CN105087754B - 一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法，包括如下步骤：饲料非淀粉多糖组分的分析、非淀粉多糖酶类型和剂量的设定、饲料胃肠道模拟消化、非淀粉多糖酶谱的优化。本发明采用非淀粉多糖酶组分分析技术和体外模拟消化法，使用饲料体外能值表征非淀粉多糖酶的作用效果，快速获取饲料中添加的最优非淀粉多糖酶谱。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法，特别是涉及饲料非淀粉多糖组分分析和利用体外模拟消化法快速优化饲料非淀粉多糖酶谱的方法。
背景技术
畜禽饲料的主体成分是碳水化合物，碳水化合物为动物提供主要的能量。随着饲料成本持续上涨，不断寻求较低廉的饲料原料(如：谷物类加工副产物，玉米DDGS，高粱DDGS)部分替代传统的玉米和豆粕饲料原料。然而，这些饲料原料常含有较高的非淀粉多糖，这些非淀粉多糖一部分难以被动物机体充分利用(Anguita et al.,2006)；另一部分虽然可经畜禽的大肠发酵产生挥发性脂肪酸，提供能量，但这种方式功能的效率较低。目前，通常采用添加非淀粉多糖酶改善养分的消化和发酵，从而提高饲料的利用率。非淀粉多糖酶常包括木聚糖酶(Engberg et al.,2006；丁雪梅等,2009；Selle et al.,2003)、纤维素酶(Nahm et al.,1985；陈晓春等,2005)、β-葡聚糖酶(Philip et al.,1995；Yu et al.,1998)等。文献资料显示，非淀粉多糖酶提高畜禽饲料的能量效率不明显，这与选择的非淀粉多糖酶的作用效果与饲粮组成、酶的活性、酶谱配伍以及酶促反应环境密切相关。然而，饲料选择的非淀粉多糖酶的类型和配伍等不确定性，导致目前普遍对酶的添加具有一定的盲目性和低效率性。
分析饲料中非淀粉多糖组分是筛选饲料的外源添加酶的基础，筛选饲料的最优酶谱的方法主要有体内法(in vivo)和体外法(in vitro)。体内法就是进行动物试验，常常耗资、费力、费时，系统误差和偶然误差影响因素多。而体外法具有快速、简便、费用低等优点，但目前体外法选择的参数和条件常常缺乏理论的解释，具有一定的随意性(Coles et al.,2005)。因此，选取合理的体外模拟消化参数，模拟畜禽饲料的消化过程，针对不同饲料非淀粉多糖成分特性，筛选与之相适应的非淀粉多糖酶谱，对于充分发挥饲料潜能，提高饲料利用率和增加养殖生产效益具有重要意义。
发明内容
本发明的技术解决问题：为了克服目前饲料中非淀粉多糖酶添加的盲目性，提高饲用酶制剂的功效，提供一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法，通过饲料非淀粉多糖组分分析技术和体外法模拟动物消化过程，使用饲料体外能值表征非淀粉多糖酶的作用效果，快速获取饲料最优的非淀粉多糖酶谱。
本发明的一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法，依次包括以下步骤：饲料非淀粉多糖组分的分析、非淀粉多糖酶类型和剂量的设定、饲料胃肠道模拟消化、非淀粉多糖酶谱的优化，其中：
(1)饲料非淀粉多糖组分的分析：选取猪饲料放入粉碎机中，其中所述的饲料包括配合饲料和组成配合饲料的原料；再将所述的粉碎机的转速控制在8000～10000转/分钟，粉碎时间为5～10分钟；将粉碎后的饲料过0.25～0.42毫米筛；精确称取饲料样品，测定配合饲料以及饲料原料的非淀粉多糖组分的含量；
(2)非淀粉多糖酶类型和剂量的设定：根据所述的配合饲料以及饲料原料的非淀粉多糖组分，按照主成分分析结果，称取目标配合饲料，并在所述的饲料中添加3～7非淀粉多糖酶，每种非淀粉多糖酶的添加剂量设置0～900μg/g系列浓度梯度，制备出一系列添加了不同浓度非淀粉多糖酶的猪饲料；
