CN105219816B - Sclerotiorin衍生物及其制备方法与作为抗病毒剂的应用 - Google Patents
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Abstract
一种Sclerotiorin衍生物及其制备方法与作为抗病毒剂的应用，制备时先对真菌Penicillium sp.(TA33‑1)进行菌种培养，再对该真菌进行发酵培养，将所得菌丝体用氯仿‑甲醇混合液(1∶1)浸提3次减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；依次进行正相硅胶柱层析、Sephadex LH‑20凝胶柱层析、HPLC高效液相色谱，得黄色粉末，即为(+)‑Sclerotiorin；在溶有(+)‑Sclerotiorin的二氯甲烷溶液中，加入有机伯胺和碳酸钾，反应后得到式I化合物。本发明提供一种抗病毒剂，其特征在于以本发明的式I化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗病毒引起的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种Sclerotiorin衍生物及其制备方法与应用，特别是涉及一种对多种病毒具有强的选择性抑制活性的Sclerotiorin衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
病毒严重威胁着人类的健康，如单纯疱疹I型病毒是一种包裹着的DNA病毒，具有高发病率，潜伏期长，嗜神经组织的特点，潜伏于周围神经系统，主要感染儿童，免疫力低下者以及器官移植者，一旦受到外界适当刺激就会大规模爆发，引发脑炎和角膜炎，严重者能致人死亡。目前临床上抗病毒药物主要是核苷类抗生素，如阿昔洛韦，但近年来耐药性感染人群迅速增加。因此，寻找新的抗病毒药物尤其是结构新颖的抗病毒药物已成为亟待解决的课题。海洋微生物独特的生存环境造就了海洋微生物独特的代谢机制，可以产生大量结构新颖、活性显著的化合物，为寻找潜在的抗病毒药物提供了重要来源。然而，近年来尚未见到从海洋微生物中获得有重要抗病毒活性的Sclerotiorin衍生物作为抗病毒剂的使用。(Newman，D.J.；Cragg，G.M.J.Nat.Prod.2012，75，311-335；Blunt，J.W.；Copp，B.R.；Keyzers，R.A.；Munro，M.H.G.；Prinsep，M.R.Nat.Prod.Rep.2014，31，160-258，andprevious annual reports.)
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于海洋真菌的Sclerotiorin衍生物的制备方法与作为抗病毒剂的应用，它能满足现有技术的上述需求。菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年4月3日；保藏编号：CGMCC No.8994；分类命名：Penicillium sp.。
本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐：
或其药学上可接受的盐。式I中R为
本发明提供式I化合物的制备方法，其特征在于先在菌种培养基中对分离自柳珊瑚的内生真菌Penicillium sp.(TA33-1)进行菌种培养，再在发酵培养基中对该真菌进行发酵培养，将所得菌丝体用氯仿-甲醇混合液(1∶1)浸提3次减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分别进行正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析后，再经HPLC高效液相制备色谱，将所得洗脱液浓缩，得黄色粉末，即为(+)-Sclerotiorin；在溶有(+)-Sclerotiorin的二氯甲烷溶液中，加入有机伯胺和碳酸钾，反应后得到式I化合物。
上述制备方法中菌种培养基优选含有葡萄糖0.1％-5.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.01％-1％、蛋白胨0.01％-1％、琼脂0.1％-3.0％、氯化钠0.05％-5％，其余为水，培养温度优选为0-30℃，培养时间优选为3-15天；发酵培养基优选含有大米1.0％-80.0％(重量百分比，下同)、氯化钠0.05％-5％，其余为水，培养温度优选为0-30℃，培养时间优选为10-60天；所述的正相硅胶柱层析采用的固定相优选200-300目硅胶，流动相优选体积比为15％-60％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂；所述Sephadex LH-20凝胶柱层析采用的流动相优选体积比为石油醚∶氯仿∶甲醇＝2∶1∶1的混合溶剂；所述HPLC高效液相制备色谱中采用的色谱柱为本领域常规ODS C18柱，优选为Kromasil 10×250mm，5μm，流速优选为1.0-5.0mL/min，流动相优选体积比为50％-80％的甲醇-水混合溶剂；所述的有机伯胺为
本发明的另一实施方案提供式I化合物的晶体，其Cu靶X-射线晶体衍射数据：空间群为P2(1)2(1)2(1)，晶胞参数为 β＝90(0)°，Z＝4，Dc＝1.193g/cm3，F(000)＝1064，μ＝0.173mm-1。
本发明的另一实施方案提供上述式I化合物晶体的制备方法，其特征在于将式I化合物溶于甲醇、乙醇、水、四氢呋喃或丙酮中的任一种或几种，静置缓慢结晶即可得到式I化合物的晶体。
上述晶体的制备方法中静置缓慢结晶的条件优选在0-30℃下，静置1-30天。
