CN103965284A

CN103965284A - 桃叶卫矛果实皂苷及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103965284A
Application number: CN201410190229.6A
Authority: CN
Inventors: 李泽鸿; 刘继阳; 于新海; 赵福广; 刘莹; 李振华; 刘洪章; 张文惠; 刘淑英; 陈屏; 韩鹏
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2014-08-06

Abstract

本发明公开了桃叶卫矛果实皂苷，它是用干燥的桃叶卫矛果实粉末，超声破碎，乙醇提取；再用石油醚、饱和正丁醇萃取获得，在料液比为1：10，提取温度为60℃，乙醇浓度80%，超声时间为40min条件下，提取皂苷的桃叶卫矛果实皂苷，提取率最高，为9.172%；经硅胶层析纯化，获得了桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A和Ebs-B，Ebs-A对人肺癌细胞系-A549、小鼠骨髓瘤细胞系-SP2/0、人皮肤黑色素瘤细胞系-A375的生长有明显的抑制作用，Ebs-B对人宫颈癌细胞系-HeLa、人结肠癌细胞系-LOVO的生长有明显的抑制作用；而组分A、B均可有效杀死人肝癌细胞系-SMMC、胆管癌细胞系-QBC939。

Description

桃叶卫矛果实皂苷及其制备方法和应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及桃叶卫矛果实皂苷及其制备方法和应用。

背景技术

桃叶卫矛（Euonymus bungeanus ），卫矛科卫矛属植物，别称明开夜合、白杜，中文学名：丝棉木。其枝叶秀丽，红果密集，可作庭园绿化树种，同时也具有一定的经济价值。叶可代茶，根和皮中含有多种药用成分、杀虫活性成分，同时也是硬橡胶资源，具有巨大的开发潜力。

皂苷(Saponins)是存在于植物界的一类结构比较复杂的苷类化合物，其苷元大多属于具有螺甾烷及其生源相似的甾族化合物或三萜类化合物。大多数皂苷水溶液振摇后可产生持久性的泡沫，故称皂苷。按照皂苷元的化学结构不同，可以将皂苷分为三萜皂苷和甾体皂苷。三萜类皂苷如人参皂苷、柴胡皂苷、桔梗皂苷等具有降低胆固醇、抗炎、抑制肿瘤、免疫、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌等作用。甾体皂苷如沿阶草皂苷、知母皂苷等经研究表明有抗肿瘤、抗真菌和细菌以及降低胆固醇等作用。以从植物中提取的甾体皂苷为起始原料合成的甾体激素类药物用于治疗风湿性关节炎、心脏病、阿狄森氏病、红斑狼疮，可以止血、抗肿瘤和作避孕药，还可以利用甾体原料合成镇痛药、麻醉药、杀虫剂、冠心病药等。也有将甾体皂苷用作避孕药和激素类等药物的重要合成原料。

大量的研究表明，中药皂苷类成分能解热、降温、镇痛、镇静、消炎、抗菌，还能够刺激粘膜促进分泌，通常用作清热解毒、止咳化痰、抗菌消炎药，临床多用于治疗各种感冒、发烧、咳嗽等，如柴胡、桔梗、远志等。一些皂苷如三七皂苷对消肿止痛、改善心血管功能方面作用明显；人参皂苷能明显增强机体的免疫机能，改善物质代谢，促进造血机能，调节人体的气血平衡和代谢平衡。最近，备受关注的是皂苷在抗癌活性上的研究，研究证实，从人参中提取得到的人参皂苷有抗癌作用，人参茎叶皂苷可抑制肿瘤细胞的RNA和DNA的合成。越来越多的研究表明，皂苷不但具有广泛的生物活性和药理作用，而且还可以作为食品添加剂如天然甜味剂、保护剂、发泡剂、增味剂、抗氧剂等等。

桃叶卫矛作为一种常见庭院观赏类树种，其果实资源非常丰富，但对其生物活性的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供桃叶卫矛果实皂苷。

桃叶卫矛果实皂苷，它是用下述方法制备的，它包括：

1）干燥的桃叶卫矛果实粉末，超声破碎，乙醇提取；

2）石油醚萃取；

3）用饱和正丁醇萃取；

得桃叶卫矛果实皂苷。

所述的步骤1）为：干燥的桃叶卫矛果实粉末，用80%乙醇浸泡24h，料液比为1︰9-11；用超声波清洗器，温度为60℃，进行超声波浸提40min，过滤；

桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A和Ebs-B，它是由下述方法制备：

将上述的桃叶卫矛果实皂苷，甲醇溶解，加入100-200目硅胶，充分吸附后加热挥干甲醇后，以10%-90%的乙醇对硅胶柱进行洗脱，得到洗脱峰标记为Ⅰ、洗脱峰Ⅱ；

合并收集洗脱峰Ⅰ洗脱液，经浓缩、冷冻干燥，得到粗桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A；

合并收集洗脱峰Ⅱ洗脱液，经浓缩、冷冻干燥，得到粗桃叶卫矛果实皂苷Ebs-B；

将粗桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A和Ebs-B再分别用d152大孔树脂柱纯化。

桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A在制备治疗肝癌-SMMC、胆管癌-QBC939、人肺癌-A549、小鼠骨髓瘤-SP2/0或人皮肤黑色素瘤-A375药物中的应用。

