CN109596837A - 一种猪饲料蛋白质消化率的仿生消化测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速测定猪饲料蛋白质消化率的体外仿生消化方法，包括如下步骤：将饲料样品粉碎过标准筛；制备胃缓冲液及小肠缓冲液；制备模拟胃液、浓缩模拟小肠液、浓缩补充小肠液；将胃缓冲液、小肠缓冲液装入单胃动物仿生消化的保温室中，并连接好与模拟消化器相通的管道；将粉碎好的饲料样品装入模拟消化器中，加入模拟胃液后装入单胃动物仿生消化系统中；将上述胃、小肠各阶段仿生消化参数通过设置仿生消化系统的控制软件，自动完成猪饲料蛋白质的体外仿生消化过程；获得未消化残渣后，烘干后测定残渣及饲料样品的粗蛋白含量，计算蛋白质的消化率。本发明方法简单、精度高、实施成本低，可在48小时内准确地测定猪饲料的蛋白质消化率。

Description

一种猪饲料蛋白质消化率的仿生消化测定方法

技术领域

本发明涉及一种猪饲料蛋白质消化率的仿生消化测定方法，尤指通过在实验室条件下全自动体外模拟猪的体内消化过程估测饲料蛋白质的消化率。

背景技术

饲料的可消化蛋白及氨基酸等养分的含量是指导企业建立饲料原料蛋白质效价数据库与配方标准及招标采购、优化饲料配方的主要决策依据，也是我国实施从源头减少畜禽氮排泄量的重要技术支撑。目前，在配合饲料生产中，该数据均不是实测数据，而是查表或通过粗蛋白含量作经验校正，存在较大的偏差乃至误导，已经成为饲料工业隐性浪费之首。近半个世纪以来，人们在实测饲料蛋白质或氨基酸消化率的方法上仍以在猪回肠末端安装套管后通过代谢试验获得标准回肠末端(SID)可消化粗蛋白或氨基酸数据。该动物试验方法的测定周期约需要10～15天，耗时长、系统误差大、精度低、可重复性差等缺点无法满足现代畜牧业对精准、快速获取饲料可消化粗蛋白或氨基酸含量的基本要求。

为了满足企业生产能在实验室条件下进行猪饲料蛋白质或氨基酸消化率的快速测定，欧美等发达国家一直致力于通过模拟猪饲料在胃-小肠的消化来建立一种快速评价饲料可消化蛋白质及氨基酸含量的技术。其中丹麦学者Boisen和Fernandez建立的胃蛋白酶——胰液素为体系的猪饲料蛋白质消化率的快速评定操作技术规程在国际上相对引用较多(见参考文献：Boisen,S.,and J.A.Fernandez.Prediction of the apparent ilealdigestibility of protein and amino acid in feedstuffs and feed mixtures forpigs by in vitro analyses.Anim.Feed Sci.Technol.,1995,51:29-43)。然而，该方法存在以下缺陷：1)在胃、小肠模拟消化液的制备上，存在配制模拟消化液所用试剂——胰液素中的消化酶活性不清楚，导致配制成的模拟消化液活力也不清楚，引发消化能力难以重复；2)在模拟消化过程中，未阐明猪体内消化液的组成，在模拟目标物不清楚的前提下导致了胃、小肠消化阶段消化液中酶的活性与体内相差非常大；3)在猪的小肠模拟消化过程中，模拟小肠液都是在开始小肠消化时一次性加入，消化过程中消化酶活性是平稳还是衰减不清楚。由于猪胰液的分泌及消化道内消化酶活性均随采食呈周期性变化，因此，在体内虽然存在消化酶活性衰变的现象，但因有胰液的分泌而使消化酶的活性成脉冲式变化。在体外消化中如何模拟这一现象，仍鲜见报道；4)体外模拟消化过程都在以三角瓶为反应容器的密闭系统中进行，每一消化阶段pH值的改变、消化液的加入、产物的分离等都是通过手工操作实现；5)在水解产物的分离中，通过磺基水杨酸沉淀未消化蛋白，再过滤的方式分离水解物与未水解物，具有较大的人为随意性，往往导致未消化蛋白被过滤出去而视为已消化蛋白，从而引起测值大大高于体内测值。由于存在上述问题，该方法在诸多方面难以标准化，从而导致美国、加拿大等发达国家以及我国均未在饲料工业中采用该方法用于饲料原料蛋白质效价的测定。

近年来，为了排除手工操作对体外模拟消化测试结果的干扰，结合现代自动化控制技术，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所于2009年研制了专用于猪禽的单胃动物仿生消化系统(参见专利号为ZL 200910078147.1的中国发明专利“单胃动物仿生消化系统及基于该系统模拟单胃动物消化的方法”)。目前该专利技术已转让，并生产了标准化的单胃动物仿生消化仪器产品供行业使用(国内科研单位及饲料与养殖企业均有购置)。该仪器为猪体外消化技术的标准化及应用于饲料可消化蛋白与氨基酸含量的快速测定提供了技术基础。另一方面，随着蛋白质提纯技术的发展，专业公司(如Sigma公司，Amersco公司)已生产出高纯度的试剂级消化酶对外提供。以消化酶活性为参照，通过试剂级消化酶制备模拟消化液，可以实现体外消化中所用消化液消化活力的标准化。因此，在弄清猪体内消化过程基础参数的基础上，基于全自动体外模拟消化工具及高纯度试剂酶来实现模拟消化液的规范化及体外模拟消化过程的自动化；在弄清体外模拟消化过程中消化酶活性的衰变规律的基础上，通过补充消化酶后进一步提高体外对体内的模拟消化程度。基于上述技术改进，可以解决现有体外模拟消化方法的缺陷。综上，开辟新的方法进一步逼近对猪体内消化过程的模拟来快速测定饲料的可消化蛋白及氨基酸含量对解决行业的重大技术需求势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪饲料蛋白质或氨基酸消化率的体外快速测定方法。该方法通过体外全自动模拟猪胃、小肠两阶段的消化实现对猪饲料蛋白质或氨基酸回肠末端消化率的准确估测，解决了传统方法中模拟消化过程消化酶活性不清楚、消化酶活性衰减、消化过程手工操作及与体内法测定猪饲料回肠末端粗蛋白消化率相差10％以上的缺陷，同时，具有节耗、省资、重复性高、测试速度快的优点。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种通过体外仿生消化测定猪饲料蛋白质消化率的方法，包括如下步骤：

