CN104472895A - 一种猪用活性微生物饲料 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种具有多种能共存的活性有益微生物的猪用活性微生物发酵饲料，其能产生多种活力高的酶，而且本产品中各种营养物质种类多、具有活性有益菌和新鲜复合酶的双重作用，易消化吸收，助消化作用强，价格低廉，是传统日粮不可取代的新产品。

Description

一种猪用活性微生物饲料

技术领域

本发明涉及饲料技术领域，尤其是一种猪饲料添加剂及制备方法。

背景技术

现有饲料中的化肥农药等残留物对胃肠造成亚健康状态，从而出现一系列的胃肠疾病，消化吸收差，饲料的吸收利用率低。大量使用抗生素，畜产品药残大；目前的活性微生物饲料还存在有益微生物种类单一，配方不合理，饲料价格偏高等问题。

目前市场上的活性微生物饲料多以糠渣、草粉等粗纤维物质为载体，饲料营养物质含量低。传统饲料中添加的外源性酶制剂大多经过提纯、干燥等工序影响了酶原有活性，供给猪，酶的活性相对较低。由于益生菌种类单一从而产生的酶种类也少。此外，现有发酵工艺及环境、设备需彻底灭菌，饲料保存必须密封厌氧，发酵环境、温度要求较严格。

本发明人在先申请号为2013100901713的中国专利申请，公开了一种猪饲料添加剂及制备方法，它是由重量比份数为曲霉组18份、酵母菌组18份、芽孢杆菌组30份、复合菌组40份的菌液分别发酵后得到的含水量≤16wt％的发酵产物组合而成，制备步骤为：配制培养基、冷却、原菌稀释、接种、发酵、干燥、混合、包装。本发明所述的饲料添加剂含20种益生菌，具有调节猪肠道菌群平衡，防治肠道疾病，提高免疫力，增强消化功能，提高饲料转化率的功效。

本发明人在在先申请的基础上，进一步进行大量的实验和研究，对菌株的种类进行了进一步的优化，并且在培养基中加入了海藻糖、寡糖，结果证明优化后的饲料出乎意料地在各方面效果相对之前有极大的提高，尤其是酶活的指数和猪肉的风味。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有多种能共存的活性有益微生物的猪用活性微生物发酵饲料，其能产生多种活力高的酶，而且本产品中各种营养物质种类多、具有活性有益菌和新鲜复合酶的双重作用，易消化吸收，助消化作用强，价格低廉，是传统日粮不可取代的新产品。

本发明是这样实现的，一种猪专用活性微生物生物发酵饲料，所用的菌液选用公认卫生安全的优良菌种，酵母菌，乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪链球菌、谷氨酸棒杆菌、波状丝孢酵母菌等。将这些菌选择适宜的培养条件扩大培养。扩大培养最后制备成的菌液为10⁷-10¹¹菌株/ml。扩培过程一般为：斜面活化→液体试管→小三角瓶→大三角瓶→卡氏罐(1：10-20)备用。

A菌液培养基工艺组成包括:

A1酵母菌、波状丝孢酵母菌液培养基的制备:取10L大生产用的糖化麦汁，用滤布过滤后加热至40℃，加入事先已准备好的蛋清煮至沸腾后，开始计时，再煮沸20分钟，加适量蒸馏水补充到麦汁浓度要控制在10-11度之间，再煮沸至沸腾后，放凉、过滤。用IN的磷酸调PH5.4--5.8，备用；

A2乳酸杆菌、谷氨酸棒杆菌培养基配方：2％蔗糖 2％酵母膏 10％马铃薯汁培养后乳酸杆菌增加至1.58*10¹¹cfu/ml；

A3枯草芽孢杆菌培养基，葡萄糖30.0g 蛋白胨10.0g 酵母膏5.0g 磷酸二氢钾4.5g 碳酸钙2.0g 无菌水1000ml；

A4地衣芽孢杆菌培养基 玉米浆0.45g 蛋白胨1.50g 豆饼粉浸汁1：15葡萄糖1.50g 最适种龄18小时，接种量是8％，起始PH7.5，最佳温度37.5℃；

