TWI803052B

TWI803052B - 經皮遞送裝置及其使用及製造方法

Info

Publication number: TWI803052B
Application number: TW110142248A
Authority: TW
Inventors: 陳玉暄; 蔡協致; 李展毅; 海爾芬塔洪達格; 林欣榮; 邱紫文; 張嘉佑
Original assignee: 佛教慈濟醫療財團法人
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2023-05-21
Also published as: TW202319042A

Abstract

本揭露提供一種藥物之經皮遞送裝置。該裝置包含可分離之基底，並裝載有基於互穿聚合物網狀水凝膠之雙重藥物。本揭露亦提供製造和使用該經皮遞送裝置之方法。

Description

經皮遞送裝置及其使用及製造方法

本揭露係關於一種經皮遞送裝置，該裝置具有基底及由互穿聚合物網狀水凝膠製成以裝載和遞送藥物的複數個突出部。

藥物遞送的技術領域致力於將藥物遞送至不同器官之靶點，目的在於藉由控制藥物釋放以提高藥物療效並最小化副作用。

迄今為止，有很多種將藥物遞送至人體中以治療癌症的方法，一般分為口服、腸胃外途徑的注射(靜脈、肌內或皮下)和經皮藥物遞送。

然而，口服施用或腸胃外注射途徑都具有影響其有效性的幾個限制；例如，口服施用導致酶消化作用，且因其於進入血液循環之前通過肝臟以發揮治療效果，而可能對肝臟產生副作用。此外，脫靶遞送與不良副作用有關，注射可能對患者有害及痛苦，尤其會增加感染的風險。因此，迫切需要一種有效的癌症治療遞送途徑。

為了克服經由口服途徑施用或腸胃外途徑注射的上述限制，業已開發於皮膚上建立微型途徑的微針(microneedle,MN)，允許分子藥物以經皮遞送裝置進入並到達目標位置。經皮施用藉由將欲擴散至身體循環系統中的藥物製劑施用至皮膚表面，為一種對患者友善且安全的藥物遞送方式。例如，與口服施用或腸胃外注射相比，經皮施用具有許多優點，包含有效遞送以及可吸引局部免疫活化和癌症治療的後續治療結果。微針介導之經皮施用亦優於傳統的靜脈內、肌內或皮下的藥物遞送施用，可最小化藥物於其作用前代謝的風險，亦降低施用頻率。

然而，不像衍生自矽或金屬的微針，使用這些傳統方法製造的可生物降解聚合微針由於缺乏足夠的機械強度而存在例如於施用至皮膚的過程中彎曲和變形的問題。在這方面，聚合方法和單體類型分別是調節微針的機械強度和降解速率以穿透皮膚和增強藥物釋放所需要考慮的問題。

因此，仍需要具有足夠的機械性能且易於使用於皮膚表面之改進的微針裝置。

本揭露藉由提供經皮遞送裝置以提供早期微針的許多缺點的解決方案，該經皮遞送裝置包含複數個突出部(projection)，該複數個突出部各自包含由具有第一鍵聯之第一單體所形成之第一聚合物及由具有第二鍵聯之第二單體所形成之第二聚合物；基底，包含由具有第三鍵聯之該第一單體形成之第三聚合物；以及生物活性劑，其係包含於該複數個突出部之一者中，其中，該複數個突出部耦合至該基底，並配置為至少部分可插入至有需要的個體的皮膚中，且於將經皮遞送裝置施用至皮膚一預定時間後，用以靶向破壞形成該第三聚合物在該基底中的第三鍵聯之化合物移除該基底。

由於改進的機械和化學特性，本揭露的形成微針(MN)的複數個突出部可用於現有微針已失效之應用中。本文所揭示的微針改善現有應用中之性能。例如，本文所揭示之改進的微針可用於現有微針缺乏足夠機械強度的應用，例如，穿透至角質層和如血管、心臟瓣膜、肌肉和皮膚的其他生物組織、刺穿皮膚外層，以及化合物進入血流中的滲透性。本文所揭示之改進的微針亦可用於經皮藥物遞送和腫瘤生長抑制。本揭露亦提供藉由減少腫瘤質量和增加腫瘤部位周圍的免疫活化反應以製造微針和治療癌症的方法。

本揭露提供一種包含互穿聚合物網狀(interpenetrating polymer network,IPN)水凝膠之裝置。在至少一實施例中，水凝膠包含藻酸鈉和磺基甜菜鹼丙烯酸甲酯(SBMA)，其依序與N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺(MBAAm)進行光交聯，接著與鈣離子進行離子交聯。該裝置復包含可分離的基底，包含與雙硫鍵、N,N-雙丙烯醯胱胺酸(N,N-bisacryloylcystine,BISS)交聯的IPN水凝膠，其中，雙硫鍵經二硫蘇糖醇(DTT)和/或乙二胺四乙酸(EDTA)裂解並可與微針陣列分離。

