MX2014005707A - Procedimiento de esterilizacion. - Google Patents

Procedimiento de esterilizacion.

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Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para esterilizar biomateriales implantables. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para esterilizar un biomaterial a base de colágeno entrelazado, que comprende poner en contacto dicho biomaterial a base de colágeno entrelazado con una solución de esterilización comprendiendo de entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno e incubar dicho biomaterial de entre 30°C y 55°C durante más de 48 horas; siempre que la solución de esterilización no incluya alcohol.

Description

PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACION Campo de la invención La presente invención se refiere a un proceso para esterilizar biomateriales implantables. En particular, la invención se refiere a un proceso para esterilizar biomateriales implantables conteniendo colágeno y almacenamiento posterior.
Antecedentes Los biomateriales implantables, especialmente biomateriales basados en colágeno, requieren esterilización y muy frecuentemente almacenamiento antes de usarse. En general, existen dos clases amplias de biomateriales basados en colágeno implantables: (1 ) tejido natural y (2) tejido químicamente reticulado. Así, dependiendo del tipo de biomaterial basado en colágeno y si ha tenido lugar reticulación o no, existe la necesidad de un medio para esterilizar el tejido así como almacenar tejido una vez que ha sido esterilizado.
Los biomateriales basados en colágeno reticulados químicos, tales como parches cardiovasculares, válvulas del corazón, matrices y arterias son usualmente esterilizados después de la reticulación y almacenadas en una solución estéril hasta el implante. Varios métodos de esterilización para biomateriales basados en colágeno reticulados químicos han sido probados e implementados durante las últimas tres a cuatro décadas incluyendo irradiación gamma, irradiación UV y una variedad de agentes químicos. Aunque la mayoría de estos métodos de esterilización son eficientes para prevenir la contaminación, efectos adversos tales como daño estructural (corte de enlaces de peptido) y degeneración de tejido (reducción en la fuerza de tensión) ha hecho una variedad de estos métodos menos atractivos para la aplicación industrial.
Por ejemplo, los biomateriales basados en colágeno reticulados con glutaraldehído pueden volverse químicamente inestables cuando se exponen a soluciones de esterilización basadas en alcohol debido a la interacción del alcohol con glutaraldehído residual y no ligado presente en el tejido. Los hemiacetilos inestables son formados cuando un alcohol reacciona con un aldehido. Estos hemiacetilos inestables tienen la capacidad de reaccionar con alcohol para formar un acetilo, el cual puede disociarse para formar un aldehido y un alcohol.
Así, en la actualidad, la mayoría de los fabricantes de biomateriales basados en colágeno prefieren el uso de combinaciones de glutaraldehído-formaldehído para reticulación química y agentes no de aldehido para esterilización. Uno de tales agentes no de aldehido es gas de óxido de etileno (oxirano), el cual ha sido usado para esterilizar válvulas mecánicas del corazón durante muchos años. El gas de óxido de etileno también ha sido usado para esterilizar una variedad de equipo médico, artículos desechables y válvulas mecánicas de corazón.
Una vez que el biomaterial basado en colágeno ha sido esterilizado, generalmente es almacenado durante un periodo antes de la implantación. Almacenamiento a mediano a largo plazo de biomateriales basados en colágeno requiere protección adecuada de contaminación en una solución fisiológicamente estable. Aunque la mayoría de los biomateriales basados en colágeno comercialmente disponibles todavía son almacenados en soluciones basadas en aldehido, efectos adversos tales como calcificación y fibrosis son bien conocidos.
Debido a que el óxido de propileno de la decada de 1970 ha sido usado como un agente desterilización (ver, por ejemplo, Hart & Brown, 1974, Appl Microbiol, Dic. P.1069-1070; Brown & Ng, 1975, Appl Microbiol, Sept. P483-484). En cada caso, una solución comprendiendo 5% de óxido de propileno más 70% de alcohol isopropílico o 0.5% de clorhexidina o 2% de cetrimida fue efectiva para destruir una suspensión de esporas bacterianas. Sin embargo, mientras que el uso de óxido de propileno ha sido registrado, esto es aplicado usualmente en la presencia de alcohol (etanol o isopropanol). Así, el uso de un alcohol como un aditivo para esterilización de óxido de propileno con tejidos reticulados con aldehido (conteniendo aldehidos residuales) podría resultar en niveles de aldehido elevados, lo cual a su vez aumenta el potencial de calcificación de estos tejidos y por último falla bioprotésica.
En consecuencia, lo que se requiere es un proceso de esterilización eficiente, el cual no solo esterilice biomateriales basados en colágeno reticulados químicos, sino también proporcione un medio de almacenamiento conveniente para el biomaterial esterilizado.
Breve descripción de la invención Los inventores han desarrollado un proceso que supera o al menos mejora los problemas asociados con métodos de esterilización y/o almacenamiento normalmente usados para biomateriales basados en colágeno reticulados.
De acuerdo con esto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para esterilizar un biomaterial basado en colágeno reticulado comprendiendo contactar dicho biomaterial basado en colágeno reticulado con una solución de esterilización comprendiendo entre 3% y 6% p/p de óxido de propileno e incubar dicho biomaterial entre 30°C y 55°C por más de 48 horas; con la condición de que la solución de esterilización no incluya alcohol.
En algunas modalidades, la temperatura de incubación está entre 30°C, 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C, y 55°C. En otras modalidades, la temperatura de incubación está entre 30°C y 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C o 55°C. En otras palabras, todas las combinaciones de temperaturas entre el rango 30°C y 55°C son previstas. En algunas modalidades, la temperatura de incubación está de preferencia entre 35°C y 50°C, más preferiblemente entre 40°C y 48°C. En algunas modalidades, la temperatura de incubación es aproximadamente 45°C.
Una vez que el periodo de incubación ha transcurrido, es decir, más de 48 horas han transcurrido, es permisible que la temperatura sea reducida a temperatura ambiente. En realidad, el biomaterial basado en colágeno reticulado esterilizado puede permanecer a temperatura ambiente durante algún tiempo después de las 48 horas iniciales como en este momento. Una vez que el biomaterial basado en colágeno reticulado esterilizado ha sido incubado en el óxido de propileno durante al menos 4 días, el óxido de propileno habrá sido convertido a propilenglicol y el biomaterial basado en colágeno estará listo para usarse.
En algunas modalidades, la solución de esterilización comprende entre 3.8% y 4.5% v/v de óxido de propileno. En otras modalidades, la solución de esterilización comprende aproximadamente 4% v/v de óxido de propileno. En algunas modalidades, la solución de esterilización consiste esencialmente de entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno, más preferiblemente la solución de esterilización consiste de entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno. En algunas modalidades, la solución de esterilización consiste esencialmente de entre 3.8% y 4.5% v/v de óxido de propileno, más preferiblemente la solución de esterilización consiste de entre 3.8% y 4.5% v/v de óxido de propileno. En algunas modalidades, la solución de esterilización consiste esencialmente de aproximadamente 4% v/v de óxido de propileno, más preferiblemente la solución de esterilización consiste de aproximadamente 4% v/v de óxido de propileno.
Se apreciará que el alcohol, especialmente etanol y/o isopropanol no es usado en la solución de esterilización de la presente invención.
Es un requerimiento que el paso de esterilización sea realizado por más de 48 horas (2 días); sin embargo, como la solución de esterilización también puede ser usada como un medio de almacenamiento, el paso de esterilización puede ser realizado durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días.
El biomaterial basado en colágeno reticulado puede ser cualquier material el cual comprende, consiste esencialmente de o consiste de colágeno. En algunas modalidades, el biomaterial basado en colágeno es aislado directamente de un animal. El biomaterial puede ser aislado de cualquier animal, ya sea de la misma especie como un receptor o de un animal de una especie diferente al receptor. De preferencia, el animal es de una de las órdenes de mamífero, es decir, Artiodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Perissodactyla, Carnívora y Marsupialia. Más preferiblemente, el animal es seleccionado del grupo que consiste de un ovino, un bovino, un caprino, un equmo, un porcino, un marsupial y un humano.
El biomaterial puede ser cualquier tipo de tejido celular. De preferencia, el tejido celular es seleccionado del grupo que consiste de tejido cardiovascular, tejido del corazón, válvula del corazón, raíces aórticas, pared aórtica, valvas aórticas, tejido pericárdico, tejido conectivo, dura madre, tejido dérmico, un tejido vascular, cartílago, pericardio, ligamento, tendón, vasos sanguíneos, tejido umbilical, tejido óseo, fascias y tejido submucoso y piel.