桃叶卫矛果实皂苷Ebs-B在制备治疗肝癌-SMMC、胆管癌-QBC939、人宫颈癌细胞系-HeLa或人结肠癌细胞系-LOVO药物中的应用。

桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A在制备抗大肠杆菌、肠炎沙门氏菌或金黄色葡萄球菌药物中的应用。

桃叶卫矛果实皂苷Ebs-B在制备抗大肠杆菌、肠炎沙门氏菌或枯草芽孢杆菌药物中的应用。

本发明提供了桃叶卫矛果实皂苷，它是用干燥的桃叶卫矛果实粉末，超声破碎，乙醇提取；再用石油醚、饱和正丁醇萃取获得，在料液比为1：10，提取温度为60℃，乙醇浓度80%，超声时间为40min条件下，提取皂苷的桃叶卫矛果实皂苷，提取率最高，为9.172%，经硅胶层析纯化，获得了桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A和Ebs-B，Ebs-A对人肺癌细胞系-A549、小鼠骨髓瘤细胞系-SP2/0、人皮肤黑色素瘤细胞系-A375的生长有明显的抑制作用，Ebs-B对人宫颈癌细胞系-HeLa、人结肠癌细胞系-LOVO的生长有明显的抑制作用；而组分A、B均可有效杀死人肝癌细胞系-SMMC、胆管癌细胞系-QBC939。

两种皂苷组分抑菌原液对于大肠杆菌和肠炎沙门氏菌均有良好的抑制效果，而皂苷组分A能够充分抑制金黄色葡萄球菌的生长，抑菌圈明显，但是对枯草芽孢杆菌则几乎没有抑制效果；皂苷组分B对于枯草芽孢杆菌也有明显的抑制作用，同样出现了明显的抑菌圈，对于金黄色葡萄球菌则没有抑制效果。

附图说明

图1为人参皂苷标准曲线；

图2为桃叶卫矛果实皂苷的硅胶层析洗脱曲线(上样量2g)；

图3 Ebs-A的d152大孔树脂柱纯化洗脱曲线；

图4 Ebs-B的d152大孔树脂柱纯化洗脱曲线；

图5皂苷组分A对SMMC的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组； 100×4)；

图6 皂苷组分B对HeLa的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组；10×4)；

图7 皂苷组分B对LOVO的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组； 10×4)；

图8皂苷组分A对Sp2/0的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组； 10×4)；

图9皂苷组分A对A375的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组； 10×4)；

图10 皂苷组分A对A549的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组； 10×4)

图11 皂苷组分A对QBC939的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组； 100×4)；

图12 皂苷组分B对BHK的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组； 10×4)；

图13 皂苷组分A对DK的细胞毒性作用(1：对照组；2：加样组； 10×4)。

具体实施方式

实施例1桃叶卫矛果实皂苷的分离纯化

1、桃叶卫矛果实总皂苷粗品提取

桃叶卫矛果实（吉林农业大学校内采集），粉碎过40目筛。称取2g干燥的桃叶卫矛果实粉末，用80%乙醇20ml浸泡24h，采用WD-9415B型超声波清洗器 (北京市六一仪器厂，40KHz，100kW)，温度为60℃，进行超声波浸提40min，过滤，经旋转蒸发仪将提取剂挥至无醇味，将所剩溶液用石油醚萃取3次，再用饱和正丁醇萃取3次，然后将正丁醇层用旋转蒸发仪将正丁醇挥干，真空干燥，得总皂苷粗品。用甲醇将总皂苷粗品溶解，定容为50mL待用，用分光光度法在349nm处对桃叶卫矛皂苷含量的进行测定，测得的数据作分析对照。剩余提取液进行减压浓缩，即得粗皂苷产品。

标准曲线的绘制

准确称取人参皂苷标准品10.00 mg，用70%乙醇溶解并定容至50 mL，配置成0.2mg/mL的人参皂苷标准溶液。分别取上述标准溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，再用70%乙醇定容至20 mL，以70%乙醇为空白，在波长349 nm下，用紫外分光光度计分别测OD值，得标准曲线图1，得回归方程为：Y=0.1453X-0.0071（ R²=0.9993）。

皂苷含量计算：

在349nm下测定吸光度值，并根据标准曲线和样品浓度计算皂苷得率。

皂苷得率（mg/g）=C*V/W

C：由人参皂苷标准曲线测得的皂苷浓度（mg/ml）

V：皂苷提取溶液体积(ml)

