CN104286372A - 一种羽毛蛋白粉的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物饲料加工技术领域，特别公开了一种羽毛蛋白粉的制备方法。该羽毛蛋白粉的制备方法，以鸡羽毛为原料，其特征为：将鸡羽毛经预处理研磨为羽毛粉；将羽毛粉置于容器中，加入蒸馏水，每1g羽毛粉的酶添加量为角蛋白酶0.015-0.0525g/中性蛋白酶0.050-0.175g，调节pH为6-8.5，于35-60℃下酶解4-48h；将酶解反应液过滤，取过滤液为产品。本发明工艺步骤简单，成本投资较少，产品纯度高，产品可加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白，应用较为广泛，适于广泛推广应用。

Description

一种羽毛蛋白粉的制备方法

（一）        技术领域

    本发明涉及动物饲料加工技术领域，特别涉及一种羽毛蛋白粉的制备方法。

（二）        背景技术

目前，我国屠宰业所造成的环境污染相当严重，主要是在屠宰畜禽生产肉食品的同时会产生大量的羽毛、血液、内脏、蹄壳等系列产物，对环境造成了很大的污染。以2010年为例，我国家禽屠宰业约达到110亿只，按每只家禽可产生羽毛0.10g计算产羽毛约为110万吨，这相当于约90万吨的蛋白资源。

另一方面，在我国蛋白质资源越发缺乏的今天，充分利用羽毛蛋白的资源，就显得非常重要。但由于羽毛特定的双硫键蛋白结构，严重影响其开发利用。从一级结构看，羽毛角蛋白含脱硫氨酸较多（4.65%），脱氨酸中的二硫键在肽链间形成交联结构阻碍了角蛋白的溶解；从高结构上看，α-螺旋状的肽链组合符合螺旋式的初原纤维，11根初原纤维构成的小原纤维，小原纤维在平行排列的大原纤维二形成角蛋白，空间结构属纤维蛋白。由于角蛋白的结构复杂，表现出质地坚硬、不溶于水，只是在饲料应用上难以被消化吸收，客观上存在着严重的蛋白资源浪费。

申请号为2009101700823的专利公开一种羽毛蛋白粉的制备方法，该方法采用气爆酶解的方法。该方法一方面工序复杂，存在安全隐患，另一方面对羽毛粉中氨基酸的破坏大，且制备出羽毛蛋白粉中的粗蛋白含量达到90%，同时制备出的羽毛蛋白粉用途仅可用作饲料蛋白。

（三）        发明内容

    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种制备简单、产品纯度高的羽毛蛋白粉的制备方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种羽毛蛋白粉的制备方法，以鸡羽毛为原料，包括如下步骤：

（1）将鸡羽毛经预处理研磨为羽毛粉；

（2）将羽毛粉置于容器中，加入蒸馏水，每1g羽毛粉的酶添加量为角蛋白酶0.015-0.0525g/中性蛋白酶0.050-0.175g，调节pH为6-8.5，于35-60℃下酶解4-48h；

（3）将酶解反应液过滤，取过滤液为产品测定可溶性蛋白含量，滤出的残渣经烘干后称重待用。

本发明的更优技术方案为：

步骤（1）中，所述鸡羽毛经清洗、除杂、剪碎、晾干后装入烧杯，置于高压蒸汽灭菌锅内于120℃下灭菌40min，之后处理、沥干，再于80℃的恒温干燥箱内干燥12h，经粉碎、研磨、过100目筛后得到羽毛粉，干燥保存。

步骤（2）中，每1g羽毛粉的蒸馏水添加量为100ml、酶添加量为角蛋白酶0.0375g/中性蛋白酶0.125g，调节pH为8，于40℃下酶解32h。

步骤（3）中，过滤液中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法；滤出残渣中添加胃蛋白酶和预制至45℃的酸性水，将其混合物置于45℃恒温摇床中消化16h，将反应液过滤、烘干、称重，完成体外消化率的测定，其中，每1g滤出残渣添加5000单位的胃蛋白酶，酸性水的添加量为100ml。