本发明从海洋真菌中获得的Sclerotiorin衍生物对多种病毒具有强的选择性抑制活性，可用于开发抗病毒剂，应用前景广阔。
本发明的另一实施方案提供式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒剂中的应用。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐。可参见“Salt selection for basic drugs”，Int.J.Pharm.(1986)，33，201-217。
附图说明
说明书附图为式I化合物的XRD图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说 明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)柳珊瑚内生真菌Penicillium sp.(TA33-1)的菌种培养
菌种培养所用的培养基含有葡萄糖1.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.2％、蛋白胨0.2％、琼脂1.0％、氯化钠3.0％，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在30℃下培养3天。
(2)柳珊瑚内生真菌Penicillium sp.(TA33-1)的发酵
发酵培养所用的培养基含有大米40.0％(重量百分比，下同)、氯化钠3.0％，其余为水；真菌菌株于28℃培养30天。
(3)(+)-Sclerotiorin的提取分离
取60瓶步骤(2)得到的菌丝体，用氯仿-甲醇混合液(1∶1)浸提3次减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分别进行正相硅胶柱层析(固定相为200-300目硅胶；流动相为30％乙酸乙酯/石油醚混合溶剂，体积比)、Sephadex LH-20凝胶柱层析(石油醚∶氯仿∶甲醇＝2∶1∶1的混合溶剂，体积比)后，再经HPLC高效液相制备色谱分离(色谱柱为Kromasil 10×250mm，5μm，流速为2.0mL/min，流动相为65％的甲醇-水混合溶剂，体积比)，将所得洗脱液浓缩，得黄色粉末，即为(+)-Sclerotiorin。
实施例2
(1)柳珊瑚内生真菌Penicillium sp.(TA33-1)的菌种培养
菌种培养所用的培养基含有葡萄糖0.1％-5.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.01％-1％、蛋白胨0.01％-1％、琼脂0.1％-3.0％、氯化钠0.05％-5％，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在0-30℃下培养3-15天。
(2)柳珊瑚内生真菌Penicillium sp.(TA33-1)的发酵
发酵培养所用的培养基含有大米1.0％-80.0％(重量百分比，下同)、氯化钠0.05％-5％，其余为水，真菌菌株于0-30℃培养10-60天。
(3)(+)-Sclerotiorin化合物的提取分离
取10-300瓶步骤(2)所得的将所得菌丝体用氯仿-甲醇混合液(1∶1)浸提3次减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏浓缩后分别进行正相硅胶柱层析(固定相为本领域常规正相硅胶，流动相为15％-40％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂，体积比)、Sephadex LH-20凝胶柱层析(流动相为石油醚∶氯仿∶甲醇＝2∶1∶1的混合溶剂，体积比)后，再经HPLC高效液相制备色谱(色谱柱为本领域常规ODS C18柱，流速为1.0-5.0mL/min，流动相为50％-80％的甲醇-水混合溶剂，体积比)，将所得洗脱液浓缩，得黄色粉末固体，即为(+)-Sclerotiorin化合物。
实施例1-2中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、Sephadex LH-20凝胶柱层析分离、高效液相色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。
实施例3
称取上述干燥后的(+)-Sclerotiorin(0.1mol)溶解在二氯甲烷中，常温条件下，在充分搅拌下将有机伯胺(0.12mol)逐滴滴加到反应溶液中，反应1小时后，向反应物中加入蒸馏水(200mL)来终止反应，用乙酸乙酯(500mL)进行萃取，将萃取液浓缩后，进行柱层析，用乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓缩，重结晶后得到式I化合物。
实施例3中未具体指明的其他有机化学反应条件，以及正相硅胶柱色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。
式I化合物的具体化合物结构实例：
式I化合物的结构确证数据：