A5粪链球菌培养基 氯化钠0.5g 蛋白胨1.0g 乳糖2.0g 猪心汤100ml PH自然，供活化菌种用。增殖培养基(％)蛋白胨2 猪肉膏2 乳糖2PH6.8。

进一步该生物发酵饲料的质量百分比为：葵粕为2；菜粕为3；豆粕为29；玉米为20；次小麦10；海藻糖1.55；寡糖1.0；饲料级磷酸钙为1.3；饲料级碳酸钙为1.35；普通饲料添加剂为0.8；上述A菌液为30。

所述添加剂为现有技术普通饲料添加剂，根据需要进行选择和添加。

进一步该活性微生物发酵饲料制造工艺为:

该工艺首先选取绿色原料→原料入库→提升→高效振动除杂筛→除杂物→低压除尘→提升→磁桶除铁→提升→配料→粉碎→提升→混合→喷A菌液→提升→装入发酵罐→装入发酵室→密封包装→检验出厂。

进一步，该活性微生物发酵饲料采用控温厌氧发酵。

进一步，该活性微生物发酵饲料采用生物法清除环境有害菌。

本发明的积极效果为：

1、该活性微生物发酵饲料中的有益菌能抑制或分解肠道有害菌，分解饲料中的化肥、农药等有害残留物。

2、活性有益菌及其代谢产生的多种酶能将饲料中的大分子蛋白质、粗纤维、淀粉等物质分解成小分子的氨基酸、肽、还原糖等易消化吸收的物质，同时能产生有机酸、维生素B族，但不含任何抗生素。充分提高猪日粮消化利用率，降低养殖成本。

3、本微生物饲料营养丰富，有益菌种类多及其代谢产生的酶种类多活性高，具有高度专一性。本产品价格低廉。

4、长期使用本品可降低粪便氨臭味，减少环境污染，属于环保饲料；可为生产出无公害绿色畜产品提供绿色饲料原料。

5、充分提高日粮的适口性。

6、本微生物饲料属于功能饲料，具有物理和化学方法所不可替代的优势，可提猪高胃肠功能及免疫力，减少疾病的发生。

具体实施方式

实施例1猪专用活性微生物发酵饲料的生产：

本发明实施例提供了一种猪专用活性微生物发酵饲料，该活性微生物发酵饲料所用的菌液选用公认卫生安全的优良菌种，酵母菌，乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪链球菌等。将这些菌选择适宜的培养条件扩大培养。扩大培养最后制备成的菌液为10⁷-10¹¹菌株/ml。扩培过程一般为：斜面活化→液体试管→小三角瓶→大三角瓶→卡氏罐(1：10-20)备用菌液培养基组成包括:

A1酵母菌、波状丝孢酵母菌液培养基的制备:取10L大生产用的糖化麦汁，用滤布过滤后加热至40℃，加入事先已准备好的蛋清煮至沸腾后，开始计时，再煮沸20分钟，加适量蒸馏水补充到麦汁浓度要控制在10-11度之间，再煮沸至沸腾后，放凉、过滤。用IN的磷酸调PH5.4-5.8，备用。

A2乳酸杆菌、谷氨酸棒杆菌培养基配方：2％蔗糖 2％酵母膏 10％马铃薯汁培养后乳酸杆菌增加至1.58*10¹¹u/ml；

A3枯草芽孢杆菌培养基，葡萄糖30.0g 蛋白胨10.0g 酵母膏5.0g 磷酸二氢钾4.5g 碳酸钙2.0g 无菌水1000ml

A4地衣芽孢杆菌培养基 玉米浆0.45g 蛋白胨1.50g 豆饼粉浸汁1：15葡萄糖1.50g 最适种龄18小时，接种量是8％，起始PH7.5，最佳温度37.5℃

A5粪链球菌培养基 氯化钠0.5g 蛋白胨1.0g 乳糖2.0g 猪心汤100ml PH自然，供活化菌种用。增殖培养基(％)蛋白胨2 猪肉膏2 乳糖2PH6.8

该生物发酵饲料的菌液的组成见表1.