En algunas modalidades, el biomaterial es y/o comprende colágeno discreto, es decir, aislado, en lugar de un tejido conteniendo colágeno que ocurre de manera natural. El colágeno discreto puede ser usado en este estado aislado o formado en cualquier dispositivo o artículo medico conocido en la téenica.
En algunas modalidades, el biomaterial es un tejido cultivado, una prótesis conteniendo matriz extra-celular obtenida de un animal, un tejido reconstituido (por ejemplo, matriz de colágeno) o similares.
También se apreciará que el biomaterial pudiera comprender además análogos sintéticos formados a partir de polímeros sintéticos, polímeros biológicos o ambos, incluyendo aquéllos encontrados de manera general en las matrices de tejido naturales. Los polímeros sintéticos adecuados incluyen, por ejemplo, poliamidas y polisulfonas. Los polímeros biológicos pueden ser que ocurran de manera natural o producidos in vitro mediante, por ejemplo, fermentación y similares.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para esterilizar un biomaterial basado en colágeno que comprende: (a) proporcionar un biomaterial basado en colágeno y lavar el mismo con solución salina al 0.9% v/v helada y colocar dicho biomaterial en solución sallna/fenil-metil-sulfonil-fluoruro (PMSF) al 0.9% v/v helado; (b) contactar dicho biomaterial basado en colágeno con solución de glutaraldehído al 0.625% v/v y di-hidrógeno fosfato de potasio pH 7.4 e incubar el mismo a aproximadamente 1 -5°C durante al menos 5 días para producir un biomaterial basado en colágeno reticulado; (c) enjuagar dicho biomaterial basado en colágeno reticulado en cloruro de sodio al 0.9% v/v estéril a aproximadamente 10°C y entonces contactar el biomaterial basado en colágeno reticulado con una solución de esterilización comprendiendo entre 3.8% y 4.5% v/v de óxido de propileno e incubar dicho tejido entre 30°C y 55°C por más de 48 horas; con la condición de que la solución de esterilización no incluya alcohol.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un metodo para almacenar un biomaterial basado en colágeno reticulado, esterilizado, que comprende contactar un biomaterial basado en colágeno reticulado con una solución comprendiendo entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno e incubar dicho biomaterial entre 30°C y 55°C por más de 48 horas y entonces permitir que el biomaterial permanezca en contacto con dicho ótfido de propileno hasta que el mismo se convierta a propileng licol ; con la condición de que la solución no incluya alcohol.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un biomaterial basado en colágeno reticulado, esterilizado, producido por un método de acuerdo con el primero, segundo o tercer aspectos.
Se apreciará que una vez que el biomaterial basado en colágeno, reticulado, esterilizado ha sido obtenido por los métodos de la presente invención, puede incluirse con dispositivos biológicos implantables. De acuerdo con esto, en un qumto aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo biológico implantable comprendiendo un biomaterial basado en colágeno reticulado, esterilizado de acuerdo con el cuarto aspecto.
En un aspecto adicional de la presente invención, el biomaterial basado en colágeno reticulado de la presente invención está contenido dentro de un kit para reparar una lesión de tejido. Así, en un sexto aspecto, la presente invención proporciona un kit para reparar una lesión de tejido que comprende: (a) un recipiente esteril teniendo un bíomaterial basado en colágeno reticulado, esterilizado, de acuerdo con el cuarto aspecto o un dispositivo de acuerdo con el qumto aspecto; y (b) instrucciones para uso en un sujeto lesionado.
En un séptico aspecto la presente invención proporciona un recipiente comprendiendo un bíomaterial basado en colágeno reticulado, esterilizado, y una solución de propilenglicol al 3% a 6% v/v, en donde dicho propilenglicol ha resultado de la conversión in situ de una solución de óxido de propileno al 3% a 6% v/v mientras está en la presencia del bíomaterial.
El bíomaterial basado en colágeno de la presente invención puede ser reticulado mediante cualquier método conocido en la téenica para reticular colágeno incluyendo, pero no limitando a, los métodos descritos en Eyre et al, 1984, Annu. Rev. Biochem. 537, 717-748; Eyre, 1982, En: Symposium on Heritable Disorders of Connective Tissue (Simposium sobre trastornos heriditables de tejido conectivo) (Akeson et al. Eds) pp. 43-58, Mosby, St. Louis, Missouri; Davison & Brennan, 1983, Connect. Tissue Res. 1 1 , 135-151 ; Robins, 1982; Methos Biochem. Analysis, 28, 330-379; Reiser, 1991 , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 196, 17-29; todos los cuales son incorporados en la presente en su totalidad por referencia. Sin embargo, un método preferido para reticular el bíomaterial basado en colágeno de la presente invención comprende: (a) exponer un bíomaterial basado en colágeno a una solución conteniendo alcohol por al menos 24 horas; (b) exponer dicho biomaterial en el paso (a) a un agente reticulante; y (c) exponer dicho biomaterial en el paso (b) a una solución ácida; en donde el paso (b) y (c) son secuenciales al paso (a).
La solución conteniendo alcohol usada en el paso (a) es de preferencia un líquido basado en agua, es decir, es una solución acuosa demás de aproximadamente 50% v/v de alcohol, y de preferencia entre 60% a 80% de alcohol en volumen. Puede usarse ya sea una solución conteniendo alcohol amortiguada como no amortiguada; sin embargo, se prefiere que se use una solución conteniendo alcohol no amortiguada ya que se ha encontrado que las soluciones conteniendo alcohol amortiguadas afectan adversamente los procedimientos de reticulación subsecuentes produciendo un biomaterial amarinado.
El método preferido de reticulación puede usar cualquier alcohol conocido en la téenica en la solución conteniendo alcohol. De preferencia, el alcohol es un alcohol inferior de C1-C6 en una solución libre de amortiguador. Aún más preferiblemente, el alcohol es seleccionado del grupo que consiste de metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec-butanol y t-butanol.
En algunas modalidades, la solución conteniendo alcohol comprende una mezcla de dos o más alcoholes siempre que el volumen combinado del alcohol sea mayor que 50% v/v. Por ejemplo, una mezcla de aproximadamente 70% v/v de etanol y aproximadamente 10% v/v de isobutanol es efectiva.
El biomaterial en el paso (a) puede ser expuesto a la solución conteniendo alcohol por cualquier lapso de tiempo siempre y cuando sea suficiente para hacer al biomaterial resistente a calcificación patogenica in vivo. E preferencia, el biomaterial permanece en contacto con la solución conteniendo alcohol durante tiempo suficiente para permitir que el alcohol se difunda y permee en el biomaterial. Más preferiblemente, el biomaterial es expuesto a la solución conteniendo alcohol durante al menos 24 horas, aún más preferiblemente al menos 36 horas y muy preferiblemente, al menos 48 horas.
El biomaterial, después de exposición a la solución conteniendo alcohol, es removido y expuesto a uno o más agentes reticulantes. Cualquier forma de agente reticulante conocida en la téenica o combinación de los mismos puede usarse siempre y cuando sea capaz de reticular colágeno. De acuerdo con esto, se apreciará que los agentes reticulantes, incluyen pero no están limitados a, divinil sulfona (DVS), polietilenglicol divinil sulfona (VS-PEG-VS), hidroxietil metacrilato divinil sulfona (HEMA-DIS-HEMA), formaldehído, glutaraldehído, aldehidos, isocianatos, alquil y aril haluros, imidoésteres, maleimidas N-substituidas, compuestos acilantes, carbodiimida, hidroxicloruro, N-hidroxisuccinimida, luz (por ejemplo, luz azul y luz UV), pH, temperatura, y combinaciones de los mismos. De preferencia, el agente reticulante es un agente reticulante químico seleccionado del grupo que consiste de carbodiimida, poliepoxi éteres, divinil sulfona (DVS), polialdehído y difenlfosforil azida (DPPA).
En algunas modalidades, el polialdehído es un bi-, tri- o di- aldehido. El glutaraldehído es especialmente preferido.
En algunas modalidades, el paso de reticulación (b) es seguido por el paso (c), con o sin un paso de lavado interpuesto. La solución ácida usada en el paso (c) contiene cualquier ácido capaz de inactivar y/o modificar las porciones de agente reticulante fijado y/o no fijado presentes en el biomaterial después del paso (b) para remover o reducir sitios de unión de calcio disponibles. De manera alternativa, o además de, la solución ácida usada en el paso (c) contiene cualquier ácido capaz de reticular adicionalmente los grupos carboxilo activados con los grupos amina activados en el colágeno para formar enlaces de amida. De preferencia, el ácido en la solución ácida comprende un ácido aminocarboxílico. De preferencia, el ácido aminocarboxílico es un ácido teniendo al menos un grupo amino y al menos un substituyente de ácido carboxílico. Más preferiblemente, el ácido aminocarboxílico es seleccionado del grupo que contiene de L-arginina, L-lisina, L-histidina, L-glutamato o L-aspartato.
