KR20070106696A

KR20070106696A - 이식가능한 바이오물질 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20070106696A
Application number: KR1020077017057A
Authority: KR
Inventors: 윌리암 모리스 레오나르드 니트링; 앤드류 줄리안 호지
Original assignee: 셀스셀 피티와이 엘티디
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2007-11-05
Also published as: CA2591882C; ES2569494T3; ZA200706089B; EA200701377A1; DK1835948T3; BRPI0519285A2; NZ556610A; US20060193885A1; AU2005318938B2; EP1835948B1; PL1835948T3; JP2008525057A; CN101128225A; CN101128225B; NO20073846L; EP1835948B8; AU2005318938A1; EP1835948A4; WO2006066327A1; IL184130A0

Abstract

본 발명은 이식가능한 바이오물질 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바이오물질을 알코올 함유액에 적어도 24시간 노출시키는 단계를 포함하는, 이식가능한 바이오물질의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

이식가능한 바이오물질 및 그 제조 방법{AN IMPLANTABLE BIOMATERIAL AND A METHOD OF PRODUCING SAME}

본 발명은 이식가능한 바이오물질 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 석회화를 경감 및/또는 완화시키고 바이오물질의 수명을 개선시키기 위한, 콜라겐 함유성 바이오물질을 처리하는 방법 및 그의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 바이오물질은 이식 장치에, 또는 상기 장치와 함께 사용할 수 있다.

생물 조직을 살아있는 포유류 체내에 이식하기 위하여, 상기 조직의 콜라겐 매트릭스를 화학적으로 변화 및/또는 고정하는 방법에는 여러가지가 있다. 변화되고 고정된 이식가능한 생물 조직의 예로는, 심장 판막, 혈관, 심막, 피부, 경막, 힘줄 및 인대가 있다.

이들 생물 조직은 주로 콜라겐 및 엘라스틴으로 구성되어 있다. 대부분의 생물 조직의 강성/탄성은 조직의 상대적인 콜라겐 및 엘라스틴 함량, 및/또는 연결 조직 프레임워크의 물리적인 구조에 의해 주로 결정된다.

각각의 콜라겐 분자는 3개의 폴리펩티드 체인들로 구성되어 있으며, 이들 체인은 서로 얽혀 코일형의 삼중 나선을 형성하고 있다. 생물 조직을 보존하기 위해 사용되는 화학 물질은 일반적으로 콜라겐 분자의 폴리펩티드 체인상에 위치되어 있 는 아미노기들 간에(분자내) 가교 결합을 형성하며, 인접한 콜라겐 분자의 폴리펩티드 체인상에 위치되어 있는 아미노기와도 (분자간) 가교 결합을 형성한다.

콜라겐계 바이오물질(Collagen-based biomaterial)을 상이한 수혜자 종(recipient species)에게 이식 장치로서 사용하면 초급성 거부 반응이 발생되는 경향이 있다. 이러한 초급성 거부 반응은 콜라겐계 바이오물질 구조에 존재하는 항원에 의해 촉발되는, 자연적인 면역 반응이다. 초급성 거부 반응은 급속한 퇴행 과정으로, 이러한 이식 장치의 기능 및 내구성에 영향을 미친다.

콜라겐계 바이오물질의 항원성(antigenicity)은 콜라겐의 물리적 또는 화학적 가교 결합에 의해 억제될 수 있다. 자외선 조사 또는 열에 의한 탈수와 같은 물리적인 가교 방법은 저밀도 가교 결합을 형성시킨다. 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 디알데하이드 스타치(dialdehyde starch) 및 임의의 폴리에폭시 화합물과 같은 화학 물질은 콜라겐계 바이오물질에 대한 화학적인 가교제로서 사용되고 있다.

콜라겐의 가교 과정에는, 가교제와, 여러가지 폴리펩티드 체인들의 라이신 또는 하이드록시라이신 잔기들의 아민기와의, 반응이 포함된다. 공지된 또다른 콜라겐 가교 방법은, 폴리펩타드 체인의 글루탐산 및 아스파르트산 잔기의 카르복시기를 활성화시켜 다른 폴리펩티드 체인의 아민기와 반응시킴으로써, 아미드 결합을 형성하는 방법이다.

또한, 가교 결합은 인접한 폴리펩티드 체인들의 아민기들을 디이소시아네이트와 연결시켜 유레아 결합을 형성시킴으로써, 수행된다. 이러한 방법은 대부분의 디이소시아네이트의 독성 및 낮은 용해성으로 인해 일반적으로 사용되지는 않는다.

최근, 글루타르알데하이드가 가교제로서 사용되고 있다. 글루타르알데하이드는 탄소수 5의 지방족 체인의 양 말단에 있는 알데하이드에 의해 두가지 기능을 가진다. 글루타르알데하이드는 조직 고정과는 별개로, 이식용 생물 조직 준비에 탁월한 멸균제이다.

구체적으로, 글루타르알데하이드로 고정된 영구 이식가능한 바이오물질로는 돼지의 심장 판막 생체 보형기, 소의 심막 판막(pericardial valve) 및 소의 심막 패치(pericardial patch)가 있다.

화학 물질을 이용하여 가교한 생체 물질을 이식하는 경우의 문제점으로는, 이들 물질, 특히 이들 물질내 콜라겐 및 엘라스틴이 석회화되는 경향이 있다는 것이다. 이들 물질이 석회화되면 딱딱해져서, 분해되고 약해질 수 있다. 가교된 바이오물질의 석회화는 외인성 및 내인성 석회화 둘다에 의한 것으로 알려져 있다.

공교롭게도, 글루타르알데하이드는 바이오물질의 석회화를 조장하는 것으로 알려져 있다. 바이오물질내 알데하이드와 일차 아민간의 반응으로 불안정한 이민(schiff 염기)이 형성되며, 이우허 바이오물질에서 글루타르알데하이드가 방출된다. 조직에 존재하는 비결합형 알데하이드는 이식 후에 염증성 반응과 같이 조직에 심각한 자극을 줄 수 있다. 따라서, 글루타르알데하이드와 같은 가교제의 석회화 조장 작용을 제거 또는 불활성화할 필요가 있다.

가교된 바이오물질의 석회화 기전은 아직 완전하게 파악되지 않았다. 임상 데이타에 따르면, 환자의 연령, 감염, 숙주 조직 화학, 탈수, 염좌(distortion), 식이 인자 및 부적절한 초기 항응고 요법과 같은 인자들이, 이식된 바이오물질의 석회화를 조장할 수 있는 것으로 나타났다.

가교된 바이오물질의 석회화를 완화시키기 위한 방법을 찾기 위해, 다양한 시도들이 착수되었다. 바이오물질의 석회화 완화 연구는, 우선 가교된 바이오물질의 처리에 집중되었으며, 그 예로는 미국 특허 제4,553,974 (Dewanjee et al.); 미국 특허 제4,120,649 (Schechter); 미국 특허 제4,648,881 (Nashef et al.); 및 미국 특허 제4,976,733 (Girardot) Vyavahare et al., 1997, Circulation, 95:479-488 and Pathak et al., 2004, J. Biomed. Mater Res., 69A: 140-144가 있는데, 이들로만 제한되는 것은 아니다. 이들 공개문헌들에는, 일반적으로 이식하기 전에 고정된 조직을 알코올로 처리하는 방법이 개시되어 있다. 즉, 조직을 알코올에 노출시키기 전에 가교시키는 것이다. 알코올 존재하에 조직을 미리 배양한다고 해도, 노출 기간이 너무 짧아 유용하지 않거나, 또는 완충액 및 다른 물질의 존재가 가교 안정성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다(예, 상기 Vyavahare et al., 1997 참조). 비-글루타르알데하이드 제제를 이용하여 바이오물질을 고정하기 위한 다른 방법이 공개되어 있으며, 그 방법으로는 폴리글리시달 에테르를 사용하는 방법(Imamura et al., (1988), Jpn. J. Artif. Organs, 17:1101-1103); 광-산화 (Moore et al., (1994), J. Biomed. Mater. Res., 28:611-618)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

아미노-디-포스페이트 및 계면활성제를 이용하여 가교된 바이오물질을 처리하는 방법이 바이오물질의 이식후 석회화를 감소시키는 것으로 확인되었다. 그러 나, 이러한 물질은 이식후 바이오물질을 유실시키는 경향이 있으며, 단지 석회화 과정을 지연시킬 뿐이다.

바이오물질을 처리하는데 있어서의 알코올의 용도는 잘 알려져 있으나, 그것은 용매 및/또는 살균제로서의 용도로서 제한되어 있다. 예컨대, 병적 석회화(pathologic calcification)를 방지하기 위한 바이오물질의 처리에 있어서의 알코올의 용도는, 이미 가교된 콜라겐성 바이오물질에 사용되는 것으로 한정된다; 미국 특허 제5,746,775 (Levy et al.) 및 국제 특허 WO84/01894.

따라서, 석회화에 대해 장기간 내성을 가지는 바이오물질을 제조하는 방법이 여전히 요구된다.

발명의 개요

본 발명자들은, 콜라겐을 포함하는 이식가능한 바이오물질을 이용하여 석회화 문제를 해결 또는 적어도 개선시키는 방법을 개발하였다.

따라서, 본 발명의 제1 측면은, (a) 바이오물질을 알코올 함유액에 적어도 24시간동안 노출시키는 단계를 포함하는, 이식가능한 바이오물질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제2 측면은, (a) 바이오물질을 알코올 함유액에 적어도 24시간동안 노출시키는 단계를 포함하는, 석회화 내성 바이오물질을 제조하기 위한 콜라겐 함유 바이오물질을 처리하는 방법을 제공한다.

예로, 본 발명의 상기 제1 및 제2 측면은

(b) 단계 (a)의 바이오물질을 가교제에 노출시키는 단계; 및

(c) 단계 (b)의 바이오물질을 산성 용액에 노출시키는 단계;

를 추가적으로 포함하며,

상기 단계 (b) 및 (c)는 단계 (a) 이후에 순차적으로 이루어진다.

상기 단계 (a)는 적어도 24시간, 더 바람직하기로는 적어도 36시간, 및 가장 바람직하기로는 적어도 48시간 수행하는 것이 바람직하지만, 일정 조건에서 단계 (a)는 보다 단시간 수행될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

본 발명의 제3 측면은

(a) 바이오물질을 알코올 함유액에 노출시키는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 상기 바이오물질을 가교제에 노출시키는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 상기 바이오물질을 산성 용액에 노출시키는 단계;

를 포함하며,

상기 단계 (b) 및 (c)는 상기 단계 (a) 이후에 순차적으로 이루어지는, 이식가능한 바이오물질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 제4 측면은,

(a) 바이오물질을 알코올 함유액에 노출시키는 단계;

를 포함하며,

상기 단계 (b) 및 (c)는 상기 단계 (a) 이후에 순차적으로 이루어지는, 석회화 내성 바이오물질을 제조하기 위한 콜라겐 함유 바이오물질을 처리하는 방법을 제공한다.

예에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 단계 (a) 및 (b) 사이에, 및/또는 단계 (b)와 (c) 사이에, 남아있는 알코올 및/또는 가교제를 제거하기 위해 상기 바이오물질 또는 콜라겐 함유 물질을 세정한다. 바람직하기로는, 단계 (c) 이후에 상기 바이오물질 또는 콜라겐 함유 물질을 세정하여, 남아있는 산성 용액을 추가적으로 제거한다.

본원에 개시된 방법들은 모든 바이오물질을 처리하는데 유용할 수 있음을, 당업자는 이해할 것이다. 바람직하기로는, 상기 바이오물질은 콜라겐을 포함한다.

예에 있어서, 상기 바이오물질은 배양 조직, 동물로부터 수득한 세포외 매트릭스를 포함하고 있는 보형물 또는 재구성된 조직(예, 콜라겐 매트릭스) 등이다.

또한, 상기 바이오물질은 천연 조직 매트릭스에서 일반적으로 발견되는 것을 포함하여, 합성 폴리머로부터 형성된 합성 유사체, 생물학적 폴리머 또는 이들 모두를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 적합한 합성 폴리머로는, 예컨대 폴리아미드류 및 폴리설폰류가 있다. 생물학적 폴리머는 자연적으로 형성된 것이거나 또는 발효 등과 같은 방법에 의해 시험관내에서 제조될 수 있다.

예에 있어서, 바이오물질은 자연적으로 형성되며, 동물로부터 정제한다. 바이오물질은 수용체와 동일한 종이나 또는 수용체와 다른 종 동물 등의 모든 동물로부터 분리할 수 있다. 바람직하기로는, 동물은 포유류 목, 즉, 소목류(Artiodactyla), 토끼목(Lagomorpha), 쥐목(Rodentia), 유류목(Perissodactyla), 식육목(Carnivora) 및 유대목(Marsupialia) 중 하나에 속하는 동물이다. 더 바람직하기로는, 동물은 양, 소, 염소, 말, 돼지, 유대류(marsupial) 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바이오물질은 임의 타입의 세포 조직일 수 있다. 바람직하기로는, 상기 세포 조직은 심혈관 조직, 심장 조직, 심장 판막, 대동맥근(aortic root), 대동맥벽(aortic wall), 대동맥판(aortic leaflets), 심막 조직(pericardial tissue), 연결 조직, 경막(dura mater), 진피 조직, 도관 조직(vascular tissue), 연골, 심막, 인대, 힘줄, 혈관, 배꼽 조직(umbilical tissue), 뼈 조직, 근막(fasciae), 점막밑 조직 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 예에서, 바이오물질은 천연 콜라겐 함유 조직 보다는 개별물, 즉 분리한 콜라겐이거나 또는 이를 포함한다. 개별 콜라겐은 분리된 상태로 이용되거나, 또는 당업계에 공지된 모든 의료 장치 또는 용품으로 제조될 수 있다.