1)样品预处理：将猪饲料样品粉碎过标准筛，然后将粉碎后的样品经抽真空-充氮后低温储存备用；

2)缓冲液的制备：以稀盐酸、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备胃缓冲液；以磷酸盐、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备小肠缓冲液；

3)模拟胃液的制备：根据猪体内胃液中胃蛋白酶的活性，以试剂级胃蛋白酶制备模拟胃液；

4)模拟小肠液的制备：根据猪体内空肠液中消化酶的活性，以试剂级α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩模拟小肠液；根据体外模拟消化中小肠阶段消化酶的衰变情况，以试剂级α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩补充模拟小肠液；

5)上样：采用单胃动物仿生消化系统，其包括模拟消化器、消化液试剂瓶、缓冲液试剂瓶、废液收容瓶、清洗液储存瓶、清洗液试剂瓶和清洗残留液收容瓶，所述模拟消化器包括玻璃管和透析管，该玻璃管为一中空管体，该管体的两端各设有一磨口，该管体的侧面设有输入管和输出管，该透析管放置在该玻璃管内，该透析管的两端分别从该玻璃管的两个磨口处伸出而外翻，外翻露于磨口外侧的透析管端部被橡皮条捆扎固定在磨口上，捆扎透析管端部后的两个磨口分别塞有一硅胶塞和一带有输液管的硅胶塞；

将步骤4)得到的浓缩模拟小肠液、补充浓缩模拟小肠液放入所述单胃动物仿生消化系统的消化液试剂瓶中；将步骤2)中得到的胃缓冲液、小肠缓冲液放入所述单胃动物仿生消化系统的缓冲液控温室；在所述单胃动物仿生消化系统预运行30～60分钟且各温度参数达到39℃后，将步骤1)制备的饲料样品倒入所述单胃动物仿生消化系统的模拟消化器的透析管内，并向所述透析管内加入步骤3)得到的模拟胃液，塞上胶塞；

6)胃模拟消化：将所述胃缓冲液泵入到所述模拟消化器的透析管外再回到胃缓冲液试剂瓶中往复循环，通过回旋震荡提供模拟胃液与饲料样品的混合动力，进行胃的模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的胃缓冲液，泵入去离子水清洗胃模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；上述过程反复清洗多次，以便清洗干净；

7)小肠模拟消化：将所述小肠缓冲液泵入到所述单胃动物模拟消化器的透析管外再回到小肠缓冲液试剂瓶中一直往复循环，通过回旋震荡提供浓缩模拟小肠液与饲料样品的混合动力，在透析管中溶液的pH值变为小肠缓冲液的pH值后，往透析管内注入浓缩模拟小肠液，开始小肠的模拟消化；在消化4h后再次往透析管内注入浓缩补充模拟小肠液，继续小肠模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的缓冲液；

8)水解产物的清洗：往所述模拟消化器的透析管外泵入去离子水清洗整个模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；反复进行多次，以便彻底清洗干净；

9)未消化残渣的分析及消化率的计算：将步骤8)清洗后透析管内剩余的残渣转移到培养皿中，干燥，然后分别测定残渣及饲料样品的粗蛋白或氨基酸含量，计算粗蛋白或氨基酸的消化率。

在所述步骤1)中，所述猪饲料为单一饲料原料或配合饲料，如玉米型饲粮、大豆粕型饲粮、小麦麸型饲粮、玉米-大豆粕型饲粮等。

所述粉碎在万能粉碎机中进行。当生产中饲料原料粉碎过2mm筛片，则样品在万能粉碎机中粉碎时间为20～60s，过40目分级筛；当生产中饲料原料粉碎过1mm筛片，则样品在万能粉碎机中粉碎时间为60～90s，过60目分级筛。

在所述步骤1)中，将粉碎后的样品经抽真空-充氮处理的方法具体如下：将粉碎后的样品先装入透气棉纸袋中，封口后再套入塑料样品袋内，接着在真空包装机上调节抽气时间为10～20s，充气时间为2～4s，加热封口时间为1.5～4.5s，然后进行抽真空-充氮-封口处理。所述低温储存的温度为-20～-10℃。

在所述步骤2)中，所述胃缓冲液中盐酸的浓度为5～10mmol/L，NaCl的浓度为60～110mmol/L，KCl的浓度为4～8mmol/L，抗菌剂的浓度为1～2g/L；在39℃调节pH至2～3；所述抗菌剂可为山梨酸钾。

在所述步骤2)中，所述小肠缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为30mmol/L，磷酸二氢钠的浓度为170mmol/L，NaCl的浓度为70～106mmol/L，KCl的浓度为14～17mmol/L，青霉素的浓度为800U/L，抗菌剂的浓度为1～3g/L；在39℃用1～2mol/L的磷酸或氢氧化钠调节pH至6.4～6.5；所述抗菌剂可为山梨酸钾。

在所述步骤3)中，所述模拟胃液中胃蛋白酶的活性为737～1000U/mL，盐酸的浓度为5～10mmol/L，NaCl的浓度为60～110mmol/L，KCl的浓度为4～8mmol/L，pH为2～3。

在所述步骤4)中，所述浓缩模拟小肠液中淀粉酶浓度为2046～2893U/mL，胰蛋白酶浓度为627～858U/mL，糜蛋白酶浓度为77～110U/mL。

所述浓缩补充模拟小肠液中淀粉酶浓度为1935～2139U/mL，胰蛋白酶浓度为1359～1502U/mL，糜蛋白酶浓度为48～53U/mL。

本发明中使用的胃蛋白酶具体可购自Sigma公司，产品目录号为P7000；淀粉酶具体可购自美国Sigma公司，产品目录号为A3306；胰蛋白酶具体可购自美国Amersco公司，产品目录号为0785；糜蛋白酶具体可购自美国Amersco公司，产品目录号为0164。

在所述步骤5)中，所述单胃动物仿生消化系统为中国专利ZL 200910078147.1中的记载的单胃动物仿生消化系统，具体可为湖南中本智能科技有限公司生产的型号SDS-2的单胃动物仿生消化系统。所述透析管的截留分子量为12000～14400道尔顿，扁平直径44mm；管体张开体积为35～45mL。