本揭露提供一種裝載有例如脂多醣(LPS)和阿黴素(doxorubicin,DOX)的雙重藥物的藥物遞送裝置，用於協同免疫化學治療結果。LPS是一種經充分研究的免疫刺激大分子，由脂質和多醣組成，能夠藉由分泌如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的強效抗腫瘤促發炎細胞激素，將腫瘤相關巨噬細胞(TAM)重新編程為具有抗腫瘤功能的類M1表現型。根據報導，促發炎細胞激素與如阿黴素(DOX)、放線菌素(dactinomycin)和依托泊苷(etoposide)的多種抗癌藥物具有協同治療作用。LPS進一步誘導抗原呈遞細胞和包含CD4+、CD8+和CD25+以及其他癌症免疫監控的T細胞的活化。在最初的24小時(h)中，從微針中釋放出足夠數量的藥物，接著於接下來的7天內緩慢且持續地釋放。舉例而言，在前24小時分別釋放66.1±7.4%和59.4±5.5%的DOX和LPS。在至少一實施例中，體內研究證明LPS的存在增強免疫調節劑的表現和活化並協同增強免疫化學治療價值。是以，與個別藥物相比，裝載雙重藥物的微針，例如裝載LPS和DOX的微針，於攜帶神經膠質瘤的C57BL/6小鼠誘導顯著腫瘤抑制作用(p<0.05)。因此，聯合藥物至皮下腫瘤附近的微針介導經皮遞送是一種可提高治療效果的有效藥物施用方法，具有可忽略不計的全身不良反應。

在至少一實施例中，本揭露提供一種藥物遞送裝置，包含可分離且機械強度高的微針貼片，其可承受高達0.64N/針，用於高效經皮藥物遞送。在至少一實施例中，微針復包含雙硫鍵交聯劑，以形成可分離基底，其可用還原劑或金屬螯合劑，例如DTT和/或EDTA溶液，分解和去除，同時將微針陣列保留在皮膚內，以持續經皮釋放藥物。

在至少一實施例中，本揭露提供一種呈微針陣列形式的藥物遞送裝置，其裝載有例如雙藥物以經皮施用，接著用二硫蘇糖醇(DTT)和/或乙二胺四乙酸(EDTA)溶液移除微針的可分離基底。在至少一實施例中，微針陣列包含具有可分離基底的互穿聚合物網狀水凝膠，其中，互穿聚合物網狀水凝膠包含藻酸鈉和SBMA單體，其中，該藻酸鈉和SBMA 與MBAAm光交聯並與鈣離子離子交聯。在一些實施例中，該可分離基底包含二硫化物鏈接，例如，N,N-雙丙烯醯基胱胺酸。

本揭露提供一種包含複數個突出部的經皮遞送裝置，該複數個突出部各自包含由具有第一鍵聯之第一單體所形成的第一聚合物及由具有第二鍵聯之第二單體所形成的第二聚合物；基底，包含由具有第三鍵聯之該第一單體所形成的第三聚合物；以及生物活性劑，其係包含於該複數個突出部之一者中，其中，該複數個突出部耦合至該基底，且配置為至少部分可插入至有需要的個體的皮膚中，並且於將經皮遞送裝置施用至皮膚一預定時間後，用以靶向破壞形成該第三聚合物在該基底中的第三鍵聯之化合物移除該基底。

在至少一實施例中，該第一單體是兩性離子。在一些實施例中，該兩性離子是磷醯膽鹼(phosphorylcholine)、磺基甜菜鹼、烷基磺酸吡啶鹽、羧基甜菜鹼、磷酸基甜菜鹼(phosphobetaine)、膦醯基甜菜鹼(phosphonobetaine)、膦基甜菜鹼(phosphinobetaine)、硫酸銨(ammoniosulfate)、胺基磺醯胺(ammoniosulfonamide)、吡啶基羧酸鹽(pyridiniocarboxylate)或磺基羧酸鹽(sulfoniocarboxylate)。在至少一實施例中，該磷醯膽鹼是磷醯膽鹼丙烯酸酯、磷醯膽鹼丙烯醯胺、磷醯膽鹼丙烯酸甲酯、烷氧基二氰乙烯醇酯(alkoxydicyanoethenolate)或2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼。在至少一實施例中，該磺基甜菜鹼是磺基甜菜鹼丙烯酸酯、磺基甜菜鹼丙烯醯胺、磺基甜菜鹼丙烯酸甲酯、磺基甜菜鹼乙烯基咪唑或磺基甜菜鹼乙烯基吡啶。在至少一實施例中，該羧基甜菜鹼是羧基甜菜鹼丙烯酸酯、羧基甜菜鹼丙烯酸甲酯、羧基甜菜鹼丙烯醯胺、羧基甜菜鹼乙烯基咪唑、羧基甜菜鹼甲基丙烯醯胺、羧基甜菜鹼異丁烯或羧基甜菜鹼二烯丙胺。在至少一實施例中，該烷基磺酸吡啶鹽是3-(2-乙烯基吡啶鎓-1-基)丙烷-1-磺酸鹽、N-(2-甲基丙烯醯氧基)乙基-N,N-二甲基銨基丙磺酸鹽或N-(3-甲基丙烯醯基亞胺基)丙基-N,N-二甲基胺基丙磺酸鹽。

