CN111175166A - 一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法 - Google Patents

一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法 Download PDF

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CN111175166A CN202010011510.4A CN202010011510A CN111175166A CN 111175166 A CN111175166 A CN 111175166A CN 202010011510 A CN202010011510 A CN 202010011510A CN 111175166 A CN111175166 A CN 111175166A
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朱勇文
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刘�英
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Abstract

本发明提供一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法，包括：样品处理、溶液制备和上样、模拟胃消化、模拟肠消化、消化残渣处理、数据测定和结果计算；溶液制备包括：胃缓冲液、肠缓冲液、模拟胃液以及模拟肠液的制备；模拟胃液中胃蛋白酶活性为1475～1550U/ml；模拟肠液中淀粉酶活性为261.43～381.88U/ml、胰蛋白酶活性为48.04～72.84U/ml、糜蛋白酶活性为9.04～24.90U/ml；该方法能够显著降低该体外仿生消化方法测定值与传统生物学法测定值的差异，而且该方法操作简单、精确性和重复性好，解决了传统生物学发存在的耗时耗力、个体变异大、稳定性较差、实验动物成本较高的问题；此外，以该方法测定的消化能为基础配制饲料，能够实现饲料高效、精准饲喂和能量的高效利用。

Description

一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法
技术领域
本发明涉及鸭饲料代谢能值技术领域，尤其涉及一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法。
背景技术
2018年，全年商品肉鸭出栏29.13亿只，总产值777.39亿元，市场潜力巨大。肉鸭饲料原料营养价值的快速有效评定是配制日粮的关键。饲料原料的代谢能值是优化饲料配方的主要依据，也是从源头减少畜禽碳排放的重要技术支撑。虽然传统的生物学法相对较直观的方法反应出在特定的生理情况下动物对饲料养分的实际消化情况；但传统的生物学法评价肉鸭饲料原料价值耗时耗资耗力且变异大，不适合在现代大型饲料生产企业的推广应用。而采用体外酶消化法评定饲料养分利用率进行，不仅快速、稳定、有效，而且能保证肉鸭饲料营养精确供给，避免营养不足或过剩引起的生产性能不佳或资源浪费等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法，以解决传统生物学法在测定鸭饲料养分利用率时存在耗时耗力、个体变异大、稳定性较差、实验动物成本高的问题。
基于上述目的，本发明提供了一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法，包括：样品处理、溶液制备和上样、模拟胃消化、模拟肠消化、消化残渣处理、数据测定和结果计算；
所述溶液制备包括：胃缓冲液、肠缓冲液、模拟胃液以及模拟肠液的制备；
所述模拟胃液中胃蛋白酶活性为1475～1550U/ml；
所述模拟肠液中淀粉酶活性为261.43～381.88U/ml、胰蛋白酶活性为 48.04～72.84U/ml、糜蛋白酶活性为9.04～24.90U/ml。