1：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH7.82(1H，s，H-1)，7.21(2H，d，J＝8.4Hz)，7.15(1H，s，H-4)，7.03(2H，d，J＝8.4Hz)，6.97(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，5.67(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，5.63(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，3.89(3H，s)，2.41(1H，m，H-13)，2.18(3H，s，H-20)，1.59(3H，s，H-17)，1.54(3H，s，H-18)，1.42(1H，m，H-14)，1.32(1H，m，H-14)，0.99(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC193.9(C-6)，184.6(C-8)，170.2(COCH3)，160.5，148.0，147.8，144.3，143.2，141.6，133.1，132.0，127.8，127.8，116.3，115.2， 115.2，114.4(C-5)，109.7，103.0(C-8a)，84.8(C-7)，55.8(-OCH3)，35.0(C-13)，30.1(C-14)，23.3(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.4(C-17)，12.0(C-15).ESIMSm/z 496.07/498.09[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，517.99/520.02[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，1012.89[2M+Na]+.HRESIMS m/z 496.1880[M+H]+(calcd for C28H31O5NCl，496.1885).
2：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH7.85(1H，s，H-1)，7.16(1H，s，H-4)，6.99(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.50(2H，s)，5.68(2H，overlapped，H-9 and H-12)，3.91(3H，s)，3.87(6H，s)，2.42(1H，m，H-13)，2.19(3H，s，H-20)，1.59(3H，s，H-17)，1.57(3H，s，H-18)，1.42(1H，m，H-14)，1.32(1H，m，H-14)，1.00(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13CNMR(150MHz，CDCl3)δC193.9(C-6)，184.7(C-8)，170.4(COCH3)，154.1，148.0，148.0，147.6，144.1，143.3，141.2，141.2，139.2，135.8，131.9(C-11)，116.2，114.3(C-5)，109.6，104.2，103.4(C-8a)，84.8(C-7)，61.2(-OCH3)，56.7(-OCH3)，56.6(-OCH3)，35.1(C-13)，30.1(C-14)，23.3(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.5(C-17)，12.0(C-15).ESIMS m/z 556.07/558.06[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，578.05/580.04[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，1132.83[2M+Na]+；HRESIMS m/z 556.2087[M+H]+(calcd for C30H35O7NCl，556.2097).
3：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH8.10(1H，d，7.8Hz)，7.88(1H，s)，7.87(1H，s，H-1)，7.64(1H，t，J＝7.8Hz)，7.43(1H，d，J＝7.8Hz)，7.13(1H，s，H-4)，6.97(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.09(1H，br s，-NH)，5.68(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，5.60(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，2.41(1H，m，H-13)，2.11(3H，s，H-20)，1.57(3H，s，H-17)，1.51(3H，s，H-18)，1.42(1H，m，H-14)，1.32(1H，m，H-14)，0.99(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC193.3(C-6)，184.9(C-8)，170.3(COCH3)，167.3，148.4，147.8，144.6，143.9，143.8，141.5，140.6，135.9，132.0，130.4，129.9，126.0，116.2，116.2，114.6(C-5)，109.9， 85.1(C-7)，35.1(C-13)，30.1(C-14)，23.4(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.4(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z 509.05/511.06[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，531.07/533.03[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，1038.93[2M+Na]+.HRESIMS m/z 509.1839[M+H]+(calcd forC28H30O5N2Cl，509.1838).