在至少一實施例中，該第二聚合物是一種或多種選自由生物相容性合成聚合物、半合成聚合物和天然聚合物所組成之群組。在至少一實施例中，該第二聚合物選自由膠、多醣、多醣衍生物、包含藻酸鈉或藻酸鈣的藻酸鹽、幾丁聚醣、幾丁聚醣衍生物、膠原、明膠、聚葡萄糖、聚(乙烯吡咯啶酮)、羥乙基(heta)澱粉、聚乙二醇、具官能基聚葡萄糖、含海藻糖之糖聚合物、玻尿酸、甲基丙烯酸化玻尿酸、聚(甲基乙烯基醚)、聚(甲基乙烯基醚-alt-馬來酸酐)、聚(乳酸)、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚碳酸酯、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、(2-羧甲基)-3-丙烯醯胺丙基二甲基溴化銨、(2-羧甲基)-3-丙烯醯胺丙基二甲基銨溴化銨-共-甲基丙烯酸羥乙酯、(2-羧甲基)-3-丙烯醯胺丙基二甲基溴化銨-共-丙烯醯胺、甲基丙烯酸化(2-羧甲基)-3-丙烯醯胺丙基二甲基溴化銨-共-丙烯醯胺、聚(ε-己內酯)聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)、聚(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼)、聚(羧基甜菜鹼)乙烯基咪唑、聚(磺基甜菜鹼)乙烯基咪唑以及聚(磺基甜菜鹼)乙烯基吡啶。

在至少一實施例中，該第一單體藉由化學鍵交聯，且該第二單體藉由物理鍵交聯。在至少一實施例中，該化學鍵和物理鍵形成互穿聚合物網絡。在至少一實施例中，該化學鍵藉由選自由N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺(MBA)、胱胺酸之二丙烯醯衍生物(BISS)、辛二亞胺酸二甲酯(dimethylsubermidate)、戊二醛、N,N-亞乙基-雙(碘乙醯胺)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDM)、聚(ε-己內酯)二丙烯酸酯、聚乳酸二丙烯酸酯、聚乳酸二甲基丙烯酸酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)二丙烯酸酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)二甲基丙烯酸酯、聚(ε-己內酯-b-乙二醇-b-ε-己內酯)二丙烯酸酯、乙二醇-b-(乳酸-共-乙醇酸)二甲基丙烯酸酯、包含雙硫鍵、肽鍵或酯鍵之可聚合化合物、聚(ε-己內酯)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCL-MAC)、聚(ε-己內酯-b-乙二醇-b-ε-己內酯)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCL-PEG-PCL-MAC)、聚(乳酸-b-乙二醇-b-乳酸)二丙烯酸酯(AC-PLA-PEG-PLA-AC)、聚(乳酸-b-乙二醇-b-乳酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PLA-PEG-PLA-MAC)、聚[(乳酸-共-乙醇酸)-b-乙二醇-b-(乳酸-共-乙醇酸)]二丙烯酸酯(AC-PLGA-PEG-PLGA-AC)、聚[(乳酸-共-乙醇酸)-b-乙二醇-b-(乳酸-共-乙醇酸)]二甲基丙烯酸酯(MAC-PLGA-PEG-PLGA-MAC)、聚(ε-己內酯-共-乳酸)-二丙烯酸酯(AC-PCLA-AC)、聚(ε-己內酯-共-乳酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCLA-MAC)、聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)二丙烯酸酯(AC-PCGA-AC)、聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCGA-MAC)、聚(ε-己內酯-共-乳酸)-b-乙二醇-b-(ε-己內酯-共-乳酸)二丙烯酸酯(AC-PCLA-PEG-PCLA-AC)、聚(ε-己內酯-共-乳酸)-b-乙二醇-b-(ε-己內酯-共-乳酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCLA-PEG-PCLA-MAC)、聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)-b-乙二醇-b-(ε-己內酯-共-乙醇酸)二丙烯酸酯(AC-PCGA-PEG-PCGA-AC)以及聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)-b-乙二醇-b-(ε-己內酯-共-乙醇酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCGA-PEG-PCGA-MAC)所組成之群組的至少一種交聯劑所形成。

在至少一實施例中，該第一單體與第二單體之比例為約1：1、約1：2、約1：3、約1：4、約1：5、約2：1、約3：1、約4：1或約5：1。

在至少一實施例中，該第三鍵聯是雙硫鍵。在至少一實施例中，該用以靶向破壞形成該第三聚合物在該基底中的第三鍵聯之化合物為二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、麩胱甘肽(GSH)、β-巰基乙醇或L-半胱胺酸。

在至少一實施例中，該複數個突出部各自具有逐漸變細之形狀。在至少一實施例中，該複數個突出部各自具有錐體形或圓錐形。在至少一實施例中，該複數個突出部各自具有介於約25μm至約2,500μm之間的高度、介於約50μm至約250μm之間的寬度以及介於約1μm至約25μm之間的尖端直徑。

本揭露復提供一種製造經皮遞送裝置的方法，包含：製備包含第一單體、第二單體、第一交聯劑及至少一種生物活性劑之第一溶液；製備包含該第一單體及第二交聯劑之第二溶液；將包含該至少一種生物活性劑之該第一溶液施加至倒模，並離心該第一溶液；離心後，移除該第一溶液之上層並將該第二溶液施加至該倒模之頂部；用蓋模蓋住該倒模並進行離心；施加適於引起該第一溶液固化以形成複數個突出部之第一條件；施加適合於引起該第二溶液固化以形成基底之第二條件；以及將該複數個突出部和基底從該倒模中脫模，以獲得該經皮遞送裝置。