表1

活菌计数法常用平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的活性微生物的菌悬液，做一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数可算出培养物中的活菌数。

质量百分比为：葵粕为2；菜粕为3；豆粕为29；玉米为20；次小麦10；海藻糖1.55；寡糖1.0；饲料级磷酸钙为1.3；饲料级碳酸钙为1.35；普通饲料添加剂为0.8；上述A菌液为30。

本配方是按照饲料原料测得营养成分含量进行配方设计，符合猪饲料营养及原料来源，充分满足多种有益菌的生长、繁殖、代谢，同时产生活力大、专一性高的活性菌和复合酶。猪日粮中添加(替换)10％-30％的活性微生物发酵饲料，能充分发挥了活性菌和酶类的活力和高度专一性。

该活性微生物发酵饲料所用菌液的制造工艺：菌液选用公认卫生安全的优良菌种，酵母菌，乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪链球菌等。将这些菌选择适宜的培养条件扩大培养。扩大培养最后制备成的菌液为107-1011菌株/ml。扩培过程一般为：斜面活化→液体试管→小三角瓶→大三角瓶→卡氏罐(1：10-20)备用。

菌液选用的培养基分别为:

A1酵母菌、波状丝孢酵母菌液培养基的制备:取10L大生产用的糖化麦汁，用滤布过滤后加热至40℃，加入事先已准备好的蛋清煮至沸腾后，开始计时，再煮沸20分钟，加适量蒸馏水补充到麦汁浓度要控制在10-11度之间，再煮沸至沸腾后，放凉、过滤。用IN的磷酸调PH5.4--5.8，备用。

A2乳酸杆菌、谷氨酸棒杆菌培养基配方：2％蔗糖 2％酵母膏 10％马铃薯汁培养后乳酸杆菌增加至1.58*10¹¹cfu/ml；

A3枯草芽孢杆菌培养基，葡萄糖30.0g 蛋白胨10.0g 酵母膏5.0g 磷酸二氢钾4.5g 碳酸钙2.0g 无菌水1000ml

A4地衣芽孢杆菌培养基 玉米浆0.45g 蛋白胨1.50g 豆饼粉浸汁1：15葡萄糖1.50g 最适种龄18小时，接种量是8％，起始PH7.5，最佳温度37.5℃

A5粪链球菌培养基 氯化钠0.5g 蛋白胨1.0g 乳糖2.0g 猪心汤100ml PH自然，供活化菌种用。增殖培养基(％)蛋白胨2 猪肉膏2 乳糖2PH6.8

该活性微生物发酵饲料制造工艺为:选取绿色原料→原料入库→提升→高效振动除杂筛→除杂物→低压除尘→提升→磁桶除铁→提升→配料→粉碎→提升→混合→喷菌液→提升→装入发酵罐→装入发酵室→密封包装→检验出厂。

包头市康牧饲料有限责任公司生产的活性微生物发酵饲料是按照以上配方及工艺生产。选用原料都来自于绿色原料种植基地及生产厂家，生产设备符合生产绿色活性微生物发酵饲料标准。生产车间、发酵车间，工人符合生产绿色生物饲料条件，严格按照绿色生物饲料生产程序生产及详细记录。

该活性微生物发酵饲料采用多条件控温发酵

为了充分满足各种活性有益菌的生长、繁殖、代谢，必须提供下列条件:

1、水分：菌液占配方质量百分比30％,活性微生物发酵饲料含水总量不高于45％；

2、pH：6.8-7.2；

3、发酵培养基:葵粕为2；菜粕为3；豆粕为29；玉米为20；次小麦10；海藻糖1.55；寡糖1.0；饲料级磷酸钙为1.3；饲料级碳酸钙为1.35；普通饲料添加剂为0.8；上述A菌液为30，含粗蛋白，粗纤维，淀粉，糖类，矿物质等，不含有其他有害物质；