단계 (a)의 바이오물질은 미리 가교된 것이 아니다.

단계 (a)에서 사용되는 알코올 함유액은 바람직하기로는 액체이며, 물 기재의, 즉 알코올 함량이 약 50%보다 높은 수용액이며, 바람직하기로는 알코올은 60 내지 80 부피%이다. 알코올을 함유하는 완충화된 또는 완충화되지 않은 용액을 사용할 수 있지만, 바람직하기로는, 완충화된 알코올 함유액이 이후의 가교 과정에 부정적인 영향을 미쳐 노란색 바이오물질을 형성하는 것으로 확인되었으므로, 완충화되지 않은 알코올 함유액을 사용한다.

본 발명의 방법에서는 당업계에 공지된 모든 알코올을 알코올 함유액으로 사용할 수 있다. 바람직하기로는, 알코올은 완충액 결핍 용액 형태의 C₁-C₆ 저급 알코올이다. 보다 바람직하기로는, 알코올은 메탄올, 에탄올, 사이클로헥산올, 이소프로판올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 이소부탄올, sec-부탄올 및 t-부탄올 중에서 선택된다.

일부 예에서, 알코올 함유액은 2 종 이상의 알코올 혼합물을 알코올의 조합 부피(combined volume)로 50% 보다 높게 포함한다. 예를 들어, 약 70%의 에탄올과 약 10%의 이소부탄올의 혼합물이 유효하다.

단계 (a)에서, 바이오물질은 바이오물질에 생체내 병적 석회화에 대한 내성을 부여하기에 충분할 만큼 장기간 알코올 함유액에 노출될 수 있다. 바람직하기로는, 바이오물질은 알코올이 확산되어 바이오물질내로 투과할 수 있는 충분한 시간동안 알코올 함유액과 접촉한 상태로 유지된다. 더 바람직하기로는, 바이오물질은 적어도 24시간 동안, 더 바람직하기로는 적어도 36시간동안, 가장 바람직하기로는 적어도 48시간 동안 알코올 함유액에 노출된다.

바이오물질을 24시간 보다 장시간 알코올 함유액에 노출시키는 예로, 바이오물질은 하기에 기재된 본 발명의 처리 방법으로 직접 사용될 수 있다.

일부 예에서, 바이오물질은 알코올 함유액에 노출시킨 다음, 꺼내어, 하나 이상의 가교제에 노출시킨다. 당업계에 공지된 어떠한 형태의 가교제 또는 그의 조합물을 콜라겐을 가교할 수 있는 시간동안 사용할 수 있다. 따라서, 가교제는, 비제한적으로, 디비닐 설폰(DVS), 폴리에틸렌 글리콜 디비닐 설폰(VS-PEG-VS), 하이드록시에틸 메타크릴레이트 디비닐 설폰(HEMA-DIS-HEMA), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 알데하이드, 이소시아네이트, 알킬 및 아릴 할라이드, 이미도에스테르, N-치환된 말레이미드, 아실화 화합물, 카르보디이미드, 하이드록시클로라이드, N-하이드록시숙신이미드, 광(예, 청색 광 및 UV 광), pH, 온도 및 이들의 조합을 포함함을 이해할 것이다. 바람직하기로는, 가교제는 카르보디이미드, 폴리에폭시 에테르, 디비닐 설폰(DVS), 폴리알데하이드 및 디페닐포스포릴 아지드(DPPA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학 가교제이다.

일부 예들에서, 폴리알데하이드는 bi-, tri- 또는 di-알데하이드이다. 특히, 글루타르알데하이드가 바람직하다.

일부 예들에서, 가교 단계 (b)는 단계(c) 이후에 수행되며, 그 사이에 세정 단계가 개입되거나 되지 않는다. 단계 (c)에서 사용되는 산성 용액은, 이용가능한 칼슘 결합부를 제거 또는 감소시키기 위해, 단계 (b) 이후에 바이오물질에 존재하는 고정된 및 비고정된 가교제 모이어티를 불활성화 및/또는 변형시킬 수 있는 임의의 산을 함유한다. 대안적으로, 또는 덧붙여, 단계 (c)에서 사용되는 산성 용액은, 콜라겐 상의 활성화된 카르복시기를 활성화된 아민기와 추가적으로 가교하여 아미드 결합을 형성시킬 수 있는, 모든 산을 함유한다. 바람직하기로는, 산성 용액 중의 산은 아미노카르복시산을 포함한다. 바람직하기로는, 아미노카르복시산은 적어도 하나의 아미노기와 적어도 하나의 카르복시산 치환을 가지는 산이다. 더 바람직하기로는, 아미노카르복시산은 L-아르기닌, L-라이신, L-히스티딘, L-글루타메이트 또는 L-아스파르테이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 예에서, 본 발명의 단계 (c)는 바이오물질에 존재하는 엘라스틴 분자상에서 메탈로프로테나제 형성을 저해하는 방법으로 치환되거나 또는 상기 방법이 보충된다. 구체적으로, 대동맥 조직과 같은 조직은 다른 조직에 비해 엘라스틴 존재 비율이 보다 높다. 이들 엘라스틴 분자는 감소, 제거 또는 불활성화될 필요가 있는 부위로서, 메탈로프로테나제의 형성을 위한 부위로 제공될 수 있다. 하기 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 마그네슘염, 페릭염 및 알루미늄염과 같은 다가 양이온을 함유하는 완충제 결핍 용액을 사용하여, 메탈로프로테나제의 형성을 감소시킬 수 있다.

바이오물질의 세정 단계는 포스페이트 결핍성 0.9% 염수액을 이용하여 수행된다.

바람직한 일 예에서, 바이오물질은 단계 (c) 다음에 추가적으로 멸균된다. 더 바람직하기로는, 바이오물질은 세정 후 멸균된다.

당업자라면 본 발명의 각각의 단계들이 수행되는 온도는 결정적인 것은 아닌 것으로 인지되지만, 온도는 바람직하기로는 2 ℃ 내지 40 ℃, 더 바람직하기로는 4 ℃ 내지 30 ℃, 가장 바람직하기로는 5 ℃ 내지 25 ℃일 수 있음을 이해할 것이다.

일 예에서, 알코올, 가교제, 산성 용액, 세정액 및 멸균화 용액은 모두 완충제가 결핍되어 있는 것이다.

당업자라면, 본원에 개시된 방법으로 석회화 내성 바이오물질을 제조할 수 있으며, 상기 바이오물질이 생체 이식된 후 200일 보다 오랜 기간동안 조직내 칼슘 함량이 50 ㎍/mg(조직) 미만으로 유지됨을 인지할 것이다. 다시 말하면, 본 발명의 석회화 내성 바이오물질은 칼슘 함량을 50 ㎍/mg(조직) 보다 높게 증가시키지 않으면서, 200일 보다 오랜 기간동안 이식되어 있을 수 있다.

따라서, 본 발명의 제5 측면은 가교된 콜라겐을 포함하는 석회화 내성 바이오물질을 제공하며, 상기 바이오물질의 칼슘 함량은 바이오물질 1 mg 당 약 50 ㎍ 미만이며, 상기 바이오물질은 칼슘의 함량을 50 ㎍/mg(바이오물질) 보다 높게 증가시키지 않으면서 200일 보다 오랜 기간동안 이식되어 있을 수 있다.

특정 이론이나 가설에 결부되지 않으며, 관찰되는 석회화 내성은 본원에 따른 바이오물질의 제조 방법에 의해 수득되는 콜라겐의 2급 아민류의 존재에 의해 부분적으로 형성되는 것으로 간주된다.

따라서, 본 발명의 제6 측면은 2급 아민류를 포함하는 가교된 콜라겐을 포함하고 있는 석회화 내성 바이오물질을 포함하는, 이식가능한 생물학적 장치를 제공한다.

일부 예들에서, 석회화 내성 바이오물질은 의료 장치의 표면에 코팅된다. 다른 예에 있어서, 상기 장치는 적어도 2차 코팅을 더 포함한다.

당업자라면, 상기 적어도 2차 코팅은 항미생물제, 항바이러스제, 성장인자, 항탈수제 또는 방부제(anti-septic agents)와 같은 물질을 포함할 수 있음을 인지할 것이다.

바람직하기로는, 항미생물제는 이소니아지드, 에탐부톨(ethambutol), 피라진아미드, 스트렙토마이신, 클로파지민, 리파부틴, 플루오로퀴놀론, 오플록삭신(ofloxacin), 스파르플록삭신(sparfloxacin), 리팜피신(rifampin), 아지트로마이신, 클라리트로마이신(clarithromycin), 다프손(dapsone), 테트라사이클린, 에리트로마이신, 시프로플록삭신, 독시사이클린, 암피실린, 암포테리신 B, 케토코나졸, 플루코나졸, 피리메타민, 설파디아진, 클린다마이신, 린코마이신, 펜타미딘, 아토바쿠온(atovaquone), 파로모마이신, 디클라자릴, 어사이클로비르, 트리플루오로유리딘, 포스카르넷, 페니실린, 젠타마이신, 간시클로비르(ganciclovir), 이타트로코나졸, 미코나졸, Zn-피리티온, 비제한적으로 금, 백금, 은, 아연 및 구리를 포함하는 중금속, 클로라이드, 브로마이드, 요오드화물 및 페리오데이트와 같은 염을 포함하는 이들의 조합형, 담체와의 복합체 및 그외 형태로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하기로는, 성장인자는 하이드록시아파티트, 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장인자(aFGF), 신경 성장인자(NGF), 표피 성장인자(EGF), 인슐린 유사 성장인자 1 및 2(IGF-1 및 IGF-2), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 종양 혈관신생 인자(TAF), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 코르티코트로핀 방출 인자(CRF), 형질변환 성장인자 α 및 β (TGF-α 및 TGF-β), 인터루킨-8 (IL-8); 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 인터루킨 및 인터페론으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 예에서, 본 발명의 장치는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체, 폴리디옥사논, 폴리카프로락톤, 폴리펩티드, 폴리카르보네이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리(알킬렌 옥살레이트), 비닐 아세테이트와 불포화 카르복시산과의 공중합체, 수용성 셀룰로스 유사체, 수 분산성 셀룰로스 유사체, 에틸렌 옥사이드 폴리머, 폴리아크릴아미드, 콜라겐, 젤라틴, 폴리(오르토에스테르), 아미노산의 폴리아미드, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에테르에테르케톤, 트리칼슘 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 생체흡수성 물질을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 장치는 석회화 내성이 적합한 모든 장치일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 바람직하기로는, 상기 장치는 인공 심장, 심장외 압박 장치(extracardiac compression device), 혈관내 압박 장치, 혈관외 압박 장치, 심장 판막 보형물, 판막륜링(annuloplasty ring), 진피 그래프트, 혈관 그래프트, 혈관 스텐트, 구조 스텐트, 혈관 션트, 심혈관 션트, 경막 그래프트, 연골 그래프트, 연골 임플란트, 심막 그래프트, 인대 보형물, 힘줄 보형물, 방광 보형물, 가제, 봉합사, 경피내 설치된 영구 장치(permanently in-dwelling percutaneous device), 수술 패치, 심혈관 스텐트, 코팅된 스텐트 및 코팅된 카테터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하기로는 상기 장치는 심장 판막 보형물이다.

일부 예에서, 상기 장치는 동물로부터 수득한 조직 단편 또는 조직과 유사한 합성물을 더 포함할 것이다.

바람직하기로는, 상기 조직 단편은 수술부위에 이식시 증식하여 주변 조직으로 통합되는, 복수의 세포를 포함할 것이다.

본 발명의 제7 측면은, 가교된 콜라겐을 포함하는 석회화 내성 바이오물질을 포함하는 생체친화적인 스캐폴드(scaffold)를 포함하는, 생체친화적인 임플란트를 제공하며, 상기 바이오물질의 칼슘 함량은 바이오물질 1 mg 당 약 50 ㎍ 미만이며, 바이오물질은 칼슘의 함량을 50 ㎍/mg(바이오물질) 보다 높게 증가시키지 않으면서, 200일 보다 오랜 기간동안 이식되어 있을 수 있다.

본 발명의 제8 측면은 가교된 콜라겐을 포함하는 석회화 내성 바이오물질을 포함하는 생체친화적인 스캐폴드를 포함하고 있는, 생체친화적인 임플란트를 제공하며, 상기 콜라겐은 2급 아민류를 포함한다.

바람직하기로는, 본 발명의 임플란트는 합성 폴리머, 천연 폴리머, 주사용 겔, 세라믹 물질, 자가 조직, 동종이계 조직, 이종 조직 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함할 것이다.

본 발명의 제9 측면은

(a) 2급 아민류를 포함하는 가교된 콜라겐을 포함하고 있는, 하나 이상의 석회화 내성 바이오물질을 가지고 있는 멸균 용기; 및

(b) 부상자에게 대한 사용 설명서

를 포함하는, 조직의 상처 회복용 키트를 제공한다.

본 발명의 제10 측면은

(a) 2급 아민류를 포함하는 가교된 콜라겐을 포함하고 있는, 석회화 내성 바이오물질을 제공하는 단계; 및

(b) 상기 바이오물질을 치료가 필요한 대상자의 내부에 또는 상에 이식하는 단계

를 포함하는, 살아있는 조직을 처리하는 방법을 제공한다.

상기 처리 방법은 모든 처리, 예방적인 및 치료적인 처리를 포함할 수 있다. 바람직하기로는, 처리 방법은 조직 회복, 심부 조직 보호(deep tissue protection), 조직 벌킹(tissue bulking), 미용적 처리(cosmetic treatment), 치료적 처리, 조직 증대 및 조직 실링(tissue sealing)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 제11 측면은 2급 아민류를 포함하는 가교된 콜라겐을 포함하고 있는 석회화 내성 바이오물질을 포함하는, 상처 드레싱을 제공한다.