本发明上述体外仿生消化方法通过对模拟胃液以及模拟肠液中不同消化酶含量的限定，能够显著降低该体外仿生消化方法测定值(体外测定值) 与传统生物学法测定值(体内测定值)的差异，而且该方法操作简单、精确性和重复性好，解决了传统生物学法存在的耗时耗力、个体变异大、稳定性较差、实验动物成本较高的问题；此外，以该方法测定的消化能为基础配制饲料，能够实现饲料高效、精准饲喂和能量的高效利用。
可选地，所述样品处理包括将采集的样品进行粉碎过60目筛，收集筛下物并密封保存备用；通过对样品进行粉碎过筛，能够使得在仿生消化过程中与实际进入鸭体内样品粒度相同，进而降低体外测定值与体内测定值的差异。
可选地，所述模拟肠液中Na+浓度为93.33～105.83mmol/L，K+浓度为 12.83～14.21mmol/L，pH值为7.7～7.8。
可选地，所述模拟胃液中Na+浓度为13.50～14.00mmol/L，K+浓度为 10.50～10.80mmol/L，pH值为2.0～2.2。
本发明中对鸭饲料的种类不作严格限制，例如可以为本领域市面上存在的任何鸭饲料原料或配合饲料；优选地，所述鸭饲料为能量饲料和/或蛋白质饲料；所述能量饲料包括玉米、小麦、高粱、大麦、稻谷和碎米；所述蛋白质饲料包括豆粕、棉粕、菜粕、花生粕、葵花粕和羽毛粉。
可选地，所述鸭饲料为能量饲料时，所述模拟肠液中淀粉酶活性为 261.43～307.26U/ml、胰蛋白酶活性为48.04～54.68U/ml、糜蛋白酶活性为 18.44～24.90U/ml；
可选地，所述鸭饲料为蛋白质饲料时，所述模拟肠液中淀粉酶活性为 338.59～381.88U/ml、胰蛋白酶活性为63.57～72.84U/ml、糜蛋白酶活性为 9.04～11.98U/ml。
本发明针对不同类型的饲料(例如能量饲料、蛋白质饲料)限定不同浓度的淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶，模拟了不同类型饲料在鸭体内应激作用下对不同酶活性的影响，提高了针对不同类型饲料的体外测定值与体内测定值精确度。
可选地，所述胃缓冲液通过如下方法制得：配制氯化钠浓度为 17.97～21.39mmol/L，氯化钾浓度为10.06～12.07mmol/L，pH值为3.4～3.6的混合溶液；
所述鸭饲料为能量饲料时，所述肠缓冲液通过如下方法制得：配制无水磷酸氢二钠浓度为179.63～183.15mmol/L，无水磷酸二氢钠浓度为16.67～18.75mmol/L mmol/L，氯化钠浓度为47.06～55.61mmol/L，氯化钾浓度为6.71～10.06mmol/L，pH值为7.7～7.8的混合溶液；
所述鸭饲料为蛋白质饲料时，所述肠缓冲液通过如下方法制得：配制无水磷酸氢二钠浓度为179.63～183.15mmol/L，无水磷酸二氢钠浓度为 16.67～18.75mmol/L，氯化钠浓度为42.78～47.06mmol/L，氯化钾浓度为 6.71～10.06mmol/L，青霉素浓度为(75～100)×104U/L，pH值为7.7～7.8的混合溶液。
可选地，所述上样包括：
将胃缓冲液和肠缓冲液分别放入单胃动物仿生消化系统(型号SDS- Ⅱ)的相应位置，并连接好管道；并设置系统预热时间为55-65min，以及设置模拟胃消化参数和模拟肠消化参数；在系统预热期间，将处理好的透析袋纵穿模拟消化管，两端外翻并用橡皮筋将透析袋扎紧，固定在模拟消化管上，然后，用翻口硅胶塞将一端塞严；然后称取1-2g样品置于装有透析袋的模拟消化管中，并同步测定样品干物质含量；
可选地，所述模拟胃消化包括：
向透析袋中添加模拟胃液；所述模拟胃液添加量为18-22ml；并将模拟消化管的另一端采用带有模拟肠液的加酶管的反口硅胶塞塞严；然后将模拟消化管置于单胃动物仿生消化系统中，按照模拟消化管下端进水上端出水的原则接好管道；每5根模拟消化管之间串联连接，消化管加液管与系统依次以快速接头相连；
