CN101671385B - 仿刺参中三萜皂苷类抗真菌化合物HolotoxinD～I及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，是从仿刺参中分离到的6种三萜皂苷类抗真菌化合物Holotoxin D～I，化学结构通式如下：
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是从海洋动物仿刺参中分离到的新的三萜皂苷类抗真菌化合物Holotoxin D、E、F、G、H、I及其制备方法。
背景技术
仿刺参(Apostichopusjaponicus Selenka)是一种广泛分布于我国山东、辽宁和河北、江苏北部沿海的海参纲动物，属刺参科仿刺参属动物。已从该种海参动物中分离得三萜皂苷类化合物HolotoxinA、A1、B、B1、C(Kitagawa I.，YamanakaH.，Kobayashi M.，et al.Saponin and Sapogenol.XV.Antifungal glycoside from thesea cucumber Stichopus japonicus Selenka.(2).Structures of Holotoxin A andHolotoxin B.Chem Phar Bull，1976，24(2)：275；KitagawI.a，Yamanaka H.，Kobayashi M.，et al.Saponin and Sapogenol.XXVII.Revised structure of HolotoxinA and Holotoxin B，two antifungal oliglycosides from the sea cucumber Stichopusjaponicus Selenka.Chem Phar Bull，1978，26(12)：3722；Maltser I.I，Stonik VA，Kalinovsky AI，et al.Triterpene glycosides from sea cucumber Stichopus japonicusSelenka.Comp.Biochem.Physiol.1984，78B(2)：421)，但未见有关从该种仿刺参中分离得到Holotoxin D～I及其抗真菌活性的报道。
发明内容
本发明提供从生长于我国渤海海域的仿刺参中提取分离到的6种新的三萜皂苷类化合物，分别命名为Holotoxin D，Holotoxin E，Holotoxin F，Holotoxin G，Holotoxin H，Holotoxin I，它们的化学结构通式如下：
其中，基团R1为CH2OH或Me
R2为OMe或OH
R3为
或或H
E为
或
Δ为双键，分别位于7，8位或9，11位所说化合物的基团搭配分别如下：
1、Holotoxin D：为无色结晶性粉末，熔点209-211℃，分子式C66H104O32。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+)：m/z 1431[M+Na]+；电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-)：m/z 1407[M-H]+。1H-NMR和13C-NMR谱数据见表1和表2。以15％的HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定Holotoxin D的糖链由D-木糖、D-葡萄糖和3-O-甲基D-葡萄糖组成，比例为2∶2∶2。
2、Holotoxin E：为无色结晶性粉末，熔点245-247℃，分子式C65H102O31。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+)：m/z 1401[M+Na]+；电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-)：m/z 1377[M-H]+。1H-NMR和13C-NMR谱数据见表3和表4。以15％的HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定Holotoxin E的糖链由D-木糖、D-喹诺糖、D-葡萄糖和3-O-甲基D-葡萄糖组成，比例为2∶1∶2∶1。
3、Holotoxin F：为无色结晶性粉末，熔点227-229℃，分子式C66H106O33。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+)：m/z 1449[M+Na]+；电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-)：m/z 1425[M-H]+。1H-NMR和13C-NMR谱数据见表5和表6。以15％的HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定Holotoxin F的糖链由D-木糖、D-喹诺糖、D-葡萄糖和3-O-甲基D-葡萄糖组成，比例为2∶1∶1∶2。
4、Holotoxin G：为无色结晶性粉末，熔点197-199℃，分子式C65H102O32。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+)：m/z 1417[M+Na]+；电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-)：m/z 1393[M-H]+。1H-NMR和13C-NMR谱数据见表7和表8。以15％的HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定Holotoxin G的糖链由D-木糖、D-喹诺糖、D-葡萄糖和3-O-甲基D-葡萄糖组成，比例为2∶1∶1∶2。