바람직하기로는, 바이오물질의 콜라겐은 양의 콜라겐, 소의 콜라겐, 염소의 콜라겐, 말의 콜라겐, 돼지의 콜라겐, 유대류의 콜라겐 및 인간 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 예들에서, 상처 드레싱은 헤파린, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파란 설페이트, 케라탄 설페이트, 헥스유로닐 헥소스아미노글리칸 설페이트(hexuronyl hexosaminoglycan sulfate), 이노시톨 헥사설페이트 및 슈크로스 옥타설페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 설페이트화된 다당류를 더 포함한다. 바람직하기로는, 상처 드레싱은 항미생물제, 항바이러스제, 성장인자, 항탈수제 및 방부제를 더 포함한다.

바람직하기로는, 바이오물질은 적어도 50% 콜라겐, 더 바람직하기로는 적어도 70% 콜라겐, 더더 바람직하기로는 적어도 90% 콜라겐을 포함하며, 및 가장 바람직하기로는 본질적으로 콜라겐으로 구성된다.

발명의 상세한 설명

본 발명을 구체적으로 설명하기 전에, 본 발명은 특히 예시적인 제조 방법으로 한정되지 않으며, 변경가능할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본원의 용어는 단지 본 발명의 구체적인 예를 설명하기 위한 것일 뿐, 첨부된 특허청구범위로만 한정되는 것으로 제한되는 의도는 아니다.

상기 및 하기에서 본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 그러나, 언급한 공개문헌은 공개문헌에 기재되어 있으며 본 발명에서 사용될 수 있는, 프로토콜 및 반응시약을 기재하고 설명하기 위한 목적으로 인용된 것이다. 본 발명이 종래 발명에 의한 개시물을 선행하는 자격이 없다는 것을 승인하는 것으로 해석되는 것은 아니다.

더욱이, 본 발명의 실시는 별도의 언급이 없는 한, 해당 분야의 기술에 속하는 기존 면역 기법, 화학 및 약학을 채택한다. 이러한 기법은 기술자들에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예로, Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher and Wingfield "Current protocols in Protein Science"(1999) Volume I and II (John Wiley & Sons Inc.); 및 Bailey, J.E. and Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)을 참조한다.

본원 및 첨부한 특허청구범위에서 사용되는 단수형의 "하나(a)", "하나(an)" 및 "상기(the)"는 문맥에서 명확하게 언급하지 않는 한 복수를 포함함을 유념하여야 한다. 따라서, 예컨대, "가교제"에 대한 언급은 이러한 물질의 복수형을 포함하며, "알코올"에 대한 언급은 하나 이상의 알코올을 의미한다. 별도로 언급하지 않는 한, 본원에 기재된 모든 기술적인 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 바와 동일하거나 동등한 모든 재료 및 방법을 본 발명을 실시 또는 테스트하는데 사용할 수 있지만, 이하 바람직한 재료 및 방법을 개시한다.

본 발명의 가장 광의의 측면은 이식가능한 바이오물질의 제조 방법이다.

본원에서, 용어 "바이오물질"은 잠재적으로 생물학적인 용도를 가지는 모든 물질을 의미하며, 상기 물질은 동일한 콜라겐을 포함한다. 콜라겐은 임의 기원 유래의 모든 타입의 콜라겐일 수 있으며, 단독이거나 또는 다른 물질과의 조합일 수 있다. 즉, 콜라겐은 바이오물질의 총 중량의 작게는 1 중량%이거나, 많게는 100 중량%일지도 모른다.

용어 "콜라겐"은 본원에서 딱딱한, 삼중 가닥의 나선 구조를 특징으로 하는, 세포외 섬유성 단백질 패밀리를 의미한다. 3개의 콜라겐 폴리펩티드 체인("알파-체인")은 서로 감겨 상기 나선 분자를 형성하고 있다. 이 용어는 또한 다양한 타입의 콜라겐을 포함하는 것으로 의도된다.

콜라겐의 나선 부분은 대부분 포유류 종들간에 거의 차이가 없다. 실제, 다수의 콜라겐 타입들은 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 상동성 정도가 높다. 예로, 콜라겐 알파 I 타입 II의 뉴클레오티드 서열 상동성은, 인간, 말 및 뮤라인과 비교하면 88% 이상이다. 인간 및 말의 뉴클레오티드 서열 상동성은 93%이며, 마우스와 말간의 뉴클레오티드 서열 상동성은 89%이다. 인간과 마우스간의 뉴클레오티드 서열의 상동성은 88%이다(참조, NCBI accession numbers U62528 (Equine), NM033150 (Human) and NM031163 (mouse) http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 다른 타입의 콜라겐도 유사한 아미노산 상동 수준을 보인다. 예컨대, 돼지 콜라겐 알파 I 타입 I과 양 콜라겐 알파 I 타입 I 간의 뉴클레오티드 서열 상동성은 90%이다(참조, NCBI accession numbers AF29287 (Ovine) and AF201723 (Porcine) http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

상기 많은 동물들의 공통 기원 및 생물 수준과, 소, 양, 마우스 및 돼지와 같은 많은 종들에서의 콜라겐의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 높은 상동성을 고려하면, 본원에 개시된 바이오물질을 제조하는 방법은 모든 포유류 동물로부터 분리된 콜라겐성 물질에 대해 적용가능한 것으로 당업자는 이해할 것이다.

따라서, 일부 예에 있어서, 바이오물질은 포유류 목, 즉 소목류(Artiodactyla), 토끼목(Lagomorpha), 쥐목(Rodentia), 유류목(Perissodactyla), 식육목(Carnivora) 및 유대목(Marsupialia) 중 하나에 속하는 동물로부터 분리 또는 수득된다. 동물은 양, 소, 염소, 말, 돼지, 유대류 및 인간이 바람직하다. 바이오물질은 수용체와 동일한 동물 종으로부터 분리되는 것이 바람직하지만, 수용체와 상이한 종으로부터 분리될 수 있는 것으로 파악된다.

대안적으로, 일부 예로, 바이오물질은 배양한 조직, 또는 재구성한 조직 등을 포함한다.

바이오물질은 임의 타입의 세포 조직일 수 있다. 예컨대, 세포 조직은 일부 콜라겐을 포함하는 임의의 것으로서, 심혈관 조직, 골반기저 조직, 심장 조직, 심장 판막, 대동맥근(aortic root), 대동맥벽, 대동맥 판(aortic leaflet), 심막 조직, 연결 조직, 연기관 또는 고형 기관의 매트릭스, 경막, 진피 조직, 관 조직, 연골, 심막, 인대, 힘줄, 혈관, 배꼽 조직, 골 조직, 근막, 및 근육기저 조직 또는 피부일 수 있다.

바이오물질은 합성 폴리머로 형성된 합성 유사체, 정제된 생물 폴리머 또는 이들 둘다를 더 포함할 수 있으며, 이들은 천연 조직 매트릭스에서 일반적으로 발견되는 것이다. 적합한 합성 폴리머로는, 예컨대 폴리아미드와 폴리설폰이 있다. 생물 폴리머는 천연적으로 형성되거나 또는 예컨대 발효 등에 의해 시험관내에서 제조될 수 있다.

정제된 생물 폴리머는 직조, 뜨개질, 주조, 몰딩, 압출 성형(extrusion), 세포 배열(cellular alignment) 및 자기 배열(magnetic alignment)과 같은 기법에 의해 기질로 적절하게 형성될 수 있다. 적합한 생물 폴리머로는 콜라겐, 엘라스틴, 실크, 케라틴, 젤라틴, 폴리아미노산, 다당류(예, 셀룰로스 및 전분) 및 이들의 모든 공중합체가 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 예로, 콜라겐 및 엘라스틴 폴리머는 직조 및 몰딩과 같은 다양한 임의 기법에 의해 이식가능한 합성 물질로 형성될 수 있다. 합성 조직 유사체는 천연 조직 매트릭스를 모방한다. 대안적으로, 합성 기질을 사용하여 단독으로 또는 천연 기질과 조합하여, 조직 유사체를 형성할 수 있다. 그 예로는, 폴리프로필렌, 폴리락트산, 폴리에스테르, 나일론, 실리콘 등이 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본원의 방법은 미리 가교된 바이오물질에도 일부 작용하지만, 본원의 방법은 비가교된 즉, "천연" 또는 "원시(naive)" 물질상에 사용되는 것으로 의도된다.

바이오물질을 수득하여 이식용으로 준비한다. 용어 "이식", "이식가능한" 및 "임플란트"는 본원에서 상호 호환가능하며, 모두 거부 반응, 감염 또는 독성 문제를 유발하지 않으면서 본 발명의 바이오물질, 장치 등이 동물의 살아있는 조직 내에 또는 상에 위치되는 능력을 의미한다. 용어 "이식가능한"은 일부 바이오물질 또는 장치를 포함할 수 있으며, 또는 콘택트 렌즈 등과 같은 부분적으로 이식된 장치 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 방법의 초기 단계에서, 바이오물질은 알코올 함유액에 노출된다. 본원에서, 용어 "노출된" 또는 "노출"은, 원하는 결과를 수득하기에 충분한 시간동안, 전술한 바와 같이 바이오물질이나 또는 콜라겐 함유 물질을 알코올 함유액과 접촉시키는 활성 단계 또는, 후술한 바와 같이, 이후 콜라겐 함유 바이오물질을 가교제, 산성 용액 또는 그외 물질과 접촉시키는 활성 단계를 의미한다. 바이오물질을 예컨대 알코올 함유액에 노출시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예로, 일반적으로, 바이오물질은 알코올을 포함하는 용액중에 바이오물질을 분무, 딥핑(dipping), 침지(dipping)함으로써, 알코올에 노출시킬 수 있다.

용어 "알코올"은 본원에서 트리글리세라이드를 제거 또는 함량을 감소시킬 수 있으며 콜라겐에서 발견되는 카르복시기를 적어도 부분적으로 에스테르화할 수 있는, 당업계에 공지된 임의 알코올이다. 바람직하기로는, 알코올은 수용성 알코올이다. 더 바람직하기로는, 알코온은 완충제가 결핍된 용액 상태의 C₁-C₆ 저급 알코올이다. 더더 바람직하기로는, 알코올은 메탄올, 에탄올, 사이클로헥산올, 이소프로판올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 이소부탄올, sec-부탄올 및 t-부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된다.

임의의 특정 이론 또는 가설에 결부되지 않으면서, 본 발명자는 알코올 함유액이 콜라겐 이중 나선을 느슨하게 하는 것을 도와, 소수성 부위가 노출되는 것으로 생각한다(Karube & Nishida, 1979, Biochim Biophys Acta., 23;581(1): 106-13). 또한, 발명자들은, 콜라겐에서 발견되는 카르복시기 및 아민기가 알코올 함유액의 존재중에 에스테르화되어, 이후 단계에서 가교에 이용가능하게 되는 것으로 생각한다. 이처럼, 바람직한 알코올 용액은 완충제 결핍성 수용액에 적어도 약 50 부피%, 더 바람직하기로는 적어도 약 70 부피% 및 가장 바람직하기로는 약 80 부피%로 알코올을 포함한다. 일 예로, 상기 알코올 용액은 0.9% 염수(0.5 mM PMSF 함유) 중의 70 부피% 에탄올이다.

일 예로, 본 발명의 방법은 바이오물질을 100% 미만으로 알코올을 포함하는 알코올 함유성 완충제 결핍 용액에 적어도 24시간 노출시키는 단계를 포함하는, 이식가능한 바이오물질의 제조 방법을 제공한다.

일부 예에서, 고정하는 동안에 알데하이드를 포함하는 가교제를 완충제와 반응시키면 알데하이드의 중합을 초래하는 것으로 가설되어 있으므로, 상기 알코올 함유액과 그외 용액 및 반응시약은 "완충제가 결핍된" 것이다.

바이오물질을 알코올 함유액에 노출시키는 단계는 바이오물질에 생체내 병적 석회화에 대한 내성을 부여하며, 콜라겐에서 발견되는 카르복시기와 아민기 대부분(높은 비율)이 에스테르화되기에 충분히 긴 임의 시간동안 수행될 수 있다. 바람직하기로는, 바이오물질은 알코올이 확산되어 바이오물질로 투과가능한 충분한 시간동안 알코올 함유액과 접촉한 상태로 유지된다. 더 바람직하기로는, 바이오물질은 적어도 24시간, 더더 바람직하기로는 적어도 36시간동안, 및 가장 바람직하기로는 적어도 48시간 동안, 알코올 함유액에 노출된다.

바이오물질을 알코올에 노출시킨 다음, 꺼낸다. 일 예로, 바이오물질을 알코올에 노출한 다음, 포스페이트가 없는 0.9% 염수 용액을 포함하는 세정액으로 세정한다. 그러나, 완충화되지 않은 생리적으로 허용가능한 임의 용액을 세정액으로서 사용할 수 있다. 세정액의 목적은 주로 과량의 알코올을 제거하기 위한 것이지만, 중요한 것은 아니다.