4、厌氧环境：发酵罐中装入原料后用真空泵抽吸罐内多余氧气，创造厌氧环境。发酵三天后，将发酵罐上的单排气阀打开排气；

5、温度：原料装入发酵罐后，将罐内温度恒温控制在26-36℃(前三天36℃，后六天28℃)；

6、发酵时间：避光厌氧发酵7---9天。

该活性微生物发酵饲料采用生物法清除有害菌。

1、生产车间在生产前，先彻底清洗干净，然后用紫外线照射24小时进行消毒，关闭紫外线灯，最后用10％益生菌菌液喷雾生产车间。

2、对生产设备消毒，主要针对混合罐及后续相连接的设备先用双氧水进行洗涤消毒。一小时后用10％的益生菌菌液喷雾。

3、饲料原料进入混合罐后，喷入活性有益菌菌液，充分搅拌，活性有益菌对饲料原料中的杂菌有很强的抑制作用，进入发酵罐中有益菌，快速生长繁殖，从而抑制或杀灭原料中的杂菌。

实施例2酶活性的测定：

蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)

1 原理

蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钨兰和钨兰混合物)。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。

2 仪器和设备

2.1 分析天平：精度0.0001g

2.2 恒温水浴：精度±0.2℃

2.3 计时表

2.4 分光光度计

2.5 沸水浴器

2.6 振荡混合器

2.7pH计:精度0.01pH单位

3 试剂和溶液

3.1 乳酸缓冲液(pH＝3.0)适用于酸性蛋白酶

甲液：称取乳酸(80％-90％)10.6g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取乳酸钠(70％)16g,加水溶解并定容至1000ml.

使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。

3.2 磷酸缓冲液的制备(pH＝7.5)适用于中性蛋白酶

准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO3.12H2O)6.02和磷酸二氢钠(NaH2PO3.2H2O)0.5g,加水定容至1000ml

3.3 硼酸缓冲液(pH＝10.5)适用于碱性蛋白酶

甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.

使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。

3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：

准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.

3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：

准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml

3.6 0.5mol/L的NaOH：

准确称取2g NaOH溶解并定至100ml

3.7 10.00mg/ml酪素溶液

称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.

3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液

3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,用1mol/L的盐酸60ml溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.

3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.

3.9 酶样的制备

准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。

4 分析步骤

4.1 标准曲线的绘制

L-酪氨酸标准溶液按下表配制。

表2

4.2 分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值，其K值应在95-100范围内。

4.3 样品测定：

4.3.1 先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min

4.3.2 取4支试管，各加入1ml酶液

4.3.3 取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1ml酪素，摇匀，40℃保温10min

4.3.4 取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。

4.3.5 静置10min，过滤沉淀

4.3.5 各取1ml滤液，分别加0.4mol/L的Na2CO35ml、福林试剂1ml。在40℃显色20min。680nm处测OD值。以空白管调零点。

注：1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为30℃±0.2℃外，其他操作同上，标准曲线做同样处理。

5.计算

5.1 酶活定义：

1g固体酶粉(或1ml液体酶)，在40℃(酸性pH＝3.0、中性pH＝7.5、碱性pH＝10.5)条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。

5.2 计算酶的活性单位依据以下公式

蛋白酶的活力＝A*K*4/10*n U/g(ml)

A：样品平行试验的平均OD值

K：吸光常数

4：反应试剂的总体积

10：酶解反应时间

n：酶液稀释总倍数

α－淀粉酶活力的测定

一原理

α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。

二、试剂和仪器

(一)试剂

1.原碘液

称取碘(I2)11g，碘化钾(KI)22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

2.稀碘液

吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

3.20g/L可溶性淀粉溶液

称取可溶性淀粉(以绝干计)2000g.精确至0.001g，用水调成浆状物.在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。此溶液需要当天配制。

注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。

4.磷酸缓冲液(pH6.0)

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)45.23g、柠檬酸(C6H8O7·H2O)8.07g，用水溶解并定容至1000mL。配好后用pH计校正。

(二)仪器

1.分光光度计应符合GB 9721的有关规定

2.秒表

3.恒温水浴(60±0.2)℃

4.试管25mm*2000mm

三、步骤

1.待测酶液的制备

称取酶粉l-2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶100mL)，先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度(将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU/mL范围内)，摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

