CN107119087B - 一种细胞松弛素类化合物Aspochalasin D的制备方法及应用 - Google Patents

一种细胞松弛素类化合物Aspochalasin D的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞松弛素类化合物Aspochalasin D的制备方法及应用，属于医药技术领域。所述制备方法包括：将保藏号为CCTCC NO:M 2013631的黄柄曲霉Z‑4接入大米培养基中进行发酵培养，再从发酵液中分离得到细胞松弛素类化合物Aspochalasin D。本发明首次利用海洋真菌黄柄曲霉Z‑4在大米培养基中发酵培养，提取分离得到Aspochalasin D，为该化合物的生产提供新的制备方式，而且该方法简便易于操作，生产成本低廉，适合规模化生产；本发明从黄柄曲霉Z‑4发酵产物中获得的化合物Aspochalasin D具有显著的抑制前列腺癌细胞增殖的活性，因此可将其开发应用于抗前列腺癌药物或前列腺癌预防保健食品当中。

Description

一种细胞松弛素类化合物Aspochalasin D的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种细胞松弛素类化合物Aspochalasin D的制备方法及应用。
背景技术
癌症是严重威胁人类生命健康的常见病、多发病，死亡率极高，全世界每年死于癌症的约有430万人，我国每年死于癌症的约有100万人，而且这种情况还在加剧。因此，研发具有抗肿瘤活性的药物具有重要的意义。
海洋生物因其所处的高压、高盐、低温、低营养等特殊的生活环境而产生和积累了许多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，成为研究发现新型海洋药物的重要资源。而海洋微生物因其不受生长季节限制且可人工大规模培养的特点，相较于其他海洋生物资源而言不致引起生态破坏，易于解决药源问题，因此在后续开发研究方面具有独特的优势。
如公开号为CN 101591288A的中国专利文献从球毛壳菌(Chaetomium globosum)的发酵物中分离得到一个细胞松弛素类化合物，该化合物可作为细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
又如公开号为CN 105085538 A的中国专利文献公开了通过对黄柄曲霉固体发酵和对其发酵产物的甲醇提取物进行分离纯化，得到18个细胞松弛素类新化合物，通过抗肿瘤活性评价，发现化合物1(黄柄曲霉菌素A)对白血病细胞HL-60，人肝癌细胞SMMC-7721，人肺癌细胞A-549，人乳腺癌细胞MCF-7，人结肠癌细胞SW480有一定的抑制作用，同时发现化合物1能够特异性的将人早幼粒白血病细胞HL-60、急性早幼粒白血病细胞株NB4、结肠癌细胞株RKO、人结直肠癌细胞HCT116阻滞在G1期，而对两株正常细胞无明显影响。
细胞松弛素是由真菌产生的一种结构和活性相关的次级代谢产物，大多具有高度取代的全氢异吲哚酮并大环内酯的结构，结构的独特性造就了该类化合物的具有抑制HIV病毒，抗肿瘤等多种活性。Rochfort Simone等发现Aspochalasin L对HIV-1整合酶具有抑制活性，其半数抑制浓度IC50为71.7μM(Journal of Antibiotics,2005,58(4),279-283)；Taijiro Tomikawa等发现Aspochalasin D可使小鼠原B细胞Ba/F3凋亡，其半数致死浓度为0.49μg/mL(1.22μM)(The Journal of Antibiotics,2001,54(4),379-381)；Lin Zhenjian等发现Aspochalasin D对人肺癌细胞A-549有抑制活性，其半数抑制浓度为6.4μM(European Journal of Organic Chemistry,2009,18,3045-3051)。然而，至今未见有关化合物Aspochalasin D对前列腺癌细胞有较强抑制活性的报道。
发明内容
本发明的目的提供一种细胞松弛素类化合物Aspochalasin D的制备方法以及该化合物在制备抗前列腺药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备细胞松弛素类化合物Aspochalasin D方法，包括：将保藏号为CCTCC NO:M 2013631的黄柄曲霉Z-4接入大米培养基中进行发酵培养，再从发酵液中分离得到细胞松弛素类化合物Aspochalasin D。
所述黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)Z-4是从海蟑螂的肠道中分离得到，该菌株的菌落生长速度较快，质地疏松，平坦，丝绒放射状，边缘整齐；分生孢子球形，分生孢子头呈放射状。该菌株已保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013631，保藏日期为2013年12月4日。
本发明研究证明，黄柄曲霉Z-4只有在大米培养基中培养发酵才会产生细胞松弛素类化合物Aspochalasin D。所述大米培养基包括大米和人工海水，由于黄柄曲霉Z-4为来源于海洋的微生物，培养基中添加人工海水更利于其生长。
作为优选，所述大米培养基由大米与3％人工海水以质量体积比1:1～1:1.5混合制得。原料混合后，经121℃高压灭菌20min制得大米培养基。
将活化后的菌种液以1:5(v:w)的比例接入大米培养基中进行发酵，所述发酵培养的条件为23～28℃静置培养25～35天。作为优选，发酵温度为25℃，时间为28天。
本发明采用静态培养方式。
发酵制得的发酵液中成分复杂，本发明联合使用多种分离方式，从而获得细胞松弛素类化合物Aspochalasin D。所述分离包括依次进行的有机溶剂萃取、正相硅胶色谱纯化和高效液相色谱纯化。
萃取时，采用的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或甲醇，作为优选，有机溶剂为乙酸乙酯。萃取时，发酵液与有机溶剂的体积比为1:1。收集有机相，减压回收有机溶剂得到提取物。
正相硅胶色谱纯化时，以二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱溶剂，洗脱时，依次采用体积比为100:1、98:2、95:5、90:10、80:20、50:50、0:100的二氯甲烷/甲醇混合液进行洗脱。收集体积比为95:5的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱的馏分。