所述单胃动物仿生消化系统中每根模拟消化器的样品上样量为1～2g，模拟胃液的体积为20mL，浓缩模拟小肠液用量2mL，浓缩补充小肠液用量1mL，胃缓冲液用量为200mL，小肠缓冲液用量为200mL。

在所述步骤6)中，消化温度为39℃；饲料样品与模拟胃液混合后的回旋震荡频率为180转/分钟；流经模拟消化器的缓冲液流速为60mL/分钟；胃的模拟消化时间为4h；胃模拟消化结束后清洗一次消化产物的清洗液量为300mL去离子水/模拟消化器，每次清洗40分钟，重复清洗3次。

在所述步骤7)中，消化温度为39℃；样品与浓缩模拟小肠液混合后的回旋震荡频率为180转/分钟；流经模拟消化器的缓冲液流速为60mL/分钟；小肠模拟消化8h，其中在小肠模拟消化4h后注入补充浓缩模拟小肠液继续消化4h。

在所述步骤8)中，整个模拟消化结束后清洗一次消化产物的清洗液量为300mL去离子水/模拟消化器，每次清洗2～4h，重复清洗6次。

在所述步骤9)中，所述未消化残渣转入恒重的培养皿中后，在65℃恒温鼓风干燥箱中烘至无水痕，或冷冻干燥，然后在105℃恒温鼓风干燥箱中烘至恒重。

在所述步骤9)中，所述饲料样品和未消化残渣用凯氏定氮法测定粗蛋白的含量，计算蛋白质的消化率。也可以通过液相色谱或全自动氨基酸分析仪测定氨基酸的含量，计算氨基酸的消化率。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、针对配合饲料生产加工中，不同粉碎粒度的饲料原料经猪消化时食糜的粒度不一样，从而导致消化率有差异的生理现象，建立了仿生消化过程中样品粉碎过40目分级筛对应实际生产中过2mm筛粉碎的猪体内食糜粒度，过60目分级筛对应实际生产中过1mm筛粉碎的猪体内食糜粒度。达到了体外消化过程中样品的粒度与猪体内食糜粒度相对应；

2、建立了抽真空-充氮低温储存样品的保质过程，解决了本发明方法在实施过程中，因样品氧化变质引起的误差；

3、在缓冲液中加入了抗细菌和真菌的试剂，最大限度地降低了仿生消化过程中因微生物发酵导致pH值的下降，而影响仿生消化的程度；

4、在胃、小肠的仿生消化过程中，饲料与消化液混合后溶液中消化酶的活性及缓冲液的离子浓度均与猪体内消化液保持一致，在消化液的配制上明确了影响消化程度的消化酶活性浓度作为配制的依据，克服了传统方法以消化酶试剂的重量作为配制依据而导致模拟消化液活力不清楚，无法重复的弊端；

5、在小肠消化阶段泵入浓缩模拟小肠消化液后，透析管内消化液中主要消化酶的活性浓度与猪小肠液中相应消化酶的活性浓度一致。解决了传统方法中小肠消化阶段加入胰液素溶液后，因胰液素溶解性不好，导致消化酶活性远低于体内肠液消化酶活性浓度的问题；

6、根据仿生消化中，小肠阶段消化酶的衰减变化情况，在小肠消化阶段补注一次补充浓缩小肠液，达到了小肠消化酶活性的脉冲式变化，实现了与猪体内类似的变化规律。进一步减少了体外测值与体内测值的差异。

7、在仿生消化过程中，经酶消化形成的低分子物质，经透析管的孔径透出到缓冲液或清洗用的去离子水中，一方面模拟了猪体内的吸收过程，另一方面也减少了产物对体外消化程度的抑制，提高了体外测值与体内测值的接近程度；

8、在胃、小肠仿生消化中，缓冲液、消化液的泵入、残液的排出、从胃至小肠消化阶段的切换、水解产物的分离清洗均由电脑程控进行，大大减少了传统方法因每个步骤都需人工操作而引入的累积误差，使重复测定的变异系数低于1％。

附图说明

图1为本发明提供的测定方法的实现流程图。

图2为玉米在小肠模拟消化阶段消化酶活性随消化时间的变化图。

图3为大豆粕在小肠模拟消化阶段消化酶活性随消化时间的变化图。

图4为小麦麸在小肠模拟消化阶段消化酶活性随消化时间的变化图。

图5为玉米-大豆粕型饲粮在小肠模拟消化阶段消化酶活性随消化时间的变化图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中使用的胃蛋白酶购自Sigma公司，产品目录号为P7000；淀粉酶购自美国Sigma公司，产品目录号为A3306；胰蛋白酶具体可购自美国Amersco公司，产品目录号为0785；糜蛋白酶具体可购自美国Amersco公司，产品目录号为0164。

实施例一、猪胃-小肠仿生消化过程中消化酶活性随消化时间的变化及小肠消化阶段补充消化酶的效果

1饲料原料、日粮及预处理

从我国饲料原料市场上随机选取玉米(粗蛋白含量8.57％，粗纤维含量1.36％，粗脂肪含量3.03％)、大豆粕(粗蛋白含量42.50％，粗纤维含量6.78％，粗脂肪含量3.22％)、小麸皮(粗蛋白含量16.15％，粗纤维含量9.01％，粗脂肪含量3.92％)作为代表性样品。并配制玉米-大豆粕型饲粮(组成如下：玉米67.03％，大豆粕23.22％，小麦麸3.20％，大豆油2.98％，多维多矿3.57％；粗蛋白含量17.43％，粗纤维含量2.90％，粗脂肪含量4.80％)。上述4个样品分别用万能粉碎机粉碎后过60目标准筛孔后，分别装入透气棉纸袋中，然后将棉纸袋口在热塑封口机上封口，再将棉纸袋装入塑料样品袋中。采用多功能真空包装机(山东诸城市大洋食品机械厂，型号DZ500)，调节抽气时间为15s，充气时间为2.5s，加热封口时间为1.8s，以抽真空充氮的程序密封于样本袋后在-20℃下保存备用。

