶酮环氮原子上。δ_Η0.92(6H,d,J＝6.7Hz,H-17,18)与δ_C46.5(C-15),24.5(C-16),22.2(C-18,17)相关；δ_Η2.08(1H,m,H-16)与δ_C46.5(C-15),22.2×2(C-17,18)相关；δ_Η2.61(2H,d,J＝7.2Hz,H-15)与δ_C173.5(C-14),24.5(C-16),22.2×2(C-17,18)相关，确定式I化合物中含有异丁基片段，且与14位羰基相连；δ_Η12.94(1Η,s)与δ_C115.6(C-11),46.5(C-15)相关，以及δ_Η8.57(1H,s,H-19)与δ_C176.6(C-12)相关，确定12位羰基连在吡啶酮环C-11上。由此确定式I化合物的平面结构。式I化合物的绝对构型是通过将实测的ECD谱与计算得到的ECD谱对比确定的，即采用Gaussian03软件基于B3LYP/6-31G*水平计算出式I化合物的ECD光谱，由于式I化合物在228nm附近存在正性CD谱带，将计算ECD光谱与化合物实测CD谱进行拟合，从而确定了式I化合物C-7位绝对构型为S构型。

通过以上解析，最终确定式I化合物即为本发明的吡啶酮类生物碱。

表1：式I化合物的¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)和¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)数据以及主要的HMBC和¹H-¹HCOSY相关

对所得到的式I化合物进行肿瘤细胞生长抑制方面的研究。体外实验结果表明式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60和人乳腺癌细胞MCF-7均具有较好的生长抑制作用，其IC₅₀值分别为23.03，66.2μM。因此，本发明所述的吡啶酮类生物碱具有制备临床肿瘤预防和治疗药物的前景。

本发明的优点在于，所得到的化合物提取分离方法简易，重现性好，且具有较好地抑制肿瘤细胞生长的活性。

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：式I化合物的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：植物内生真菌Trametestrogii经复苏后，从斜面转移到装有150mL培养液[培养基组成：甘露醇2％；葡萄糖2％；酵母膏0.5％；蛋白胨1％；KH₂PO₄0.05％；MgSO₄·7H₂O0.03％；玉米浆0.1％；自来水配制]的三角瓶(500mL)中，于28℃摇床上180rpm振荡培养2天后作为种子培养液。然后将种子液按5％的接种量接种到含有200mL新鲜、灭菌的真菌4号液体培养基的500mL三角瓶中，在室温条件下静置培养,获得发酵培养液约70L。

2粗提物的获得

发酵培养物用16层纱布过滤，将菌丝体和发酵液分离。发酵液减压浓缩至10L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到发酵液乙酸乙酯萃取物。菌丝体用80％丙酮超声提取3次，每次1小时，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到菌丝体乙酸乙酯萃取物。将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取物合并后，得到总粗提物40.5g。

3化合物的分离精制

乙酸乙酯萃取物(40.5g)经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇溶液或三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:4-100:6的洗脱物再经二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:3-100:4洗脱，洗脱物再经SephadexLH-20凝胶柱色谱，用甲醇洗脱，并经半制备高效液相色谱进行纯化，使用长度为250mm，内径为10mm的色谱柱，以内径为5mm的ODS为填料，以甲醇-水60:40-50:50为流动相洗脱，t_R为25min，得式I化合物。

实施例2：式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60和人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制实验：

HL-60细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100mg/mL链霉素及1mmol/LL-谷氨酰胺RPMI1640培养液中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中孵育。称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水稀释到4％的储存浓度，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，将该储存液用PBS稀释至0.4％工作浓度。取上述细胞(1×10⁵/mL)接种于12孔板，每孔2mL。加入不同浓度药物孵育后制备单个细胞悬液，取50μL细胞悬液加入50μL的0.4％台盼蓝溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。化合物对HL-60细胞的生长抑制作用通过细胞计数测得。取HL-60细胞(1×10⁵/mL)接种于12孔板，每孔2mL。加入不同浓度式I化合物孵育后制备单个细胞悬液，用血球计数板分别计数对照孔和加药孔的细胞数。利用下列公式求得细胞生长抑制率：1-(加药孔细胞数/对照孔细胞数)×100％。按相同方法对阳性对照药5-氟尿嘧啶进行测试。其IC₅₀结果如表2所示。

MCF-7细胞培养于DMEM低糖培养液中，称取MTT，加入PBS溶解，配制成2mg/mL溶液，避光搅拌30min，0.22μM滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。取对数生长期的受试细胞(MCF-7细胞株)，以(2～3)×10⁴cells/mL的密度接种于96孔培养板内，每孔内100μL，使其贴壁24h后，加入用培养液稀释成不同浓度的待测化合物100μL，于37℃继续培养96h。然后每孔加入50μLMTT溶液于37℃孵育4h后，弃取上清液，每孔加入200μLDMSO，室温振荡10min后，在酶标仪570nm处测定每个孔的吸光度值，同时设置调零孔(培养液、MTT、DMSO)，对照孔(受试细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)，利用下列公式求得肿瘤细胞生长抑制率：1-(加药孔吸光度值/对照孔吸光度值)×100％。所求结果代入IC₅₀计算软件，求出IC₅₀值。按相同方法对阳性对照药5-氟尿嘧啶进行测试。其IC₅₀结果如表2所示。

表2：式I化合物对HL-60和MCF-7的生长抑制作用

体外实验结果表明，式I化合物在体外显示出较好的抑制人急性早幼粒白血病细胞株HL-60和人乳腺癌细胞MCF-7生长的活性，其IC₅₀分别为23.03,66.2μM，有望开发其在制备肿瘤细胞抑制剂中的用途。

Claims

1.如（I）所示的吡啶酮类生物碱：

。

2.根据权利要求1所述的吡啶酮类生物碱，其特征在于，该化合物是从透骨草植物内生真菌Trametestrogii发酵产物中分离得到的。

3.如权利要求1所述的吡啶酮类生物碱的制备方法，其特征在于：将植物内生真菌Trametestrogii进行大量发酵，发酵产物经过滤得到发酵液和菌丝体，发酵液经浓缩后，用乙酸乙酯萃取；菌丝体用80%-90%丙酮水溶液超声提取，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取，将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取物合并，将合并的乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇溶液或三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:4-100:6的洗脱物再经二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:3-100:4洗脱，洗脱物再经SephadexLH-20凝胶柱色谱，用甲醇洗脱，并经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积配比为60:40-50:50的甲醇-水溶液为流动相洗脱，即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵产物通过如下方法制备：植物内生真菌Trametestrogii经复苏后，从斜面转移到装有培养液的三角瓶中，于25-30°C摇床上160-180rpm振荡培养2-3天后作为种子培养液，然后将种子液按5-10%的接种量接种到含有新鲜、灭菌的真菌4号液体培养基的三角瓶中，在室温条件下静置培养，即得。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述真菌4号液体培养基组成：甘露醇1.5-2.5%；葡萄糖1.5-2.5%；酵母膏0.3-0.6%；蛋白胨0.8-1.5%；KH₂PO₄0.05-0.08%；MgSO₄·7H₂O0.03-0.05%；玉米浆0.1-0.2%；自来水配制。

6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的吡啶酮类生物碱。

7.权利要求1所述的吡啶酮类生物碱或权利要求6所述的组合物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

8.权利要求1所述的吡啶酮类生物碱或权利要求6所述的组合物在制备肿瘤细胞抑制剂中的应用。

9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为白血病或乳腺癌。