El paso de enjuagar el biomaterial es conducido usando una solución libre de fosfato de solución salina al 0.9% v/v.
Aunque se apreciará por aquéllos expertos en la téenica que la temperatura a la cual cada uno de los pasos en el método de reticulación preferido es realizado no es crítica, se entenderá que de preferencia, la temperatura está entre 2°C y 40°C, más preferiblemente, entre 4°C y 30°C, y muy preferiblemente, entre 5°C y 25°C.
En una modalidad, el alcohol, solución ácida y solución de enjuague son todas libres de amortiguador.
Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra el efecto de 2% de óxido de propileno a temperaturas variantes entre 15°C y 45°C en esporas de B. subtilis en el tiempo.
La Figura 2 muestra el efecto de 4% de óxido de propileno a temperaturas variantes entre 15°C y 45°C sobre esporas de B. subtilis en el tiempo.
Descripción detallada de las modalidades preferidas Antes de describir la presente invención en detalle, se entenderá que esta invención no está limitada a metodos de producción particularmente ejemplificados de producción, los cuales, por supuesto pueden variar. También es entendido que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención solamente, y no se pretende limitar, lo cual será limitado solamente por las reivindicaciones anexas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes declaradas en la presente, ya sea supra o infra, son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Sin embargo, las publicaciones mencionadas en la presente son citadas para el propósito de describir y divulgar los protocolos y reactivos los cuales son reportados en las publicaciones y los cuales pudieran ser usados en conexión con la invención. Nada aquí va a ser interpretado como una admisión de que la invención no está autorizada para preceder tal descripción en virtud de la invención anterior.
Adicionalmente, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otra manera, téenicas inmunológicas convencionales, química y farmacología dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas son bien conocidas para el trabajador experto y son explicadas completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher y Wingfield “Current protocols in Protein Science” (Protocolos actuales en la ciencia de las proteínas) (1999) Volumen I y II /John Wilcy & Sons I nc. ) ; y Bailey, J.E. y Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentáis (Fundamentos de ingeniería bioquímica), McGraw-Hill Book Company, NY, 1986; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Métodos inmunoquímicos en biología celular y molecular) (Myaer y Walker, eds, Academic Press, Londres, 1987); Handbook of Experimental Immunology (Manual de inmunología experimental), volúmenes l-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1986).
Se debe notar que como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formulas singulares “un”, “una”, “el", “la”, incluyen referencias en plural a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Así, por ejemplo, una referencia a un “agente reticulante” incluye una pluralidad de tales agentes, y una referencia a “un alcohol” es una referencia a uno o más alcoholes, y así sucesivamente. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usaos en la presente tienen los mismos significados como es entendido comúnmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque cualquier material y método similar o equivalente a esos descritos en la presente pueden usarse para practicar o probar la presente invención, los materiales y métodos preferidos son ahora descritos.
En uno de los aspectos más amplios, la presente invención se refiere a un método para esterilizar un biomaterial basado en colágeno.
Como se usa en la presente, el término “biomaterial” se refiere a cualquier material contiendo colágeno que potencialmente tiene un uso biológico. El colágeno pudiera ser cualquier tipo de colágeno de cualquier fuente y pudiera estar presente solo o en combinación con otros materiales. De acuerdo con esto, el colágeno pudiera representar tan poco como 1 % p/p del peso total del biomaterial o tanto como 100%.
El término “colágeno” como se usa en la presente, se refiere a la familia extracelular de proteínas fibrosas que son caracterizadas por su estructura helicoidal de triple filamento, rígida. Tres cadenas de polipéptido de colágeno (“cadenas a”) son enrolladas alrededor una des de otras para formar esta molécula helicoidal. El término también pretende abarcar los diversos tipos de colágeno.
La porción principal de la porción helicoidal de colágeno varía poco entre especies de mamífero. En realidad, una variedad de tipos de colágeno tienen altos grados de homologías de secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, la homología de secuencia de nucleótidos para colágeno alfa I tipo II es al menos 88% cuando se compara con humanos, equmos y murino. Los humanos y equinos tienen 93% de homología de secuencia al nivel de nucleótidos, mientras que el ratón y equino tienen 89% de homología de secuencia. La homología de secuencia de nucleótidos para humano y ratón es 88% (ver, números de acceso NCBI U62528 (equmo), NM033150 (humano) y NM031163 (ratón) http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Otros tipos de colágeno tienen niveles similares de homología de aminoácidos. Por ejemplo, la homología de secuencia de nucleótidos entre colágeno porcino alfa I tipo I y colágeno ovino alfa I tipo I es 90% (ver, números de acceso NCBI AF29287 (ovino) y AF201723 (porcino) http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Dado el nivel de ascendencia y biología común para muchos de los animales anteriores, el alto grado de homología de secuencias de aminoácidos y nucleótidos para colágeno a través de una variedad de especies, tales como ganado, borregos, ratones y cerdos, una persona experta en la téenica apreciaría que los métodos para producir el biomaterial como se describe en la presente son aplicables para material colagenoso aislado a partir de todos los animales mamíferos.
De acuerdo con esto, en algunas modalidades, el biomaterial es aislado o recolectado a partir de un animal de uno de las órdenes de mamífero, es decir, Artiodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Perissodactyla, Carnívora y Marsupiala. El animal es de preferencia un ovino, un bovino, un caprino, un equino, un porcino, un marsupial o un humano. Aunque el biomaterial es de preferencia aislado de la misma especie animal que el receptor, se prevé que el biomaterial pudiera aislarse de una especie diferente al receptor.
De manera alternativa, en algunas modalidades, el biomaterial comprende un tejido cultivado, un tejido reconstituido o similares.
El biomaterial pudiera ser cualquier tipo de tejido celular. Por ejemplo, el tejido celular pudiera ser tejido cardiovascular, tejido de piso pelvico, tejido de corazón, válvula de corazón, raíces aórticas, pared aórtica, valvas aórticas, tejido pericárdico, tejido conectivo, la matriz de órganos suaves o sólidos, tejido dérmico, un tejido vascular, dura madre, cartílago, pericardio, ligamento, vasos sanguíneos de tendón, tejido umbilical, tejido óseo, fascias, y tejido submucoso o piel ya que todos estos comprenden algo de colágeno.
También se apreciará que el biomaterial pudiera comprender además análogos sintéticos formados a partir de polímeros sintéticos, polímeros biológicos purificados, o ambos, incluyendo aquéllos encontrado de manera general en matrices de tejidos naturales. Los polímeros sintéticos adecuados incluyen, por ejemplo, poliamidas y polisulfonas. Los polímeros biológicos pueden ocurrir de manera natural o ser producidos in vitro mediante, por ejemplo, fermentación y similares.
Los polímeros biológicos purificados pueden ser formados aproximadamente en un substrato mediante téenicas tales como tejido plano, tejido de punto, vaciado, moldeo, extrusión, alineación celular y alineación magnética. Los polímeros biológicos adecuados incluyen, sin limitación, colágeno, elastina, seda, queratina, gelatina, poliaminoácidos, polisacáridos (por ejemplo, celulosa y almidón), y copolímeros de cualquiera de éstos. Por ejemplo, los polímeros de colágeno y elastina pueden ser formados en un material ¡mplantable sintético por cualquiera de una variedad de técnicas, tales como tejido y moldeo. Los análogos de tejidos sintéticos imitan una matriz de tejido natural. De manera alternativa, los substratos sintéticos pueden ser usaos para formar un análogo de tejido, ya sea solo o junto con substratos que ocurren de manera natural. Ejemplos no limitantes incluyen polipropileno, ácido pol i láctico , poliéster, nylon, Silicon y similares.
Una vez que el biomaterial ha sido adquirido es reticulado. La reticulación puede utilizar cualquiera de los procedimientos bien conocidos incluyendo, pero no limitados a, aquéllos descritos en Eyre et al., 1984, Annu. Rev. Biochem 537, 717-748; Eyre, 1982, en; Symposium on Heritable Disorders of Connective Tissue (Simposio sobre trastornos hereditables de tejido conectivo) (Akeson et al. Eds) pp. 43-58, Mosby, St. Louis, Missouri; Davison & Brennan, 1983, Connect. Tissue Res. 11 , 135-151 ; Robins, 1982, Methods Biochem. Analysis 28, 330-379; Reiser, 1991 , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 196, 17-29.