4：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH8.05(2H，d，J＝8.4Hz)，7.81(1H，s，H-1)，7.41(2H，d，J＝8.4Hz)，7.15(1H，s，H-4)，6.99(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.63(1H，s，-NH)，5.94(1H，s，-NH)，5.69(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，5.57(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，2.41(1H，m，H-13)，2.18(3H，s，H-20)，1.60(3H，s，H-17)，1.52(3H，s，H-18)，1.42(1H，m，H-14)，1.32(1H，m，H-14)，0.99(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC193.6(C-6)，185.0(C-8)，170.4(COCH3)，167.5，148.5，147.3，143.9，143.8，143.2，140.8，135.0，131.9，129.7，129.7，126.9，126.9，116.0，114.8(C-5)，110.2，103.9，85.0(C-7)，35.1(C-13)，30.1(C-14)，23.3(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.5(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z 509.07/511.07[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，531.03/533.03[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，1038.75[2M+Na]+.HRESIMS m/z 509.1848[M+H]+(calcd for C28H30O5N2Cl，509.1838).
5：1H NMR(600MHz，Acetone)δH8.94(1H，s，-NH)，7.79(2H，d，J＝7.8Hz)，7.78(1H，s，H-1)，7.16(2H，d，J＝7.8Hz)，7.16(1H，s，H-4)，6.98(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，5.68(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，5.64(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，2.41(1H，m，H-13)，2.20(3H，s)，2.16(3H，s，H-20)，1.61(3H，s，H-17)，1.53(3H，s，H-18)，1.42(1H，m，H-14)，1.32(1H，m，H-14)，0.99(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC193.7(C-6)，184.7(C-8)，170.5(COCH3)，169.6，148.4，144.9，143.8，141.6，140.5，135.1，132.0，126.9，122.6，120.6，116.2，116.2，115.4，114.6(C-5)，109.9，102.7，85.1(C-7)，35.1(C-13)，30.1(C-14)，29.4，23.5(C-18)，20.5(C-16)，20.3(COCH3)，12.5(C-17)， 12.1(C-15).ESIMS m/z 523.05/525.07[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，545.03/547.02[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，1066.91[2M+Na]+.HRESIMS m/z 523.1989[M+H]+(calcd for C29H32O5N2Cl，523.1994).
6：1H NMR(600MHz，acetone)δH9.91(1H，s，-NH)，7.70(1H，s，H-1)，7.20(H，d，J＝8.4Hz)，7.09(1H，d，1.8Hz)，7.04(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.93(1H，d，J＝2.4Hz)，6.89(1H，s，H-4)，6.71(H，dd，J＝8.4，2.4Hz)，6.26(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.72(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，4.52(1H，m)，4.29(1H，m)，3.23(2H，m)，2.50(1H，m，H-13)，2.02(3H，s，H-20)，1.72(3H，s，H-17)，1.43(1H，m，H-14)，1.35(3H，s，H-18)，1.32(1H，m，H-14)，1.00(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.86(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，acetone-d6)δC193.9(C-6)，183.8(C-8)，169.9(COCH3)，152.1，149.9，147.1，145.4，144.8，142.7，133.6，132.5，129.1，125.3，125.2，117.3，115.3(C-5)，112.9，112.8，111.0，110.0103.0，86.2(C-7)，55.4，35.6(C-13)，30.9(C-14)，26.9，23.7(C-18)，20.7(C-16)，20.4(COCH3)，12.6(C-17)，12.4(C-15).ESIMS m/z 549.13/551.12[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，571.16/573.12[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，1118.99[2M+Na]+.HRESIMS m/z 549.2144[M+H]+(calcd for C31H34O5N2Cl，549.2151).