所述模拟胃消化参数如下：温度41.5～42.5℃、胃缓冲液流速为 110～130ml/min、消化时间为3.5～4.5h、清洗液1400～1600ml/次，每次清洗 35～45min，清洗2-4次。
可选地，所述模拟肠消化包括：
在胃模拟消化结束时，将模拟肠液移入单胃动物仿生消化系统的肠消化液储藏室中；所述模拟肠消化参数如下：温度40.5～41.5℃、肠缓冲液流速为110～130ml/min、消化时间为14～16h、清洗液1400～1600ml/次，每次清洗35～45min，清洗5～7次。
本发明通过对模拟胃消化和模拟肠消化参数的具体限定，能够模拟鸭体内消化环境的同时，并减少体外测定值与体内测定值的误差。
可选地，所述消化残渣处理包括：
待所述模拟肠消化结束后，将透析袋中的未消化残渣转移至已知重量的平皿(W0)中，具体通过将透析袋从模拟消化管中取出，横向剪开并用去离子水清洗；然后，将平皿烘干至恒重(W1)，具体地先在60～70℃下烘干至无水痕，再在100-110℃下烘干至恒重；再将平皿中残渣转移至已知绝干重量的砂芯坩锅(W3)中，并用无水乙醇冲洗残渣3次进行脱脂，直至滤出液为无色为止，同时将转移残渣后的平皿在100～110℃下烘干至恒重 (W2)；后将砂芯坩埚在100～110℃下烘干至恒重(W4)，再将砂芯坩埚内的残渣转移到氧弹热量计的称量纸上，称取风干样品的重量(W6)，同时将转移残渣后的砂芯坩埚在100～110℃下烘干至恒重(W5)；
可选地，所述数据测定包括：
被测饲料按照GB/T6435测定水分并计算其干物质含量，并根据ISO 9831:1998的规定同步测定待测饲料总能；
可选地，所述结果计算包括：
脱脂未消化残渣干物质量和干物质能值的计算分别按公式1和式2计算：
Figure RE-GDA0002413215690000041
Figure RE-GDA0002413215690000042
上述式1和式2中：
M2为样品未消化残渣干物质量，单位为克(g)；
W0为培养皿绝干重量，单位为克(g)；
W1为未消化残渣+培养皿绝干重量，单位为克(g)；
W2为转移未消化残渣后残留物+培养皿绝干重量，单位为克(g)；
W3为砂芯坩埚绝干重量，单位为克(g)；
W4为脱脂未消化残渣+砂芯坩埚绝干重量，单位为克(g)；
W5为转移脱脂未消化残渣样品后残留物+砂芯坩埚绝干重量，单位为克(g)；
W6为脱脂消化残渣风干样品重量，单位为克(g)；
Er为脱脂残渣风干样品总能，单位为焦耳(J)；
饲料酶水解物能值(EHGE，单位为MJ/kg)干物质基础和风干物质基础分别按式3和式4计算：
Figure RE-GDA0002413215690000051
Figure RE-GDA0002413215690000052
上述式3和式4中：
EHGE为被测饲料酶水解物能值，单位为兆焦酶千克(MJ/kg)；
GE1为上样饲料总能，单位为焦耳(J)；按热化学卡(calth)计算，1cal＝4.184J(准确值)；
GE2为残渣总能，单位为焦耳(J)；
M1为上样饲料干物质量，单位为克(g)；
M3位上样饲料风干物质量，单位为克(g)。
从上面所述可以看出，本发明提供的一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法至少包括如下效果：
(1)本发明体外仿生消化方法通过对模拟胃液以及模拟肠液中不同消化酶含量的限定，能够显著降低该体外仿生消化方法测定值(体外测定值) 与传统生物学法测定值(体内测定值)的差异，而且该方法操作简单、精确性和重复性好，解决了传统生物学发存在的耗时耗力、个体变异大、稳定性较差、实验动物成本较高的问题；此外，以该方法测定的消化能为基础配制饲料，能够实现饲料高效、精准饲喂和能量的高效利用。
(2)本发明针对不同类型的饲料(例如能量饲料、蛋白质饲料)限定不同浓度的淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶，模拟了不同类型饲料在鸭体内应激作用下对不同酶活性的影响，提高了针对不同类型饲料的体外测定值与体内测定值精确度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