바이오물질 또는 콜라겐 함유 물질은 24시간 보다 장시간 알코올에 노출시킨 다음, 이식에 직접 사용할 수 있다. 알코올 사전-고정은 다른 것에 의해 이미 사용되고 있지만, 콜라겐에서 발견되는 카르복시기와 아민기의 에스테르화가 아닌, 조직 멸균에 전통적으로 사용된다. 이처럼, 알코올 노출 시간은 비교적 짧으며, 예컨대 24시간 미만이며, 알코올이 조직에 완전히 침투하는데에는 충분하지 않은 시간이다. 그 결과, 본 발명 이전에는, 바이오물질을 알코올 함유액에 장기간, 즉 24시간 이상 노출시킴으로써, 석회화 내성의 바이오물질(하기 정의 참조)을 제조할 수 있다는 것을 인지하지 못하였다. 이는, 24시간 보다 장시간동안 알코올 함유액에 노출시킨 다음, 바이오물질을 석회화 내성 바이오물질로서 직접 이식할 수 있음(하기)을 의미한다. 그러나, 당업자라면, 단계 (a) 이후에 바이오물질을 가교함으로써 우수한 형태의 석회화 내성 바이오물질을 제조할 수 있음을 인지할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 일부 예들에서, 바이오물질 또는 콜라겐 함유 물질은 알코올에 노출한 다음, 하나 이상의 이중 기능의 가교제에 노출시킨다. 용어 "이중 기능"은 본원에서 탄소수 5의 체인의 양 끝에 존재하는 2개의 기능성 알데하이드기를 의미한다. 가교는 콜라겐을 가교할 수 있는 모든 형태의 가교제를 이용하여 당업계에 공지된 임의 기법에 의해 처리될 수 있다. 가교제로는, 아실화 화합물, 아디필 클로라이드, 알데하이드, 알킬 및 아릴 할라이드, 비스아미데이트, 카르보디이미드, 디비닐 설폰(DVS), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 글리옥살, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 하이드록시클로라이드, 하이드록시에틸 메타크릴레이트 디비닐 설폰(HEMA-DIS-HEMA), 이미도에스테르, 이소시아네이트, 광(예, 청색광 및 UV 광), N-하이드록시숙신이미드, N-치환된 말레이미드, pH, 폴리알데하이드, 디페닐포스포릴 아지드(DPPA), 17-25개의 탄소 및 4-5 에폭시기의 벡본을 포함하는 폴리에폭시 화합물, 폴리에폭시 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 디비닐 설폰(VS-PEG-VS), 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르, 온도 및 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

일부 예에서, 가교제는 카르보디이미드, 폴리에폭시 에테르, 디비닐 설폰(DVS), 제니핀, 글루타르알데하이드, 포름알데하이드 및 디페닐포스포릴 아지드(DPPA)와 같은 화학 가교제이다.

또한, 17-25개의 탄소 및 4-5 에폭시기의 벡본을 포함하는 폴리에폭시 화합물은 콜라겐 가교에 매우 효과적인 것으로 입증되었다(예, 미국 특허 출원번호 제 20040059430 (S/N 10/618,447)). 또한, 콜라겐과 같은 나선형 폴리펩티드와 반응시키는 경우에, 폴리에폭시 화합물의 독성은 글루타르알데하이드 보다 낮으며, 항원성 또는 조직의 면역 반응 유도는 반응 시간에 비례하여 감소되는 것으로 확인되었다. 천연적으로, 폴리에폭시 화합물은 비교적 우수한 생체친화성을 보인다(예, Lohre et al., (1992), Artif. Organs, 16:630-633; Uemaㅇtsu et al., (1998), Artif. Organs, 22:909-913 참조). 따라서, 언급된 바와 같이 폴리에폭시 화합물이 바람직한 가교제이다.

일부 예에서, 가교제는 약 1%의 글루타르알데하이드를 포함하며, 노출 시간은 적어도 약 24시간이다. 바이오물질을 가교제에 노출시키는 시간은 사용되는 물질, 농도 및 온도에 의존적임을 인지할 것이다. 전형적으로, 노출 시간은 24시간 내지 28일이다. 바이오물질을 가교제에 노출시키는 정확한 시간 결정은 당업자의 능력하에서 가능하다.

즉, 특정한 이론이나 가설에 결부되지 않으며, 본 발명자들은 알코올에 노출시킨 바이오물질을 가교제에 노출시킴으로써, 바이오물질에 있는 콜라겐상의 에스테르화된 카르복시기와 아민기가 가교되는 것으로 생각한다.

본 발명의 각각의 단계가 수행되는 온도는 결정적이지 않다는 것을 당업자라면 인지하겠지만, 온도는 바람직하기로는 2 ℃ 내지 40 ℃, 더 바람직하기로는 4 ℃ 내지 30 ℃, 가장 바람직하기로는 5 ℃ 내지 25 ℃이라는 것을 이해할 것이다.

즉, 가교 단계 이후에, 바이오물질은 알코올 노출 단계 (a) 이후에 사용한 바와 같은 세정액으로 세정하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 세정 단계는 단지 선택(preferment)일 뿐이라는 것을 인식할 것이다.

가교 단계 이후에, 또는 가교 단계 이후에 세정 단계를 이용한 경우라면 그 이후에, 단계 (b) 이후에 바이오물질에 존재하는 고정된 및/또는 비고정된 가교제 모이어티를 활성화 및/또는 변형할 수 있는 임의 산을 함유하고 있는 산성 용액에 바이오물질을 노출하여, 이용가능한 칼슘 결합부를 제거 또는 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 덧붙여, 단계 (c)에 사용되는 산성 용액은 콜라겐상의 활성화된 카르복시기를 활성화된 아민기와 추가적으로 가교하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 임의 산을 포함한다.

바람직하기로는, 산성 용액은 적어도 한가지 아미노카르복시산을 포함한다. 용어 "아미노카르복시산"은 본원에서 적어도 하나의 아미노기와 적어도 하나의 카르복시산 치환체를 가지는 임의 산이다. 본 발명에서 이용가능한 아미노카르복시산의 대표적인 예로는 L-글루타메이트, L-아스파르테이트, L-라이신, L-아르기닌, L-히스티딘을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 산성 용액의 목적은 두 가지이다: 먼저, 아미노카르복시산은 고정 및 고정되지 않은 가교제의 불활성화 및/또는 변형을 보조하여, 모든 생물학적인 부작용을 경감 또는 완화시킨다. 두번째로, 아미노카르복시산은 콜라겐 상의 활성화된 카르복시기를 활성화된 아민기와 추가적으로 가교시켜, 아미드 결합을 형성시킨다.

아미노카르복시산의 농도는 실제 사용되는 산 및 사용되는 바이오물질의 총 무게 등과 같은 다른 매개변수에 따라 결정될 것이다. 또한, 아미노카르복시산 대 바이오물질의 최소 습윤 무게 비는 약 1:4이다. 산성 용액의 가장 중요한 측면은 pH이다. pH는 7 보다 낮으며, 바람직하기로는 6 미만, 더 바람직하기로는 5 미만, 가장 바람직하기로는 4.6 미만이어야 한다.

일 예에서, 산성 용액은 탈이온수 1 ml당 아미노카르복시산 8 mg이며, 포스페이트가 결핍되어 있으며, pH는 약 4이다.

바이오물질은 적어도 6시간, 더 바람직하기로는 적어도 24시간, 더더 바람직하기로는 48 시간 이상동안 아미노카르복시산에 노출된다. 인큐베이션 온도가 결정적인 것은 아니지만, 바람직하기로는 5 ℃ 내지 55 ℃, 더 바람직하기로는 10 ℃ 내지 45 ℃ 및 가장 바람직하기로는 약 45 ℃이다.

일부 예에서, 본 발명의 방법에서 단계 (c)는 바이오물질에 존재하는 엘라스틴 분자상에서 메탈로프로테아제의 형성을 저해하는 방법으로 치환 또는 방법이 보충된다. 구체적으로, 대동맥 조직과 같은 조직에는, 엘라스틴이 다른 조직에 비해 높은 비율로 존재한다. 이들 엘라스틴 분자는 메탈로프로테아제의 형성 부위를 감소, 제거 또는 불활성화가 필요한 부위로서 제공될 수 있다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 마그네슘염, 페릭염 및 알루미늄염과 같은 다가 양이온을 함유하는 완충제 결핍성 용액을 사용하여, 메탈로프로테아제의 형성을 감소시킬 수 있다.

바이오물질 또는 콜라겐 함유 물질을 산성 용액 및/또는 다가 양이온을 함유하는 완충제 결핍성 용액에 노출시키는 단계 이후에, 바이오물질은 세정액으로 다시 세정하는 것이 바람직하다. 일부 예에서, 바이오물질은 또한 멸균한다.

바이오물질의 멸균 단계는 콜라겐 함유 물질에 대한 당업계에 공지된 임의의 멸균 방법에 의한 것이다. 예컨대, 바이오물질은 멸균 시간동안 멸균제(예, 0.2 내지 2.0 중량%의 글루타르알데하이드 용액과 같은 액체 멸균제)에 투입될 수 있다. 0.625% 글루타르알데하이드 용액은 멸균제로서 열과 함께 사용될 수 있다(즉, 실온 보다 높은 온도이지만 바이오물질에 손상을 야기할 수 있는 온도 보다 낮은 온도). 대안적으로, 적합한 멸균제 용액은 단독으로 또는 비접촉성 멸균화(sterilisation) 소스(예, 방사능, 전자빔, UV, 또는 그외 유사한 수단)과 조합하여, 삼투 균형의 수용액을 포함할 수 있거나, 또는 포스페이트 완충화된 염수와 조합한 글루타르알데하이드 수용액을 함유할 수 있다. 0.625% 글루타르알데하이드 용액을 멸균제로서 사용하는 경우, 멸균 시간은 37 ℃에서 1 내지 6일이거나, 또는 50 ℃에서 1 내지 2일일 수 있다. 이러한 최종 멸균 단계는 최종 용기에 바이오물질을 패키징(packaging)한 후 실시하여, 이식할때까지 바이오물질을 어떠한 방식으로도 후속 처리할 필요가 없을 수 있다.

바람직한 일 예에서, 바이오물질은 포타슘 디-하이드로겐 포스페이트 완충액 9.07 g/l를 함유하고 있는 탈이온수 중의 0.25%의 글루타르알데하이드에 노출시킴으로써 멸균시킨다.

멸균 단계는 임의 시간동안 수행될 수 있으며, 보관을 포함할 수 있다. 멸균 온도는 바람직하기로는 60분 이상동안 40-50 ℃에서 수행된다.

바이오물질은 본 발명의 방법으로 처리한 후, 높은 수준의 석회화 내성을 가지며, 즉 "석회화 내성 바이오물질"이다. 용어 "석회화"는 본원에서 연결 조직의 단백질(즉, 콜라겐 및 엘라스틴)을 포함하는, 전통적으로 제조된 바이오물질의 주된 병적 문제점들 중 한가지이다. 이러한 물질들은 체내에 이식된 후 석회화될 수 있는 것으로 이미 입증되었다. 이러한 석회화는 바이오물질이 바람직하지 않은 딱딱하게 되거나 변성되는 결과를 발생시킬 수 있다. 두 가지(2) 유형의 석회화: 이러한 석회화가 발생된 실제 기전(들)은 알려져 있지 않지만, 내인성 및 외인성 석회화는 고정된 콜라겐성 바이오물질에서 발생되는 것으로 알려져 있다. 내인성 석회화는 고정된 콜라겐 매트릭스 및 잔류 세포를 포함한, 생체인공(bioprosthetic) 조직내 칼슘과 포스페이트 이온의 침전을 특징으로 한다. 외인성 석회화는 바이오물질에 유착하는 세포(예, 혈소판)을 포함한, 유착 혈전내 칼슘 및 포스페이트 이온의 침전과 바이오물질상의 칼슘 포스페이트 함유성 표면 플라그의 발생을 특징으로 한다.

따라서, 표현 "높은 수준의 석회화 내성" 또는 "석회화 내성"은 본 발명의 바이오물질을 적용하였을때 바이오물질을 적어도 200일동안 생체내에 이식한 후, 이를 제거한 이후에도 건조 조직의 1 mg당 칼슘의 양이 바람직하기로는 20 ㎍ 미만, 더더 바람직하기로는 10 ㎍ 미만, 및 가장 바람직하기로는 10 ㎍ 미만임을 의미한다.

바람직하기로는, 본 발명의 바이오물질은 또한 효소적 분해에 내성이다. 용어 "효소적 분해에 대한 내성"은 본원에서 본 발명의 바이오물질이 전통적인 고정된 조직과 비교되는 수준으로 효소적 분해를 견디는 능력을 의미한다.

본 발명의 이식가능한 바이오물질 또는 콜라겐 함유 물질이 일단 형성되면, 이를 사용하여 다수의 상태 및/또는 장애들을 치료할 수 있다.

일반적으로, 용어 "치료(treating)", "치료(treatment)" 등은 본원에서 개체 또는 동물, 이들의 조직이나 세포에 원하는 약리학적 및/또는 생리학적인 영향을 미치는 것을 의미한다. 영향은 특히 상태 및/또는 장애의 일부 또는 완전한 치유 측면에서의 치료이다. "치료"는 본원에서 척추동물, 포유류, 특히 인간의 상태 및/또는 장애의 모든 치료를 포괄하며, (a) 상태 및/또는 장애의 저해, 즉 발병 정지; 또는 (b) 상태 및/또는 장애의 증상 완화 또는 개선, 즉 효소적 분해/상태 및/또는 장애의 증상의 회복 유발을 포함한다.

본원에서, 용어 "상태" 및/또는 "장애"는 상호호환적으로 사용되며, 인간을 포함한 동물에게 작용하는 본 발명의 바이오물질을 사용하여 치료가능한 비정상적인 상태를 의미한다. 따라서, 상처, 손상, 조직 변성, 미생물 감염, 화상, 궤양, 진피 상태의 치료가 본 발명에 포함된다. 더욱이, 심장 판막, 대동맥근, 대동맥벽, 대동맥판, 심막 조직, 연결 조직, 경막, 진피 조직, 도관 조직, 연골, 심막, 인대, 힘줄, 혈관, 배꼽 조직, 뼈 조직, 근막, 및 점막밑 조직의 치환도 포함된다.