2试验设计

在猪胃-小肠仿生消化过程中消化酶活性随消化时间的变化中，考察玉米、大豆粕、小麦麸及玉米-大豆粕型饲粮在猪胃-小肠两阶段仿生消化中一次性注入模拟胃液、模拟小肠液后，消化酶活性随消化时间的变化。采用单因素完全随机设计，胃消化阶段在消化的0、1、2、3、4h后取消化液样品，分析胃蛋白酶活性(单位体积的比活性及总活性)。小肠消化阶段在胃消化4h后，注入模拟小肠液消化0、2、4、6、8、12、16h后取消化液样品，分析胰蛋白酶、糜蛋白酶和淀粉酶的活性。每个处理5个重复，每个重复1根消化管。小肠消化阶段补充消化酶的效果根据前一试验消化酶活性变化的规律，设置小肠阶段消化4h时补注消化酶。考察在玉米、大豆粕、小麦麸、玉米-大豆粕型饲粮小肠仿生消化4h、6h、8h消化酶活性随消化时间的变化。每个处理5个重复，每个重复1根消化管。

3猪的仿生消化方法

将透析管(截留分子量14000道尔顿，扁平直径44mm)截成22～28cm左右的小段，放入碳酸氢钠浓度为2％(W/V)和乙二胺四乙酸二钠浓度为1mmol/L pH＝8.0的混合溶液中。在电陶炉上加热至沸腾后，保持微沸10分钟。倒掉混合溶液后，用蒸馏水清洗透析袋3～5次。再加入浓度为1mmol/L pH＝8.0乙二胺四乙酸二钠溶液，在电陶炉子上煮沸10分钟。倒掉废液后，加入去离子水保存于4℃冰箱中备用。使用前在透析管内装满水，然后排出，彻底清洗透析袋。

胃缓冲液的制备：配制氯化钠浓度为81mmol/L，氯化钾浓度为6mmol/L，盐酸的浓度为10mmol/L，山梨酸钾(抗菌剂)浓度为2g/L的混合溶液2000mL，用2mol/L的盐酸在39℃下调节溶液的pH至2.0。

小肠缓冲液的制备：配制磷酸氢二钠浓度为30mmol/L，磷酸二氢钠浓度为170mmol/L，氯化钠浓度为90mmol/L，氯化钾浓度为15mmol/L，青霉素浓度为800U/L，山梨酸钾浓度为2g/L的混合溶液2000mL。用2mol/L的磷酸或2mol/L的氢氧化钠在39℃下调节溶液的pH至6.44。

模拟胃液：根据胃蛋白酶活性的测定方法，测定试剂中胃蛋白酶的活性。称取223KU的胃蛋白酶溶解于250mL氯化钠浓度为81mmol/L，氯化钾浓度为6mmol/L，盐酸的浓度为10mmol/L，pH为2.0的盐酸溶液中，缓慢搅拌直至溶解，制备模拟胃液的胃蛋白酶活性浓度为892U/mL。

浓缩模拟小肠液的制备：根据α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的测定方法，测定试剂级淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中相应消化酶的活性。称(量)取α-淀粉酶60.9KU，胰蛋白酶19.00KU，糜蛋白酶2.38KU溶解于25mL去离子水中，并缓慢搅拌直至溶解。使得淀粉酶的浓度为2436U/mL，胰蛋白酶的浓度为760U/mL，糜蛋白酶的浓度为95U/mL。

浓缩补充模拟小肠液的制备：根据α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的测定方法，测定试剂级淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中相应消化酶的活性。称(量)取α-淀粉酶30.5KU，胰蛋白酶21.5KU，糜蛋白酶0.75KU溶解于15mL去离子水中，并缓慢搅拌直至溶解。使得淀粉酶的浓度为2037U/mL，胰蛋白酶的浓度为1430U/mL，糜蛋白酶的浓度为50U/mL。

准备：将胃缓冲液、小肠缓冲液均按照200mL/重复放入单胃动物仿生消化系统(湖南中本智能科技有限公司生产，型号SDS-2)的缓冲液控温储存室，并将系统的管道与缓冲液瓶连接好。在仿生消化系统的控制软件中，设置单胃动物仿生消化系统的预热时间为60min；混合频率设置180rpm；缓冲液流速设置60mL/min；模拟消化室、缓冲液控制室、管路保温室的温度均设置为39℃；消化液保温室的温度设置为6℃；胃消化时间设置1、2、3、4h；胃缓冲液排空时间设置4min；胃消化阶段清洗液(去离子水)体积设置300mL/重复，清洗时间设置40min，清洗次数设置3次；胃-小肠缓冲液切换循环时间设置30min，浓缩模拟小肠液注入体积设置为2mL、补充浓缩模拟小肠液体积设置为1mL，小肠消化时间设置0、2、4、6、8、12、16h；浓缩模拟小肠液注入时刻、补充浓缩模拟小肠液注入时刻分别设置为小肠消化0h和4h，缓冲液排空时间设置4min。

上样：在仿生消化系统完成预热后，将处理好的透析管纵向穿过模拟消化管，两端外翻并用橡皮筋将透析管扎紧，固定在模拟消化管上。然后，用翻口硅胶塞将一端塞严。称取1～2g饲料样品(配合饲料和能量饲料为2g，蛋白质为1g，精确到0.0002g)到玻璃试管中，然后将玻璃试管内的样品倒入装有透析管的模拟消化器中，并用20mL模拟胃液冲洗试管，倒入透析管中，塞上硅胶塞。将模拟消化器置于单胃动物仿生消化系统，按照模拟消化器下端进水，上端出水的原则，接好管路。每组5根模拟消化器间串联连接。消化液加液管及缓冲液与模拟消化器间以快速接头相连。点击单胃动物仿生消化系统控制软件的开始选项，开始自动运行猪胃-小肠仿生消化过程。