2.测定

(1)吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于(60±0.2)℃恒温水浴中预热5min。

(2)加入稀释好的待测酶液1.00mL，立刻记时，摇匀，准确反应5min。

(3)立即吸取反应液1.00mL于稀碘液5.00mL中，摇匀，并以稀碘液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿，迅速测定其吸光度(A)。根据其吸光度查表，求得测试酶液的浓度(C)。

四、结果整理

样品酶的活力根据以下公式计算：

X＝c×n

式中：X－样品的酶活力[IU/g(IU/mL)]

c－样品酶液的浓度(IU/mL)

n－样品的稀释倍数

所得结果表示至整数。平行实验相对误差不得超过2％。

测定时注意事项：

1.底物浓度除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于[S]与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。[S]范围一般选择在10-20Km为宜，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差在可接受范围。

2.酶浓度在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有[S]>>[E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。

3.温度不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37-40℃，高于或低于最适温度，酶活性都降低。目前，酶活性的测定温度尚未统一，但常规实验室多使用37℃。温度对酶促反应的影响程度通常用温度系数(Q10)表示。温度系数指温度每升高10℃，化学反应速度增加的倍数。Q10通常为l-2。由温度系数得知，温度的变化对酶活性有着重要影响，因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。

4.离子强度和pH值在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低，多数酶的最适pH在5-8之间。在测定酶活性时，要求缓冲液具有足够的缓冲容量，以便使pH值保持稳定。血浆或血清标本含有多种缓冲溶质，具有较强的缓冲能力。为了防止血浆或血清标本缓冲溶质对反应液酸碱度的影响，使pH不致偏离设定值，标本用量不宜过大，血浆或血清标本体积/反应液体积≤1/10为宜。

5.辅助因子某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的辅基，Mo6+是黄嘌呤氧化酶的辅基，NADH是不需氧脱氢酶的辅酶。这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性测定时，就要保证辅基或辅酶的供给。

6.激活剂有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂，Cl-是淀粉酶的激活剂。因此在酶活性测定时，也要满足酶对激活剂的需要。

7.抑制剂酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。重金属离子和砷化物对巯基酶的抑制、有机磷对羟基酶的抑制属于不可逆抑制；丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制、磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制属于竞争性抑制；哇巴因对Na+，K+-ATP酶的抑制属于非竞争性抑制。抑制剂使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。

综上所述，测定酶活性时，最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最适pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则。

纤维素酶活测定方法——3，5—二硝基水杨酸法

1.纤维素酶的活力单位定义：

在50℃，pH为4.8条件下，每分钟从浓度为10mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位(IU)。

2.测定原理

在50℃，pH为4.8条件下纤维素酶水解纤维素，产生分子量较小的聚合物和还原糖，还原糖可将3，5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙色的氨基化合物。利用比色法测出还原糖的量，从而计算出酶活力。

3.试剂和溶液

3.110.0mg/mL的葡萄糖溶液

称取的无水葡萄糖1.0000g加水溶解后定容至100mL。

3.20.05mol/L的柠檬酸盐酸性缓冲液

a、0.5mol/L柠檬酸溶液

准确称取105.0g柠檬酸完全溶解于800mL的蒸馏水中，定容至1000mL，标记为A溶液；

b、0.5mol/L柠檬酸三钠溶液

准确称取147.0g柠檬酸三钠完全溶解于800mL的蒸馏水中，定容至1000mL，标记为B溶液；

c、0.5mol/L的柠檬酸钠缓冲液

取600mL的A液与1000mL的B液充分混匀，标记为C液。

d、0.05mol/L的柠檬酸盐酸性缓冲液(pH＝4.80)

取C液1000mL加入到8000mL的蒸馏水中，必要时用3mol/L的盐酸溶液或3mol/L的氢氧化钠溶液调pH为4.80，再定容10000mL，混匀后标记为0.05mol/L的酸性缓冲液，同时标记pH＝4.80、配制日期。在4℃冰箱内保存。

3.31.0％CMC底物

精密称取羧甲基纤维素钠1.0000g溶于80mL0.1mol/L的酸性缓冲液中，室温下磁力搅拌至完全溶解(3小时以上)。用3mol/L盐酸溶液或3mol/L的氢氧化钠溶液调pH值为4.80，再用0.05mol/L的酸性缓冲液定容在100mL的容量瓶中。标记为1.0％酸性羧甲基纤维素钠溶液，同时标记pH＝4.80、配制日期。保存在4℃的冰箱内。使用前恢复到室温并摇均。