본 발명의 석회화 내성 바이오물질은 또한 광범위한 임의 의료 장치의 접촉 표면에 적용될 수 있다. 접촉 표면은 특히 인간을 포함하여 동물의 혈액, 세포 또는 그외 체액이나 조직에 접촉시키는 것으로 의도된 표면을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 적합한 접촉 표면은 혈액이나 그외 조직과 접촉시키는 것으로 의도된 의료 장치의 하나 이상의 표면을 포함한다. 의료 장치로는 동맥류 코일(aneurysm coils), 인공 혈관, 인공 심장, 인공 판막, 인공 신장, 인공 힘줄 및 인대, 혈액백, 혈액 산화기(blood oxygenator), 뼈 및 심혈관 치환기, 뼈 보형물, 뼈 왁스, 심혈관 그래프트, 연골 치환 장치, 카테터, 콘택트 렌즈, 세포 및 조직의 배양물 및 재생물의 컨테이너, 색전술 입자(embolization particle), 여과 시스템, 그래프트, 가이드 채널, 삽입성 카테터(in-dwelling catheter), 실험 장치, 마이크로비드, 신경 성장 가이드, 눈 임플란트, 정형외과 임플란트, 인공심장박동기 리드(pacemaker lead), 프로브, 보형물, 션트, 스텐트, 펩티드 지지체(support for peptide), 외과 장치, 봉합사, 시린지, 배뇨관 치환물, 상처 피복물, 상처 드레싱, 상처 치유기 및 그외 당업계에 공지된 의료 장치가 있다.

본 발명의 적용이 이로운 의료 장치의 다른 예는 외과 및 의료 절차 분야의 당업자들에게 매우 분명할 것이며, 따라서, 본 발명에 포함된다. 접촉 표면은 메쉬, 코일, 와이어, 확장 벌룬(inflatable balloon) 또는 혈관내 위치, 루멘내 위치, 고형 조직내 위치 등을 포함한, 표적 위치에 이식되어 있을 수 있는 그외 모든 구조를 포함할 수 있다. 이식가능한 장치는 영구적인 이식 또는 일시적인 이식으로 의도될 수 있다. 이러한 장치는 도관 및 다른 의료용 카테터에 의해 전달되거나 또는 이들 내로 병합될 수 있다.

이러한 장치의 표면을 코팅하는 과정은 국제 특허 출원 WO96/24392에 개시된 바와 같이, 플라즈마 코팅 기법에 의해 수행될 수 있다.

바람직한 일 예에서, 본 발명의 바이오물질은 상처 드레싱과 같이 직접적으로 이용된다. 예컨대, 전술한 바와 같이, 바이오물질을 건조시켜, 상처 드레싱으로 직접 사용될 수 있다.

본 발명의 상처 드레싱은 당업계에 공지된 상처 드레싱과 유사한, 연속 시트 형태가 바람직하다. 그러나, 본 발명은 또한 다른 구체적인 형상을 취할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 상처 드레싱은 전술한 바이오물질의 스톡 시트(stock sheet)를 원하는 디자인 패턴으로 잘라 만들 수 있다. 예컨대, 시트를 바이오물질의 스톡 시트를 다이-컷(die-cut) 할 수 있다.

사용시, 본 발명의 상처 드레싱은 바람직하기로는 상처 자리(wound bed)와 직접 접촉되게 위치된 일차 드레싱으로서 또는 상처 자리에 대해 효과적인 근접 접촉되게 위치된 일차 드레싱으로서 사용된다. 드레싱은 패키징 물질로서 제공될 수 있으며, 필요에 따라 랩, 테이프, 거즈, 패드, 봉합사 또는 클립과 같은 적합한 모든 이차 상처 드레싱 또는 장치를 이용하여 위치에 고정될 수 있다. 드레싱은 일시적 또는 영구적일 수 있으며, 치유된 조직으로 영구적으로 병합될 수 있다. 필요한 경우, 상처 드레싱은 임의의 오버-드레싱 물질을 일차로 제거한 다음, 드레싱을 제거함에 의해 변화되며, 따라서 축적된 임의 괴사 조직 및 삼출물이 걷어지게 된다. 본 발명의 일시적인 상처 드레싱은 새로운 드레싱 또는 다른 적합한 상처 커버링에 의해 교체될 수 있다.

드레싱은 그 전체가 상처에 위치될 수 있다. 본 발명의 드레싱은 수많은 용도 및 이용을 도모하기 위해, 절단, 모양 형성 및 변형될 수 있다.

본 발명의 바이오물질의 다른 용도는 전술한 모든 이용을 포함한 치료학적으로 활성인 물질의 전달에 있다. 치료학적으로 활성인 물질은 상처 치유 과정에 관여하여 개선시킬 수 있으며, 항진균제, 항세균제, 항바이러스제 및 항기생충제, 성장인자, 신생혈관 인자, 항염증제, 항혈전제, 마취제, 뮤코폴리사카라이드, 금속 및 그외 상처 치유제를 비제한적으로 포함한, 항미생물제를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항미생물제의 예로는, 이소니아지드(isoniazid), 에탐부톨(ethambutol), 피라진아미드, 스트렙토마이신, 클로파지민, 리파부틴, 플루오로퀴놀론, 오플록사신, 스파르플록사신, 리팜피신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 다프손, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 시프로플록사신, 독시사이클린, 암피실린, 암포테리신B, 케토코나졸, 플루코나졸, 피리메타민, 설파디아진, 클린다마이신, 린코마이신, 펜타미딘, 아토바큐온, 파로모마이신, 디클라자릴, 어사이클로비르, 트리플루오로유리딘, 포스카르넷, 페니실린, 젠타미신, 강시클로비르, 이아트로코나졸, 미코나졸, Zn-피리티온, 금, 백금, 은, 아연 및 구리를 비제한적으로 포함하는 중금속, 및 클로라이드, 브로마이드, 요오드화물 및 페리오데이트와 같은 염을 포함하는 이들의 조합형, 담체와의 복합체 및 그외 형태가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상처 드레싱 장치에 병합할 수 있는 성장인자 제제로는, 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장인자(aFGF), 신경 성장인자(NGF), 표피 성장인자 (EGF), 인슐린 유사 성장인자 1 및 2(IGF-1 및 IGF-2), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 종양 혈관신생 인자(TAF), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 코르티코트로핀 방출 인자(CRF), 형질변환 성장인자 α 및 β(TGF-α 및 TGF-β), 인터루킨-8(IL-8); 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 인터루킨 및 인터페론이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상처 드레싱에 병합될 수 있는 다른 물질로는, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파리노이드, 더마탄 설페이트, 펜토산 폴리설페이트, 셀룰로스, 아가로스, 키틴, 덱스트란, 카라기닌, 리놀레익산 및 알란토인이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

항염증제 및 항혈전제의 예로는, 엔도메티신, 헤파린, 인도메타신, 이부프로펜, 아스피린, 콜린 살리실레이트, 디플루니살, 마그네슘 살리실레이트, 마그네슘 콜린 살리실레이트, 살살레이트, 플루르비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜, 나프로신, 나프록센 소듐, 옥사프로진, 디클로페낙 소듐, 디클로페낙 미소프로스톨, 에토돌락, 인도시드, 케토롤락, 나투메톤, 설린닥, 톨메틴, 설핀피라존, 디피리다몰, 티클로피딘, 발데코십, 로펙코십, 리폭시캄, 멜록시캄, 메클로페나메이트 소듐, 메페나믹산, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린 마이크로멀젼(cyclosporine micromulsion), 클로람부실, 아나그렐리드, 클로피도그렐 및 실로스트졸(cilostazol)이 있으며; 항혈전제는 헤파린, 아르데파린 및 에녹사파린, 틴자파린, 다나파로이드, 엘피루덴 및 히루딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 항응고제일 수 있다.

치료학적으로 활성인 물질은 당업계에 잘 알려져 있는 방법들에 의해 본 발명의 바이오물질에 물리적 또는 화학적으로 결합될 수 있다.

"포함하는"는 비제한적으로 용어 "포함하는"을 뒷따르는 모든 것을 비제한적으로 포함하는 의미이다. 따라서, 용어 "포함하는"의 사용은 나열된 요소들이 필수 또는 강제임을 의미하며, 다른 요소는 선택적으로 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. "구성되는"는 표면 "구성하는"에 뒷따르는 모든 것을 비제한적으로 포함한다. 따라서, 표현 "구성하는"은 나열된 요소들이 필수 또는 강제임을 의미하며, 그외 다른 요소는 존재되지 않음을 의미하다. "필수적으로 구성되는"은 이 표현 이후에 나열된 모든 요소를 포함하는 것을 의미하며, 나열된 요소에 대해 기재된 내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 또는 책임지지 않는 그외 요소로 한정된다. 따라서, 표현 "필수적으로 구성되는"은 나열된 요소들이 필수 또는 강제적이지만, 다른 요소는 선택적이며 나열된 요소의 활성 또는 작용에 작용하는지 여부에 따라 존재 또는 존재하지 않을 수 있음을 의미한다.

본 발명을 하기 비제한적인 실시예를 예로 들어 추가적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 단지 예를 든 것에 불과하며, 전술한 방법의 보편성으로 한정되는 방식을 취하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 특히, 본 발명은 소, 돼지 및 유대류 기원의 심막, 판막 대동맥근, 판막 편 및 대동맥벽 조직의 치료와 관련하여 구체적으로 설명되지만, 본원의 결과는 이러한 구체적인 조직 또는 동물 기원으로만 한정되는 것이 아님이 명확하게 이해될 것이다.

도 1은 알코올로 전처리한 다음 글루타르알데하이드로 고정한 캥거루 심막 조직을, 글루타르알데하이드 고정 조직, 즉 알코올로 전처리하지 않은 조직 및 "신선한(fresh)" 조직과 비교하여 나타낸 것이다.

도 2는 알코올로 전처리한 다음 글루타르알데하이드로 고정한 캥거루 대동맥 조직을, 글루타르알데하이드 고정 조직, 즉 알코올로 전처리하지 않은 조직 및 "ㅅ신ㅅ선resh)" 조직과 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 (A) 돼지 교두(porcine cusp) 및 (B) 대동맥벽 조직의 효소 분해에 대한 내성을 나타낸 것이다.

도 4는 경피 랫 모델에서 8주 후 (A) 외식한 돼지 판막 교두 및 (B) 돼지의 대동맥벽 조직의 칼슘 농도를 정량하여 나타낸 것이다.

실시예 1 바이오물질의 기본적인 처리

웨스턴 그레이 캥거루 성체의 캥거루 심장을 호주 서부의 전문 캥거루 사냥꾼으로부터 수득하여, 죽은지 4-6시간 이내에 얼음팩에 넣어 실험실로 이동시켰다. 심장을 빙냉한 0.9% 염수액으로 2회 세정하였다. 심막을 적출하고, 조심스럽게 붙어있는 지방을 제거하고 연결 조직을 느슨하게 하였다. 대동맥 판막이 있는 대동맥근을 심장으로부터 적출하여, 0.5 mM 페닐-메틸-설포닐-플루오라이드(PMSF)를 함유하고 있는 빙냉한 0.9% 염수중에 위치시켰다. 심막은 0.5 mM PMSF를 함유하고 있는 빙냉한 0.9% 염수중에서 4 ℃로 철야 보관하였고, 판막이 있는 대동맥근은 PMSF를 함유하고 있는 빙냉한 0.9% 염수로 20분간 세정하였다.

60-80 부피%의 에탄올을 포함하는 수용성 알코올 함유 용액을 준비하였다. 심막을 4 ℃에서 철야 보관한 다음 상기 알코올 용액에 침지하였다. 판막이 있는 대동맥근을 빙냉한 0.9% 염수(0.5 mM PMSF)로 최종 세정한 다음, 즉시 동일한 알코올 용액에 침지하였다. 심막과, 판막이 있는 대동맥근을 최소 24시간동안 약 5 ℃에서 상기 알코올 용액중에 보관하였다.

심막과, 판막이 있는 대동맥근을 알코올 용액으로부터 꺼내어 0.9% 염수로 약 10분간 세정하였다. 세정 단계동안에, 세정액의 온도를 약 10 ℃로 유지하였다.

심막과, 판막이 있는 대동맥근을 포타슘 디-하이드로겐 포스페이트 완충제 9.07g/l를 함유하고 있는 0.625 % 글루타르알데하이드 멸균액에 침지하였다. 글루타르알데하이드 용액의 pH는 소듐 하이드록사이드로 7.4로 조절하였다. 심막과, 판막이 있는 대동맥근을 글루타르알데하이드 용액중에 최소 24시간 동안 1 내지 5 ℃에서 고정하여, 조직의 콜라겐에 존재하는 단백질을 가교시켰다.

심막과, 판막이 있는 대동맥근을 글루타르알데하이드 용액에서 꺼내 약 15분간 0.9% 소듐 틀로라이드 멸균액에 세정하였다. 세정 단계동안, 세정액의 온도를 10 ℃로 유지시켰다.

이후, 심막과, 판막이 있는 대동맥근을 두 가지 대안책으로 처리하였다. 그중 한가지 방법으로, 심장과 판막이 있는 대동맥근을 탈이온수 1 ml 당 디카르복시산 8 mg을 함유하는 완충제 결핍 용액에 침지하였다. 이 용액의 pH는 희석한 하이드로클로르산으로 pH 4.5로 조절하였다. 심막 및 판막이 있는 대동맥근은 상기 용액에 약 48시간동안 약 45 ℃로 침지하였다.

다른 방법으로, 심막과, 판막이 있는 대동맥근을 탈이온수에 용해한 마그네슘염, 페릭염 및 알루미늄 염과 같은 다가 양이온을 함유하는 완충제 결핍 용액에 약 60분간 pH 3.5로 침지하였다.

다음으로, 바이오물질은 멸균 탈이온수중의 포타슘 디-하이드로겐 포스페이트 완충제 9.07g/l을 함유하고 있는 0.25% 글루트라알데하이드 용액중에 조직을 침 지하여, 멸균화하였다. 알데하이드 용액의 pH는 소듐 하이드록사이드로 7.4로 조절하였다. 멸균 과정은 약 120분간 약 45 ℃에서 수행하였다.