Un método preferido de reticulación es descrito en la solicitud de patente internacional W02006/066327 incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Brevemente, un paso inicial en el método preferido para reticular el biomaterial basado en colágeno de la presente invención, comprende contactar el biomaterial con una solución conteniendo alcohol. Como se usa en la presente, el término “contactado” o “contactar” se refiere al paso activo de sumergir el biomaterial basado en colágeno en una solución o agente como se describe aquí, o como se describe infra, subsecuentemente contactar el biomaterial con un gente de reticulación, una solución ácida u otra materia durante un periodo suficiente para producir un resultado deseado. Los metodos para contactar el biomaterial con, por ejemplo, la solución conteniendo alcohol son bien conocidos en la téenica. Por ejemplo, en general, el biomaterial puede ser contactado al atomizar o sumergir el biomaterial en una solución o agente.
El término “alcohol” como se usa en la presente se refiere a cualquier alcohol conocido en la técnica, el cual es capaz de remover o reducir la cantidad de triglicéridos y al menos esterificar parcialmente los grupos carboxilo encontrados en el colágeno. De preferencia, el alcohol es un alcohol soluble en agua. Más preferiblemente, el alcohol es un alcohol inferior de C1-C6 en una solución libre de amortiguador. Aún más preferiblemente, el alcohol es seleccionado del grupo que consiste de metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec-butanol y t-butanol.
Sin desear ligar a una teoría particular o hipótesis, los inventores consideran que la solución conteniendo alcohol ayude a aflojar la triple hélice de colágeno y por ello exponer sitios hidrofóbicos (ver, Karube & Nishida, 1979, Biochim Biophys Acta., 23; 581 (1 ): 106-13). También consideran que los grupos carboxilo y amina encontrados en el colágeno son esterificados en la presencia de la solución conteniendo alcohol, de manera que se vuelven disponibles para reticular en pasos posteriores. Como tal, una solución de alcohol preferida es una que comprende al menos aproximadamente 50% v/v, más preferiblemente al menos aproximadamente 70% v/v y muy preferiblemente al menos aproximadamente 80% v/v de alcohol a solución acuosa libre de amortiguador. En una modalidad, la solución de alcohol es 70% etanol v/v en solución salina a 0.9% (conteniendo 0.5 mM PMSF).
En algunas modalidades, la solución conteniendo alcohol, así como otras soluciones y reactivos usados en la presente son “libres de amortiguador”, como se formula la hipótesis de que los agentes reticulantes conteniendo aldehido reaccionan con el amortiguador durante la fijación provocando de polimerización el aldehido.
El paso de contactar el biomaterial a la solución conteniendo alcohol puede ser realizado durante un lapso de tiempo tan largo como sea suficiente para hacer al biomaterial resistente a calcificación patogenica in vivo y que la mayoría (es decir, un alto porcentaje) de los grupos carboxilo y amina encontrados en el colágeno son esterificados. De preferencia, el biomaterial permanece en contacto con la solución conteniendo alcohol durante tiempo suficiente para permitir que el alcohol se difunda y permee hacia el biomaterial y más preferiblemente, el biomaterial es expuesto a la solución conteniendo alcohol durante al menos 24 horas, aún más preferiblemente al menos 36 horas y muy preferiblemente, al menos 48 horas.
Una vez que el biomaterial basado en colágeno ha sido expuesto a alcohol, éste es removido. En algunas modalidades, el biomaterial es enjuagado después de la exposición a alcohol en una solución de enjuague que comprende una solución libre de fosfato de solución salina al 0.9% v/v. Sin embargo, cualquier solución fisiológicamente aceptable o amortiguada puede ser usada como una solución de enjuague. El propósito de la solución de enjuague es principalmente remover el exceso de alcohol y como tal no es crítica.
Después de que el biomaterial basado en colágeno ha sido expuesto a alcohol por más de 24 horas, se pone en contacto con un o más agentes reticulantes, especialmente agentes reticulantes bifuncíonales. El término “bifuncional” como se usa en la presente, se refiere a los dos grupos aldehido funcionales, presentes en ambos extremos de la cadena de cinco carbonos. La reticulación puede ser experimentada por cualquier téenica conocida en la técnica, con cualquier forma de agente reticulante siempre y cuando sea capaz de reticular colágeno. Los agentes reticulantes, incluyen pero no están limitados a, compuestos achantes, cloruro de adipilo, aldehidos, haluros de alquilo y arilo, bisimidatos, carbodiimidas, divinil sulfona (DVS), formaldehído, glutaraldehido, glioxal, hexametilen diisocianato, hiroxicloruro, hidroxietil metacrilato divinil sulfona (HEMA-DIS-HEMA), imidoésteres, isocianatos, luz (por ejemplo, luz azul y luz UV), N-hidroxisuccinimida, maleimidas N-substituidas, pH, polialdehído, difenilfosforil azida (DPPA), compuestos poliepóxidos comprendiendo esqueleto de 17-25 carbonos y 4-5 grupos epoxi, poliepoxi éteres, polietilenglicol divinil sulfona (VS-PEG-VS), poliglicerol poliglicidil éter y temperatura y combinaciones de los mismos.
En algunas modalidades, el agente reticulante es un agente reticulante químico, tal como carbodiimida, poliepoxi éteres, divinil sulfona (DVS), genipina, glutaraldehido, formaldehído y difenilfosforil azida (DPPA).
También se ha demostrado que los compuestos de poliepoxi comprendiendo esqueleto de 17-25 carbonos y 4-5 grupos epoxi muestran una alta eficiencia para el colágeno reticulante (ver, por ejemplo, solicitud de patente estadounidense no. 20040059430 (S/N 10/618,447). También se ha mostrado que la toxicidad de compuestos de poliepoxi es menor que aquélla de glutaraldehído, y la antigenicidad o inducción de respuesta inmune de tejidos disminuye en proporción del tiempo de reacción, en el caso de reaccionar con moléculas de polipéptidos helicoidales, tal como colágeno. De manera natural, muestra biocompatibilidad relativamente buena (ver, por ejemplo, Lohre et al., (1992), Artif. Organs, 16:630-633; Uematsu et al., (1998), Artif. Organs, 22:909-913). En consecuencia, los compuestos de poliepoxi como se describe son un agente reticulante preferido.
En algunas modalidades, el agente reticulante comprende aproximadamente 1 % de glutaraldehído y el lapso de exposición es al menos aproximadamente 24 horas. Se apreciará que el lapso para exposición del biomaterial al agente reticulante y depende agente usado, la concentración y la temperatura. Normalmente, el lapso de exposición está entre 24 horas y 28 días. La determinación de la cantidad precisa de tiempo de exposición para el biomaterial al agente reticulante está dentro del alance de una persona experta en la téenica.
Nuevamente, sin desear ligar a una teoría o hipótesis particular, los inventores consideran que al exponer el biomaterial basado en colágeno que ha sido expuesto a alcohol a un agente reticulante, los grupos de carboxilo esterificados y grupos amina sobre el colágeno presentes en el biomaterial son reticulados.
Aunque se apreciará por aquéllos expertos en la téenica que la temperatura a la cual cada uno de los pasos del método de reticulación preferido es realizado no es crítico, se entenderá que de preferencia, la temperatura está entre 2°C y 40°C, más preferiblemente, entre 4°C y 30°C y muy preferiblemente, entre 5°C y 25°C.
Nuevamente, después del paso de reticulación, el biomaterial basado en colágeno es de preferencia enjuagado en solución de enjuague, de manera que después del paso de exposición a alcohol (a). Sin embargo, nuevamente será apreciado que el paso de enjuague es meramente un prefermento.
Siguiendo el paso de reticulación, o si se utiliza, el paso de enjuague después del paso de reticulación, el biomaterial basado en colágeno puede ser esterilizado para uso mediante los métodos descritos en al presente. De manera alternativa, el biomaterial basado en colágeno es contactado con una solución ácida conteniendo cualquier ácido capaz de inactivar y/o modificar las porciones de agente reticulante fijas y/o no fijas presentes en el biomaterial después del paso (b) para remover o reducir sitios de unión de calcio disponibles. De manera alternativa, o adicional, la solución ácida usada en el paso (c) contiene cualquier ácido capaz de reticular adicionalmente los grupos carboxilo activado con los grupos amina activados sobre el colágeno para formar enlaces de amida.
De preferencia, la solución ácida comprende al menos un ácido aminocarboxílico. El término “ácido aminocarboxílico” como se usa en la presente es cualquier ácido teniendo al menos un grupo amino y al menos un substituyente de ácido carboxílico. Ejemplos representativos de ácidos aminocarboxílicos que son útiles en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, L-glutamato, L-aspartato, L-lisina, L-arginina, L-histidina. El propósito de la solución ácida es doble: primero, el ácido aminocarboxílico ayuda en la inactivación y/o modificación de las porciones de agente reticulante fijas y no fijas, reduciendo o mejorando por ello cualquier efecto biológico adverso. En segundo lugar, el ácido aminocarboxílico retícula además los grupos carboxilo activados con los grupos amina activados sobre el colágeno para formar enlaces de amida sobre el colágeno apara formar enlaces de amida.