本发明工艺步骤简单，成本投资较少，产品纯度高，产品可加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白，应用较为广泛，适于广泛推广应用。

（四）        附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明的蛋白质含量标准曲线图；

图2为本发明的酶解温度试验曲线图；

图3为本发明的酶解液初始pH试验曲线图；

图4为本发明的复酶添加量试验曲线图；

图5为本发明的酶解时间试验曲线图。

（五）        具体实施方式

实施例：

一．材料及方法

材料

鸡羽毛（从家禽屠宰厂获得），角蛋白酶：100000U/g（济南诺能生物工程有限公司），中性蛋白酶:30000U/g（济南诺能生物工程有限公司），1mol/LNaOH溶液，1mol/LHCL溶液，蒸馏水，考马斯亮蓝试剂（称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95％乙醇中，加入100mL85％磷酸，加蒸馏水稀释至1000mL。），蛋白质标准溶液（结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成100μg/mL的蛋白质标准溶液。），胃蛋白酶（蛋白酶实际效价为1：3000）。

主要仪器设备

主要仪器

250mL三角瓶18只，吸量管（10mL),试管及试管架，容量瓶（50mL),研钵，100目标准筛，滴管，漏斗，滤纸，量筒，移液器（100—1000μl；5ml），大小枪头，比色杯，擦镜纸，玻璃棒，精密PH试纸。

主要设备

立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI型）（上海申安医疗器械厂），恒温培养摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司），可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），恒温干燥箱，微量电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

试验方法及内容   

羽毛的预处理及羽毛样品的制备

从家禽处理厂获得的羽毛样品一般含有许多的血液泥沙等杂质，所以使用前需要清洗除杂，否则会影响试验效果和品质。为了酶解反应更均匀需要把羽毛制成粉末。

羽毛预处理：羽毛→清洗、除杂→剪碎、晾干→装入烧杯→置入高压蒸汽灭菌锅（120℃、40min）→处理→沥干→恒温干燥箱（80℃、12h)→粉碎、研磨、过筛（100目）→羽毛粉→干燥保存待用。

复酶（中性蛋白酶/角蛋白酶）酶解羽毛粉试验

单因子试验确定复酶酶解最佳条件

取18只250ml三角瓶，6个处理组，每组3个重复组，每瓶加100ml蒸馏水和1g羽毛粉样品。

A.酶解温度试验：酶添加量角蛋白酶0.030g/中性蛋白酶0.100g，调节PH为7，酶解时间24h，酶解温度分别为35、40、45、50、55、60℃，恒温摇床下反应。

B.酶解液初始PH试验：酶解温度以上次试验为参考，酶添加量角蛋白酶0.030g/中性蛋白酶0.100g，酶解时间24h，酶解液PH分别为6、6.5、7、7.5、8，8.5恒温摇床下反应。

C.酶添加量试验：酶解温度和PH以上次试验为参考，酶添加量分别为角0.015/中0.050g、角0.0225/0.075g、角0.030/中0.100g、角0.0375/中0.125 g、角0.045/中0.150g、角0.0525/中0.175 g，恒温摇床下反应。

D.酶解时间试验：酶解温度、PH、酶添加量以上次试验为参考，酶解时间分别为4、8、12、24、32、48h，恒温摇床下反应。

每组试验结束后，将酶解反应液过滤，取过滤液测定可溶性蛋白含量，滤过残渣经烘干后称重待用。

可溶性蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，以牛血清蛋白为标准蛋白，测定波长为595nm，计算可溶性蛋白含量（μg/g)及羽毛分解率（%），绘制曲线。蛋白质含量的计算方法如下：