대안적으로, 바이오물질을 20 중량%의 에틸 알코올이 조합된 2 % 에폭시프로판을 포함하는 수용액중에 약 24시간동안 37 ℃에서 멸균화하였다. 멸균된 조직은 이후 0.2% 완충화된 글루타르알데하이드 및 15% 이소프로판올 혼합물 중에 보관하였다.

실시예 2 바이오물질에 대한 온도 영향

변성 온도는 가교 안정성의 중요한 수치이며, 물질 강도, 내구성 및 완전성을 반영한다.

소의 심막은 호주 서부의 지방 도살장에서 수득하여, 얼음상에서 실험실로 이동하였다. 심막은 실시예 1에 기재한 것과 같이 세정하였다.

실시예 1에 기재된 방법에 따른 준비한 소 심막의 가교 정도는 0.625%의 완충된 글루타르알데하이드 중에 고정한 소의 심막(심막 대조군)과 비교하였다.

각 군의 대표적인 심막 샘플 스트립(5 x 10 mm)을 PowerLab 데이타 습득 시스템과 데스크탑 퍼스널 컴퓨터가 연결되어 있는 등장성 장력 변환기(isometric force transducer)(MLT0500, AD Instruments, Australia)에 부착하였다. 샘플은 하중 90 + 5 g으로 일정한 신장(constant extension)하에 유지시켰고, 0.9% 염수가 충진된 온도 조절성 개방형 수조내에 침지하였다. 수조의 온도는 약 1.5 ℃/min로 증가시켜 25 ℃에서 95 ℃로 서서히 승온하였다. 수축 온도는 콜라겐성 물질이 변성되었을때 일정한 신장으로부터 뚜렷한 굴곡점(deflection point)에서 표시되었 다. 결과(수축 온도는 ℃로 표시함)은 표 I에 요약하였다.

표 I

조직 타입	수	수축 온도
심막 대조군	10	84.10 + 0.17
심막 처리군	10	85.54 + 0.15

실시예 3 바이오물질의 효소학적 분해

실시예 1의 방법에 따라 준비한 소 심막(심막 처리군)의 효소학적인 분해에 대한 내성 수준을 0.625% 완충화된 글루타르알데하이드에 고정한 소 심장(심막 대조군)과 비교하였다.

프로나제 용액(pronase solution)을 100 mg의 프로나제(스트렙토마이세스 그리세우스) 및 100 mg의 칼슘 클로라이드를 0.1 M 글리신을 함유하고 있는 HEPES 완충제 용액(0.01 M, pH 7.4) 중에 희석하여 준비하였다. 고정한 조직 샘플을 3분간 탈이온수로 세정하고, 블롯팅한 다음, 70 ℃에서 철야 건조한 다음 무게를 측정하였다. 이 샘플을 24시간동안 50 ℃에서 상기 프로나제 용액중에 인큐베이션하였다. 나머지 조직 샘플을 탈이온수에 세정하고 70 ℃에서 철야 건조한 다음 무게를 측정하였다. 프로나제 분해에 대한 내성은 나머지 조직의 무게에 의해 결정하였고, 미리 분해시킨 조직 무게에 대한 백분율로 나타내었다. 그 결과는 표 II에 요약하였다.

표 II

조직 타입	샘플 수	나머지 조직 %
심막 대조군	10	81.98 + 1.97
심막 처리군	10	89.13 + 0.39

실시예 4 바이오물질의 인장 강도

인장 강도는 물질 강도의 중요한 수치이며, 가교된 조직의 내구성을 반영한다.

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조한 소 심막(심막 처리군)의 인장 강도는 0.625% 완충화된 글루타르알데하이드에 고정한 소 심막(심막 대조군)과 비교하였다.

두 군의 조직의 심막 스트립(8 x 80 mm)의 인장 강도는 10 kNewton 하중의 셀이 장착된 하이드라울릭 Zwick/Roell (Model 2010) 인장 테스트 기계에서 50 mm/min의 일정 신장 속도로 측정하였다. 인장 강도 및 파단신율(elongation at break)을 기록한 하중/신장 곡선으로 평가하였다. 결과는 표 III에 요약하여 나타내었다.

표 III

조직 타입	샘플 수	인장 강도(N/mm²)	신장(%)
심막 대조군	10	36.59 + 1.33	14.18 + 1.67
심막 처리군	10	71.82 + 3.33	15.99 + 0.61

실시예 5 바이오물질의 석회화 양상

작은 동물 모델 및 큰 동물 모델에서의 실험 연구를 수행하여, 콜라겐 함유 바이오물질 처리군의 석회화 완화에 있어서의 상기 과정의 효과를 분석하였다.

1차 동물 연구에서, 0.625% 완충화된 글루타르알데하이드(무처리 조직)에만 표준적으로 고정하여 준비한, 캥거루 판막 편과 캥거루 대동맥벽 조직을, 실시예 1(처리 조직)의 방법에 따라 처리한 캥거루 판막 편과 캥거루 대동맥벽 조직과 비교하였다.

양 군의 대동맥벽 조직 샘플(10 x 5 mm 크기)과 대동맥 판막 편을 5분간 0.9% 염수로 세정하였다. 세정한 조직을 성장기(6주령) Wistar 수컷 랫의 중앙 배벽에 만든 피하 포켓(랫 당 각 군에서 샘플 하나)에 외과적으로 이식하였다. 60일 후에, 외식한 조직을 주변 숙주 조직으로부터 적출하여 Biotherm 인큐베이터(Selby Scientific, Perth, WA)내에서 90 ℃에서 48시간 건조하였다. 건조한 샘플의 무게를 측정하였고, 칼슘 내용물은 5.0 ml의 6 N 초순수 하이드로클로르산(Merck, Perth, WA) 중에서 75 ℃로 24 시간동안 추출하였다. 추출가능한 칼슘 내용물은 이후 원자 흡광 분광광도계(atomic absorption spectrophotometer)(Varian AA1275)를 이용하여 측정하였고, 조직 1 mg 당 칼슘 ㎍으로 나타내었다(건조 중량). 이 데이타는 표 IV로 요약하였다.

표 IV

조직 타입	샘플 수	무처리 조직	처리 조직
판막 편	10	6.45 + 4.65	1.3 + 0.74
대동맥벽	10	28.67 + 7.22	1.9 + 0.15

석회화를 완화시키는데 있어, 새로운 과정의 효과는 표 IV에서 명확하게 나타난다. 처리한 조직의 칼슘 농도는 비고정 조직에 정상적으로 존재하는 농도에 상응하였으며, 따라서 표준적인 글루타르알데하이드 고정만을 수행한 것에 비해 새로운 과정이 우수함을 의미한다.

실시예 6 양에서의 추가적인 석회화 실험

추가적인 동물 연구로, 실시예 1에서와 같이 0.625%의 완충화된 글루타르알데하이드에서 고정한 캥거루의 판막이 있는 대동맥 도관(valved aortic conduit)(처리 조직)을 실시예 1에서와 같이 추출한 판막이 있는 대동맥근(무처리 조직)과 비교하였다. 대동맥근은 5분간 0.9 % 염수로 세정하고, 어린(4달된) Merino-Dorset crossbred 양의 폐동맥 위치에 수술로 이식하였다. 이 판막이 있는 임플란트를 200일 후에 제거하고, 판막 편 및 대동맥벽 조직의 칼슘 양을 전술한 바와 같이 원자 흡광 분광광도계로 측정하였다.

결과(건조 조직 1 mg 당 칼슘 ㎍)는 표 V에 요약하였다.

표 V

조직 타입	샘플 수	무처리 조직	처리 조직
판막 편	12	2.54 + 1.30	1.20 + 0.94
대동맥벽	12	137.93 + 12.68	3.22 + 0.75

실시예 8 돼지 유래 조직을 이용한 추가적인 석회화 연구

추가적인 동물 연구로, 완충화된 0.625% 글루타르알데하이드에 고정한 판막이 있는 대동맥 도관(무처리 조직)을 실시예 1에서와 같이 준비한 판막이 있는 돼지 도관(무처리 조직)과 비교하였다. 돼지의 판막이 있는 도관을 5분간 0.9 % 염수로 세정하고, 어린(4달된) Merino-Dorset crossbred 양의 폐동맥 위치에 수술로 이식하였다. 이 판막이 있는 임플란트를 200일 후에 제거하고, 판막 편 및 대동맥벽 조직의 칼슘 양을 전술한 바와 같이 원자 흡광 분광광도계로 측정하였다.

결과(건조 조직 1 mg 당 칼슘 ㎍)는 표 VI에 요약하였다.

표 VI

조직 타입	샘플 수	무처리 조직	처리 조직
판막 편	6	40.68 + 5.39	3.60 + 1.75
대동맥벽	5	142.62 + 14.25	5.54 + 1.99

실시예 9 소 심막의 석회화

추가적인 동물 연구로, 완충화된 0.625% 글루타르알데하이드에 고정한 소 심막(심막 대조군)의 석회화 가능성을, 실시예 1의 방법에 따라 준비한 소 심막(심막 처리군)의 석회화 가능성과 비교하였다. 각 군의 대표 샘플을 1 x 1 cm로 잘라, 5분간 0.9% 염수로 세정하였다. 세정한 조직을 성장기(6주령) Wistar 수컷 랫의 중앙 배벽에 만든 피하 포켓(랫 당 각 군에서 샘플 하나)에 외과적으로 이식하였다. 60일 후에, 이 조직을 꺼내고, 주변 호스트 조직을 회수하여 원자 흡광 분광광도계로 칼슘 함량을 측정하였다. 결과(건조 조직 1 mg 당 칼슘 ㎍)는 표 VII에 요약하였다.

표 VII

조직 타입	샘플 수	나머지 조직 %
심막 대조군	10	136.68 + 11.39
심막 처리군	10	4.10 + 2.11

실시예 10 탈세포 캥거루 심막의 석회화

다른 동물 연구로, 완충화된 0.625% 글루타르알데하이드에 고정한 캥거루 심막(심막 대조군)의 석회화 가능성을, 탈세포화된 실시예 1의 방법에 따라 준비한 캥거루 심막(심막 처리군)의 석회화 가능성과 비교하였다.

각 군의 대표 샘플을 1 x 1 cm로 잘라, 5분간 0.9% 염수로 세정하였다. 세정한 조직을 성장기(6주령) Wistar 수컷 랫의 중앙 배벽에 만든 피하 포켓(랫 당 각 군에서 샘플 하나)에 외과적으로 이식하였다. 60일 후에, 이 조직을 꺼내고, 주변 숙주 조직을 회수하여, 표준 절차에 따라 원자 흡광 분광광도계로 칼슘 함량을 측정하였다. 결과(건조 조직 1 mg 당 칼슘 ㎍)는 표 VIII에 요약하였다.

표 VIII

조직 타입	샘플 수	나머지 조직 %
심막 대조군	5	2.440 + 0.600
심막 처리군	7	0.406 + 0.029

실시예 11 탈세포 캥거루 심막의 재세포화

6번째 동물 실험으로, 완충화된 0.625% 글루타르알데하이드에 고정한 탈세포화된 캥거루 심막(심막 대조군)의 재세포화 가능성을, 실시예 1의 방법에 따라 준비한 탈세포화된 캥거루 심막(심막 처리군)의 재세포화 가능성과 비교하였다. 캥거루 심막을 실온에서 24시간동안 0.25% 트리톤X-100 및 0.25% 소듐 도데실 설페이트 중에 탈세포화시킨 다음, 배양 배지로 20분간 세정하였다. 각 군의 대표 샘플(n=5)을 2 x 2 cm로 잘라, 5분간 0.9% 염수로 세정하였다. 이 샘플을 멸균 상태에서 인간 복재 정맥에서 수득한 인간 섬유모세포에 3.0 x 10⁵ /cm²로 접종하였다. 접종한 심막은 21일 동안 표준적인 정치 세포 배양 조건하에서 37 ℃로 배양하였다. 세포 증식은 매일 7일간 현미경으로 조사하였고, 하기 육안 검사에 따라 분류 하였다:

1) 매트릭스 표면상에 섬유모세포의 존재가 관찰 안됨;

2) 매트릭스 표면의 50% 미만이 섬유모세포로 덮혀있음(+);

3) 매트릭스 표면의 50% 보다 많은 표면이 섬유모세포로 덮혀있음 (++);

4) 매트릭스가 다층의 섬유모세포로 완전히 덮혀 있음 (+++).

신속한 색 분석인 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5디페닐테트라-졸리움 브로마이드 테스트를 21일째에 수행하여, 심막 대조군상에 육안 확인시 섬유모세포가 관찰되지 않으며, 심막 처리군에는 섬유모세포가 육안으로 확인된다는 것을 확인하였다(MTT 방법, Zund et al., 1999, Eur J Cardiothorac Surg., 15(4):519-24). 결과는 표 IX에 요약하였다.

표 IX

시간	심막 대조군	심막 처리군
0일 7일 14일 21일	+ + + + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0	+ + + + + + ++ + ++ ++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++

실시예 12 캥거루 조직의 가교 안정성

2종의 캥거루 조직, 대동맥벽 조직과 캥거루의 심막을 단계 (b)를 포함하는 실시예 1에 언급된 방법, 즉 알코올 용액 전처리 및 이후의 글루타르알데하이드 가교 방법으로 처리하였다. 처리한 조직을 글루타르알데하이드로 고정한 조직, 즉 알코올 전처리 안한 조직 및 "신선한(fresh)" 조직과 비교하였다. 도 1 및 도 2는 심막(도 1) 및 대동맥벽 조직(도 2)의 가교 안정성을 나타낸다. 에탄올을 전처리 하면 ~85 ℃ - 86 ℃에서 가교 안정성에 상당한 영향을 미치는 것을 볼 수 있었다. 이 결과는 표 X에서 볼 수 있다.