5、Holotoxin H：为无色结晶性粉末，熔点164-166℃，分子式C58H94O25。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+)：m/z 1213[M+Na]+；电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-)：m/z 1189[M-H]+。1H-NMR和13C-NMR谱数据见表9和表10。以15％的HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定Holotoxin H的糖链由D-木糖、D-喹诺糖和D-葡萄糖组成，比例为2∶1∶2。
6、Holotoxin I：为无色结晶性粉末，熔点164-166℃，分子式C59H96O25。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性。电喷雾-正离子质谱(ESI-MS+)：m/z 1227[M+Na]+；电喷雾-负离子质谱(ESI-MS-)：m/z 1203[M-H]+。1H-NMR和13C-NMR谱数据见表11和表12。以15％的HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成组成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物比较对照，确定Holotoxin I的糖链由D-木糖、D-喹诺糖、D-葡萄糖和3-O-甲基D-葡萄糖组成，比例为2∶1∶1∶1。
表1.Holotoxin D苷元部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表2.Holotoxin D糖链部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表3.Holotoxin E苷元部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表4.Holotoxin E糖链部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表5.Holotoxin E苷元部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表6.Holotoxin F糖链部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表7.Holotoxin G苷元部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表8.Holotoxin G糖链部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表9.Holotoxin H苷元部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表10.Holotoxin H糖链部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表11.Holotoxin I苷元部分的13C-NMR和1H-NMR数据
表12.Holotoxin I糖链部分的13C-NMR和1H-NMR数据
Xyl：木糖；Glc：葡萄糖；Qui：喹喏糖；J：偶合常数
本发明化合物Holotoxin D～I的制备方法如下：
(1)制备总皂苷提取物：：将新鲜的仿刺参冷冻干燥后，粉碎成粉末，用重量比为5～10倍的50％～95％乙醇水溶液热水浴提取，提取液减压回收得流浸膏，将流浸膏混悬于水中，过HP20或DA101大孔吸附树脂柱，分别用纯水、70％乙醇和95％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收至无醇味，用重量比为3～6倍的正丁醇萃取，取萃取液，回收溶剂浓缩至干，得仿刺参总皂苷提取物；(2)分离纯化：上述总皂苷提取物进行正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水的体积比为10～6∶1～4∶0.1～0.8的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇∶水的体积比50～90∶50～10的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，最后进行C18高效液相色谱分离，以甲醇∶水的体积比为70～90∶30～10作为流动相洗脱，分别得到Holotoxin D～I的纯品。
本发明化合物HolotoxinD～I经体外抗真菌活性实验，表明这些化合物有明显的抑制真菌生长的效果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作详细描述，但保护范围不局限于实施例。
实施例1 从仿刺参中制备Holotoxin D～I
将新鲜的冷冻干燥后的仿刺参3.0kg，粉碎成粉末，用重量比为6倍的60％乙醇热水浴提取，提取液减压回收得流浸膏，将流浸膏混悬于水中，过HP20大孔吸附树脂柱，分别用纯水、70％乙醇和95％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收至无醇味，用重量比为4倍的正丁醇萃取3次，合并萃取液，回收溶剂浓缩至干，得仿刺参总皂苷提取物，再进行正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水的体积比为7∶3∶0.5的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇∶水的体积比70∶30洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，最后进行C18高效液相色谱分离，以甲醇∶水的体积比为80∶20的溶剂作为流动相洗脱，分别得到Holotoxin D～I的纯品为20.1mg，18.4mg，12.7mg，7.2mg，17.8mg，15.9mg。
实施例2 从仿刺参中制备Holotoxin D～I