W：桃叶卫矛样品质量(g)

经反复试验，在料液比为1：10，提取温度为60℃，乙醇浓度80%，超声时间为40min条件下，提取皂苷的桃叶卫矛果实皂苷，提取率最高，为9.172%

2、桃叶卫矛果实皂苷的分离纯化

称取提取的皂苷粗品2g，以甲醇溶解，向其中加入硅胶（100-200目），拌样，充分吸附后加热挥干甲醇后上样。以10%-90%的乙醇对硅胶柱进行洗脱，流速1mL/min，自动部分收集器收集，每管5mL，隔管于349nm处检测OD值，记录绘制洗脱曲线，见图2。

得到两个洗脱峰，标记为Ⅰ、Ⅱ，按照洗脱峰合并收集洗脱液，经浓缩、冷冻干燥得到两种皂苷组分，按出峰的先后顺序标记为Ebs-A、Ebs-B。经硅胶层析纯化所得后各皂苷组分中Ebs-A得率最高，为57.1%，Ebs-B得率为30.1%。

、D152大孔树脂柱层析

将两个组分分别加入D152大孔树脂，充分吸附后，以10%-90%的乙醇对树脂柱进行洗脱，流速1mL/min，自动部分收集器收集，349nm紫外检测OD值，绘制洗脱曲线，见图3、4。

图3、4可以看出，经过d101大孔树脂层析柱的洗脱峰均呈现单一对称峰形，说明经纯化后的两种皂苷组分均一。

通过对桃叶卫矛果实总皂苷的最佳提取条件，提取出桃叶卫矛果实总皂苷，然后通过硅胶柱将其进行纯化，并进一步将所得组分通过D152大口树脂进行纯化，得到两个单一组分Ebs-A、Ebs-B，含量分别为0.876g、0.486g，得率依次为43.8%、24.3%。所得皂苷成分在349nm处有最高吸收峰，由于含C-12羰基的甾体皂苷元均有350nm的最大吸收峰，所以推测桃叶卫矛果实皂苷为含C-12羰基的甾体皂苷。

实施例2桃叶卫矛果实皂苷的抑菌活性试验

1）培养基的配制

牛肉膏 3.5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，水1000 mL，pH7.0~7.2，加热煮沸，120 ℃灭菌20 min。

2）测试样品的制备

分别取桃叶卫矛果实皂苷组分Ebs-A、Ebs-B适量，用无菌水溶解配制成浓度为50 mg/mL的皂苷溶液，为抑菌原液A、B。

3）菌种处理

预先将供试菌种接在斜面培养基上活化2次，37℃恒温培养24 h。分别挑取1环己活化好的菌种放入10 mL无菌生理盐水中，振荡摇匀，制成浓度约为10⁶~10⁷cfu/mL的菌悬液，备用。

4）不同浓度皂苷提取液抑菌活性研究

分别取两种桃叶卫矛果实皂苷组分原液(50 mg/mL)，采用二倍稀释法用对照溶液分别稀释至25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.75 mg/mL，以无菌水作对照。无菌条件下，取菌悬液 1 mL 倒入充分凝固的培养基，涂匀，取无菌滤纸(Φ=0.5 cm)浸没于样品试液中使其完全饱和，稍风干，接于含菌培养皿中，每皿按梯度均匀铺置5个滤纸片，处理后的抑菌平皿倒置于恒温培养箱中28℃培养24 h后观察，测抑菌圈直径并记录。

5）抑菌结果

如表1所示，桃叶卫矛果实皂苷两种组分对大肠杆菌和沙门氏菌均有抑制作用，随着皂苷组分溶液浓度的增大，抑菌圈直径随之增大；而皂苷组分A能够充分抑制金黄色葡萄球菌的生长，抑菌圈明显；皂苷组分B对于枯草芽孢杆菌也有明显的抑制作用，同样出现了明显的抑菌圈。

表1 不同浓度桃叶卫矛果实总皂苷试液的抑菌效果

5）结果

试验对桃叶卫矛果实皂苷进行抑菌试验，供试菌种为四种细菌，桃叶卫矛果实两种皂苷组分抑菌原液对于大肠杆菌和肠炎沙门氏菌均有良好的抑制效果，而皂苷组分A能够充分抑制金黄色葡萄球菌的生长，抑菌圈明显，但是对枯草芽孢杆菌则几乎没有抑制效果；皂苷组分B对于枯草芽孢杆菌也有明显的抑制作用，同样出现了明显的抑菌圈，对于金黄色葡萄球菌则没有抑制效果，随着皂苷组分抑菌原液浓度的增大，抑菌圈直径随之增大。皂苷组分的抑菌机制可能是由于甾体皂苷能与细菌细胞膜中的胆甾醇形成复合物从而具有抗菌性。