표 X

가교 안정성 - 캥거루 심막

수축 온도 (℃) : n = 5
신선한 조직 글루타르알데하이드 고정한 조직 알코올 + 글루타르알데하이드 고정한 조직	66.55 + 1.200 80.74 + 1.047 84.62 + 0.465

p = 0.016 (글루타르알데하이드 고정 대 알코올+글루타르알데하이드 고정)

가교 안정성 - 캥거루 대동맥별

수축 온도 (℃) : n = 5
신선한 조직 글루타르알데하이드 고정한 조직 알코올 + 글루타르알데하이드 고정한 조직	65.00 + 1.423 80.11 + 1.281 86.21 + 0.449

p = 0.002 (글루타르알데하이드 고정 대 알코올+글루타르알데하이드 고정)

실시예 13 랫 경피 모델에서 가교 안정성 및 석회화 양상

본 연구는 실시예 1의 방법으로 처리한 돼지 조직(교두 및 벽)의 가교 안정성 및 석회화 양상을, 글루타르알데하이드로 고정한 대조군 조직과 상업적으로 판매되는 Freestyle^® 및 Prima Plus^® 생체보형 조직과 비교하였다.

판막이 있는 신선한 돼지 대동맥근을 수거하여 포스페이트 완충화된 염수(PBS; 0.1 M, pH7.4) 중, 4 ℃에서 운반하였다. 대표적인 대동맥 판막 교두(n=30) 및 대동맥벽 샘플(n = 30; 10 mm x 15 mm)을 대동맥근에서 취하여 2가지 군으로 나누었다. 판막 교두(n = 15) 및 대표적인 대동맥벽(n = 15; 10 mm x 15 mm) 샘플을 포함한 I 군은 0.25% 완충화된 글루타르알데하이드 중에 보관하였다. 판막 교두(n = 15) 및 대표적인 대동맥벽(n = 15; 10 mm x 15 mm) 샘플을 포함한 II 군은 실시예 1의 방법으로 실시한 다음, 0.25% 완충화된 글루타르알데하이드 중에 보관하였다. 비교를 위해, Freestyle^® 생체보형물 유래 판막 교두(n = 10) 및 대동맥벽 샘플(n = 10; 10 mm x 15 mm)을 3번째(III) 군으로 구성하였고, Prima Plus^® 생체보형물 유래 판막 교두(n = 10) 및 대동맥벽 샘플(n = 10; 10 mm x 15 mm)을 4번째(IV) 군으로 구성하였다.

수축 온도를 측정하여, 조직의 콜라겐 가교 안정성을 분석하였다(Levy et al., 1986, Am. J. Pathol., 122:71-82). 각각의 군에서, 교두 및 대동맥벽 샘플 조직 스트립(5 x 10 mm; n = 10)을 PowerLab 데이타 습득 시스템과 데스크탑 퍼스널 컴퓨터가 연결되어 있는 등장성 장력 변환기(MLT0500, AD Instruments, Australia)에 부착하였다.

샘플은 하중 90 + 5 g으로 일정한 신장(constant extension)하에 유지시켰고, 0.9% 염수가 충진된 온도 조절성 개방형 수조내에 침지하였다. 수조의 온도는 약 1.5 ℃/min로 증가시켜 25 ℃에서 95 ℃로 서서히 승온하였다. 수축 온도는 콜라겐성 물질이 변성되었을때 일정한 신장으로부터 뚜렷한 굴곡점(deflection point)에서 표시되었다.

판막 교두 및 대동맥벽 조직의 수축 온도는 표 XI에 나타내었다. 대조군, 실시예 1의 테스트 과정("테스트"), Freestyle^® 및 Prima Plus^® 교두간에 현저한 차이는 확인되지 않았다. 테스트 과정을 실시한 대동맥벽 조직은 대조군, Freestyle^® 및 Prima Plus^® 벽 조직에 비해 현저하게(p<0.05) 높은 수축 온도를 보였다.

표 XI

판막 교두 및 대동맥벽 조직의 수축 온도(℃)

조직 타입	교두	대동맥벽
대조군 테스트 Freestyle Prima Plus	84.6 + 1.40 85.5 + 0.24 85.7 + 0.35 84.3 + 0.18	86.73 + 0.26 89.34 + 0.19* 86.16 + 0.40 86.37 + 0.34

(n = 10 / 군)

수치는 평균 + 표준편차

*p <0.05 (테스트 대 대조군, Freestyle, Prima Plus).

단백질분해 효소에 의한 분해에 대한 내성은 Girardot & Girardot (J. Heart Valve Dis., 1996, 122: 71-82)의 방법을 토대로 한다. 0.1 M 글리신을 함유하는 HEPES 완충액(0.01 M, pH7.4) 200 ml 중에 프로나제 E(타입 XIV, Streptomyces griseus; Sigma) 10 mg 및 칼슘 클로라이드 100 mg을 용해하여, 프로나제 용액을 준비하였다. 고정한 조직 샘플은 탈이온수에 3분간 세정한 다음, 블롯팅하고, 70 ℃에서 철야 건조하여, 무게를 측정하였다. 이러한 샘플을 프로나제 용액 중에 24시간 동안 50 ℃에서 인큐베이션하였다. 나머지 조직 샘플은 탈이온수에 세정하고, 70 ℃에서 철야 건조하여, 무게를 측정하였다. 프로나제 분해에 대한 내성은 사전-분해한 조직의 무게에 대한 백분율로서 나타낸, 나머지 조직의 무게로 결정하 였다.

효소 분해에 대한 내성은 도 3에 설명되어 있다. 테스트 과정, Freestyle^® 및 Prima Plus^® 교두 조직은, 대조군에 비해 단백질분해성 분해에 대해 현저한(p<0.0001) 내성 증가를 보였다(도 3A). 테스트 과정, Freestyle^® 및 Prima Plus^® 교두 조직간에는 현저한 차이는 보이지 않았다.

테스트 과정을 수행한 대동맥벽 조직은 대조군 조직과 동일한(p = NS) 단백질분해성 분해에 대한 내성을 보였으며, Freestyle^® 및 Prima Plus^® 벽 조직에 비해서는 현저하게(p<0.01) 높은 내성을 나타내었다(도 3B).

어린, 수컷 Wistar 랫(체중 150-200 g)을 두 가지 군으로 나누었다; 제1군(n = 10)에는 교두 임플란트를 제공하였고, 제2군(n = 10)에는 대동맥벽 임플란트를 제공하였다. 4가지 군의 조직 각각의 하나이 샘플을 각 동물에 제공하여, 총 80개의 임플란트를 만들었다.

랫은 펜트바르비탈(Nembutal^®; 45 mg/kg, 복막내)로 마취하였다. 등 근육 부위를 면도하고, 15%의 희석한 클로르헥시딘 글루코네이트(ICI Pharmaceuticals, Perth, WA) 및 에탄올(Merck Chemicals, Perth, WA)으로 소독하였다.

임플란트를 2분간 탈이온수로 잘 세정하여, 남아있는 고정제를 제거한 다음, 등 근육벽쪽 2.5 cm 절개를 통해 경피 포켓에 이식하였다. 절개는 5-0 프롤렌 봉 합사로 봉합하였다.

8주 후에, 바르비투레이트(Euthenase^®)를 과다 투여하여 랫을 죽이고, 피하 임플란트가 있는 등 근육벽을 적출하여, 조직의 칼슘을 정량 및 정성 분석하였다. 회수한 각 샘플을 해부적으로 대칭되게 반반씩 나누었다. 절반은 원자 흡광 분광광도계에 사용하였고, 나머지 반쪽은 10%의 완충화된 포름알데하이드에 고정하여, 조직을 분석하였다.

고정한 샘플을 파라핀 왁스로 포매한 다음, 3 ㎛로 단편화한 다음, Von Kossa 염료를 처리하여, 칼슘을 정성 분석하였다. 조직 검사는 Olympus BHS 광 현미경으로 수행하였다.

모든 군의 이식한 조직 샘플을 주변 숙주 조직으로부터 절개하여, Biotherm 인큐베이터(Selby Scientific, Perth, WA) 에서 48시간 동안 90 ℃에서 건조하였다. 건조된 샘플의 무게를 측정한 다음, 6 N 초순수 하이드로클로르산(Merck, Perth, WA) 5.0 ml 중에 75 ℃에서 24시간 동안 칼슘을 추출하였다. 추출가능한 칼슘 양을 원소 흡광 분광광도계(Varian AA1275)로 측정하여, 조직(건조 무게) mg 당 Ca ㎍으로서 나타내었다.

조직 검사 결과, 이식한 대조군 교두 샘플에 심한 내인성 석회화가 존재하는 것으로 확인되었다(데이타 미첨부). ADAPT, Freestyle 또는 Prima Plus 판막 교두 중 어느 것에서도 가시적인 석회화는 확인되지 않았다(데이타 미첨부).

대조군 샘플에서 이식한 대동맥벽 조직에서 기질(media)의 심각한 석회화가 확인되었다(데이타 미첨부). 이식한 테스트 대동맥벽 조직에서는 가시적인 석회화가 관찰되지 않았다(데이타 미첨부). 이식한 Freestyle (데이타 미첨부) 및 Prima Plus (데이타 미첨부) 대동맥벽 조직에서는 기질의 석회화가 완화된 수준으로 관찰되었다.

이식한 교두의 조직내 정량적인 칼슘 농도는 도 4A에 나타낸다. 글루타르알데하이드로만 고정한 대조군 샘플이, 이 모델에서 가장 높은 칼슘 농도를 보였다(92.37 + 7.9 ㎍/mg). 실시예 1의 방법에 따라 처리한 조직의 칼슘 농도는 2.09 + 0.22 ㎍/mg(조직)이었으며, Freestyle은 2.03 + 0.29 ㎍/mg이고 Prima Plus는 1.54 + 0.17 ㎍/mg이었다. 이러한 결과는, 처리한 교두가 대조군 샘플에 비해 칼슘 농도가 현저하게 감소됨을(p <0.001) 나타낸다. 8주 이후에, 실시예 1, Freestyle 및 Prima Plus 교두의 조직내 칼슘 농도는 서로 현저한 차이가 없었다.

이식한 대동맥벽 샘플의 정량적인 조직 칼슘 농도는 도 4B에 나타내었다. 실시예 1로 처리한 대동맥벽 샘플의 칼슘 농도(4.86 + 0.12 ㎍/mg tissue)는 대조군 샘플(120.11 + 7.48 ㎍/mg tissue)에 비해 현저하게(p <0.001) 낮았다(95.9%). Freestyle 및 Prima Plus의 대동맥벽 샘플은 각각 47.8% 및 51.95%의 석회화 감소를 보였다.

이러한 결과는, 실시예 1의 방법이 피하 랫 모델에서 돼지의 교두 조직 및 벽 조직 둘다의 석회화를 감소시키는데 유효함을 시사한다. 이러한 결과는 또한, 강화된 가교가 대동맥벽의 석회화를 최소화하는데 중요한 기능을 수행함을 시사한다.

Claims

(a) 바이오물질을 알코올 함유액에 적어도 24시간 노출시키는 단계를 포함하는, 이식가능한 바이오물질의 제조 방법.
(a) 바이오물질을 알코올 함유액에 적어도 24시간 노출시키는 단계를 포함하는, 석회화 내성 바이오물질을 제조하기 위한 콜라겐 함유 바이오물질의 처리 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 하기 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

(b) 단계 (a)의 상기 바이오물질을 가교제에 노출시키는 단계; 및

(c) 단계 (b)의 상기 바이오물질을 산성 용액에 노출시키는 단계.
(a) 바이오물질을 알코올 함유액에 적어도 24시간 노출시키는 단계;

(b) 단계 (a)의 상기 바이오물질을 가교제에 노출시키는 단계; 및

(c) 단계 (b)의 상기 바이오물질을 산성 용액에 노출시키는 단계;

를 포함하며,

단계 (b) 및 (c)가 단계 (a) 이후에 연속되는, 이식가능한 바이오물질의 제조 방법.
(a) 바이오물질을 알코올 함유액에 적어도 24시간 노출시키는 단계;

(b) 단계 (a)의 상기 바이오물질을 가교제에 노출시키는 단계; 및

(c) 단계 (b)의 상기 바이오물질을 산성 용액에 노출시키는 단계;