一种用于测定鸭能量饲料玉米养分利用率的体外仿生消化方法，包括：
样品处理：
将采集的样品进行粉碎过60目筛，收集筛下物并密封保存备用；
溶液制备和上样：
胃缓冲液制备：
配制氯化钠浓度为20.00mmol/L，氯化钾浓度为11.00mmol/L，pH值为 3.5的混合溶液；
肠缓冲液制备：
鸭饲料为能量饲料时，肠缓冲液通过如下方法制得：配制无水磷酸氢二钠浓度为183.15mmol/L，无水磷酸二氢钠浓度为16.67mmol/L mmol/L，氯化钠浓度为55.61mmol/L，氯化钾浓度为6.71mmol/L，pH值为7.7的混合溶液；
鸭饲料为蛋白质饲料时，肠缓冲液通过如下方法制得：配制无水磷酸氢二钠浓度为183.15mmol/L，无水磷酸二氢钠浓度为16.67mmol/L，氯化钠浓度为42.78mmol/L，氯化钾浓度为6.71mmol/L，青霉素浓度为80×104U/L， pH值为7.7的混合溶液；
模拟胃液制备：配制胃蛋白酶活性为1550U/ml、Na+浓度为 13.50～14.00mmol/L，K+浓度为10.50～10.80mmol/L，pH值为2.1的模拟胃液；
模拟肠液制备：配制淀粉酶活性为307.26U/ml、胰蛋白酶活性为 54.68U/ml、糜蛋白酶活性为24.90U/ml、Na+浓度为104.39mmol/L，K+浓度为 14.21mmol/L，pH值为7.79的模拟肠液；
上样包括：将胃缓冲液和肠缓冲液分别放入单胃动物仿生消化系统(型号SDS-Ⅱ)的相应位置，并连接好管道；并设置系统预热时间为60min，以及设置模拟胃消化参数和模拟肠消化参数；在系统预热期间，将处理好的透析袋纵穿模拟消化管，两端外翻并用橡皮筋将透析袋扎紧，固定在模拟消化管上，然后，用翻口硅胶塞将一端塞严；然后称取2g样品置于装有透析袋的模拟消化管中，并同步测定样品干物质含量；
模拟胃消化：
向透析袋中添加模拟胃液；模拟胃液添加量为20ml；并将模拟消化管的另一端采用带有模拟肠液的加酶管的反口硅胶塞塞严；然后将模拟消化管置于单胃动物仿生消化系统中，按照模拟消化管下端进水上端出水的原则接好管道；每5根模拟消化管之间串联连接，消化管加液管与系统依次以快速接头相连；
模拟胃消化参数如下：温度42℃、胃缓冲液流速为120ml/min、消化时间为4h、清洗液1500ml/次，每次清洗40min，清洗3次；
模拟肠消化：
在胃模拟消化结束时，将模拟肠液2ml移入单胃动物仿生消化系统的肠消化液储藏室中；所述模拟肠消化参数如下：温度41℃、肠缓冲液流速为120ml/min、消化时间为15h、清洗液1500ml/次，每次清洗40min，清洗 6次；
消化残渣处理：
待模拟肠消化结束后，将透析袋中的未消化残渣转移至已知重量的平皿中，具体通过将透析袋从模拟消化管中取出，横向剪开并用去离子水清洗；然后，将平皿烘干至恒重，具体地先在65℃下烘干至无水痕，再在105 ℃下烘干至恒重；再将平皿中残渣转移至已知绝干重量的砂芯坩锅中，并用无水乙醇冲洗残渣3次进行脱脂，直至滤出液为无色为止，同时将转移残渣后的平皿在105℃下烘干至恒重；后将砂芯坩埚在105℃下烘干至恒重，再将砂芯坩埚内的残渣转移到氧弹热量计的称量纸上，称取风干样品的重量，同时将转移残渣后的砂芯坩埚在105℃下烘干至恒重；
数据测定:
被测饲料按照GB/T6435测定水分并计算其干物质含量，并根据ISO 9831:1998的规定同步测定待测饲料总能；
结果计算：
脱脂未消化残渣干物质量和干物质能值的计算分别按公式1和式2计算：
Figure RE-GDA0002413215690000071
Figure RE-GDA0002413215690000072
上述式1和式2中：
M2为样品未消化残渣干物质量，单位为克(g)；
W0为培养皿绝干重量，单位为克(g)；
W1为未消化残渣+培养皿绝干重量，单位为克(g)；
W2为转移未消化残渣后残留物+培养皿绝干重量，单位为克(g)；
W3为砂芯坩埚绝干重量，单位为克(g)；