仿生消化：胃、小肠阶段的仿生消化温度、时间、缓冲液的切换、残液的排空均按照控制软件中设置的参数全自动进行。

下样：消化结束后，将透析管内的未消化残渣无损失地转移到50mL量筒中，读取体积。然后，转入50mL离心管中，在4℃1250g下离心10分钟，获得上清液。

4消化酶活性的测定方法

下样上清液中胃蛋白酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定均为公知技术，其中：胃蛋白酶的活性测定可参考文献“Wirnt R and Wolf-Peter F.Pepsin,2.Assayat 280nm.In:Bergmeyer H U.Methods of enzymatic analysis[M].Weinheinm:Verlagchemie.1974”中的相关描述，测定原理：牛血红蛋白为底物生成可溶于三氯乙酸溶液的氨基酸含量在280nm处的吸光度变化与胃蛋白酶活性具有一定相关性。α-淀粉酶的活性测定可参考文献“Dahlqvist A.A method for the determination of amylase inintestinal content.Scandinavian Journal of Clinical and LaboratoryInvestigation,1962,14:145-151”中的相关描述，其测定原理为：可溶性淀粉经淀粉酶作用后的还原物质与3，5-二硝基水杨酸可形成有颜色的络合物，在530nm下，络合物颜色的深浅与还原物质的量呈线性关系；胰蛋白酶的活性测定可参考文献“Wirnt R.Trypsin,measurement with nα-p-toluenesulfonyl-l-arginine methyl ester as substrate[A].In:Bergmeyer H U.Methods of enzymatic analysis.Weinheinm:Verlagchemie.1974”中的相关描述，其测定原理为：对-甲苯磺酸-L-精氨酸乙酯经胰蛋白酶水解成的对-甲苯磺酸-L-精氨酸在247nm下吸光度的变化速度为酶促反应的一级速度；糜蛋白酶的活性测定可参考文献“Wirnt R.Chymotrypsin,measurements with n-benzoyl-l-tyrosin ethyl ester as substrate.In:Bergmeyer H U.Methods of enzymaticanalysis.Weinheinm:Verlag chemie.1974”中的相关描述，其测定原理为：苯甲酰-L-酪氨酸乙酯经糜蛋白酶水解成苯甲酰-L-酪氨酸在256nm下吸光度的变化为酶促反应的一级速度。

5猪胃-小肠仿生消化过程中消化酶活性随消时间的变化

5.1仿生消化过程中胃蛋白酶活性随消化时间的变化

表1胃仿生消化阶段胃蛋白酶活性的变化

当模拟胃液与玉米、大豆粕、小麦麸或玉米-大豆粕型饲粮混合后，消化液中胃蛋白酶的比活性分别为模拟胃液相应活性的59.1％，28.8％，30.3％，32.7％。在模拟消化1，2，3，4h时，消化液中胃蛋白酶的比活性和总活性均显著地高于样品与模拟胃液刚混合时(0时刻)消化液中胃蛋白酶的相应活性(P<0.05)。在玉米模拟消化1，2，4h时，胃蛋白酶的比活性和总活性呈二次曲线增加(P<0.05)，在3～4h胃蛋白酶活性达到稳定。4h时消化液中胃蛋白酶的比活性及总活性达到模拟胃液相应活性的95.1％和101.4％。在大豆粕模拟消化1，2h时，胃蛋白酶的比活性与总活性依次显著增加(P<0.05)，在3～4h时胃蛋白酶的比活性与总活性达到稳定，但相对于2h时比活性显著下降(P<0.05)，而总活性无显著差异。总体上，胃蛋白酶的比活性与总活性随模拟消化时间呈二次曲线变化(P<0.05)。4h时消化液中胃蛋白酶的比活性及总活性达到模拟胃液相应活性的89.5％和102.0％。在小麦麸模拟消化1，2h时，胃蛋白酶的比活性差异不显著，在随后3，4h时胃蛋白酶的比活性呈下降变化。而总活性在模拟消化1，2，3h无显著差异，但显著地高于4h的总活性。总体上，胃蛋白酶的比活性与总活性随模拟消化时间呈二次曲线增加(P<0.05)。4h时消化液中胃蛋白酶的比活性及总活性达到模拟胃液相应活性的96.1％和102.7％。在玉米-大豆粕型饲粮模拟消化1，2，3h时，胃蛋白酶的比活性和总活性依次显著增加(P<0.05)，在3～4h胃蛋白酶活性达到稳定。胃蛋白酶的比活性与总活性均随模拟消化时间呈二次曲线变化(P<0.05)。4h时消化液中胃蛋白酶的比活性及总活性达到模拟胃液相应活性的78.0％和87.2％。

5.2小肠仿生消化过程中消化酶活性随消化时间的变化

图2为玉米在小肠模拟消化阶段消化酶活性随消化时间的变化图，其中，淀粉酶活性浓度：SEM＝1.21U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；胰蛋白酶活性浓度：SEM＝0.25U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；糜蛋白酶活性浓度：SEM＝0.32U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；淀粉酶总活性：SEM＝0.20KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；胰蛋白酶总活性：SEM＝0.04KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；糜蛋白酶总活性：SEM＝0.05KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01。

在玉米的小肠消化阶段(见图2)，消化液中淀粉酶比活性和总活性随消化时间呈二次曲线降低(P<0.05)，其中比活性和总活性在0～4h依次显著降低(P<0.05)；6～16h相对平稳，但均显著地低于0和2h的相应值。胰蛋白酶的比活性和总活性呈现0～8h急速下降(P<0.05)，8～16h保持较低值的二次曲线性变化。糜蛋白酶的比活性和总活性呈二次曲线变化，在2h达到最高，随后依次显著下降(P<0.05)。

图3为大豆粕在小肠模拟消化阶段消化酶活性随消化时间的变化图，其中，淀粉酶活性浓度：SEM＝1.25U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P＝0.51；胰蛋白酶活性浓度：SEM＝0.46U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；糜蛋白酶活性浓度：SEM＝0.37U/mL，方差P<0.01，线性P<0.01。淀粉酶总活性：SEM＝0.19KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P＝0.39；胰蛋白酶总活性：SEM＝0.07KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；糜蛋白酶总活性：SEM＝0.06KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.05，二次P<0.01。

在大豆粕的小肠消化阶段(图3)，消化液中淀粉酶比活性和总活性随消化时间呈现非线性变化。在0h和4h淀粉酶比活性以及总活性的差异不显著，但显著低于2h的相应值(P<0.05)；4～12h淀粉酶比活性以及总活性依次显著降低(P<0.05)，随后趋于稳定。胰蛋白酶的比活性和总活性随消化时间呈二次曲线显著降低(P<0.05)，总体上0～8h呈现急速下降，8～16h酶活性降到较低水平。糜蛋白酶的比活性和总活性呈二次曲线降低，其中在0～12h呈缓慢下降，12～16h显著下降(P<0.05)。

图4为小麦麸在小肠模拟消化阶段消化酶活性随消化时间的变化图；其中，淀粉酶活性浓度：SEM＝1.36U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；胰蛋白酶活性浓度：SEM＝0.46U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；糜蛋白酶活性浓度：SEM＝0.30U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01。淀粉酶总活性：SEM＝0.21KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.05；胰蛋白酶总活性：SEM＝0.07KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；糜蛋白酶总活性：SEM＝0.04KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01。