将新鲜的冷冻干燥后的仿刺参4.5kg，粉碎成粉末，用重量比为5倍的70％乙醇水溶液热水浴提取，提取液减压回收得流浸膏，将流浸膏混悬于水中，过DA101大孔吸附树脂柱，分别用纯水、70％乙醇和95％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收至无醇味，用重量比为4倍的正丁醇萃取3次，合并萃取液，回收溶剂浓缩至干，得仿刺参总皂苷提取物，再进行正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水的体积比为6∶4∶0.8的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇∶水的体积比75∶25洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，最后进行C18高效液相色谱分离，以甲醇∶水的体积比为85∶15的溶剂作为流动相洗脱，分别得到Holotoxin D～I的纯品为30.5mg，26.8mg，18.7mg，10.4mg，25.8mg，21.3mg。
抗真菌活性实验：
实验所用真菌菌株：白念珠菌(Candida albicans)SC5314、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)BLS108由第二军医大学长征医院菌种保存中心提供；热带念珠菌(Candida tropicalis)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、石膏状小孢子菌(Microsporum gypseum)、薰烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)由第二军医大学长海医院真菌室提供。阳性对照药为：伊曲康唑、特比芬、两性霉素B、活力康唑、氟康唑和酮康唑。
实验前，用接种圈从4℃保存的沙堡葡萄糖琼脂培养基上挑取新生隐球菌、白念珠菌和热带念珠菌少量，接种至1ml YEPD培养液，于35℃，250rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1ml YEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整菌液浓度至1×103～5×103个/ml。
将熏烟曲霉菌、红色毛癣菌和石膏状小孢子菌接种至沙堡葡萄糖琼脂培养基斜面，其中，熏烟曲霉菌于35℃培养一周；红色毛癣菌和石膏状小孢子菌于28℃培养两周。各菌活化两次后，加适量RPMI1640培养液于沙堡葡萄糖琼脂培养基斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至1×103～5×103个/ml。
将本发明化合物及对照药物分别用DMSO配成6.4g·L-1溶液，-20℃保存，实验前，将分别取出置35℃温箱融化备用。
取无菌96孔药敏板，于每排1号孔加RPMI 1640培养液
作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液2号孔分别加菌液
和受试化合物溶液1.6↘1。2～11号孔10级4倍稀释，使各孔中的药物终浓度分别为64、16、4、1、0.25和0.0625、0.0156、0.0039、0.00097、0.00024mg·L-1，各孔中DMSO含量均低于1％；12号孔不含药物，作阳性对照。念珠菌(白色念珠菌和热带念珠菌)、新生隐球菌及丝状菌(熏烟曲霉菌、红色毛癣菌和石膏状小孢子菌)药敏板分别于35℃培养24h、72h和一周后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。实验结果见表13。
表13.Holotoxin D～I对真菌菌株的抑制作用(MIC80，mg·L-1)
从表11可见，这六种化合物对6种真菌菌株均显示明显的抑制作用，因而可用于制备抗真菌药物。
本发明为研制新的抗真菌药物提供了新的先导化合物，对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。
Claims (3)
1.三萜皂苷类抗真菌化合物Holotoxin D～I，其特征在于化学结构通式如下：
Δ为双键，分别位于7，8位或9，11位，所说化合物的基团搭配分别如下：
2.权利要求1所述抗真菌化合物的制备方法，步骤如下：
(1)制备总皂苷提取物：将新鲜的仿刺参冷冻干燥后，粉碎成粉末，用重量比为5～10倍的50％～95％乙醇水溶液热水浴提取，提取液减压回收得流浸膏，将流浸膏混悬于水中，过HP20或DA101大孔吸附树脂柱，分别用纯水、70％乙醇和95％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收至无醇味，用重量比为3～6倍的正丁醇萃取，取萃取液，回收溶剂浓缩至干，得仿刺参总皂苷提取物；
(2)分离纯化：上述总皂苷提取物进行正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水的体积比为10～6∶1～4∶0.1～0.8的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇∶水的体积比50～90∶50～10的溶剂洗脱，根据薄层层析检测，收集含皂苷的流分，最后进行C18高效液相色谱分离，以甲醇∶水的体积比为70～90∶30～10作为流动相洗脱，分别得到Holotoxin D～I的纯品。
3.权利要求1所述三萜皂苷类化合物在制备抗真菌药物中的应用。
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| 丛日山 等.仿刺参水溶性海参皂苷的分离制备及抗真菌活性的研究.《中国海洋大学学报》.2006,第36卷(第6期),959-964. * |
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