W4为脱脂未消化残渣+砂芯坩埚绝干重量，单位为克(g)；
W5为转移脱脂未消化残渣样品后残留物+砂芯坩埚绝干重量，单位为克(g)；
W6为脱脂消化残渣风干样品重量，单位为克(g)；
Er为脱脂残渣风干样品总能，单位为焦耳(J)；
饲料酶水解物能值(EHGE，单位为MJ/kg)干物质基础和风干物质基础分别按式3和式4计算：
Figure RE-GDA0002413215690000081
Figure RE-GDA0002413215690000082
上述式3和式4中：
EHGE为被测饲料酶水解物能值，单位为兆焦酶千克(MJ/kg)；
GE1为上样饲料总能，单位为焦耳(J)；按热化学卡(calth)计算， 1cal＝4.184J(准确值)；
GE2为残渣总能，单位为焦耳(J)；
M1为上样饲料干物质量，单位为克(g)；
M3位上样饲料风干物质量，单位为克(g)。
实施例2
本实施例为一种用于测定鸭能量饲料高粱养分利用率的体外仿生消化方法，该体外仿生消化方法与实施例1基本相同，区别仅在于模拟肠液中淀粉酶活性为261.43U/ml、胰蛋白酶活性为48.04U/ml、糜蛋白酶活性为 18.44U/ml。
实施例3
本实施例为一种用于测定鸭蛋白质饲料豆粕养分利用率的体外仿生消化方法，该体外仿生消化方法与实施例1基本相同，区别仅在于模拟肠液中淀粉酶活性为381.88U/ml、胰蛋白酶活性为72.84U/ml、糜蛋白酶活性为 11.98U/ml。
实施例4
本实施例为一种用于测定鸭蛋白质饲料棉粕养分利用率的体外仿生消化方法，该体外仿生消化方法与实施例1基本相同，区别仅在于模拟肠液中淀粉酶活性为338.59U/ml、胰蛋白酶活性为63.57U/ml、糜蛋白酶活性为 9.04U/ml。
实验例1
本实验例为对本申请实施例体外仿生方法的可行性研究；
采集不同产地具有代表性的能量类饲料原料玉米、高粱和大麦，蛋白质饲料豆粕、棉粕和菜粕等原料26个，进行番鸭代谢实验；
生物学法试验设计及饲养管理：
选取20周龄、遗传背景和体重相近的公番鸭48只，随机分为6个组，每个组8个重复，单笼饲养于代谢笼中，自由采食和饮水，光照时间为16 h，饲养管理参照常规饲养试验管理程序进行；排空强饲法预饲期为3天，强饲前禁食36h，整个试验期间自由饮水，强饲60g试验料，收集36h内的排泄物，采用空腹法收集36h的内源性排泄物，每次试验结束后设置2周左右的恢复期；其中能量饲料直接强饲原料，蛋白质饲料以40％玉米淀粉+60％待测饲料作为强饲用料；
番鸭体外仿生消化试验：
分别按照实施例1和实施例3中的方法分别对能量类饲料和蛋白质类饲料进行仿生消化试验，每个样品5个重复，每个重复1根消化管；
试验结果：
实施例1和实施例3中的仿生消化方法以及生物学法对不同饲料原料的测定结果如表1所示：
表1仿生消化能值估测饲料代谢能值的精度和偏差
Figure RE-GDA0002413215690000091
Figure RE-GDA0002413215690000101
由表1可知：
13个能量类饲料样品中有9个样品的SDGE与AME无显著差异；对于 13个蛋白质类饲料样品中有8个样品的SDGE与TME无显著差异，达到了仿生法估测鸭饲料TME的定量水平；
生物学法和实施例1和实施例3的仿生法能值和干物质消化率的变异系数在各区间的占比如表2所示；
表2
Figure RE-GDA0002413215690000102
Figure RE-GDA0002413215690000111
由表2可知：
相比于生物学法，仿生法SDGE以及SDDM，变异系数均在5％以内，且主要分布区间均在2.5％以内，其中SDGE在此区间内的占比为84.6％， SDDM在此区间内的占比为96.15％，其精度高于生物学法。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于测定鸭饲料养分利用率的体外仿生消化方法，其特征在于，包括：样品处理、溶液制备和上样、模拟胃消化、模拟肠消化、消化残渣处理、数据测定和结果计算；
所述溶液制备包括：胃缓冲液、肠缓冲液、模拟胃液以及模拟肠液的制备；