本揭露復提供一種在有需要的個體中誘導生物活性之方法，包含：提供如上所述之該經皮遞送裝置；將該經皮遞送裝置施用至該個體之皮膚上，以令該複數個突出部刺穿該個體之皮膚；以及用以靶向破壞形成該第三聚合物在該基底中的第三鍵聯之化合物將該經皮遞送裝置之基底自該個體移除，包含該生物活性劑之該複數個突出部保留於該皮膚中。

圖1A是IPN水凝膠的示意說明，其顯示互穿聚合物網狀(IPN)水凝膠採用SBMA網絡的依序化學交聯，接著為藻酸鹽之網絡與鈣離子(Ca²⁺)的離子交聯，以製造相對堅韌的微針陣列。

圖1B是顯示微針製造的示意圖。

圖2A是二硫化物交聯劑、BISS和L-胱胺酸單體的NMR和拉曼光譜分析，其具有單體的特徵峰，δ=2.89至3.01ppm(a,a’)和δ=3.48ppm(b)。

圖2B顯示二硫化物交聯劑、BISS和丙烯醯氯單體的NMR和拉曼光譜分析，其具有單體特徵峰，δ=5.62ppm(b)，δ=5.80ppm(c)和δ=6.14ppm(a)，用於合成BISS。

圖2C是二硫化物交聯劑、BISS的NMR和拉曼光譜分析，其具有相應的質子光譜出現於δ=3.05ppm(a)和3.4ppm(a’)，δ=4.8ppm(b)，δ=5.85ppm(c)、6.3ppm(c’)和δ=6.45ppm(d)，這證實雙硫鍵交聯劑(BISS)成功合成。

圖2D是識別二硫化物交聯劑(BISS)中形成的共價鍵之拉曼光譜，且BISS中500cm^-1、670cm^-1和1247cm^-1處的特徵拉曼訊號分別代表S-S、C-S和C-C鍵，表明交聯劑成功合成。

圖3A是顯示IPN水凝膠的拉曼訊號出現在約1133cm^-1處的拉曼光譜，代表源自SBMA的SO₃ ^-的不對稱振動。807cm^-1、888cm^-1和954cm^-1處的特徵峰分別代表來自藻酸鈉的C-C、C-O和C-C-O的伸縮振動。1240cm^-1和1413cm^-1的拉曼訊號代表藻酸鹽COO^-伸縮振動，證實IPN水凝膠的形成。MBAAm交聯劑和光引發劑(α-酮戊二酸)的特徵拉曼光譜在IPN水凝膠中不可見，暗示有毒單體完全反應形成IPN水凝膠，且水凝膠可能的有害影響是可忽略的。

圖3B是COO^-訊號從藻酸鈉中的1595cm^-1至IPN水凝膠中的1642cm^-1之化學位移的FT-IR光譜，表明與鈣離子形成離子交聯(-COOCa)。

圖4A至圖4C是SBMA：藻酸鹽單體比例分別為1：1、2：1和3：1的IPN水凝膠內部結構的一系列FESEM影像。

圖5A是微針形態的顯微觀察。

圖5B和圖5C是微針形態的FESEM影像。

圖6A至圖6C是顯示IPN水凝膠的機械性能的折線圖。圖6A是不同交聯條件的IPN水凝膠之拉伸試驗折線圖；圖6B為不同單體比例的IPN水凝膠之拉伸試驗折線圖；以及圖6C是用1：1-Uv60、Ca²⁺30製造的微針貼片的壓縮應力折線圖。

圖7是隨時間變化的微針形態變化的一系列顯微影像，該微針於37℃浸入PBS溶液(pH 7.4)中。

圖8A是可分離IPN水凝膠的示意圖，其具有浸入DTT和EDTA溶液(DTT 20mM，EDTA 100mM)之混合物中的交聯劑。

圖8B是顯示比例為1：10和1：100的交聯劑濃度對可分離IPN水凝膠降解速率的影響的折線圖。

圖8C是顯示不同濃度交聯劑的水凝膠的一系列照片。

圖8D是顯示可分離的IPN水凝膠在不同崩解溶液(n=3)下的崩解的折線圖。

圖9A是顯示在刺入微針之前的小鼠皮膚的照片。

圖9B是微針穿透後留在皮膚上的圓孔的光學影像。

圖9C是微針穿透後皮膚組織的H&E染色影像。

圖9D為小鼠皮膚穿透試驗時的定力裝置之示意圖。

圖9E是皮膚穿透後微針的形態。

圖10A是顯示IPN水凝膠微針(n=3)的體外藥物釋放的曲折線圖，其為DOX之累積釋放。

圖10B是顯示IPN水凝膠微針(n=3)的體外藥物釋放的折線圖，其是LPS之累積釋放。

圖11A是顯示從微針釋放的DOX對CT-2A-Luc細胞和NIH-3T3細胞的化學毒性作用的條狀圖。

圖11B是顯示從CT-2A-Luc細胞和NIH-3T3細胞(n=8)中的微針釋放的DOX的IC₅₀趨勢線的折線圖。

圖12A是顯示治療期間載藥微針在體內的腫瘤抑制，特別是腫瘤體積的折線圖。

圖12B是顯示平行趨勢的照片，以裝載LPS/DOX的微針治療的腫瘤尺寸明顯小於其他製劑。

圖12C是顯示雙重藥物(裝載LPS/DOX的微針)或單獨藥物(裝載LPS的微針或裝載DOX的微針)治療18天後腫瘤重量的條狀圖。

圖12D是顯示用微針治療的小鼠體重與對照組體重的折線圖。

圖13A和圖13B是脾臟和腫瘤組織的免疫組織化學(IHC)染色。

圖14A和圖14B分別顯示DOX和LPS在不同系列濃度下的紫外光-可見光(Uv-vis)吸收光譜和標準校準曲線。

圖15顯示雙硫鍵交聯劑(BISS)及其單體的FTIR光譜。

圖16A和圖16B分別顯示IPN水凝膠對小鼠神經膠質瘤細胞(CT-2A-Luc細胞)和小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3細胞)的生物相容性測試(MTT測定)的結果。(n=8)