(3)胃肠道模拟消化：将所述的加酶饲料样品置于三角瓶中，加入pH 2.0，摩尔质量比85：6～90：8的氯化钠：氯化钾的混合缓冲溶液；同时加入800～1400U/mL胃蛋白酶液；其中饲料、缓冲液和胃蛋白酶液按照2：10：1～4：12：1重量百分比混合均匀；将所述的混合均匀的饲料、缓冲液和胃蛋白酶液的三角瓶置于恒温水浴摇床中，设定恒温水浴摇床温度和摇床转速，消化时间2～6h；待所述的模拟胃消化结束后，在所述的三角瓶中加入pH 6.2～6.5摩尔质量比为97：14：160～108：16：180的氯化钠：氯化钾：磷酸盐的混合缓冲溶液；同时加入单位酶活力比57：7：186：2～76：10：264：4＝胰蛋白酶：糜蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶的混合酶液；其中缓冲液和消化酶液的重量百分比范围是60：1～65：1；继续设定恒温水浴摇床温度和摇床转速，消化时间20～24h；
(4)非淀粉多糖酶谱的优化：待模拟消化结束后，将消化残渣烘干至恒重，测定残渣体外消化能值，计算出添加每种非淀粉多糖酶的饲料体外消化能值，并根据非淀粉多糖酶和体外消化能值的回归关系，得出每种非淀粉多糖酶能提高目标的饲料体外消化能值的临界点；将每种非淀粉多糖酶依据所述临界点进行编码时，根据添加的多种非淀粉多糖酶的种类，设置对应数量的影响因子，每个影响因子设置5个水平，采用回归正交旋转组合设计分析体外消化能值，并利用体外消化能值与非淀粉多糖酶添加剂量关系，表征出最优的非淀粉多糖酶谱；
作为一个优选的方式，所述步骤(1)中称取猪饲料样品量为100～250毫克；
作为一个优选的方式，所述步骤(2)中称取猪饲料样品量为1～2克；
作为一个优选的方式，所述步骤(3)中恒温水浴摇床的转速160～190rpm，温度37～40℃；
作为一个优选的方式，所述步骤(4)中所述5个水平设置为-2.378、-1、0、1和2.378。
本发明与现有技术相比的优点在于：
(1)本发明以大量动物体内实验数据为依据，选取的体外模拟参数更加贴近动物的实际生理状况，具有较好的模拟饲料在体内消化过程的效果；
(2)本发明克服了以往筛选非淀粉多糖酶的盲目性，提高饲用酶制剂的功效，使用快捷的体外手段模拟饲料在胃肠道的消化过程，并提出体外消化能值表征最优酶谱，达到了快速优化非淀粉多糖酶谱的目的。
附图说明
图1为本发明实现的流程图。
具体实施方式
本发明采用非淀粉多糖酶组分分析技术和体外模拟消化法，使用饲料体外能值表征非淀粉多糖酶的作用效果，快速获取饲料中添加的最优非淀粉多糖酶谱。
下面结合附图及具体实施例详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，不仅仅限于本实施例。
实施例1，
如图1所示，本发明具体实现方法可以如下方式实施：
选取玉米-豆粕型配合饲料放入粉碎机中，其中所述的饲料包括玉米-豆粕型配合饲料和组成配合饲料的玉米和豆粕原料；再将所述的粉碎机的转速控制在8000～10000转/分钟，粉碎时间为5～10分钟；将粉碎后的饲料过0.25～0.42毫米筛；精确称取100～250毫克饲料样品，测定配合饲料以及饲料原料的非淀粉多糖组分的含量；
根据所述的配合饲料以及饲料原料的非淀粉多糖组分，按照主成分分析结果，称取玉米——豆粕配合饲料1～2克，并在饲料中分别添加三种非淀粉多糖酶，即木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶，每种非淀粉多糖酶添加剂量的浓度梯度水平分别设为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900μg/g，制备出一系列添加了不同浓度非淀粉多糖酶的玉米——豆粕配合饲料；
将所述的加酶饲料样品置于三角瓶中，加入摩尔质量比85：6～90：8的氯化钠：氯化钾的混合缓冲溶液(pH 2.0)；同时加入800～1400U/mL胃蛋白酶液；其中饲料、缓冲液和胃蛋白酶液按照2：10：1～4：12：1重量比混合均匀；将所述的混合均匀的饲料、缓冲液和胃蛋白酶液的三角瓶置于恒温水浴摇床中，设定摇床的转速160～190rpm，温度37～40℃，消化时间2～6h；待所述的模拟胃消化结束后，在所述的三角瓶中加入摩尔质量比为97：14：160～108：16：180的氯化钠：氯化钾：磷酸盐的混合缓冲溶液(pH 6.2～6.5)；同时加入单位酶活力比57：7：186：2～76：10：264：4＝胰蛋白酶：糜蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶的混合酶液；其中缓冲液和消化酶液的重量百分比范围是60：1～65：1；继续设定恒温水浴摇床温度37～40℃，摇床转速160～190rpm，消化时间20～24h；