所述模拟胃液中胃蛋白酶活性为1475～1550U/ml；
所述模拟肠液中淀粉酶活性为261.43～381.88U/ml、胰蛋白酶活性为48.04～72.84U/ml、糜蛋白酶活性为9.04～24.90U/ml。
2.根据权利要求1所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述模拟肠液中Na+浓度为93.33～105.83mmol/L，K+浓度为12.83～14.21mmol/L，pH值为7.7～7.8。
3.根据权利要求1所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述模拟胃液中Na+浓度为13.50～14.00mmol/L，K+浓度为10.50～10.80mmol/L，pH值为2.0～2.2。
4.根据权利要求1所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述鸭饲料为能量饲料和/或蛋白质饲料；所述能量饲料包括玉米、小麦、高粱、大麦、稻谷和碎米；所述蛋白质饲料包括豆粕、棉粕、菜粕、花生粕、葵花粕和羽毛粉。
5.根据权利要求4所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述鸭饲料为能量饲料时，所述模拟肠液中淀粉酶活性为261.43～307.26U/ml、胰蛋白酶活性为48.04～54.68U/ml、糜蛋白酶活性为18.44～24.90U/ml。
6.根据权利要求4所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述鸭饲料为蛋白质饲料时，所述模拟肠液中淀粉酶活性为338.59～381.88U/ml、胰蛋白酶活性为63.57～72.84U/ml、糜蛋白酶活性为9.04～11.98U/ml。
7.根据权利要求1所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述胃缓冲液通过如下方法制得：配制氯化钠浓度为17.97～21.39mmol/L，氯化钾浓度为10.06～12.07mmol/L，pH值为3.4～3.6的混合溶液；
所述鸭饲料为能量饲料时，所述肠缓冲液通过如下方法制得：配制无水磷酸氢二钠浓度为179.63～183.15mmol/L，无水磷酸二氢钠浓度为16.67～18.75mmol/L mmol/L，氯化钠浓度为47.06～55.61mmol/L，氯化钾浓度为6.71～10.06mmol/L，pH值为7.7～7.8的混合溶液；
所述鸭饲料为蛋白质饲料时，所述肠缓冲液通过如下方法制得：配制无水磷酸氢二钠浓度为179.63～183.15mmol/L，无水磷酸二氢钠浓度为16.67～18.75mmol/L，氯化钠浓度为42.78～47.06mmol/L，氯化钾浓度为6.71～10.06mmol/L，青霉素浓度为(75～100)×104U/L，pH值为7.7～7.8的混合溶液。
8.根据权利要求1所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述模拟胃消化参数如下：温度41.5～42.5℃、胃缓冲液流速为110～130ml/min、消化时间为3.5～4.5h、清洗液1400～1600ml/次，每次清洗35～45min，清洗2～4次。
9.根据权利要求1所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述模拟肠消化参数如下：温度40.5～41.5℃、肠缓冲液流速为110～130ml/min、消化时间为14～16h、清洗液1400～1600ml/次，每次清洗35～45min，清洗5～7次。
10.根据权利要求1所述的体外仿生消化方法，其特征在于，所述样品处理包括将采集的样品进行粉碎过60目筛，收集筛下物并密封保存备用。
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