參考構成實例的詳細描述的一部分圖式例示性說明實現本揭露之實例。應當理解，在不脫離本揭露之範圍下可使用其他實例，亦可進行更改。

除非另有說明，本說明書和所附申請專利範圍中使用的單數形式「一」、「一」和「該」應視為包含單數和複數形式，除非另有說明或與上下文明顯矛盾。

本文所使用之術語「大約」在值的上下文中是指近似或接近。在一個實例中，術語「約」可包含基於值的有效數的傳統四捨五入。此外，片語「大約x至y」包含「大約x至大約y」。

除非本文另有說明，本說明書和所附申請專利範圍中使用之術語「或」通常包含「和/或」含義中的使用。如本文所用且除非另有說明，連接詞「和/及/以及」旨在包含的，且連接詞「或」並非旨在排外性。例如，片語「或替代地」旨在排外性。

除非本文另有說明，術語「包含」、「具有」、「包含」和「含有」應視為開放性術語(即，意指「包含但不限於」)。

除非本文另有說明，數值範圍之表述僅是對落入該範圍內的所有單一數值的簡稱，每個單獨數值皆包含於說明書中，如同在本文單獨表述。

除非本文另有說明或與上下文相矛盾，否則本文描述的所有方法皆可以任何適當的順序進行。除非另有要求，任何和所有實例或例示性詞語(如，「例如」和「舉例而言」)的使用僅用於闡述本揭露而不限制本揭露的範圍。

如本文所用，術語「預防」或「防止」定義為消除或減少癌症或腫瘤的一種或多種症狀的發生的可能性。例如，本文所述的組成物可用於治療腫瘤或減少腫瘤細胞或治療癌症或減少癌細胞。

如本文所用，術語「治療」或「療法」係關於向有需要的個體施用有效劑量的抗癌藥物以治癒、緩解、治療、改善或預防癌症、其症狀或罹患癌症的風險。可由醫療保健專業人員基於來自任何適當診斷方法的結果來識別該個體。

如本文所用，術語「足夠劑量的藥物」是指足以導致預防癌症及其一種或多種症狀的發展、復發或發作、增強或改善另一種療法的預防效果、降低癌症的嚴重程度和階段、改善癌症的一種或多種症狀、預防癌症的進展和/或增強或改善另一種療法的治療效果。

如本文所用，術語「個體」是需要治療和/或預防癌症的任何生物體。在至少一實例中，該個體是哺乳動物，包含但不限於人類、家養動物(例如大鼠和小鼠)。

基於互穿聚合物網狀水凝膠的施用裝置具有本文所述的經皮遞送裝置的可分離基底，克服早期網絡水凝膠的局限性。本文所述改進的互穿聚合物網狀水凝膠至少在以下方面不同於先前的水凝膠：(1)機械強度，例如，本文提供的堅固微針貼片可承受76.8N(0.64N/針)的壓縮應力值，這證實微針能有效地穿透皮膚(圖6C)；(2)藥物裝載和釋放或藥物的及時釋放，例如，在前4小時觀察到阿黴素(DOX)和脂多醣(LPS)的快速釋放，隨後藉由微針的降解穩定釋放。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)介質中基於互穿聚合物網狀(IPN)水凝膠的微針的降解歸因於水凝膠中的鈉-鈣交換，增強水凝膠的膨脹和崩解，以便於藥物擴散(圖10A和圖10B)；(3)穩定的經皮藥物釋放，例如，微針的吸水和膨脹，隨著時間的推移，由逐漸的結構鬆動所識別(圖7)；(4)微針的二硫化物交聯基底的可分離性，例如，藉由調節崩解劑濃度以提高雙硫鍵連接的IPN水凝膠的崩解速度和微針的可分離性(圖8C和圖8D)；(5)IPN水凝膠的生物相容性，例如，即使在高濃度(0.1g/mL)，用N,N-雙丙烯醯胱胺酸(BISS)或N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺(MBAAm)交聯水凝膠治療的細胞生存率在CT-2A-Luc細胞上大於85%，在NIH-3T3細胞上大於92.6%，這表明水凝膠具有生物相容性，在經皮施用過程中不會影響細胞；(6)在相同濃度之DOX，裝載阿黴素的微針以更高的IC₅₀值治療癌細胞或表現出更好的細胞生存率(圖11A和圖11B)；(7)對腫瘤生長抑制的協同作用，例如，用雙重藥物(裝載LPS和DOX的微針)治療的小鼠的腫瘤生長比用僅裝載DOX的微針治療的小鼠的腫瘤生長受到更多的抑制(圖12A至圖12D)；(8)穿過角質層，將LPS遞送到富含免疫細胞的表皮，並引發如細胞凋亡的廣泛免疫反應，例如，癌細胞響應於藥物(LPS和DOX裝載微針)而發生細胞凋亡，且抑制腫瘤的進展(圖13A和圖13B)。