La concentración del ácido aminocarboxílico dependerá del ácido real usado y otros parámetros, tal como masa total del biomaterial usado y similares. Además, una proporción en peso húmedo mínima de ácido aminocarboxílico a biomaterial sería aproximadamente 1 :4. El aspecto más importante de la solución ácida es el pH. El pH debe estar por abajo de pH7, de preferencia por debajo de pH6, más preferiblemente por debajo de pH5 y muy preferiblemente por debajo de aproximadamente pH4.6.
En una modalidad, la solución ácida es 8 mg de ácido aminocarboxílico por mililitro de agua deionizada, la cual está libre de fosfato y aproximadamente pH4.
El biomaterial basado en colágeno reticulado es expuesto al ácido aminocarboxílico durante al menos 6 horas, más preferiblemente al menos 24 horas, aún más preferiblemente más de 48 horas. Aunque la temperatura de incubación no es crítica, es preferible entre 5°C y 55°C, más preferiblemente entre 10°C y 45°C, muy preferiblemente 45°C.
En algunas modalidades, el paso (c) del metodo reticulante descrito es reemplazado por o complementado con un método para inhibir la formación de metaloproteinasa sobre moléculas de elastina presentes en el biomaterial. Específicamente, en tejido tal como tejido aórtico un mayor porcentaje de elastina está presente que en otro tejido. Estas moléculas de elastina pueden proporcionar sitios para la formación de metaloproteinasa ya que tales sitios necesitan ser reducidos, removidos o inactivados.
El biomaterial basado en colágeno reticulado, antes o después del paso de exponer el biomaterial a la solución ácida y/o solución libre de amortiguador conteniendo un catión multi-valente, es nuevamente enjuagado de preferencia en solución de enjuague. El biomaterial basado en colágeno reticulado es entonces esterilizado.
El paso de esterilizar el biomaterial comprende contactar el biomaterial basado en colágeno reticulado con una solución de esterilización comprendiendo entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno e incubar dicho biomaterial entre 30°C y 55°C por más de 48 horas; con la condición de que la solución de esterilización no incluye alcohol.
Se apreciará que el alcohol, especialmente etanol y/o isopropanol no es usado en la solución de esterilización de la presente invención.
Ha sido bien establecido que a temperaturas elevadas, por ejemplo, por arriba de 55°C, el colágeno experimenta degradación intracelular. En realidad, se ha mostrado que el colágeno dentro de fibroblastos de piel humana comienza a experimentar degradación incrementada a temperaturas por arriba de 41 °C (Palotie, 1983, Coll Relat Res. Mar; 3(2): 105-13). Así, al esterilizar el biomaterial basado en colágeno reticulado de la presente invención, la temperatura de incubación es un factor crítico. La temperatura de preferencia no es mayor que 55°C ya que esto aumenta la posibilidad de que el colágeno comience a degradarse. Sin embargo, como se describe en el Ejemplo 9 y en otra parte, es importante que la temperatura de incubación no es menor que 30°C, como las temperaturas menores que 30°C han reducido el potencial de esterilización.
Se apreciará por personas expertas en la téenica que las concentraciones de óxido de propileno por debajo de 3% no proporcionarían suficiente esterilización como se define en la presente. Las concentraciones de óxido de propileno por arriba de 6% son tóxicas y tienen un efecto adverso sobre la integridad del biomaterial. En algunas modalidades, la solución de esterilización comprende entre 3.8% y 4.5% de óxido de propileno. En otras modalidades, la solución de esterilización comprende aproximadamente 4% de óxido de propileno. En algunas modalidades, la solución de esterilización consiste esencialmente de entre 3% y 6% de óxido de propileno, más preferiblemente la solución de esterilización consiste de entre 3% y 6% de óxido de propileno. En algunas modalidades, la solución de esterilización consiste esencialmente de entre 3.8% y 4.5% de óxido de propileno, más preferiblemente la solución de esterilización consiste de entre 3.8% y 4.5% de óxido de propileno. En algunas modalidades, la solución de esterilización consiste esencialmente de aproximadamente 4% de óxido de propileno, más preferiblemente la solución de esterilización consiste de aproximadamente 4% de óxido de propileno.
El término “aproximadamente” como se usa en la presente, se refiere a una desviación en el valor que sigue el término por 10% por arriba o por abajo. Por ejemplo, la referencia a aproximadamente 4% de óxido de propileno incluye rangos entre 3.6% y 4.4%, es decir, 10% por abajo o por arriba del valor de 4%. Esto incluye 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1 %, 4.2%, 4.3% y 4.4% de óxido de propileno.
Es un requerimiento que el paso de esterilización sea realizado por más de 48 horas; sin embargo, como se describe en la presente el óxido de propileno también puede ser usado como un medio de almacenamiento y como tal el paso de esterilización puede ser realizado por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 días o más.
Un beneficio mayor de los métodos descritos en la presente es que la solución de esterilización usada en la presente, es decir, entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno no solo esterilizará el tejido conteniendo colágeno sin afectar las fibrillas de colágeno, sino que el óxido se convierte después de aproximadamente 4 días que está en contacto con el biomaterial a propilenglicol (el cual no es tóxico, el biomaterial basado en colágeno reticulado esterilizado puede permanecer en la solución de esterilización mucho después de las 48 horas iniciales. En realidad, se prevé que el biomaterial basado en colágeno reticulado será esterilizado y almacenado y entonces embarcado en el mismo recipiente al cliente final sin la necesidad de manejo adicional.
El término “esterilización” como se usa en la presente, significa que el biomaterial basado en colágeno reticulado satisface los requerimientos bajo ISO 14160. ISO 14160 cubre la esterilización de productos para el cuidado de la salud y pertenece a agentes esterilizantes químicos líquidos para dispositivos médicos de uso simple utilizando tejidos animales y sus derivados. Brevemente, el ISO 14160 requiere tejidos a ser inoculados con esporas de B. subtilis y entonces se tratan para remover la contaminación. Los requerimientos para ensayos de ISO 14160 son descritos en el Ejemplo 6 supra.
En algunas modalidades, la solución de esterilización está libre de amortiguador. En otras modalidades, la solución comprende agua deionizada.
El biomaterial basado en colágeno reticulado, después del tratamiento con los métodos descritos en la presente, tiene un alto nivel de resistencia a la calcificación, es decir, es un “biomaterial resistente a calcificación”. El término “calcificación” como es usado en la presente se refiere a uno de los principales problemas patológicos asociados con biomaterial tradicionalmente producido comprendiendo proteínas de tejido conectivo (es decir, colágeno y elastina). Se ha mostrado previamente que estos materiales pueden volverse calcificados siguiendo implantación dentro del cuerpo. Tal calcificación puede resultar en rigidez o degradación indeseables del biomaterial. Dos (2) tipos de calcificación; intrínseca y extrínseca son conocidos por ocurrir en biomaterial colagenoso fijo, aunque el o los mecanismos exactos por los cuales tal calcificación ocurre son desconocidos. La calcificación intrínseca es caracterizada por la precipitación de iones de calcio y fosfato dentro del tejido bioprotesico fijo, incluyendo la matriz de colágeno y células remanentes. La calcificación extrínseca es caracterizada por la precipitación de iones de calcio y fosfato dentro de trombo adherente, incluyendo células adherentes (por ejemplo, plaquetas) al biomaterial y el desarrollo de placas de superficie conteniendo fosfato de calcio sobre el biomaterial.
En consecuencia, la frase “alto nivel de resistencia a calcificación” o “resistente a calcificación” cuando se aplica al biomaterial de la presente invención significa que el biomaterial, después de implantación in vivo durante al menos 200 días, muestra menos de 50 mg, de preferencia menos de 20 pg, e incluso aún más preferiblemente menos de 10 mg de calcio por mg de tejido seco después de su remoción.
De preferencia, el biomaterial de la presente invención también es resistente a degradación enzimática. El término “resistente a degradación enzimática” como se usa en la presente se refiere a la capacidad del biomaterial de la presente invención para soportar la degradación enzimática a un nivel comparable con tejido fijo tradicional.
Una vez formado, el biomaterial basado en colágeno reticulado esterilizado de la presente invención puede ser usado entonces para tratar una variedad de condiciones y/o desórdenes.