7：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH8.15(2H，d，J＝8.4Hz)，7.81(1H，s，H-1)，7.44(2H，d，J＝8.4Hz)，7.16(1H，s，H-4)，6.99(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，5.70(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，5.56(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，2.69(3H，s)，2.41(1H，m，H-13)，2.18(3H，s，H-20)，1.60(3H，s，H-17)，1.52(3H，s，H-18)，1.42(1H，m，H-14)，1.32(1H，m，H-14)，0.99(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC196.4(C-6)，193.6(C-8)，185.0，170.3(COCH3)，148.4，147.0，144.1，143.6，143.6，140.6，138.0，131.8，130.3，127.0，127.0，116.1，116.1，114.7，110.3，104.2，84.8(C-7)，35.1(C-13)，30.1(C-14)，26.9，23.2(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.4(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z508.09/510.09[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，530.03/532.05[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，1036.81[2M+Na]+.HRESIMS m/z 508.1878[M+H]+(calcd for C29H31O5NCl，508.1885).
8：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH7.89(1H，s，H-1)，7.06(1H，s，H-4)，6.98(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.57(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.72(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，3.28(1H，m，H-21)，2.50(1H，m，H-13)，2.16(3H，s，H-20)，1.88(3H，s，H-17)，1.54(3H，s，H-18)，1.44(1H，m，H-14)，1.36(1H，m，H-14)，1.22(2H，m)，1.06(2H，m)，1.03(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.89(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC193.8(C-6)，184.5(C-8)，170.2(COCH3)，149.1，148.0，144.2，143.7，141.2，132.0，115.5，114.3，110.3，102.7，84.8(C-7)，35.6，35.1(C-13)，30.1(C-14)，23.3(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.7(C-17)，12.1(C-15)，8.9，8.7.ESIMS m/z 430.06/432.10[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1).HRESIMS m/z 430.1785[M+H]+(calcd for C24H29O4NCl，430.1780).
9：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH7.94(1H，s，H-1)，7.01(1H，s，H-4)，6.91(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.12(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.70(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，4.57(1H，m)，2.48(3H，overlapped)，2.36(2H，m)，2.18(3H，s，H-20)，1.90(2H，m)，1.86(3H，s，H-17)，1.56(3H，s，H-18)，1.44(1H，m，H-14)，1.35(1H，m，H-14)，1.03(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.89(3H，t，J＝7.2Hz).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC194.1(C-6)，184.5(C-8)，170.3(COCH3)，148.1，147.9，144.6，144.4，137.4，131.7，115.4，114.4，111.9，102.2，84.9(C-7)，56.3，35.1(C-13)，30.5，30.5，30.1(C-14)，23.4(C-18)，20.4(C-16)，20.4(COCH3)，14.4，12.8(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z 444.13/446.11[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，466.07/468.05[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，908.91/910.88[2M+Na]+/[2M+Na+2]+(3∶1).HRESIMS m/z 444.1934[M+H]+(calcd for C25H31O4NCl，444.1936).
10：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH7.91(1H，s，H-1)，6.97(1H，s，H-4)，6.89(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.16(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.69(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，3.98(1H，m，H-21)，2.49(1H，m，H-13)，2.17(3H，s，H-20)，1.97-2.04(4H，m)，1.87(3H，s，H-17)，1.66(2H，m)，1.55(3H，s，H-18)，1.32-1.48(4H，m)，1.26(2H，m)，1.03(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.90(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC194.1(C-6)，184.5(C-8)，170.2(COCH3)，148.6，147.6，145.0，144.5，136.9，131.6，115.1，112.8，112.8，102.2，84.9(C-7)，61.2，35.1(C-13)，33.3，33.1，30.1(C-14)，25.8，25.0，23.4(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.7，12.7(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z 472.14/474.18[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，494.10/496.10[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，964.96/966.94[2M+Na]+/[2M+Na+2]+.HRESIMS m/z472.2250[M+H]+(calcd for C27H35O4NCl，472.2249).