本揭露之功效將藉由以下實例進一步說明，這些實例並非旨在限制本揭露的範圍。

實施例

實施例1：IPN水凝膠的製造

材料

藻酸鈉、氫氧化鈉(NaOH)、磺基甜菜鹼丙烯酸甲酯(SBMA，95%)、α-酮戊二酸、丙烯醯氯(97%)、甲酸鈣(Ca(HCOO)₂)、L-胱胺酸(

99.7%)、乙二胺四乙酸(EDTA，

98.5%)、D,L-二硫蘇糖醇(DTT，

99%)、甲基噻唑基二苯基-溴化四唑鎓(MTT，

97.5%)、阿黴素(DOX) 和脂多醣(LPS)購自Sigma Aldrich，且N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺(MBAAm，99.5%)購自J.T.Baker。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、杜氏改良Eagle培養基(DMEM)及其補充劑得自Hyclone。

雙硫鍵交聯劑之合成

二硫化物交聯劑，N,N-雙丙烯醯胱胺酸(BISS)，作為微針的可分離基底用於製備IPN水凝膠。將2.7g(11.2mM)L-胱胺酸和2g(50mM)氫氧化鈉(NaOH)在0℃冰浴中溶解於70mL甲醇中。當澄清無色溶液形成時，滴加2.2mL(27.2mM)丙烯醯氯，於室溫下攪拌反應4小時。最後，將反應混合物逐滴加入劇烈攪拌的冷乙醚中純化，並藉由離心分離沉澱物。藉由在真空烘箱中乾燥12小時以移除殘留的乙醚。藉由質子核磁共振光譜(¹HNMR，Bruker AVANCE 600MHz)、拉曼光譜(JASCO NRS-5100 Laser)和傅立葉轉換紅外光譜(FT-IR，Thermo Nicolet 6700系統)驗證BISS的成功合成。

MBAAm交聯預凝膠水凝膠溶液之製備

在藉由化學和離子相互作用形成依序互穿聚合物網狀(IPN)水凝膠之前，N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺(MBAAm)交聯的預凝膠水凝膠溶液製備如下。首先，將0.6984g(500mM)磺基甜菜鹼丙烯酸甲酯(SBMA)單體溶解於5mL去離子(DI)水中，接著加入交聯劑3.8mg(5mM)MBAAm。用電磁攪拌機攪拌至完全溶解後，將光引發劑α-酮戊二酸3.6mg(5mM)加入，避光攪拌。當粉末完全溶解後，將0.5g藻酸鈉加入，攪拌過夜，得到溶解均勻的微黃色黏稠溶液(MBAAm預凝膠水凝膠溶液)。類似地，為微針的可分離基底製備BISS交聯的預凝膠水凝膠溶液。此處使用50mM雙硫鍵交聯劑(BISS)代替5mM MBAAm交聯劑。

基於IPN水凝膠的可分離微針之製造

IPN水凝膠採用SBMA網絡的依序化學交聯，接著為藻酸鹽網絡與鈣離子離子交聯，以製造相對堅韌的微針陣列，如圖1A所示。藉由在市售微針模具(Blueacre Technology，600μm高度的PDMS模具，11×11陣列)中澆鑄，並用微孔板離心機進行離心以保持微針的尺寸、形狀和排列。

簡而言之，將0.5mL的MBAAm預凝膠水凝膠溶液加入微針模具中，並用3D列印模具(熱塑性聚胺酯(TPU)，長15毫米、寬15毫米、高3毫米)緊密覆蓋，防止溶液自微針模具露出。接著，將模具以1,500rpm離心25分鐘，隨後以3,000rpm離心10分鐘，以確保溶液完全填充於微針模具中並緊密堆疊於其上。離心後，移除上層3D列印模具，並刮除上層溶液(微針的底部)。將0.5mL的BISS預凝膠水凝膠溶液添加至微針模具的頂部(微針的底部)，用3D列印模具覆蓋並以1,500rpm離心30分鐘。接著，藉由全波長光纖(full-wavelength fiber optic)光源照射微針模具中的預凝膠溶液60分鐘以進行光交聯，隨後藉由浸入1M鈣離子水溶液(甲酸鈣)中30分鐘進行離子交聯。然後，將其置於空氣中24小時以蒸發水分，將具有所需形狀的完全乾燥可分離微針從模具中剝離。過程如圖1B顯示的示意圖所示。

實施例2：IPN水凝膠的表徵分析

使用拉曼光譜和FT-IR表徵IPN水凝膠之形成。對於拉曼光譜分析，將少量水凝膠樣品置於矽晶片中，藉由掃描300至3,000cm^-1之間的拉曼光譜檢測聚合物中的代表性官能基。取一塊乾燥的水凝膠樣品進行FT-IR檢查，並藉由比較聚合後單體的特徵訊號位移來驗證IPN水凝膠的形成。

此外，使用萬能試驗機(UTM)進行拉伸試驗和壓縮試驗，以研究水凝膠在不同交聯類型、各種單體莫耳比和不同交聯時間下之機械性能。在光學顯微鏡和場發射掃描式電子顯微鏡(FESEM，JSM 6500F，JEOL)下觀察IPN水凝膠和微針的內部結構和表面形態。物理和化學特性評估如下。