En general, los términos “tratar”, “tratamiento y similares son usados en la presente para significar afectar un individuo o animal, su tejido o células para obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto es especialmente terapeutico en términos de una cura parcial o completa de una condición y/o desorden. “Tratar” como se usa en la presente, cubre cualquier tratamiento de una condición y/o desorden en un vertebrado, un mamífero, en particular un humano, e incluye: (a) inhibir la condición y/o desorden, es decir, detener su desarrollo; o (b) aliviar o mejorar los síntomas de la condición y/o desorden, es decir, provocar la regresión de los síntomas de la degradación/condición enzimática y desorden.
Los términos “condición” y/o “desorden” son usados en la presente de manera intercambiable y se refieren a condiciones anormales que afectan animales, incluyendo humanos, los cuales pueden ser tratados usando el biomaterial de la presente invención. De acuerdo con esto, el tratamiento de una herida, una lesión, degeneración de tejido, una infección microbiana, una quemadura, una úlcera, condición dérmica es incluida en la presente invención. Más aún, el reemplazo de válvulas de corazón, raíces aórticas, pared aórtica, valvas aórticas, tejido pericárdico, tejido conectivo, dura madre, tejido dérmico, un tejido vascular, cartílago, pericardio, ligamentos, vasos sanguíneos de tendón, tejido umbilical, tejido óseo, fascias y tejido submucoso también son abarcados.
El biomaterial resistente a calcificación de la presente invención también puede ser aplicado a cualquiera de una amplia variedad de superficies de contacto de dispositivos médicos. Las superficies de contacto incluyen, pero no están limitadas a, superficies que pretenden contactar sangre, células u otros fluidos corporales o tejidos de un animal, incluyendo específicamente un humano. Las superficies de contacto adecuados incluyen una o más superficies de dispositivos medicos que son pretendidos para contactar sangre u otros tejidos. Los dispositivos médicos incluyen bobinas de aneurisma, vasos sanguíneos artificiales, corazones artificiales, válvulas artificiales, riñones artificiales, tendones y ligamentos artificiales, bolsas de sangre, oxigenadores de sangre, reemplazos de hueso y cardiovasculares, prótesis de hueso, ceras de hueso, injertos cardiovasculares, dispositivos de reemplazo de cartílago, catéteres, lentes de contacto, recipientes para cultivo de células y tejido y regeneración, partículas de embolización, sistemas de filtración, injertos, canales de guía, catéteres de residencia, instrumentos de laboratorio, microperlas, guías de crecimiento de nervios, implantes oftálmicos, implantes ortopédicos, cables de marcapasos, sondas, protésicos, derivaciones, stents, soportes para péptidos, instrumentos quirúrgicos, suturas, jeringas, reemplazos de tracto urinario, coberturas de heridas, vendas de heridas, dispositivos de curación de heridas y otros dispositivos médicos conocidos en la téenica.
Otros ejemplos de dispositivos médicos que se beneficiarían de la aplicación de la presente invención serán fácilmente evidentes para aquéllos expertos en la técnica de procedimientos quirúrgicos y médicos y son contemplados por lo tanto para la presente invención. La superficie de contacto puede incluir una malla, bobina, alambre, balón inflable o cualquier otra estructura que sea capaz de ser implantada en una ubicación objetivo, incluyendo ubicaciones intravasculares, ubicaciones intralumenales, ubicaciones dentro de tejido sólido y similares. El dispositivo implantable puede ser pretendido para implantación permanente o temporal. Tales dispositivos pueden ser entregados por o incorporados en cateteres intravasculares y otros catéteres médicos.
El proceso de recubrir las superficies de tales dispositivos puede ser realizado mediante la téenica de recubrimiento de plasma, como se describe en la solicitud de patente internacional no. W096/24392.
Por “comprender” se quiere decir que incluye, pero no está limitado a, lo que sea que sigue la palabra comprender. Así, el uso del término “comprender” indica que los elementos listados son requeridos u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes. Por “consistir de” quiere decir que incluye, y limitado a, lo que sea que sigue la frase “consistir de”. Así, la frase “consistir de” indica que los elementos listados son requeridos u obligatorios, y que ningún otro elemento puede estar presente. Por “consistir esencialmente de” quiere decir que incluye cualquier elemento listado después de la fase, y limitado a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos listados. Así, la frase “consistir esencialmente de” indica que los elementos listados son requeridos u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar presentes o no dependiendo de si afectan o no la actividad o acción de los elementos listados.
La invención será descrita ahora adicionalmente a manera de referencia solamente a los siguientes ejemplos no limitantes. Sin embargo se debería entender que los ejemplos que siguen son ilustrativos solamente, y no deberían ser tomados en manera alguna como una restricción sobre la generalidad de la invención descrita antes.
Ejemplo 1 : Procesamiento básico y almacenamiento de biomaterial Recolección de un biomaterial derivado de colágeno Los corazones porciones de cerdos adultos son recolectados a en un matadero local y transportados al laboratorio en empaquetes de hielo dentro de 2-4 horas de la muerte. Los corazones fueron lavados dos veces en solución salina al 0.9% v/v helada y limpiados cuidadosamente de grasa adherente y tejido conectivo suelto. Las raíces aórticas con las válvulas aórticas fueron disecadas de los corazones y colocadas en fO.9% v/v solución salina/fenil-metil-sulfonil-fluoruro (PMSF) helada y las raíces aórticas de válvula se lavaron durante 20 minutos en la solución salina al 0.9% v/v conteniendo PMSF. Las valvas fueron removidas del orificio de válvula aórtica y almacenadas en solución salina al 0.9% v/v helada.
Reticulación (fijación) del biomaterial Se preparó una solución de glutaraldehído al 0.625% v/v conteniendo 9.07 g/l de amortiguador de di-hidrógeno fosfato de potasio en agua deionizada esteril. El pH de la solución de glutaraldehído fue ajustado a 7.4 con hidróxido de sodio. Las valvas aórticas fueron reticuladas en la solución de glutaraldehído a 1 -5°C durante un periodo mínimo de 5 días para proteínas de reticulación presentes en el colágeno de los tejidos.
Enjuagar el biomaterial reticulado Las valvas aórticas fueron removidas de la solución de glutaraldehído y enjuagadas en un cloruro de sodio al 0.9% v/v estéril durante aproximadamente 15 minutos. Durante el periodo de enjuague, la temperatura de la solución de enjuague se mantuvo a aproximadamente 10°C.
Esterilización final y almacenamiento del biomaterial Las valvas aórticas porcinas fueron sumergidas en una solución v/v al 2.0% de glutaraldehído conteniendo 29.02 g/l de amortiguador de di-hidrogeno fosfato de potasio en agua deionizada estéril. El pH de la solución de aldehido fue ajustado a 7.4 con hidróxido de sodio. El proceso de esterilización fue realizado a aproximadamente 25°C durante 5 días. Los tejidos esterilizados fueron divididos en cuatro grupos y almacenados en: (i) 0.625% v/v glutaraldehído, (ii) 5.0% v/v glutaraldehído, (iii) 10% v/v glutaraldehído; y (iv) 2% v/v óxido de propileno hasta su uso adicional.
Ejemplo 2: Efecto de solución de almacenamiento en el perfil de calcificación de biomaterial Estudios experimentales en modelos de animales pequeños y grandes fueron conducidos para valorar la efectividad del proceso de esterilización-almacenamiento antes descrito para mitigar la calcificación de biomateriales conteniendo colágeno tratados.
En el primer estudio animal, las valvas aórticas porcinas esterilizadas y almacenadas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 fueron usadas para valoración en un modelo de animal pequeño.
Las valvas aórticas porcinas esterilizadas y almacenadas para los cuatro grupos fueron enjuagadas en solución salina al 0.9% v/v durante 5 minutos. Los tejidos enjuagados fueron implantados quirúrgicamente en bolsillos subcutáneos (una muestra de cada grupo por rata), creados en el área de pared abdominal central de ratas Wistar macho en crecimiento (6 semanas de edad). Estos tejidos fueron removidos después de 60 días, el tejido huésped removido y las muestras se secaron en un incubador BiothermMR (Marcus Medical, JHB, RSA) a 90°C durante 48 h. Las muestras secas fueron pesadas, y el contenido de calcio se extrajo en 5.0 mi de ácido clorhídrico ultrapuro 6 N (Merck, JHB, RSA) a 75°C durante 24 h. El contenido de calcio extraíble fue medido entonces usando un espectrofotómetro de absorción atómica (Varían AA1275) y se expresó como mg de calcio por mg de tejido (peso seco). Estos datos son resumidos en la Tabla 1. Los resultados (pg de calcio por mg de tejido seco) se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1 Ejemplo 3: Efecto de solución de esterilización y almacenamiento sobre el perfil de calcificación de biomaterial Recolección de un biomaterial derivado de colágeno En el segundo estudio animal, las valvas aórticas porcinas fueron recolectadas y aisladas de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1. Las valvas aórticas porcinas aisladas fueron divididas en tres grupos. El Grupo I recibió un tratamiento de reticulación típico (control); el Grupo II recibió un método propietario de reticulación (ver W02006/066327 incorporado en la presente por referencia); y el Grupo III recibió el mismo tratamiento de reticulación como el Grupo II, pero esto fue seguido por la ubicación del biomaterial reticulado con una solución de esterilización comprendiendo aproximadamente 4% v/v óxido de propileno e incubando el biomaterial entre 30°C y 55°C por más de 48 horas.