在小麦麸的小肠消化阶段(图4)，消化液中淀粉酶的比活性和总活性随消化时间呈二次曲线依次降低(P<0.05)，0～8h活性下降较快，8～12h缓慢下降。胰蛋白酶的比活性和总活性随消化时间呈二次曲线显著降低(P<0.05)，总体上0～8h呈现急速下降，8～16h酶活性降到较低水平。糜蛋白酶的比活性和总活性呈二次曲线降低，其中在0～12h呈快速下降，12～16h缓慢下降(P<0.05)。

图5为玉米-大豆粕型饲粮在小肠模拟消化阶段消化酶活性随消化时间的变化图，其中，淀粉酶活性浓度：SEM＝1.73U/mL，方差P<0.01，线性失拟P＝0.07，二次P＝0.38；胰蛋白酶活性浓度：SEM＝0.39U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.05，二次P<0.01；糜蛋白酶活性浓度：SEM＝0.23U/mL，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；淀粉酶总活性：SEM＝0.29KU，方差P<0.05，线性失拟P<0.05，二次P＝0.62；胰蛋白酶总活性：SEM＝0.06KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01；糜蛋白酶总活性：SEM＝0.04KU，方差P<0.01，线性失拟P<0.01，二次P<0.01。

在玉米-大豆粕型饲粮的小肠消化阶段(图5)，淀粉酶的比活性和总活性随时间消化呈现非线性变化，其中4～16h间比活性无显著性差异，仅0、2h的比活性显著地高于4、16h的比活性(P<0.05)；除4h外，其余各消化时间的总活性差异不显著。胰蛋白酶的比活性和总活性随消化时间呈二次曲线显著降低(P<0.05)，总体上0～12h呈现急速下降，12～16h酶活性缓慢回升。糜蛋白酶比活性在0～4h最高，6～12h呈显著降低(P<0.05)，糜蛋白酶总活性前0～4h显著升高，随后显著性下降(P<0.05)，总体呈现二次曲线变化。

6猪仿生消化过程中小肠消化阶段补充消化酶的效果

玉米、大豆粕、小麦麸、玉米-大豆粕型饲粮在仿生消化的小肠阶段淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性随时间均有不等程度的衰减，在小肠阶段消化4h时补充消化酶后模拟小肠液中酶的变化情况列于表2。玉米在小肠消化阶段补偿消化酶后，淀粉酶比活性及总活性在4h显著地高于6～8h的相应值(P<0.05)，且高于初始值(150.8U/mL)，其中4h的比活性与猪体内值(221U/mL)较接近。胰蛋白酶的比活性和总活性仍呈现急速下降的变化规律(P<0.05)，其中4h的比活性高于初始值，与体内值(69.1U/mL)较接近。糜蛋白酶比活性及总活性在4h显著地高于6～8h的相应值(P<0.05)，总体上与初始值较接近。大豆粕在小肠阶段补偿消化酶后，淀粉酶比活性及总活性差异不显著(P＞0.05)，且均高于初始值(145.3U/mL)，与猪体内值(221U/mL)较接近。胰蛋白酶的比活性和总活性仍呈现急速下降的变化规律(P<0.05)，其中4h的比活性与总活性与初始值较接近。糜蛋白酶的比活性和总活性呈先升高后降低的变化，总体上与初始值接近。小麦麸在小肠阶段补偿消化酶后，淀粉酶比活性以及总活性差异不显著(P＞0.05)，但稍低于初始值及体内值。胰蛋白酶的比活性和总活性仍呈现急速下降的变化规律(P<0.05)，其中4h的比活性与初始值较接近。糜蛋白酶的比活性和总活性在4～6h差异不显著，但显著高于6h的相应值(P<0.05)，均比初始值低。玉米-大豆粕型饲粮在小肠阶段补偿消化酶后，淀粉酶比活性以及总活性在4h与8h差异不显著，但高于6h的相应值(P<0.05)。其中4h的比活性高于初始值，与猪体内值较接近。胰蛋白酶的比活性和总活性仍呈现急速下降的变化规律(P<0.05)，其中4h的比活性与初始值较接近。糜蛋白酶的比活性在4h显著地高于6～8h的相应值(P<0.05)，总体上与初始值较接近，而总活性各消化时间间差异不显著。

表2小肠仿生消化4h补偿消化酶后淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的变化

综合上述试验结果，在胃消化阶段模拟胃液与饲料刚混合时呈现活性急剧下降，但消化1h后胃蛋白酶活性可以恢复到体内值的范围，并保持相对稳定。因此，在猪仿生消化中不需要补充胃蛋白酶；而在小肠模拟消化阶段，三种主要消化酶均随消化时间衰减，尤其是胰蛋白酶的活性快速下降，当补注浓缩补充模拟小肠液后，3种消化酶的活性变化可以呈现出类似于猪胰液及肠道中消化酶活性随餐后的阶段性变化，从而可以更逼真地模拟猪的体内消化过程。

实施例二、通过仿生消化测定常用猪饲料原料蛋白质消化率的效果

1饲料原料的预处理

随机选取玉米、大豆粕、小麸皮、棉籽粕常用猪饲料原料作为代表性样品。分别用万能粉碎机粉碎后过60目标准筛孔后，按照实施例1进行抽真空-充氮用样品袋包装后置于-15℃冰柜中储存备用。

2猪的仿生消化方法

将透析管(截留分子量14000道尔顿，扁平直径44mm)截成22～28cm左右的小段，放入碳酸氢钠浓度为2％(W/V)和乙二胺四乙酸二钠浓度为1mmol/L pH＝8.0的混合溶液中。在电陶炉上加热至沸腾后，保持微沸10分钟。倒掉混合溶液后，用蒸馏水清洗透析袋3～5次。再加入浓度为1mmol/L pH＝8.0乙二胺四乙酸二钠溶液，在电陶炉子上煮沸10分钟。倒掉废液后，加入去离子水保存于4℃冰箱中备用。使用前在透析管内装满水，然后排出，彻底清洗透析袋。

胃缓冲液的制备：配制氯化钠浓度为81mmol/L，氯化钾浓度为6mmol/L，盐酸的浓度为10mmol/L，山梨酸钾(抗菌剂)浓度为2g/L的混合溶液2000mL，用2mol/L的盐酸在39℃下调节溶液的pH至2.0。