를 포함하며,

단계 (b) 및 (c)가 단계 (a) 이후에 연속되는, 석회화 내성 바이오물질을 제조하기 위한 콜라겐 함유 바이오물질의 처리 방법.
제 3항 내지 제 5항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b) 사이에, 및/또는 단계 (b)와 (c) 사이에 세정 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 내지 제 6항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (a) 이후에 세정 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 바이오물질을 세정하는 단계는 포스페이트가 결핍된 0.9% 염수(saline)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항중 어느 한항에 있어서, 상기 바이오물질은 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 있어서, 상기 바이오물질은 동물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 동물은 양, 소, 염소, 말, 돼지, 유대류(marsupial) 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 있어서, 상기 바이오물질은 배양한 조직, 동물로부터 수득한 세포외 매트릭스를 함유하고 있는 보형물, 또는 재구성된 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 11항중 어느 한항에 있어서, 상기 바이오물질은 심혈관 조직, 골반기저 조직, 심장 조직, 심장 판막, 대동맥근(aortic root), 대동맥벽(aortic wall), 대동맥판(aortic leaflets), 심막 조직(pericardial tissue), 연결 조직, 연기관 또는 고형 기관의 매트릭스, 경막(dura mater), 진피 조직, 도관 조직(vascular tissue), 연골, 심막, 인대, 힘줄, 혈관, 배꼽 조직(umbilical tissue), 뼈 조직, 근막(fasciae), 점막밑 조직 및 피부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 13항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 사용되는 알 코올 함유액은 1종 이상의 수용성 알코올(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 수용성 알코올은 C₁-C₆ 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 C₁-C₆ 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 사이클로헥산올, 이소프로판올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, t-부탄올 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 16항중 어느 한항에 있어서, 상기 알코올 함유액은 완충화되지 않은 수성 용매중에 알코올을 100% 보다 낮은 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 내지 제 17항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (a)는 적어도 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 17항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (a)는 적어도 36시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 17항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (a)는 적어도 48시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 내지 제 20항중 어느 한항에 있어서, 상기 가교제는 카르보디이미드, 폴리에폭시 에테르, 디비닐 설폰(DVS), 제니핀, 폴리알데하이드, 디페닐포스포릴 아지드(DPPA) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21항에 있어서, 상기 폴리알데하이드는 글루타르알데하이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 내지 제 22항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계(c) 이후에 멸균 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 23항중 어느 한항에 있어서, 각 단계는 2 ℃ 내지 40 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항에 있어서, 각 단계는 4 ℃ 내지 30 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항에 있어서, 각 단계는 5 ℃ 내지 25 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 내지 제 26항중 어느 한항에 있어서, 상기 산성 용액은 상기 단계 (b) 이후에 상기 바이오물질에 존재하는 고정 및/또는 고정되지 않은 가교제 모이어티를 불활성화 및/또는 변형시킬 수 있는 산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 내지 제 26항중 어느 한항에 있어서, 상기 산성 용액은 콜라겐상의 활성화된 카르복시기 및 아민기를 가교하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 내지 제 28항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (c)에 사용되는 산성 용액은 아미노카르복시산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29항에 있어서, 상기 아미노카르복시산은 L-히스티딘, L-아르기닌, L-라이신, L-글루타메이트 및 L-아스파르테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 30항중 어느 한항에 있어서, 상기 알코올 함유액, 가교제 및 산성 용액은 모두 완충제가 결핍된 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항 내지 제 31항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (c)는 단계 (d)로 치환 또는 보강되며, 상기 단계 (d)는 하나 이상의 다가 양이온을 함유하는 완충제 결핍 용액에 상기 단계 (b)의 바이오물질을 노출시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 다가 양이온은 마그네슘염, 페릭염 및 알루미늄염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 33항중 어느 한항에 따른 방법에 의해 제조된 석회화 내성 바이오물질.
가교된 콜라겐을 포함하는 석회화 내성 바이오물질로서,

상기 바이오물질의 칼슘 함량은 바이오물질 1 mg 당 약 50 ㎍ 미만이며,

상기 바이오물질은 칼슘의 함량을 50 ㎍/mg(바이오물질) 보다 높게 증가시키지 않으면서, 적어도 200일간 이식되어 있을 수 있는 것을 특징으로 하는, 바이오물질.
제 35항에 있어서, 상기 바이오물질의 이식전 칼슘 함량은 약 20 ㎍/mg(바이오물질) 미만인 것을 특징으로 하는 바이오물질.
제 35항에 있어서, 상기 바이오물질의 이식전 칼슘 함량은 약 10 ㎍/mg(바이오물질) 미만인 것을 특징으로 하는 바이오물질.
제 34항 내지 제 37항중 어느 한항에 따른 석회화 내성 바이오물질을 포함하는 이식가능한 생물학적 장치.
제 38항에 있어서, 상기 바이오물질이 상기 장치의 표면에 코팅된 것을 특징으로 하는 장치.
제 38항 또는 제 39항에 있어서, 적어도 2차 코팅을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 40항에 있어서, 상기 적어도 2차 코팅은 항미생물제, 항바이러스제, 항진균제, 성장인자, 항탈수제 또는 방부제를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 41항에 있어서, 상기 항미생물제는 이소니아지드(isoniazid), 에탐부톨(ethambutol), 피라진아미드, 스트렙토마이신, 클로파지민, 리파부틴, 플루오로 퀴놀론, 오플록사신, 스파르플록사신, 리팜피신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 다프손, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 시프로플록사신, 독시사이클린, 암피실린, 암포테리신B, 케토코나졸, 플루코나졸, 피리메타민, 설파디아진, 클린다마이신, 린코마이신, 펜타미딘, 아토바큐온, 파로모마이신, 디클라자릴, 어사이클로비르, 트리플루오로유리딘, 포스카르넷, 페니실린, 젠타미신, 강시클로비르, 이아트로코나졸, 미코나졸, Zn-피리티온, 비제한적으로 금, 백금, 은, 아연 및 구리를 포함하는 중금속, 클로라이드, 브로마이드, 요오드화물 및 페리오데이트와 같은 염을 포함하는 이들의 조합형, 담체와의 복합체 및 그외 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 41항에 있어서, 상기 성장인자는 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장인자(aFGF), 신경 성장인자(NGF), 표피 성장인자 (EGF), 인슐린 유사 성장인자 1 및 2(IGF-1 및 IGF-2), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 종양 혈관신생 인자(TAF), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 코르티코트로핀 방출 인자(CRF), 형질변환 성장인자 α 및 β(TGF-α 및 TGF-β), 인터루킨-8(IL-8); 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 인터루킨 및 인터페론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 40항에 있어서, 상기 적어도 2차 코팅은 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체, 폴리디옥사논, 폴리카프로락톤, 폴리펩티드, 폴 리카르보네이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리(알킬렌 옥살레이트), 비닐 아세테이트와 불포화 카르복시산과의 공중합체, 수용성 셀룰로스 유사체, 수 분산성 셀룰로스 유사체, 에틸렌 옥사이드 폴리머, 폴리아크릴아미드, 콜라겐, 젤라틴, 폴리(오르토에스테르), 아미노산의 폴리아미드, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에테르에테르케톤, 트리칼슘 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 생체흡수성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 38항 내지 제 44항중 어느 한항에 있어서, 상기 장치는 인공 심장, 내장형 또는 외장형 심장 보조 장치, 심장 판막 보형물, 판막륜링(annuloplasty ring), 진피 그래프트, 혈관 그래프트, 혈관 스텐트, 구조 스텐트, 혈관 션트, 심혈관 션트, 경막 그래프트, 연골 그래프트, 연골 임플란트, 심막 그래프트, 인대 보형물, 힘줄 보형물, 방광 보형물, 가제, 봉합사, 경피내 설치된 영구 장치(permanently in-dwelling percutaneous device), 수술 패치, 심혈관 스텐트, 코팅된 스텐트 및 코팅된 카테터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 45항에 있어서, 상기 장치는 심장 판막 보형물인 것을 특징으로 하는 장치.
제 38항 내지 제 46항중 어느 한항에 있어서, 상기 장치는 조직 단편을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 47항에 있어서, 상기 조직 단편은 동물로부터 수득한 것을 특징으로 하는 장치.
제 48항에 있어서, 상기 동물은 인간, 소, 돼지, 개, 사슴 및 캥거루로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 38항 내지 제 49항중 어느 한항에 있어서, 상기 장치는 합성 조직 유사체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 48항 내지 제 50항중 어느 한항에 있어서, 상기 조직 단편은 복수개의 세포이며, 수술부위에 이식하면 상기 복수개의 세포중 적어도 일부는 조직 단편의 외부로 이동하여, 증식하고, 이식부의 주변 조직으로 통합될 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
가교된 콜라겐을 포함하고 있는 석회화 내성 바이오물질을 포함하는, 생체친화적인 스캐폴드(scaffold)를 포함하는 생체친화적인 임플란트로서,

상기 바이오물질의 칼슘 함량은 바이오물질 1 mg 당 약 50 ㎍ 미만이며,

상기 바이오물질은 칼슘의 함량을 50 ㎍/mg(바이오물질) 보다 높게 증가시키지 않으면서, 적어도 200일간 이식되어 있을 수 있는 것을 특징으로 하는, 생체친 화적인 임플란트.
제 52항에 있어서, 상기 바이오물질의 이식전 칼슘 함량은 약 20 ㎍/mg(바이오물질) 미만인 것을 특징으로 하는 생체친화적인 임플란트.
제 52항에 있어서, 상기 바이오물질의 이식전 칼슘 함량은 약 10 ㎍/mg(바이오물질) 미만인 것을 특징으로 하는 생체친화적인 임플란트.
가교된 콜라겐을 포함하고 있는 석회화 내성 바이오물질을 포함하는, 생체친화적인 스캐폴드를 포함하는 생체친화적인 임플란트로서,

상기 콜라겐은 2급 아민류를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체친화적인 임플란트.
제 55항에 있어서, 상기 스캐폴드는 합성 폴리머, 천연 폴리머, 주사용 겔, 세라믹 물질, 자가 조직, 동종이계 조직, 이종 조직 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체친화적인 임플란트.
(a) 제 38항 내지 제 51항중 어느 한항에 따른 하나 이상의 장치 또는 제 52항 내지 제 56항중 어느 한항에 따른 임플란트를 가지는 멸균 용기; 및

(b) 부상자에게 대한 사용 설명서

를 포함하는 조직의 상처 회복용 키트.
제 57항에 있어서, (c) 부상자로부터 하나 이상의 살아있는 조직 샘플을 수득하기 위한 수득 툴(harvesting tool)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 58항에 있어서, 적어도 하나의 조직 샘플의 생존성(viability)를 유지시키기 위한 하나 이상의 반응제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 58항에 있어서, 상기 수득 툴은 멸균 조건하에서 조직 샘플을 하나 이상의 조직 단편으로 분리하기 위한 프로세싱 툴을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
(a) 제 34항에 따른 석회화 내성 바이오물질을 제공하는 단계; 및

(b) 상기 바이오물질을 치료가 필요한 대상자에게 이식하는 단계;

를 포함하는, 살아있는 조직을 처리하는 방법.
제 61항에 있어서, 상기 석회화 내성 바이오물질이 의료용 장치내로 또는 상에 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 61항 또는 제 62항에 있어서, 상기 석회화 내성 바이오물질을 치료중인 대상자 체내의 원하는 위치에 고정시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 61항 내지 제 63항중 어느 한항에 있어서, 상기 조직을 처리하는 방법은 조직 회복, 조직 벌킹(tissue bulking), 미용적 처리(cosmetic treatment), 치료적 처리, 조직 증대 및 조직 실링(tissue sealing)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
가교된 콜라겐을 포함하고 있는 석회화 내성 바이오물질을 포함하는 상처 드레싱으로서,

상기 콜라겐은 2급 아민류를 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 65항에 있어서, 상기 석회화 내성 바이오물질은 가교전에 알코올에 노출되어진 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 66항에 있어서, 상기 알코올은 C₁-C₆ 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 67항에 있어서, 상기 C₁-C₆ 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 사이클로헥산 올, 이소프로판올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 이소부탄올, sec-부탄올 및 t-부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 65항 내지 제 68항중 어느 한항에 있어서, 상기 가교제는 카르보디이미드, 폴리에폭시 에테르, 디비닐 설폰(DVS), 제니핀, 폴리알데하이드 및 디페닐포스포릴 아지드(DPPA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 69항에 있어서, 상기 폴리알데하이드는 글루타르알데하이드인 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 65항 내지 제 70항중 어느 한항에 있어서, 상기 바이오물질은 양의 콜라겐, 소의 콜라겐, 염소의 콜라겐, 말의 콜라겐, 돼지의 콜라겐, 유대류의 콜라겐 및 인간 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 71항에 있어서, 헤파린, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파란 설페이트, 케라탄 설페이트, 헥스유로닐 헥소스아미노글리칸 설페이트(hexuronyl hexosaminoglycan sulfate), 이노시톨 헥사설페이트 및 슈크로스 옥타설페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 설페이트화된 다당류를 더 포함하 는 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 65항 내지 제 72항중 어느 한항에 있어서, 항미생물제, 항바이러스제, 항진균제, 성장인자, 항탈수제 또는 방부제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 73항에 있어서, 항미생물제는 이소니아지드, 에탐부톨, 피라진아미드, 스트렙토마이신, 클로파지민, 리파부틴, 플루오로퀴놀론, 오플록사신, 스파르플록사신, 리팜피신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 다프손, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 시프로플록사신, 독시사이클린, 암피실린, 암포테리신B, 케토코나졸, 플루코나졸, 피리메타민, 설파디아진, 클린다마이신, 린코마이신, 펜타미딘, 아토바큐온, 파로모마이신, 디클라자릴, 어사이클로비르, 트리플루오로유리딘, 포스카르넷, 페니실린, 젠타미신, 강시클로비르, 이아트로코나졸, 미코나졸, Zn-피리티온, 비제한적으로 금, 백금, 은, 아연 및 구리를포함하는 중금속, 클로라이드, 브로마이드, 요오드화물 및 페리오데이트와 같은 염을 포함하는 이들의 조합형, 담체와의 복합체 및 그외 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
제 73항에 있어서, 상기 성장인자는 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF), 산성 섬유모세포 성장인자(aFGF), 신경 성장인자(NGF), 표피 성장인자 (EGF), 인슐린 유사 성장인자 1 및 2(IGF-1 및 IGF-2), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 종양 혈관신생 인자(TAF), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 코르티코트로핀 방출 인자(CRF), 형질변환 성장인자 α 및 β(TGF-α 및 TGF-β), 인터루킨-8(IL-8); 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF); 인터루킨 및 인터페론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상처 드레싱.
2급 아민류를 포함하는 가교된 콜라겐을 포함하고 있는, 석회화 내성 바이오물질.
제 76항에 있어서, 상기 바이오물질은 콜라겐을 적어도 50% 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오물질.
제 77항에 있어서, 상기 바이오물질은 콜라겐을 적어도 70% 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오물질.
제 78항에 있어서, 상기 바이오물질은 콜라겐을 적어도 90% 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오물질.
제 79항에 있어서, 상기 바이오물질은 본질적으로 콜라겐으로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오물질.