蛋白质含量（μg/g)=W×1.0×v×1/m；

式中：W-由标准蛋白曲线上查得蛋白质的质量，μg；

      1.0-吸取提取液体积，mL；

      V-提取液总体积，mL；

      m-称取试样质量，g。

羽毛分解率（%）=（羽毛样品干质量-酶解液残渣干质量）/ 羽毛样品干质量×100。

正交实验验证实验结果

选取酶解温度、酶解液初始PH、酶添加量和酶解时间为观察因素，每个因素取3个水平，设计一个四因素、3水平的试验，选用L9（3⁴）正交进行实验。每次实验取3个250mL三角瓶，都加入1g羽毛粉样品和100mL蒸馏水，相同条件重复三次。按照正交试验确定的最佳酶解参数进行酶降解试验。

体外消化率的测定

根据GB/T 17811-1999《动物蛋白质饲料消化率的测定   胃蛋白酶法》，采用酸性水中胃蛋白酶体外消化率的测定方法进行试验。

试验方法步骤：称取1g酶解羽毛粉残渣→添加胃蛋白酶（按样品1：5000单位加入胃蛋白酶）→加入预热至45℃的酸性水100ml→将三角瓶置于45℃恒温摇床中消化16h→反应液过滤→烘干→称重。

单独角蛋白酶酶解羽毛粉试验

参照复酶（中性蛋白酶/角蛋白酶）酶解羽毛粉的方法步骤进行试验，只是把使用的复酶换成角蛋白酶进行试验。将实验结果与复酶酶解效果进行对比分析。

蛋白质含量标准曲线

如附图1所示，由标准曲线获得蛋白质标准曲线方程为y=0.0093x+0.0662,根据方程和测得的数据可以得到可溶性蛋白含量。根据数据制作数据表格和曲线图，分析数据获得实验结果。

3.2单因子试验结果及分析

酶解温度试验 

可溶性蛋白含量（单位mg/L) 

在不同温度条件下进行酶解羽毛粉试验，根据上表格制得曲线图（见附图2），从曲线图(见附图2）可知酶解温度是40℃时，酶解液中可溶性蛋白含量最高，随温度的升高或降低蛋白含量都降低，因此复酶酶解羽毛粉的最适温度为40℃。

3.2.2酶解初始PH试验

可溶性蛋白含量（单位mg/L)

以前次试验确定的温度为参考，在不同PH条件下进行酶解羽毛粉试验，根据上表格制得曲线图（见附图3），从曲线图（见附图3）可知酶解液初始PH为8时酶解液中可溶性蛋白含量最高，随PH的升高或降低蛋白含量都降低，因此复酶酶解羽毛粉的最适初始PH为8。

酶添加量试验

可溶性蛋白含量（单位mg/L)

以前次试验确定的温度和PH为参考，在不同的复酶添加量下进行酶解羽毛粉试验，根据上表格制得曲线图（见附图4），从曲线图（见附图4）可知随酶添加量的增加可溶性蛋白含量也随之增加，当酶添加量达到角0.0375/中0.125g 时，可溶性蛋白含量达到431.0mg/L,随着酶添加量的增加可溶性蛋白含量上升缓慢。因此复酶酶解羽毛粉的最适酶添加量为角蛋白酶0.0375/中性蛋白酶0.125 g。

酶解时间试验

可溶性蛋白含量测定（单位mg/L）

以前次试验确定的温度、PH和酶添加量条件为参考，在不同的酶解时间下进行试验，根据上表格制得曲线图（见附图5），从曲线图（见附图5）可以看出随酶解时间的增加可溶性蛋白含量也随之增加，当酶解时间达到32h时，可溶性蛋白含量为487.7mg/L，随着酶解时间的增加可溶性蛋白含量增加变缓，因此复酶酶解羽毛粉的最适酶解时间为32h。

根据数据分析初步得出最适反应条件为酶解温度是40℃、酶解液初始PH是8、复酶添加量是角蛋白酶0.0375/中性蛋白酶0.125 g和酶解时间是32h。通过设计正交实验对结果进行验证。