小肠缓冲液的制备：配制磷酸氢二钠浓度为30mmol/L，磷酸二氢钠浓度为170mmol/L，氯化钠浓度为90mmol/L，氯化钾浓度为15mmol/L，青霉素浓度为800U/L，山梨酸钾浓度为2g/L的混合溶液2000mL。用2mol/L的磷酸或2mol/L的氢氧化钠在39℃下调节溶液的pH至6.44。

模拟胃液：根据胃蛋白酶活性的测定方法，测定试剂中胃蛋白酶的活性。称取223KU的胃蛋白酶溶解于250mL氯化钠浓度为81mmol/L，氯化钾浓度为6mmol/L，盐酸的浓度为10mmol/L,pH为2.0的盐酸溶液中，缓慢搅拌直至溶解，制备模拟胃液的胃蛋白酶活性浓度为892U/mL。

浓缩模拟小肠液的制备：根据α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的测定方法，测定试剂级淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中相应消化酶的活性。配制的浓缩模拟小肠液中α-淀粉酶浓度为2436U/mL，胰蛋白酶浓度为760U/mL，糜蛋白酶浓度为95U/mL。

浓缩补充模拟小肠液的制备：根据α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的测定方法，测定试剂级淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中相应消化酶的活性。配制的浓缩补充模拟小肠液中α-淀粉酶浓度为2037U/mL，胰蛋白酶浓度为1430U/mL，糜蛋白酶浓度为50U/mL。

准备：将胃缓冲液、小肠缓冲液均按照200mL/重复放入单胃动物仿生消化系统(湖南中本智能科技有限公司生产，型号SDS-2)的缓冲液控温储存室，并将系统的管道与缓冲液瓶连接好。在仿生消化系统的控制软件中，设置单胃动物仿生消化系统的预热时间为60min；混合频率设置180rpm；缓冲液流速设置60mL/min；模拟消化室、缓冲液控制室、管路保温室的温度均设置为39℃；消化液保温室的温度设置为6℃；胃消化时间设置4h；胃缓冲液排空时间设置4min；胃消化阶段清洗液(去离子水)体积设置300mL/重复，清洗时间设置40min，清洗次数设置3次；小肠消化前期设置30min，浓缩模拟小肠液注入体积设置为2mL、补充浓缩模拟小肠液体积设置为1mL，小肠消化时间设置8h；浓缩模拟小肠液注入时刻、补充浓缩模拟小肠液注入时刻分别设置为小肠消化0h和4h，缓冲液排空时间设置4min。最终清洗所用清洗液体积设置300mL/重复，清洗时间设置120min，清洗次数设置6次

上样：在仿生消化系统完成预热后，将处理好的透析管纵向穿过模拟消化管，两端外翻并用橡皮筋将透析管扎紧，固定在模拟消化管上。然后，用翻口硅胶塞将一端塞严。称取1～2g饲料样品(配合饲料和能量饲料为2g，蛋白质为1g，精确到0.0002g)到玻璃试管中，然后将玻璃试管内的样品倒入装有透析管的模拟消化器中，并用20mL模拟胃液冲洗试管，倒入透析管中，塞上硅胶塞。将模拟消化器置于单胃动物仿生消化系统，按照模拟消化器下端进水，上端出水的原则，接好管路。每组5根模拟消化器间串联连接。消化液加液管及缓冲液与模拟消化器间以快速接头相连。点击单胃动物仿生消化系统的开始选项，开始自动运行猪胃-小肠仿生消化过程。

仿生消化：胃、小肠阶段的仿生消化温度、时间、缓冲液的切换、残液的排空、水解产物的清洗均按照控制软件中设置的参数全自动进行。

下样：消化结束后，将透析管内的未消化残渣无损失地转移到已知绝干重量的培养皿中，然后在65℃烘干至无水痕后(也可以冷冻干燥)，再在105℃下烘至恒重。

分别测定饲料样品和未消化残渣的粗蛋白含量，

蛋白质消化率＝(饲料粗蛋白含量×样品重量-未消化残渣粗蛋白含量×未消化残渣重量+消化酶残留蛋白质含量)/(饲料粗蛋白含量×样品重量)×100。

3仿生消化法测定饲料原料的蛋白质消化率

表3仿生消化法测定饲料原料蛋白质消化率与生长猪体内法回肠末端粗蛋白消化

率的比较

在4个常用猪饲料原料中，玉米和两个蛋白饲料原料(粗蛋白含量>40％)-大豆粕和棉籽粕仿生消化法测定的蛋白质消化率与文献报道(Sauvant,D.,Perez,J.-M.,Tran,G.,2004.Tables of composition and nutritional value of feedmaterials.Wageningen Academic Publishers and INRA Editions；National ResearchCouncil.2012.Nutrient Requirements of Swine:10th Revised Edition.Washington,DC:The National Academies Press)生长猪标准回肠末端消化率非常接近。而小麦麸仿生消化法粗蛋白消化率比文献报道标准回肠末端消化率稍高，但仍落在样品变异的范围内，这表明本发明方法测定的粗蛋白消化率可代表动物试验的测值。此外，仿生消化法测定粗蛋白消化率的变异系数均在1％以内，表明本发明方法的精度非常高。

上述是本发明的较佳实施例及其所运用的技术原理，对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案基础上的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均属于本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种通过体外仿生消化测定猪饲料蛋白质消化率的方法，包括如下步骤：

1)样品预处理：将猪饲料样品粉碎过标准筛，然后将粉碎后的样品经抽真空-充氮后低温储存备用；

2)缓冲液的制备：以稀盐酸、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备胃缓冲液；以磷酸盐、氯化钠、氯化钾和抗菌剂制备小肠缓冲液；

3)模拟胃液的制备：根据猪体内胃液中胃蛋白酶的活性，以试剂级胃蛋白酶制备模拟胃液；

4)模拟小肠液的制备：根据猪体内空肠液中消化酶的活性，以试剂级α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩模拟小肠液；以试剂级α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶制备浓缩补充模拟小肠液；