高效液相色谱纯化时，以80％的甲醇水溶液作为洗脱剂。收集该馏分即得细胞松弛素类化合物Aspochalasin D纯品。
本发明提供了由上述方法制备得到的细胞松弛素类化合物Aspochalasin D。在体外抗肿瘤活性测试中，本发明的化合物Aspochalasin D具有明显的抑制前列腺癌细胞增殖的作用，因此，该化合物可用于制备前列腺癌细胞抑制剂或者抗前列腺癌药物或前列腺癌预防保健品中。
当化合物Aspochalasin D应用于制备抗前列腺癌药物时，以有效剂量的细胞松弛素类化合物Aspochalasin D作为活性成分，添加药学上可接受的辅料。
所述药学上可接受的辅料包括淀粉、蔗糖、微晶纤维素等填充剂，淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等粘合剂，硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等湿润剂，聚山梨脂、卵磷脂等吸收促进剂，伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等表面活性剂，还可以加入香味剂、甜味剂等其它辅剂。
药物的剂型可以是片剂、丸剂、粉剂、分散片、小药囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、胶囊、注射液、搽剂、栓剂等。上述各种剂型可采用常规方法进行制备。
给药途径为肠内给药或非肠内给药，包括口服、肌肉注射、皮下注射、静脉注射等。
当化合物Aspochalasin D应用于制备前列腺癌预防保健品时，以有效剂量的化合物Aspochalasin D为活性成分，添加食品上可接受的辅料。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明首次利用海洋真菌黄柄曲霉Z-4在大米培养基中发酵培养，提取分离得到细胞松弛素类化合物Aspochalasin D，为化合物Aspochalasin D的生产提供新的制备方式，而且该方法简便易于操作，生产成本低廉，适合规模化生产。
(2)本发明从黄柄曲霉Z-4发酵产物中获得的化合物Aspochalasin D具有显著的抑制前列腺癌细胞增殖的活性，因此可将其开发应用于抗前列腺癌药物或前列腺癌预防保健食品当中。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
下述实施例采用的菌株为黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)Z-4，该菌株已保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013631，保藏日期为2013年12月4日。
实施例1
化合物Aspochalasin D的制备
(1)发酵：500mL三角锥形瓶中加入40g大米，3％人工海水45mL，121℃高压灭菌20min得到大米培养基。
将菌株Z-4从斜面培养基移入大米培养基中，25℃静置培养28天。将菌液过滤后用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压回收有机溶剂后得到提取物40g。
(2)分离和纯化：上述提取物用正相硅胶柱层析(200～300目硅胶，450g)，以二氯甲烷/甲醇(体积比100:1-0:100)进行洗脱，具体为：依次以体积比为100:1、98:2、95:5、90:10、80:20、50:50、0:100的二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，每浓度体积1000mL，薄层层析检测，合并含有目标化合物的馏分(即体积比为95:5的二氯甲烷/甲醇洗脱的馏分)；经制备型ODS-HPLC(80％甲醇/水洗脱，流速为10mL/min，保留时间为20min)纯化，得到目标化合物纯品(2mg)。目标化合物为白色无定型固体。
(3)经鉴定，目标化合物为细胞松弛素类化合物Aspochalasin D，化学结构为：
Figure BDA0001258017820000041
实施例2
采用MTT法对化合物Aspochalasin D进行体外抗肿瘤活性测试
细胞株：前列腺癌PC3细胞；
培养基：RPMI1640培养基，含10％胎牛血清；
样品配制：将实施例1获得的样品溶于DMSO，并按照一定比率稀释成5个浓度。
活性测试实验：将处于对数生长期的肿瘤细胞，以20000个/mL接种96孔板中，每孔加细胞悬浊液200μL，培养24h后，分别加入上述配制药液1μL，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育48h后，加入浓度为2.5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h，吸去上清液，加入100μLDMSO摇匀，用酶标仪于570nm波长下测定各孔的吸光度值(OD值)，并计算细胞抑制率。
表1 Aspochalasin D的抗肿瘤活性
Figure BDA0001258017820000042
表1中可见化合物Aspochalasin D对前列腺癌PC3细胞的增殖具有较强的抑制作用，半数抑制浓度IC50约为11.4μM。
从化合物Aspochalasin D的物理性质可知其可溶于甲醇，也可溶于二甲基亚砜或二甲基亚砜的含水溶液。
因此，化合物Aspochalasin D可作为抗前列腺癌药物或前列腺癌预防保健食品中加以利用。

Claims (2)

1.一种制备细胞松弛素类化合物Aspochalasin D的方法，其特征在于，包括：将保藏号为CCTCC NO:M 2013631的黄柄曲霉Z-4接入大米培养基中进行发酵培养，从发酵液中分离得到细胞松弛素类化合物Aspochalasin D；
所述大米培养基由大米与3％人工海水以质量体积比1:1～1:1.5混合制得；
所述发酵培养的条件为：23～28℃静置培养25～35天；
所述分离包括依次进行的乙酸乙酯萃取、正相硅胶色谱纯化和高效液相色谱纯化；
萃取时，发酵液与乙酸乙酯的体积比为1:1；
正相硅胶色谱纯化，以二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱溶剂，收集体积比为95:5的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱的馏分；
高效液相色谱纯化，以80％的甲醇水溶液作为洗脱剂。
2.如权利要求1所述的方法制备得到的细胞松弛素类化合物Aspochalasin D在制备抗前列腺癌药物或前列腺癌预防保健品中的应用。
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