IPN水凝膠的膨脹和降解

將製備的微針在37℃浸泡於PBS溶液(pH 7.4)中以評估水凝膠的膨脹率。於30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時和48小時後，用數位電子顯微鏡觀察微針的表面形態變化。類似地，藉由檢查其在不同濃度的DTT和/或EDTA下的降解速率以評估微針的雙硫鍵交聯基底的可分離性。

皮膚穿透試驗

根據實驗動物照護及使用委員會(IACUC-16-168)的基準，使用C57BL/6小鼠的皮膚檢驗微針陣列的皮膚穿透能力。藉由肌肉注射濃度為10mg/mL的0.15mL麻醉劑Zolctil 50麻醉小鼠，接著使用脫毛膏小心地去除小鼠背部施用微針位置的毛髮。接著，如圖9D所示，將微針固定在小鼠皮膚的頂部，並使用自製的推動器固定施力裝置施加10N的垂直向下力，以將針頭刺入皮膚。之後，取出裝置和微針，以台盼藍(trypan blue)染色皮膚，並數位電子顯微鏡觀察穿刺情況。此外，對皮膚進行H&E染色，以詳細檢驗被微針穿刺的皮膚。

裝載藥物至微針

在製備過程中，藉由與5mL MBAAm預凝膠水凝膠溶液混合，將阿黴素(5mg)和/或LPS(2mg)裝載至凝膠中。將藥物溶解在5mL去離子水中，依序與SBMA單體(0.6984g，500mM)、MBAAm交聯劑(3.8mg，5mM)、α-酮戊二酸(3.6mg，5mM)和藻酸鈉(0.5g)混合，並在黑暗中攪拌過夜，接著使用製造微針的相同步驟，使用微針模具製造載藥的微針(裝載DOX的微針、裝載LPS的微針以及裝載LPS/DOX的微針)。

體外藥物釋放

將載藥微針浸泡在10mL PBS溶液(pH 7.4)中，置於37℃和100rpm的振盪培養箱中模擬真實的藥物釋放環境。在最初4小時內，每半小時取出約2.5mL之釋放介質並補充等量體積的PBS。類似地，在第5小時、第6小時、第8小時、第12小時和第24小時收集釋放的培養基，隨後每24小時收集一次，持續7天。之後，藉由分別測量DOX和LPS在485nm和256nm處的UV-Vis吸光度以確定釋放的累積藥物，接著使用游離型藥物的標準校準曲線進行計算，如圖14A和圖14B所示。

生物相容性

使用小鼠神經膠質瘤癌細胞(CT-2A-Luc細胞)和小鼠胚胎成纖維母細胞(NIH-3T3細胞)作為模型細胞系，藉由MTT分析法檢測水凝膠的生物相容性。首先，將細胞培養在裝有完整培養基的T-75培養瓶中，該完整培養基包含在37℃和5% CO₂培養箱之DMEM(90%)、胎牛血清(FBS)(10%)和抗生素(1%)。當匯合度達到80%至90%時，將細胞以1×10⁴細胞/孔的密度繼代培養至96孔板中24小時。同時，將水凝膠樣品浸入離心管內的新鮮培養基中，並在37℃水浴中培育24小時。根據ISO 10993-12將濃度設置為0.1g/mL。接著，去除96孔板中之細胞的舊培養基並以PBS洗滌，以及將水凝膠樣品的培養基加入細胞中，接著培育24小時。下一步，以含有3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)染料(1mg/mL)的100μL新鮮培養基補充舊培養基並培育4小時。然後移除含MTT的培養基，加入100μL DMSO以溶解晶體，接著於30分鐘後培育。然後，使用ELISA微量盤檢測儀(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)讀取樣品在波長570nm(n=8)處之吸光度，並使用如下所示之等式評估細胞生存率的百分比。

動物實驗

七週齡雌性C57BL/6小鼠購自BioLASCO(台灣)。所有動物照護和實驗步驟均按照國防醫學院實驗動物照護及使用委員會(IACUC-16-168)的基準進行。將小鼠飼養在25±2℃和55±5%濕度、12小時明暗循環下的無病原體環境中，並允許自由進食和飲水。接著，在環境適應1週後，將CT-2A-Luc細胞(0.1mL培養基中的1.5×10⁶個細胞)皮下接種至每隻小鼠的右側腹中，並作為發展中的腫瘤模型。將小鼠隨機分為5組 (每組n=6)，每2天用數位卡尺測量腫瘤尺寸。當皮下腫瘤體積達到約30至50mm³(注射後約10天)時，每組小鼠用不同配方的載藥微針治療預定時間間隔。第1組(對照組)：未治療；第2組：用空白微針治療；第3組：用裝載LPS的微針治療；第4組：用裝載DOX的微針治療；和第5組：用5mg/kg LPS和10mg/kg DOX的等效濃度的裝載LPS/DOX的微針治療。將載藥的微針黏貼在皮下腫瘤上，並在24小時內使用DTT(60mM)和EDTA(300mM)溶液去除微針的可分離基底。在整個實驗期間(18天)，每2天測量並記錄腫瘤尺寸和體重，以評估不同治療組的抗腫瘤效果或腫瘤生長抑制率。分別使用下式(1)和(2)計算腫瘤體積(V)和腫瘤生長抑制率。