Reticulación (fijación) de las valvas aórticas En el grupo I, valvas aórticas porcinas fueron reticuladas en una solución de glutaraldehído al 0.625% conteniendo 9.07 g/l de amortiguador di-hidrógeno fosfato de potasio en agua deionizada, esteril fue preparada. El pH de la solución de glutaraldehído fue ajustado a 7.4 con hidróxido de sodio. Las valvas aórticas fueron reticuladas en la solución de glutaraldehído a 1 -5°C durante un periodo mínimo de 5 días para reticular proteínas presentes en el colágeno de los tejidos.
En el grupo II y III, se preparó una solución conteniendo alcohol soluble en agua de 60-80% v/v en volumen de alcohol etanol. Las valvas aórticas porcinas fueron sumergidas en la solución de alcohol después durante almacenamiento durante la noche a 4°C. Las raíces aórticas de válvulas fueron sumergidas en la misma solución de alcohol justo después del lavado final en solución salina al 0.9% v/v helada (conteniendo 0.5mM PMSF). Las valvas aórticas porcinas fueron mantenidas en la solución de alcohol a aproximadamente 5°C durante un mínimo de 24 horas.
Las valvas aórticas porcinas fueron removidas de la solución de alcohol y se enjuagaron durante aproximadamente 10 minutos con 0.9% v/v de solución salina. Durante el periodo de enjuague, la temperatura de la solución de enjuague fue mantenida a aproximadamente 10°C.
Las valvas aórticas fueron sumergidas en una solución 0.625% v/v de glutaraldehído conteniendo 9.07 g/l de amortiguador de di-hidrógeno fosfato de potasio en agua deionizada estéril. El pH de la solución de glutaraldehído se ajustó a 7.4 con hidróxido de sodio. El pericardio y las raíces aórticas de válvulas se fijaron en la solución de glutaraldehído a 1 -5%°C durante un periodo mínimo de 24 horas para reticular proteínas presentes en el colágeno de los tejidos.
Las valvas porcinas fueron removidas de la solución de glutaraldehído y se enjuagaron en 0.9% v/V cloruro de sodio estéril durante aproximadamente 15 minutos. Durante el periodo de enjuague, la temperatura de la solución de enjuague se mantuvo a aproximadamente 10°C.
Las valvas aórticas porcinas fueron sumergidas entonces en una solución libre de amortiguador conteniendo 8 mg de ácido dicarboxílico por 1 mi de volumen de agua deionizada. El pH de la solución se ajustó a un pH de 4.5 con un volumen de ácido clorhídrico diluido. El pericardio y las raíces aórticas de válvulas fueron sumergidos en la solución a una temperatura de aproximadamente 45°C durante aproximadamente 48 horas.
Esterilización y almacenamiento final del biomaterial Las valvas aórticas porcinas fueron esterilizadas y almacenadas entonces ya sea al: (i) sumergir el tejido una solución de glutaraldehído al 0.25% v/v conteniendo 9.07 g/l de amortiguador de di-hidrógeno fosfato de potasio en agua deionizada estéril. El pH de la solución de aldehido fue ajustado a 7.4 con hidróxido de sodio. El proceso de esterilización se realizó a una temperatura de aproximadamente 45°C durante aproximadamente 120 minutos (Tratamiento A); o (ii) las valvas aórticas porcinas fueron esterilizadas en una solución acuosa comprendiendo 4% v/v óxido de propileno en paso combinada con 20% v/v alcohol etílico a 37°C durante aproximadamente 24 horas y almacenada en una solución de óxido de propileno al 4% v/v (Tratamiento B - presente invención).
Las valvas aórticas porcinas esterilizadas y almacenadas de los tres grupos fueron enjuagadas en 0.9% v/v solución salina durante 5 minutos. Los tejidos enjuagados fueron implantados quirúrgicamente en bolsillos subcutáneos (una muestra de cada grupo por rata), creados en el área de pared abdominal central de ratas Wistar macho en crecimiento (6 semanas de edad). Estos tejidos fueron removidos después de 60 días, el tejido huésped fue removido y las muestras se secaron en un incubador BiothermMR (Selby Scientific, Perth, WA) a 90°C durante 48 h. Las muestras secas fueron pesadas, y el contenido de calco fue extraído en 5.0 mi de ácido clorhídrico ultrapuro 6 N (Merck, Sidncy, Australia) a 75°C durante 24 h. El contenido de calcio extraíble fue medido entonces usando un espectrofotómetro de absorción atómica (Varían AA1275) y se expresó como mg de calcio por mg de tejido (peso seco). Los resultados (pg Calcio por mg de tejido seco) se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2 Ejemplo 4: Efecto de tratamiento B sobre perfil de calcificación de pericardio bovino En un tercer estudio animal, el potencial de calcificación de pericardio bovino preparado, reticulado y almacenado de acuerdo con los tejidos en el Ejemplo 3 (0.625% glutaraldehído amortiguador, Tratamiento A + 0.2% glutaraldehído y Tratamiento B 4% v/v óxido de propileno) se comparó con el potencial de calcificación de pericardio bovino comercial (pericardio de Hancock) almacenado en una solución de 0.2% glutaraldehído.
Muestras representativas de cada grupo fueron recortadas a tamaño de 1 x 1 cm y se enjuagaron en 0.95% v/v solución salina durante 5 minutos. Estas muestras fueron implantadas quirúrgicamente en bolsillos subcutáneos, creados en el área de pared dorsal central de ratas Wistar macho en crecimiento (6 semanas de edad). Estos tejidos fueron removidos después de 60 días, el tejido huésped fue removido y el contenido de calcio fue determinado mediante espectrofotometría de absorción atómica. Los resultados (pg de calcio por mg de tejido seco) son resumidos en la Tabla 3.
Tabla 3 Ejemplo 5: Efecto de tratamiento B sobre perfil de calcificación de tejido de válvula aórtica porcina (valvas & pared aórtica) en un modelo de animal grande En el cuarto estudio animal, el potencial de calcificación de tejido de válvula aórtica porcina (valvas y pared aórtica) preparado, reticulado en 0.625% glutaraldehído amortiguado y almacenado en (i) 0.625% glutaraldehído, (ii) tratado con Tratamiento A (0.625 % glutaraldehído) y (iii) tratado con Tratamiento B (4% óxido de propileno).
Muestras representativas de cada grupo fueron recortadas en tamaño con forma oval de aproximadamente 1.2 x 1 cm y enjuagadas en 0.9% solución salina durante 5 minutos. Estas muestras fueron implantadas quirúrgicamente en la vena yugular de borres jóvenes (peso corporal 22-25 kg). Estos tejidos fueron removidos después de 150 días, el tejido huésped fue removido y el contenido de calcio fue determinado mediante espectrofotometría de absorción atómica. Los resultados (pg de calcio por mg de tejido seco) son resumidos en la Tabla 4-A (valvas) y Tabla 4-B (pared aórtica).
Tabla 4-A (valvas) Tabla 4-B (pared aórtica) Ejemplo 6: Validación: esterilización de válvula cardíaca comercial inoculada con esporas de Bacillus subtilis Esta validación se realizó para probar la factibilidad de esterilizar tejido de válvula cardíaca comercial con 4% óxido de propileno después de 48 horas a 45°C. El propósito de este estudio de factibilidad fue investigar si 3.8% de óxido de propileno (como un nivel de concentración del “peor-caso”) es capaz de esterilizar tejido X de válvulas cardíacas comerciales bajo condiciones del “peor-caso” (contaminación con esporas de Bacillus subtilis) prescritas por regulaciones de la FDA. Las condiciones de prueba fueron: • Las válvulas fueron removidas del 0.5% glutaraldehído y enjuagadas en un total de 10000 mi de agua destilada esteril para un total de 6 min.
• El sostén de válvula y la válvula fueron separados asépticamente y entonces se secaron durante aproximadamente 30 min o hasta que fueron visiblemente secos.
• El sostén de válvula y la válvula de cada dispositivo fueron inoculados entonces con un total de 20 mI de una suspensión de Bacillus subtilis obtenidas de STERIS Corporation, US. La suspensión contenía 1.25 x 106 esporas.