实施例3桃叶卫矛果实皂苷的抗癌活性试验

1）细胞系

人肝癌细胞系-SMMC、人宫颈癌细胞系-HeLa、人胃癌细胞系-BGC823、人结肠癌细胞系-LOVO、小鼠骨髓瘤细胞系-SP2/0、人皮肤黑色素瘤细胞系A375、人肺癌细胞系A549、胆管癌细胞系QBC939、犬肾细胞系DK、鼠肾细胞系BHK，共10种由军需大学军事兽医研究所提供。所用培养基均采用含10%犊牛血清、1%双抗的RPMI-1640培养基。所有细胞系均在37℃、5%CO₂的恒温环境条件下传代培养。

2）肿瘤细胞的培养

细胞均使用RPMI-1640完全培养基，100mL培养瓶中加入10mL细胞培养液，24h更换维持液，72h传代一次。传代时，弃掉旧培养液，用1×胰酶消化液消化1-5min，此时可通过倒置显微镜观察细胞收缩情况，待细胞收缩变圆后，将培养瓶轻轻震荡，使细胞完全脱落，加入适量培养液按1传3比例传代。在37℃、5% CO₂条件下培养。

3）胰蛋白酶0.5‰消化细胞

取对数生长期的细胞，经胰蛋白酶液消化，吹打分散成单细胞悬液，以每孔50mL的量加入到96孔细胞培养板中，调节细胞数至2×10⁴个/孔，放入37℃、5% CO₂培养箱中2h使之贴壁。

4）细胞特异性毒性实验

将将皂苷组分A、B分别用双蒸水溶解，使原溶液浓度为2mg/mL，经过滤除菌，分别向不同细胞孔中加入，10 mg/mL、 20 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL，然后添加不同量的培养基，使之总体积为100mL，每个梯度设置三个平行孔。实验设空白对照（加等体积的空菌蛋白和培养基）。37℃、5% CO₂条件下培养48h，取出放于倒置显微镜下观察结果。

5）结果与分析

桃叶卫矛果实两种皂苷组分对癌症细胞的杀伤作用：将不同浓度的皂苷组分溶液加入上述10种细胞系之后，对培养细胞进行显微观察。结果发现，皂苷组分A对人肺癌细胞系-A549、小鼠骨髓瘤细胞系-SP2/0、人皮肤黑色素瘤细胞系-A375的生长有明显的抑制作用，皂苷组分B对人宫颈癌细胞系-HeLa、人结肠癌细胞系-LOVO的生长有明显的抑制作用；而组分A、B均可有效杀死人肝癌细胞系-SMMC、胆管癌细胞系-QBC939，细胞的死亡数目逐渐增多，实验组细胞大部分变圆、折光性变差、裂解死亡；但是两个组分对人胃癌细胞系-BGC823均没有致死效果，并且二者对狗肾细胞系-DK、地鼠肾细胞系-BHK两种正常细胞几乎无伤害，细胞生长正常且没有明显的变化。结果见表2。

Claims

1.桃叶卫矛果实皂苷，它是用下述方法制备的，它包括：

1）干燥的桃叶卫矛果实粉末，超声破碎，乙醇提取；

2）石油醚萃取；

3）用饱和正丁醇萃取；

得桃叶卫矛果实皂苷。

2.权利要求1所述的桃叶卫矛果实皂苷，其特征在于：所述的步骤1）为：干燥的桃叶卫矛果实粉末，用80%乙醇浸泡24h，料液比为1︰9-11；用超声波清洗器，温度为60℃，进行超声波浸提40min，过滤。

3.桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A和Ebs-B，它是由下述方法制备：

权利要求所述的桃叶卫矛果实皂苷，甲醇溶解，加入100-200目硅胶，充分吸附后加热挥干甲醇后，以10%-90%的乙醇对硅胶柱进行洗脱，得到洗脱峰标记为Ⅰ、洗脱峰Ⅱ；

4.权利要求3所述的桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A在制备治疗肝癌-SMMC、胆管癌-QBC939、人肺癌-A549、小鼠骨髓瘤-SP2/0或人皮肤黑色素瘤-A375药物中的应用。

5.权利要求3所述的桃叶卫矛果实皂苷Ebs-B在制备治疗肝癌-SMMC、胆管癌-QBC939、人宫颈癌细胞系-HeLa或人结肠癌细胞系-LOVO药物中的应用。

6.权利要求3所述的桃叶卫矛果实皂苷Ebs-A在制备抗大肠杆菌、肠炎沙门氏菌或金黄色葡萄球菌药物中的应用。

7.权利要求3所述的桃叶卫矛果实皂苷Ebs-B在制备抗大肠杆菌、肠炎沙门氏菌或枯草芽孢杆菌药物中的应用。