正交实验验证实验结果 

正交实验结果统计

根据以上试验确定试验因素水平

正交实验设计结果及数据统计

由表格6对正交实验结果处理

注：K1：对应的是各因素水平“1”的各组实验结果之和；K2:对应的是各因素水平“2”的各组实验结果之和；K3：对应的是各因素水平“3”的各组实验结果之和。极差R对应的哪一因素值最大，影响就最大：反之，影响最小。

正交实验结果分析

从表格7中的极差R可以看出，在一定的范围内，对羽毛粉降解影响最大的是酶解液的初始PH，影响力第二的是酶解温度，第三是酶解时间，影响最小的是复酶的添加量。酶解温度试验组中k2>k1>k3,所以酶解温度最适为40℃；用相同的统计原理确定最适的酶解液初始PH8，最适复酶添加量为角0.0375/中0.125g，最适酶解时间为32h。酶解液可溶性蛋白含量为487.7mg/L。过滤后残渣烘干备用。

羽毛分解率

在最适反应条件下酶解羽毛粉，酶解液过滤，残渣烘干后称重。在最佳酶解参数下，羽毛分解质量为840mg,即羽毛的分解率达到84％。

酶解羽毛粉体外消化率 

采用胃蛋白酶盐酸溶液进行体外消化率实验，实验结果结果显示酶解羽毛蛋白粉体外消化率达到了81％。

4. 

本次研究通过对鸡羽毛粉进行复酶（中性蛋白酶/角蛋白酶）降解的一系列试验，并经过正交实验验证，得到了复酶降解羽毛粉的最佳工艺条件，采用高温高压预处理与复酶降解的最适宜工艺条件为：鸡羽毛经120℃高温高压处理40min，80℃烘干、粉碎、过筛，每克羽毛粉加入角蛋白酶0.0375/中性蛋白酶0.125g,酶解液初始PH为8，在40℃下酶解32h。羽毛分解率达到84％，酶解液可溶性蛋白含量为487.7mg/L，酶解羽毛蛋白粉体外消化率达到了81％，显示了具有很好的酶解效果。酶解上清液中可溶性蛋白含量较高和酶解羽毛蛋白粉较高的胃蛋白酶消化率，可以加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白。

Claims (6)

1.一种羽毛蛋白粉的制备方法，以鸡羽毛为原料，其特征为，包括如下步骤：（1）将鸡羽毛经预处理研磨为羽毛粉；（2）将羽毛粉置于容器中，加入蒸馏水，每1g羽毛粉的酶添加量为角蛋白酶0.015-0.0525g/中性蛋白酶0.050-0.175g，调节pH为6-8.5，于35-60℃下酶解4-48h；（3）将酶解反应液过滤，取过滤液为产品测定可溶性蛋白含量，滤出的残渣经烘干后称重待用。

2.根据权利要求1所述的羽毛蛋白粉的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述鸡羽毛经清洗、除杂、剪碎、晾干后装入烧杯，置于高压蒸汽灭菌锅内于120℃下灭菌40min，之后处理、沥干，再于80℃的恒温干燥箱内干燥12h，经粉碎、研磨、过100目筛后得到羽毛粉，干燥保存。

3.根据权利要求1所述的羽毛蛋白粉的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，每1g羽毛粉的蒸馏水添加量为100ml、酶添加量为角蛋白酶0.0375g/中性蛋白酶0.125g，调节pH为8，于40℃下酶解32h。

4.根据权利要求1所述的羽毛蛋白粉的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，过滤液中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。

5.根据权利要求1所述的羽毛蛋白粉的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，滤出残渣中添加胃蛋白酶和预制至45℃的酸性水，将其混合物置于45℃恒温摇床中消化16h，将反应液过滤、烘干、称重，完成体外消化率的测定。

6.根据权利要求5所述的羽毛蛋白粉的制备方法，其特征在于：每1g滤出残渣添加5000单位的胃蛋白酶，酸性水的添加量为100ml。