将消化残渣烘干至恒重，并测定残渣能值，计算在不同浓度的每种非淀粉多糖酶作用下日粮的体外消化能值；并根据非淀粉多糖酶和体外消化能值的回归关系，得出木聚糖酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶能提高目标日粮体外消化能值的临界点分别为600，700，600μg/g。三种非淀粉多糖酶设为3个影响因子，每个因子设置5个水平，将每种非淀粉多糖酶的临界添加量编码为0，采用三元二次回归正交旋转组合设计，具体的设计因素及水平见表1，建立体外消化能值与三种非淀粉多糖酶添加量的三元二次回归方程，其方程为：玉米-豆粕日粮的体外消化能值：
＝a0+a1x1+a2x2+a3x3+a12x1x2+a13x1x3+a23x2x3+a11x12+a22x22+a33x32(a，回归方程系数；x1，木聚糖酶；x2，纤维素酶；x3，β-葡聚糖酶)。使用偏导数法求解回归方程中的非淀粉多糖酶谱组合以及各个非淀粉多糖酶添加剂量。
表1
| 编码值 | 木聚糖酶 | 纤维素酶 | β-葡聚糖酶 |
| 2.378 | 400μg/g | 500μg/g | 400μg/g |
| 1 | 500μg/g | 600μg/g | 500μg/g |
| 0 | 600μg/g | 700μg/g | 600μg/g |
| -1 | 700μg/g | 800μg/g | 700μg/g |
| -2.378 | 800μg/g | 900μg/g | 800μg/g |
实施例2，
选取小麦-豆粕型配合饲料放入微型粉碎机中，其中所述的饲料包括小麦-豆粕型配合饲料和组成配合饲料的小麦和豆粕原料；再将所述的微型粉碎机的转速控制在8000～10000转/分钟，粉碎时间为5～10分钟；将粉碎后的饲料过0.25～0.42毫米筛；精确称取100～250毫克饲料样品，测定配合饲料以及饲料原料的非淀粉多糖组分的含量；
根据所述的配合饲料以及饲料原料的非淀粉多糖组分，按照主成分分析结果，称取小麦——豆粕配合饲料1～2克，并在饲料中分别添加四种非淀粉多糖酶，即木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶，每种非淀粉多糖酶添加剂量的浓度梯度水平分别设为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900μg/g，制备出一系列添加了不同浓度非淀粉多糖酶的小麦——豆粕配合饲料；
将所述的加酶饲料样品置于三角瓶中，加入摩尔质量比90：8～85：6的氯化钠：氯化钾的混合缓冲溶液(pH 2.0)；同时加入800～1400U/mL胃蛋白酶液；其中饲料、缓冲液和胃蛋白酶液按照2：10：1～4：12：1重量比混合均匀；将所述的混合均匀的饲料、缓冲液和胃蛋白酶液的三角瓶置于恒温水浴摇床中，设定摇床的转速160～190rpm，温度37～40℃，消化时间2～6h；待所述的模拟胃消化结束后，在所述的三角瓶中加入摩尔质量比为97：14：160～108：16：180的氯化钠：氯化钾：磷酸盐的混合缓冲溶液(pH 6.2～6.5)；同时加入单位酶活力比57：7：186：2～76：10：264：4＝胰蛋白酶：糜蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶的混合酶液；其中缓冲液和消化酶液的重量百分比范围是60：1～65：1；继续设定恒温水浴摇床温度37～40℃，摇床转速160～190rpm，消化时间20～24h；
将消化残渣烘干至恒重，并测定残渣能值，计算在不同浓度的每种非淀粉多糖酶作用下日粮的体外消化能值；并根据非淀粉多糖酶和体外消化能值的回归关系，得出木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶和果胶酶能提高目标日粮体外消化能值的临界点分别为600，700，500，700μg/g。四种非淀粉多糖酶设为4个影响因子，每个因子设置5个水平，将每种非淀粉多糖酶的临界添加量编码为0，采用四元二次回归正交旋转组合设计，具体的设计因素及水平见表2，建立体外消化能值与四种非淀粉多糖酶添加量的四元二次回归方程，其方程为：小麦-豆粕日粮的体外消化能值＝