3.4DNS试剂

溶解10.0g 3，5-二硝基水杨酸、16g氢氧化钠和300g酒石酸钾钠于约700mL蒸馏水中，加热搅拌使完全溶解至澄清，放至常温并定容至1000mL，置棕色试剂瓶中，暗处保存一个星期后使用。

4.仪器和设备

4.1 分析天平：感量0.0001g

4.2 精密pH计：精确至0.01

4.3 磁力加热搅拌器

4.4 分光光度计：应符合GB9721有关规定，5mm比色皿

4.5 电热恒温水浴锅：30-100℃，±0.1℃

4.6 计时器：每小时误差不超过五秒

4.7 移液器：100-1000μl

4.8 微样进量器：0-50μl

5.标准曲线的绘制

取8支试管按下表加入试剂，稀释葡萄糖标准液；再加入3mL DNS试剂。充分混匀置沸水中煮10min，水浴冷却后，用0号试管做对照在540nm下测其它试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。

6、待测酶液的制备

精密称取固体原酶粉1.0000g溶于80mL蒸馏水中(稀释倍数≤100倍直接用缓冲液溶解)；室温下磁力搅拌15min以上，用100mL容量瓶定容，离心后取上清液用缓冲液稀释，使其吸光度在0.2-0.25之间。

7.水平控制液的制备

吸取1.0mL纤维素酶标准液，(标示酶活力为2500IU/Ml)，用0.05mol/L的柠檬酸盐酸性(pH＝4.80)的缓冲液稀释10000倍。新鲜水平控制液需现配现用。

8.测定步骤

8.1 取三支试管各加入0.5mL底物，与待测酶液一起在50℃(±1℃)水浴中预热5min。

8.2 在第一、二试管中各加入0.5mL的待测酶液，50℃水浴中反应10min。

8.3 在三支试管中各加入3mL的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5mL的待测酶液。

8.4 摇匀三支试管后，在沸水浴中煮10min。

8.5 水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540nm条件下测第一、二支试管的吸光值。吸光值以0.2-0.25之间为宜，若不在此范围内可改变稀释倍数重做。

9.结果计算

酶活力(IU/g或IU/mL)＝(葡萄糖等量值/180/10/0.5)×n

式中：180指葡萄糖从微克换算成微克分子数

10指待测液与低物的反应时间

0.5指低物反应的待测酶液量

n指原酶液的稀释倍数

10.允许分析结果可以接受标准：

10.1 允许总分析误差范围，两次取样并且检测结果相对误差小于10％。

10.2 水平控制检测酶活力与标准酶活力误差小于10％

10.3 标准曲线至少由5点组成

本发明猪专用活性微生物发酵饲料活性菌及酶类测定结果如表3所示：

表3

而对照组，使用在先申请号为2013100901713的技术方案生产的饲料，其酶活性/kg为蛋白酶<2200u,淀粉酶<600u,纤维素酶<1200u。由此可见，优化后的本发明饲料，出乎意料的具有极高的酶活。

通过对活性微生物饲料的成分进行检验；见内蒙古自治区饲料草种检验站饲检报告No.WS 12-145；包头市产品质量计量检测所检验报告No.(2012)L801，所有指标均达到规定。