5)上样：采用单胃动物仿生消化系统，其包括模拟消化器、消化液试剂瓶、缓冲液试剂瓶、废液收容瓶、清洗液储存瓶、清洗液试剂瓶和清洗残留液收容瓶，所述模拟消化器包括玻璃管和透析管，该玻璃管为一中空管体，该管体的两端各设有一磨口，该管体的侧面设有输入管和输出管，该透析管放置在该玻璃管内，该透析管的两端分别从该玻璃管的两个磨口处伸出而外翻，外翻露于磨口外侧的透析管端部被橡皮条捆扎固定在磨口上，捆扎透析管端部后的两个磨口分别塞有一硅胶塞和一带有输液管的硅胶塞；

将步骤4)得到的浓缩模拟小肠液、补充浓缩模拟小肠液放入所述单胃动物仿生消化系统的消化液试剂瓶中；将步骤2)中得到的胃缓冲液、小肠缓冲液放入所述单胃动物仿生消化系统的缓冲液控温室；在所述单胃动物仿生消化系统预运行30～60分钟且各温度参数达到39℃后，将步骤1)制备的饲料样品倒入所述单胃动物仿生消化系统的模拟消化器的透析管内，并向所述透析管内加入步骤3)得到的模拟胃液，塞上胶塞；

6)胃模拟消化：将所述胃缓冲液泵入到所述单胃动物模拟消化器的透析管外再回到胃缓冲液试剂瓶中往复循环，通过回旋震荡提供模拟胃液与饲料样品的混合动力，进行胃的模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的胃缓冲液，泵入去离子水清洗胃模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；

7)小肠模拟消化：将所述小肠缓冲液泵入到所述单胃动物模拟消化器的透析管外再回到小肠缓冲液试剂瓶中一直往复循环，通过回旋震荡提供浓缩模拟小肠液与饲料样品的混合动力，在所述透析管中溶液的pH值变为小肠缓冲液的pH值后，往所述透析管内注入浓缩模拟小肠液，开始小肠的模拟消化；在消化4h后再次往透析管内注入浓缩补充模拟小肠液，继续小肠模拟消化；消化结束后排出模拟消化器中的缓冲液；

8)水解产物的清洗：往所述单胃动物模拟消化器的透析管外泵入去离子水清洗整个模拟消化阶段残留在透析管中的水解产物；清洗结束后排出模拟消化器中的清洗液；

9)未消化残渣的分析及消化率的计算：将步骤9)透析管内的残渣转移到培养皿中并干燥，然后分别测定残渣及所述猪饲料样品的粗蛋白或氨基酸含量，计算粗蛋白或氨基酸的消化率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述猪饲料为单一饲料原料或配合饲料；

所述粉碎在万能粉碎机中进行；当生产中饲料原料粉碎过2mm筛片，则样品在万能粉碎机中粉碎时间为20～30s，过40目分级筛；当生产中饲料原料粉碎过1mm筛片，则样品在万能粉碎机中粉碎时间为60～90s，过60目分级筛；

在所述步骤1)中，将粉碎后的样品经抽真空-充氮处理的方法具体如下：将粉碎后的样品先装入透气棉纸袋中，封口后再套入塑料样品袋内，接着在真空包装机上调节抽气时间为10～20s，充气时间为2～4s，加热封口时间为1.5～4.5s，然后进行抽真空-充氮-封口处理。所述低温储存的温度为-20～-10℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述步骤2)中，所述胃缓冲液中盐酸的浓度为5～10mmol/L，NaCl的浓度为60～110mmol/L，KCl的浓度为4～8mmol/L，抗菌剂的浓度为1～2g/L；在39℃调节pH至2～3；所述抗菌剂为山梨酸钾。

所述小肠缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为30mmol/L，磷酸二氢钠的浓度为170mmol/L，NaCl的浓度为70～106mmol/L，KCl的浓度为14～17mmol/L，青霉素的浓度为800U/L，抗菌剂的浓度为1～3g/L；在39℃用1～2mol/L的磷酸或氢氧化钠调节pH至6.4～6.5；所述抗菌剂为山梨酸钾。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述模拟胃液中胃蛋白酶的活性为737～1000U/mL，盐酸的浓度为5～10mmol/L mol/L，NaCl的浓度为60～110mmol/L，KCl的浓度为4～8mmol/L，pH为2～3。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述浓缩模拟小肠液中淀粉酶浓度为2046～2893U/mL，胰蛋白酶浓度为627～858U/mL，糜蛋白酶浓度为77～110U/mL；

所述浓缩补充模拟小肠液中淀粉酶浓度为1935～2139U/mL，胰蛋白酶浓度为1359～1502U/mL，糜蛋白酶浓度为48～53U/mL。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，所述透析管的截留分子量为12000～14400道尔顿，扁平直径44mm；管体张开体积为35～45mL。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，所述单胃动物仿生消化系统为湖南中本智能科技有限公司生产的型号SDS-2的单胃动物仿生消化系统；

所述单胃动物仿生消化系统中每根模拟消化器的样品上样量为1～2g，模拟胃液的体积为20mL，浓缩模拟小肠液用量2mL，浓缩补充小肠液用量1mL，胃缓冲液用量为200mL，小肠缓冲液用量为200mL。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤6)中，消化温度为39℃；饲料样品与模拟胃液混合后的回旋震荡频率为180转/分钟；流经模拟消化器的缓冲液流速为60mL/分钟；胃的模拟消化时间为4h；胃模拟消化结束后清洗一次消化产物的清洗液量为300mL去离子水/模拟消化器，每次清洗40分钟，重复清洗3次；

所述步骤7)中，消化温度为39℃；样品与浓缩模拟小肠液混合后的回旋震荡频率为180转/分钟；流经模拟消化器的缓冲液流速为60mL/分钟；小肠模拟消化8h，其中在小肠模拟消化4h后注入补充浓缩模拟小肠液继续消化4h。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤8)中，整个模拟消化结束后清洗一次消化产物的清洗液量为300mL去离子水/模拟消化器，每次清洗2～4h，重复清洗6次。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在：所述步骤10)中，所述未消化残渣转入恒重的培养皿中后，在65℃恒温鼓风干燥箱中烘至无水痕，或冷冻干燥，然后在105℃恒温鼓风干燥箱中烘至恒重；

所述饲料样品和未消化残渣用凯氏定氮法测定粗蛋白的含量，计算蛋白质的消化率；或通过液相色谱或全自动氨基酸分析仪测定氨基酸的含量，计算氨基酸的消化率。