11：1H NMR(500MHz，CDCl3)δH7.75(1H，s，H-1)，7.03(1H，s，H-4)，6.97(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.13(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.71(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，3.84(2H，m，H-21)，2.49(1H，m，H-13)，2.18(3H，s，H-20)，1.85(3H，s，H-17)，1.76(2H，m)，1.55(3H，s，H-18)，1.35-1.48(4H，overlapped)，1.03(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.99(3H，t，J＝7.2Hz)0.89(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC194.0(C-6)，184.4(C-8)，170.2(COCH3)，148.2，147.9，145.0，144.6，141.1，131.7，131.0，114.8，114.7，111.7，84.9(C-7)，54.2(C-21)，35.2(C-13)，32.3(C-22)，30.1(C-14)，23.3(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，19.7(C-23)，13.6(C-24)，12.7(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z 446.08/448.07[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，468.05/470.03[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，912.89/914.88[2M+Na]+/[2M+Na+2]+.HRESIMS m/z 446.2088[M+H]+(calcd for C25H33O4NCl，446.2093).
12：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH7.75(1H，s，H-1)，7.02(1H，s，H-4)，6.96 (1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.15(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.71(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，3.84(2H，m，H-21)，2.49(1H，m，H-13)，2.17(3H，s，H-20)，1.86(3H，s，H-17)，1.76(2H，m)，1.55(3H，s，H-18)，1.26-1.48(8H，overlapped)，1.03(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.88-0.91(6H，overlapped).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC194.0(C-6)，184.4(C-8)，170.2(COCH3)，148.1，147.9，145.0，144.7，141.1，131.7，114.8，114.7，111.7，102.2，84.9(C-7)，54.4，35.1(C-13)，31.2，30.3，30.1(C-14)，26.0，23.3(C-18)，22.5，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，14.0，12.7(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z 474.15/476.15[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，496.09/498.06[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，968.91[2M+Na]+.HRESIMS m/z 474.2397[M+H]+(calcdfor C27H37O4NCl，474.2406).
13：1H NMR(500MHz，CDCl3)δH7.75(1H，s，H-1)，7.03(1H，s，H-4)，6.97(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.12(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.71(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，3.81(2H，m，H-21)，2.49(1H，m，H-13)，2.17(3H，s，H-20)，1.85(3H，s，H-17)，1.80(2H，m，H-22)，1.55(3H，s，H-18)，1.45(1H，m，H-14)，1.35(1H，m，H-14)，1.03(6H，overlapped)，0.89(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC194.0，184.4，170.2，148.1，147.9，145.0，144.7，141.2，131.7，114.7，114.7，111.7，102.2，84.9，55.9，35.1，30.1，23.7，23.3，20.4，20.3，12.7，12.1，10.9.ESIMS m/z 432.10/434.06[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，454.07/456.06[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，884.82/886.81[2M+Na]+/[2M+Na+2]+.HRESIMS m/z432.1934[M+H]+(calcd for C24H31O4NCl，432.1936).
14：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH7.76(1H，s，H-1)，7.02(1H，s，H-4)，6.94(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.13(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.93(1H，m，H-22)，5.70(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，5.42(1H，d，J＝10.8Hz，H-23)，5.25(1H，d，J＝17.4Hz，H-23)，4.48(2H，d，J＝4.8Hz，H-21)，2.48(1H，m，H-13)，2.17(3H，s，H-20)，1.82(3H，s，H-17)，1.55(3H，s，H-18)，1.45(1H，m，H-14)，1.34(1H，m， H-14)，1.02(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.89(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13CNMR(150MHz，CDCl3)δC193.9(C-6)，184.5(C-8)，170.2(COCH3)，148.3，148.1，145.1，144.5，141.3，131.8，131.0，120.0(C-22)，114.9，114.9，111.4，102.6，84.9(C-7)，56.2(C-21)，35.1(C-13)，30.1(C-14)，23.3(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.6(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z 430.08/432.04[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，452.05/454.02[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，880.78/882.83[2M+Na]+/[2M+Na+2]+.HRESIMS m/z 430.1774[M+H]+(calcd forC24H29O4NCl，430.1780).