a0+a1x1+a2x2+a3x3+a4x4+a12x1x2+a13x1x3+a14x1x4+a23x2x3+a24x2x4+a34x3x4+a11x12+a22x22+a33x32+a44x42(a，回归方程系数；x1，木聚糖酶；x2，纤维素酶；x3，β-葡聚糖酶；x4，果胶酶)。使用偏导数法求解回归方程中的非淀粉多糖酶谱组合以及各个非淀粉多糖酶添加剂量。
表2
| 编码值 | 木聚糖酶 | 纤维素酶 | β-葡聚糖酶 | 果胶酶 |
| 2.378 | 400μg/g | 500μg/g | 300μg/g | 500μg/g |
| 1 | 500μg/g | 600μg/g | 400μg/g | 600μg/g |
| 0 | 600μg/g | 700μg/g | 500μg/g | 700μg/g |
| -1 | 700μg/g | 600μg/g | 600μg/g | 600μg/g |
| -2.378 | 800μg/g | 700μg/g | 700μg/g | 700μg/g |
实施例3，
(1)选取玉米-豆粕-棉粕-菜粕型日粮，并在饲料中分别添加六种非淀粉多糖酶，即木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶和果胶酶，每种非淀粉多糖酶添加剂量的浓度梯度水平分别设为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900μg/g，制备出一系列添加了不同浓度非淀粉多糖酶的玉米-豆粕-棉粕-菜粕型日粮；。
选取玉米-豆粕-棉粕-菜粕型配合饲料放入粉碎机中，其中所述的饲料包括玉米-豆粕-棉粕-菜粕型配合饲料和组成配合饲料的玉米、豆粕、棉粕、菜粕原料；再将所述的微型粉碎机的转速控制在8000～10000转/分钟，粉碎时间为5～10分钟；将粉碎后的饲料过0.25～0.42毫米筛；精确称取100～250毫克饲料样品，测定配合饲料以及饲料原料的非淀粉多糖组分的含量；
根据所述的配合饲料以及饲料原料的非淀粉多糖组分，按照主成分分析结果，称取玉米-豆粕-棉粕-菜粕型配合饲料1～2克，并在饲料中分别添加四种非淀粉多糖酶，即木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶酶，每种非淀粉多糖酶添加剂量的浓度梯度水平分别设为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900μg/g。
将所述的加酶饲料样品置于三角瓶中，加入摩尔质量比90：8～85：6的氯化钠：氯化钾的混合缓冲溶液(pH 2.0)；同时加入800～1400U/mL胃蛋白酶液；其中饲料、缓冲液和胃蛋白酶液按照2：10：1～4：12：1重量比混合均匀；将所述的混合均匀的饲料、缓冲液和胃蛋白酶液的三角瓶置于恒温水浴摇床中，设定摇床的转速160～190rpm，温度37～40℃，消化时间2～6h；待所述的模拟胃消化结束后，在所述的三角瓶中加入摩尔质量比为97：14：160～108：16：180的氯化钠：氯化钾：磷酸盐的混合缓冲溶液(pH 6.2～6.5)；同时加入单位酶活力比57：7：186：2～76：10：264：4＝胰蛋白酶：糜蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶的混合酶液；其中缓冲液和消化酶液的重量百分比范围是60：1～65：1；继续设定恒温水浴摇床温度37～40℃，摇床转速160～190rpm，消化时间20～24h；
将消化残渣烘干至恒重，并测定残渣能值，计算在不同浓度的每种非淀粉多糖酶作用下日粮的体外消化能值；并根据非淀粉多糖酶和体外消化能值的回归关系，得出木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶和果胶酶能提高目标日粮体外消化能值的临界点分别为700，600，600，500，700，400μg/g。六种非淀粉多糖酶设为6个影响因子，每个因子设置5个水平，将每种非淀粉多糖酶的临界添加量编码为0，采用六元二次回归正交旋转组合设计，具体的设计因素及水平见表3，建立体外消化能值与六种非淀粉多糖酶添加量的六元二次回归方程，其方程为：玉米-豆粕-棉粕-菜粕型配合饲料的体外消化能值＝