• Se permitió entonces que las válvulas se secaron durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente.
• Los dispositivos fueron entonces reensamblados según receptor y colocados en un tarro estéril.
• Para diez dispositivos, se adicionaron 160 mi de óxido de propileno al 3.8% recién preparado.
• Al dispositivo final, se adicionaron 160 mi de medio de digestión de caseína de soya (SCDM). Esto fue el control positivo para valorar la viabilidad de la suspensión de esporas. El control positivo fue incubado a 32°C durante 48 horas.
• Las diez válvulas de prueba fueron incubadas entonces a 42°C durante 44 horas.
• Siguiendo la incubación, se realizó una prueba de esterilidad en cada válvula.
• Las válvulas fueron separadas y cada componente fue transferido a un tarro estéril vacío, al cual se adicionó SCDM.
• Los tarros fueron incubados entonces a 32°C durante 14 días.
• Los tarros fueron examinados diariamente por signos de turbidez.
Detalles de prueba: Número de laboratorio: 7343042W Método: Método de acuerdo con la prueba para esterilidad, Apéndice XVI, Farmacopea británica, 2010 y procedimiento de Instalación de Prueba Farmacéutica MB:PT:0110.
Tabla 5 Efecto 7: Efecto de tratamiento B sobre perfil de calcificación de tejido de válvula cardíaca comercial (tejido pericárdico bovino) en un modelo de animal pequeño La tabla 6 muestra los resultados de un qumto estudio animal, en el cual el potencial de calcificación de pericardio bovino reticulado y esterilizado en 0.625% v/v glutaraldehído (el cual sirvió como un control de referencia - marcado A) fue comparado con el tejido de válvula cardíaca comercial (pericardio bovino, reticulado y almacenado de acuerdo con un protocolo propietario comercial, el cual es 0.625% v/v reticulación de glutaraldehído amortiguado + almacenamiento de formaldehído - marcado B) y el mismo tejido de válvula cardíaca comercial esterilizado a 45°C durante 48 horas en 4% v/v óxido de propileno y almacenado en 4% v/v solución de óxido de propileno - marcado C.
Las muestras representativas de cada grupo fueron recortadas a 1 x 1 cm de tamaño y enjuagadas en 0.9% v/v solución salina durante 5 minutos. Estas muestras fueron quirúrgicamente implantadas en los bolsillos subcutáneos, creados en el área de pared dorsal central de ratas Wistar macho en crecimiento (6 semanas de edad). Estos tejidos fueron removidos después de 8, 16 y 24 semanas, el tejido huésped fue removido y el contenido de calcio fue determinado mediante espectrofotometría de absorción atómica. Los resultados (pg de calcio por mg de tejido seco) son resumidos en la Tabla 6.
Tabla 6 Ejemplo 8: Efecto de tratamiento B sobre perfil de calcificación de tejido de válvula cardíaca comercial (tejido pericárdico bovino) en un modelo de calcificación in vitro rápido En una valoración experimental, el potencial de calcificación de tejido de válvula comercial (tejido de control) se comparó con tejido de válvula cardíaca comercial esterilizada a 45°C durante 48 horas en 4% de óxido de propileno y almacenada en 4% de solución de óxido de propileno (tejido tratado) en un modelo de calcificación in vitro rápido.
Las válvulas cardíacas comerciales con stent (control y tratadas) fueron montadas en un probador de fatiga Rowan Ash y expuestas a una solución fisiológica (con un alto contenido de calcio/fosfato) durante flujo acelerado (400 ciclos de prueba por minuto) hasta 50 millones de ciclos.
Después de 50 millones de ciclos de prueba, las válvulas cardíacas fueron removidas y una muestra de tejido representada fue tomada para histología. El tejido restante de cada una de las tres valvas en cada válvula fue removido y el contenido de calcio fue determinado mediante espectrofotometría de absorción atómica. Los resultados (pg de Calcio por mg de tejido seco) son resumidos en la Tabla 7.
Tabla 7 Ejemplo 9: Efecto de esterilización y tejido de metodología de almacenamiento inoculado con esporas de B. subtilis Las Figuras 1 y 2 muestran el efecto de 2% v/v y 4% v/v óxido de propileno a temperaturas variantes entre 15°C y 45°C sobre esporas de B. subtilis. Las condiciones experimentales usadas son descritas en el Ejemplo 6. Esencialmente, puede verse que ninguna solución de esterilización (2% o 4%) tiene poco efecto de esterilización antes de 48 horas. También puede verse a partir de la Figura 2 que dentro de 48 horas, el efecto de incrementar la temperatura tiene un profundo efecto sobre la esterilización. Por ejemplo, a una temperatura de 40°C y por arriba hubo esterilización después de 24 horas y que por 48 horas hubo esterilización incluso a temperaturas de 25°C y por arriba. La Figura 1 muestra que con el fin de obtener esterilización con 2% v/v óxido de propileno, el tejido necesita ser incubado durante al menos 6 días a temperaturas por arriba de 35°C. Incluso incubación durante 10 días a 15 a 20°C no tiene efecto material sobre esterilización con 2% v/v de óxido de propileno.
Así, puede verse a partir de las Figuras 1 y 2 que la esterilización óptima es obtenida al incubar el tejido con una solución de 4% v/v óxido de propileno e incubar el tejido a aproximadamente 45°C por más de 48 horas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para esterilizar un biomaterial basado en colágeno reticulado comprendiendo contactar dicho biomaterial basado en colágeno reticulado con una solución de esterilización comprendiendo entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno e incubar dicho biomaterial entre 30°C y55°C por más de 48 horas; con la condición de que la solución de esterilización no incluye alcohol.
2. El método de la reivindicación 1 , en donde la temperatura de incubación está entre 35°C y 50°C.
3. El método de la reivindicación 1 , en donde la temperatura de incubación es aproximadamente 45°C.
4. El método de la reivindicación 1 , en donde la temperatura de incubación después de 48 horas es reducida a temperatura ambiente.
5. El método de la reivindicación 1 , en donde la solución de esterilización comprende entre 3.8% y 4.5% v/v de óxido de propileno.
6. El método de la reivindicación 1 , en donde la solución de esterilización comprende aproximadamente 4% v/v de óxido de propileno.
7. El método de la reivindicación 1 , en donde el paso de esterilización es realizado durante 2 a 10 días o más.
8. El método de la reivindicación 1 , en donde el biomaterial basado en colágeno es aislado de un animal seleccionado del grupo que consiste de un ovino, un bovino, un caprino, un equmo, un porcino, un marsupial y un humano.
9. El metodo de la reivindicación 1 , en donde el biomaterial es un tejido celular seleccionado del grupo que consiste tejido cardiovascular, tejido del corazón, válvula del corazón, raíces aórticas, pared aórtica, valvas aórticas, tejido pericárdico, tejido conectivo, dura madre, tejido dérmico, un tejido vascular, cartílago, pericardio, ligamento, tendón, vasos sanguíneos, tejido umbilical, tejido óseo, fascias y tejido submucoso y piel.
10. El método de la reivindicación 9, en donde el biomaterial comprende además análogos sintéticos formados a partir de polímeros sintéticos, polímeros biológicos o ambos.
11. Un método para estilizar un biomaterial basado en colágeno comprendiendo: (a) proporcionar un biomaterial basado en colágeno y contactar con 0.625% v/v de solución de glutaraldehído y di-hidrógeno fosfato de potasio pH 7.4; (b) incubar dicho biomaterial a aproximadamente 1 -5°C durante al menos 5 días para producir un biomaterial basado en colágeno reticulado; (c) contactar dicho biomaterial basado en colágeno reticulado con una solución de esterilización comprendiendo entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno e incubar dicho biomaterial entre 30°C y 55°C por más de 48 horas; con la condición de que la solución de esterilización no incluya alcohol.
12. Un método para esterilizar y almacenar un biomaterial basado en colágeno reticulado que comprende contactar dicho biomaterial basado en colágeno reticulado con una solución comprendiendo entre 3% y 6% v/v de óxido de propileno e incubar dicho biomaterial entre 30°C y 55°C por más de 48 horas y entonces permitir que el biomaterial permanezca en contacto con dicho óxido de propileno hasta que el mismo se convierta a propilenglicol; con la condición de que la solución no incluya alcohol.
13. Un biomaterial basado en colágeno reticulado, esterilizado, producido mediante el metodo de la reivindicación 1.
14. Un recipiente comprendiendo un biomaterial basado en colágeno reticulado, esterilizado, y una solución de propilenglicol al 3% a 6% v/v, en donde dicho propilenglicol ha resultado de la conversión in situ de una solución de óxido de propileno al 3% a 6% v/v, mientras está en la presencia del biomaterial.
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