15：1H NMR(600MHz，CDCl3)δH7.89(1H，s，H-1)，7.00(1H，s，H-4)，6.96(1H，d，J＝15.6Hz，H-10)，6.31(1H，d，J＝15.6Hz，H-9)，5.72(1H，d，J＝9.6Hz，H-12)，4.60(2H，s，H-21)，2.63(1H，t，2.4Hz，H-23)，2.50(1H，m，H-13)，2.17(3H，s，H-20)，1.88(3H，s，H-17)，1.55(3H，s，H-18)，1.45(1H，m，H-14)，1.35(1H，m，H-14)，1.03(3H，d，J＝6.6Hz，H-16)，0.89(3H，t，J＝7.2Hz，H-15).13C NMR(150MHz，CDCl3)δC193.5(C-6)，184.7(C-8)，170.2(COCH3)，148.4，147.7，145.4，144.2，140.8，132.0，114.9，114.6，111.4，103.0，85.0(C-7)，77.5，75.3，43.8，35.2(C-13)，30.1(C-14)，23.3(C-18)，20.4(C-16)，20.3(COCH3)，12.7(C-17)，12.1(C-15).ESIMS m/z 428.03/430.09[M+H]+/[M+H+2]+(3∶1)，450.01/452.02[M+Na]+/[M+Na+2]+(3∶1)，876.80/878.80[2M+Na]+/[2M+Na+2]+.HRESIMS m/z 428.1621[M+H]+(calcdfor C24H27O4NCl，428.1623).
实施例4
取式I化合物2mg溶解在装有1000μL甲醇、乙醇、四氢呋喃或丙酮中任一种或几种的小瓶中，于30℃下静置7天后，缓慢结晶即得式I化合物的晶体。
上述晶体的Cu靶X-射线晶体衍射数据：空间群为P2(1)2(1)2(1)，晶胞参数为β＝90(0)°， Z＝4，Dc＝1.193g/cm3，F(000)＝1064，μ＝0.173mm-1。
实施例5
分别利用四种病毒和三种敏感细胞，通过采用细胞病变抑制作用(CPE)对本发明的式I化合物进行抗病毒活性研究。四种病毒分别为：EV71(肠道病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)、HSV-1(疱疹I型病毒)、Cox-B3(柯萨奇病毒)；其中非洲绿猴肾细胞(Vero)为EV71敏感细胞，人喉癌上皮细胞(Hep2)为RSV、HSV-1、Cox-B3敏感细胞。四种抗病毒活性实验中，除了敏感细胞差异外，测试方法及数据处理方法一样。以EV71为例介绍抗病毒实验方法：将培养成单层的Vero细胞用胰酶消化后，接种于96孔板中，长成单层备用。将EV71病接种于Vero细胞上，加2％血清1640培养液后置37℃、5％CO2条件下培养，出现90％以上的病变后，反复冻融3次后吹打离心，定量分装，-80℃冰箱冻存备用。受试样品每管以10μL DMSO溶解后，加入200μL的2％1640培养液，并连续10次2倍比稀释，共10个稀释度，然后横向接种于96板孔中的单层细胞上，11列为病毒对照、12列为细胞对照，37℃、5％CO2培养，每小时观察病变，连续观察24h。病毒对照出现90％以上的病变后，将板孔内液体吸弃，加1％中性红染色，在540nm波长测定OD值，用Reed-Muench方法计算药物半数有效浓度(IC50)，观察药物抑杀病毒的效果见下表。
本发明的式I化合物对四种病毒显示重要的选择性抑制活性，远强于阳性药利巴韦林。这表明式I化合物或其药学上可接受的盐可用于制备高效低毒的抗病毒剂，并且海洋来源真菌Penicilliumsp.(TA33-1)可进行大规模发酵生产，保证了式I化合物的来源，具有广阔的应用前景。
Claims (13)
1.一种Sclerotiorin衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于具有式1所示的结构：
式I中R为