a0+a1x1+a2x2+a3x3+a4x4+a5x5+a6x6+a12x1x2+a13x1x3+a14x1x4+a15x1x5+a16x1x6+a23x2x3+a24x2x4+a25x2x5+a26x2x6+a34x3x4+a35x3x5+a36x3x6+a45x4x5+a46x4x6+a56x5x6+a11x12+a22x22+a33x32+a44x42+a55x52+a66x62(a，回归方程系数；x1，木聚糖酶；x2，纤维素酶；x3，β-葡聚糖酶；x4，β-甘露聚糖酶；x5，阿拉伯聚糖酶；x6，果胶酶)。使用偏导数法求解回归方程中的非淀粉多糖酶谱组合以及各个非淀粉多糖酶添加剂量。
表3
需要说明的是，按照本发明上述各实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围的，实现过程及方法同上述各实施例；且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法，其特征在于：该筛选方法依次包括以下步骤：饲料非淀粉多糖组分的分析、非淀粉多糖酶类型和剂量的设定、饲料胃肠道模拟消化、非淀粉多糖酶谱的优化，其中：
(1)饲料非淀粉多糖组分的分析：选取猪饲料放入粉碎机中，其中所述的猪饲料包括配合饲料和组成配合饲料的原料；再将所述的粉碎机的转速控制在8000～10000转/分钟，粉碎时间为5～10分钟；将粉碎后的饲料过0.25～0.42毫米筛；置于-20℃储存备用；精确称取猪饲料，测定猪饲料样品的非淀粉多糖组分的含量；
(2)非淀粉多糖酶类型和剂量的设定：根据所述的猪饲料样品非淀粉多糖组分，按照主成分分析结果，称取猪饲料，并在所述的猪饲料中添加3～7非淀粉多糖酶，每种非淀粉多糖酶的添加剂量设置0、100、200、300、400、500、600、700、800、900μg/g系列浓度梯度，制备出一系列添加了不同浓度非淀粉多糖酶猪饲料；
(3)胃肠道模拟消化：将所述非淀粉多糖酶的猪饲料的样品置于三角瓶中，并在三角瓶中加入模拟胃消化缓冲液，所述的模拟胃消化缓冲液为pH 2.0，摩尔质量比为85：6～90：8的氯化钠：氯化钾溶液；同时加入800～1400U/mL胃蛋白酶液；其中非淀粉多糖酶猪饲料、模拟胃消化缓冲液和胃蛋白酶液按照2：10：1～4：12：1重量比混合均匀；将装有混合均匀的非淀粉多糖酶饲料、模拟胃消化缓冲液和胃蛋白酶液的三角瓶置于恒温水浴摇床中，设定恒温水浴摇床温度和摇床转速，进行2～6h模拟胃消化；待所述模拟胃消化结束后，在所述三角瓶中加入摩尔质量比为97：14：160～108：16：180的氯化钠：氯化钾：磷酸盐的模拟肠消化缓冲液；同时加入pH 6.2～6.5，单位酶活力比57：7：186：2～76：10：264：4＝胰蛋白酶：糜蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶的模拟肠消化酶液；其中模拟肠消化缓冲液和模拟肠消化酶液的重量百分比范围是60：1～65：1；继续设定恒温水浴摇床温度和摇床转速，进行20～24h模拟肠的消化；
(4)非淀粉多糖酶谱的优化：待模拟消化结束后，将消化残渣烘干至恒重，测定残渣体外消化能值，计算出添加每种非淀粉多糖酶的饲料体外消化能值，并根据非淀粉多糖酶和体外消化能值的回归关系，得出每种非淀粉多糖酶能提高目标的饲料体外消化能值的临界点；将每种非淀粉多糖酶依据所述临界点进行编码时，根据添加的多种非淀粉多糖酶的种类，设置对应数量的影响因子，每个影响因子设置5个水平，采用回归正交旋转组合设计分析体外消化能值，并利用体外消化能值与非淀粉多糖酶添加剂量关系，表征出最优的非淀粉多糖酶谱；
所述步骤(1)中称取猪饲料样品量为100～250毫克。
2.根据权利要求1所述的一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中称取猪饲料样品量为1～2克。
3.根据权利要求1所述的一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法，其特征在于：所述步骤(3)中恒温水浴摇床的转速160～190rpm，温度37～40℃。
4.根据权利要求1所述的一种猪饲料非淀粉多糖酶谱的快速筛选方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述5个水平设置为-2.378、-1、0、1和2.378。
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