实施例3从断奶仔猪到30天饲喂试验：

本发明活性微生物发酵饲料易消化吸收，降低胃肠道疾病，提高饲料利用率。本微生物发酵饲料根据原料配方可看出营养成分较高，在发酵过程中活性有益菌的大量繁殖及其产生的新鲜复合酶直接饲喂猪，充分发挥活性有益菌和高活力复合酶的双重作用。在猪等的养殖中，其饲料中的主要成分都是植物性营养物质。而植物细胞最外面都有一层由纤维素分子组成的细胞壁，这大大阻碍了植物细胞内营养物质的释放，并且使饲料中的纤维素类营养物质造成浪费。利用微生物发酵法产生的纤维素酶，可将植物纤维素分解为葡萄糖、消除饲料中非淀粉多糖的抗营养作用，使纤维素能够以葡萄糖的形式被吸收利用。除此之外，纤维素酶分解掉动物肠道中的纤维素，可很大程度上降低肠道内容物的粘度，增加饲料中营养物质和胃液中的消化酶的接触机会，能明显提高饲料的消化率和利用率，促进动物生长。利用微生物发酵法，由于蛋白质饲料原料不同有益菌种类多产生的多种蛋白分解酶，能有效地将多种粗蛋白分解成小分子易吸收的氨基酸、肽。

活性微生物发酵饲料中的多种有益菌是在饲料配方中常用的原料中生长繁殖代谢，其所产生的新鲜复合酶能够充分发挥酶活力、高度专一性这些特点，有效避免了外源性酶类拮抗、活力低等不良影响。

从断奶仔猪到30天饲喂试验报告：

本试验将58头断奶仔猪随机分为2组，试验组将10％的日粮替换成活性微生物发酵饲料，对照组按原日粮饲喂，饲喂30天。结果，试验组日增重573g，对照组日增重534g。经检验，差异明显(P＜0.5),试验组料肉比1.69：1，比对照组降低6.62％；而且试验组仔猪腹泻发病率比对照组降低18.75％。试验组每头仔猪比对照组多获利18元(仔猪单价按每千克15元)

仔猪增重及饲料利用率见表4.

表4

组别	平均始重(kg)	平均末重(kg)	日增重(g)	料重比
					对照组	10.6	26.18	519	1.81：1
试验组	9.96	26.75	559	1.69：1

此外，该活性微生物发酵饲料价格低，蛋白含量为20％的中猪育肥料市场价平均每吨3500元，而蛋白含量为20％的猪专用活性微生物饲料的市场价每吨为2900元。市场饲用复合酶制每吨8000-60000元不等

由此可见，本发明提供的猪用活性微生物发酵饲料，具有非常优秀的指标性能，并且各方面指标均达到国家性能标准。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种猪专用活性微生物生物发酵饲料，其特征在于：其添加的菌株为：酵母菌，乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪链球菌、谷氨酸棒杆菌、波状丝孢酵母菌，将这些菌选扩大培养最后制备成的菌液浓度为10⁷-10¹¹菌株/ml的A菌液；

然后进行发酵培养，所述发酵培养基的质量百分比为：葵粕为2；菜粕为3；豆粕为29；玉米为20；次小麦10；海藻糖1.55；寡糖1.0；饲料级磷酸钙为1.3；饲料级碳酸钙为1.35；普通饲料添加剂为0.8；上述A菌液为30。

2.权利要求1所述的猪专用活性微生物生物发酵饲料，其中扩大培养基组成为:

酵母菌、波状丝孢酵母菌液培养基的制备:取10L大生产用的糖化麦汁，用滤布过滤后加热至40℃，加入事先已准备好的蛋清煮至沸腾后，开始计时，再煮沸20分钟，加适量蒸馏水补充到麦汁浓度要控制在10-11度之间，再煮沸至沸腾后，放凉、过滤，用IN的磷酸调PH5.4--5.8，备用；

乳酸杆菌、谷氨酸棒杆菌培养基配方：2％蔗糖 2％酵母膏 10％马铃薯汁培养后乳酸杆菌增加至1.58*10¹¹cfu/ml；

枯草芽孢杆菌培养基，葡萄糖30.0g 蛋白胨10.0g 酵母膏5.0g 磷酸二氢钾4.5g 碳酸钙2.0g 无菌水1000ml；

地衣芽孢杆菌培养基 玉米浆0.45g 蛋白胨1.50g 豆饼粉浸汁1：15葡萄糖1.50g 最适种龄18小时，接种量是8％，起始PH7.5，最佳温度37.5℃；

粪链球菌培养基 氯化钠0.5g 蛋白胨1.0g 乳糖2.0g 猪心汤100mlPH自然，供活化菌种用，增殖培养基(％)蛋白胨2 猪肉膏2 乳糖2PH6.8。