2.权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于先在菌种培养基中对真菌Penicillium sp.保藏编号为CGMCC No.8994进行菌种培养，再在发酵培养基中对该真菌进行发酵培养，将所得菌丝体用1∶1的氯仿-甲醇混合液浸提3次减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分别进行正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析后，再经HPLC高效液相制备色谱，将所得洗脱液浓缩，得黄色粉末，即为(+)-Sclerotiorin；在溶有(+)-Sclerotiorin的二氯甲烷溶液中，加入有机伯胺和碳酸钾，反应后得到式I氯代聚酮化合物；其中所述菌种培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、粗海盐、水；所述的发酵培养基中含有大米、粗海盐、水；色谱分离为正相硅胶柱色谱分离、凝胶柱层析分离和高效液相色谱分离；所述的有机伯胺为
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述菌种培养基含有葡萄糖0.1％-5.0％、酵母膏0.01％-1％、蛋白胨0.01％-1％、琼脂0.1％-3.0％、氯化钠0.05％-5％，其余为水，上述百分含量均为重量百分比，培养温度为0-30℃，培养时间为3-15天。
4.如权利要求2-3任一项所述的制备方法，其特征在于所述发酵培养基含有大米1.0％-80.0％、氯化钠0.05％-5％，其余为水，上述百分含量均为重量百分比，培养温度为0-30℃，培养时间为10-60天。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的正相硅胶柱层析采用的固定相为200-300目硅胶，流动相为体积比为15％-60％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂；所述SephadexLH-20凝胶柱层析采用的流动相为体积比为石油醚∶氯仿∶甲醇＝2∶1∶1的混合溶剂；所述HPLC高效液相制备色谱中采用的色谱柱为Kromasil 10×250mm，5μm，流速为1.0-5.0mL/min，流动相为体积比50％-80％的甲醇-水混合溶剂。
6.权利要求1所述的式I化合物的晶体。
7.权利要求6所述化合物的晶体，其特征在于，R为该化合物晶体的空间群为P2(1)2(1)2(1)。
8.权利要求6所述晶体的制备方法，其特征在于将式I化合物溶于甲醇、乙醇、水、四氢呋喃或丙酮中的任一种或几种，静置缓慢结晶即可得到式I化合物的晶体。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于静置缓慢结晶的条件为在0-30℃下，静置1-30天。
10.一种抗肠道病毒EV71、呼吸道合胞病毒RSV、疱疹I型病毒HSV-1或柯萨奇病毒Cox-B3剂，其特征在于其含有权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。
11.一种抗肠道病毒EV71、呼吸道合胞病毒RSV、疱疹I型病毒HSV-1或柯萨奇病毒Cox-B3剂，其特征在于其含有权利要求6所述的晶体作为有效成分。
12.权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肠道病毒EV71、呼吸道合胞病毒RSV、疱疹I型病毒HSV-1或柯萨奇病毒Cox-B3剂中的应用。
13.权利要求6所述的晶体在制备抗肠道病毒EV71、呼吸道合胞病毒RSV、疱疹I型病毒HSV-1或柯萨奇病毒Cox-B3剂中的应用。
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| Azaphilone and Isocoumarin Derivatives from the Endophytic Fungus;Jiraporn ARUNPANICHLERT等;《Chem. Pharm. Bull》;20100831;第58卷(第8期);第1033-1036页 * |
| Fungal Phenalenones Inhibit HIV-1 Integrase;Shiomi, K等;《J. Antibiot》;20050131;第58卷(第1期);第65-68页 * |
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