式中，W和L分別代表最短和最長的腫瘤直徑，而Vc和Vt分別代表治療結束時對照組和治療組的平均腫瘤體積。

最後，用頸椎脫位術犧牲小鼠，收集各組的脾臟和腫瘤組織，按照Darge 2021方案固定於4%(w/v)PBS緩衝三聚甲醛中。然後，由台灣拓生科技有限公司的專家進行組織染色和免疫組織相容性分析。

統計分析

每次測量至少重複3次，並以平均值±標準偏差報告數值。使用雙測學生t-檢定進行組間變異數的統計分析，P<0.05視為具有統計學意義。星號表示統計顯著性(*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001)。

二硫化物交聯劑的合成與表徵

合成N,N-雙丙烯醯胱胺酸(BISS)雙硫鍵交聯劑以製備可分離的微針基底，該基底可容易地從微針陣列中移除，並最小化微針使用者的不適。在將微針擠壓入皮膚後，形成微針基底的交聯聚合物的雙硫鍵經可裂解雙硫鍵的還原劑(例如DTT)或經螯合水凝膠藻酸鹽網絡中的Ca²⁺離子之螯合劑(例如EDTA)溶解。因此，微針的可分離基底很容易被還原劑或金屬螯合劑分解和去除，而微針陣列保留在皮膚內以實現藥物的持續經皮釋放。

二硫化物交聯劑(BISS)的成功製備首先藉由¹HNMR得到證實。在圖2C中，相應的質子光譜出現在δ=3.05ppm(a)和3.4ppm(a’)、δ=4.8ppm(b)、δ=5.85ppm(c)和6.3ppm(c’)和δ=6.45ppm(d)，驗證雙硫鍵交聯劑(BISS)的成功合成。圖2A和2B亦顯示單體的特徵峰。如圖2A所示，δ=2.89和3.01ppm(a,a’)和δ=3.48ppm(b)處的訊號分別為L-胱胺酸的亞甲基和次甲基質子。類似地，如圖2B所示，δ=5.62ppm(b)、δ=5.80ppm(c)和δ=6.14ppm(a)處的光譜為合成BISS的丙烯醯氯單體的代表性峰。

拉曼光譜亦用於鑑定二硫化物交聯劑(BISS)中形成的共價鍵。顯然地，如圖2D所示，BISS中500cm^-1、670cm^-1和1247cm^-1處的特徵拉曼訊號分別代表S-S、C-S和C-C鍵，表明交聯劑合成成功。

此外，如圖15所示，FT-IR結果進一步證明BISS的合成成功。C=O鍵的振動訊號從丙烯醯氯中的1810cm^-1和L-胱胺酸中的1680cm^-1到BISS中的1703cm^-1的特徵偏移是形成交聯劑的指標。

實施例3：IPN水凝膠的表徵

使用拉曼光譜和FT-IR證實藉由SBMA的依序自由基聚合(化學交聯)，接著為藻酸鈉與鈣離子的離子交聯所成功製備的IPN。如圖所示。如圖3A所示，IPN水凝膠的拉曼訊號出現在約1133cm^-1處，表明源自SBMA的SO^3-的不對稱振動。類似地，觀察到分別在807cm^-1、888cm^-1和954cm^-1的特徵峰指定用於藻酸鈉中的C-C、C-O和C-C-O的伸縮振動。此外，1240cm^-1和1413cm^-1的拉曼訊號代表藻酸鹽COO^-的伸縮振動，證實IPN水凝膠的形成。顯然地，MBAAm交聯劑和光引發劑(α-酮戊二酸)的特徵拉曼光譜在IPN水凝膠中是不可見的，表明有毒單體完全反應形成IPN水凝膠，以及水凝膠可能的有害作用可忽略不計。

使用FT-IR光譜進一步表徵IPN水凝膠，該FT-IR光譜可用於檢測聚合前後聚合物的官能基。如圖3B所示，COO訊號從藻酸鈉中的1595cm^-1化學位移至IPN水凝膠中的1642cm^-1意指與鈣離子(-COOCa)離子交聯的形成。此外，IPN水凝膠的1720cm^-1出現尖銳訊號是由於SBMA單體的C=O的振動，這清楚地證明水凝膠的化學交聯。聚合後光引發劑和MBAAm交聯劑的代表性FT-IR訊號的消失也進一步證實IPN水凝膠的形成。

IPN水凝膠的形態

藉由場發射掃描式電子顯微鏡(FESEM)研究藉由不同莫耳比的SBMA單體和藻酸鈉交聯形成的IPN水凝膠的內部結構。保持其他參數不變(用MBAAm光交聯60分鐘，用1M Ca²⁺離子交聯30分鐘)，藉由將0.5M、0.67M和0.75M SBMA與0.5M、0.33M和0.25M藻酸鈉反應，分別增加SBMA：藻酸鹽的莫耳比從1：1至2：1和3：1。

IPN水凝膠的FESEM影像顯示多孔結構，這主要是由於SBMA的聚合。如圖4A至圖4C所示，隨著SBMA：藻酸鹽莫耳比的增加，水凝膠內孔的尺寸增加。可能原因之一為在光聚合的固定時間間隔(60分鐘)內，聚合的SBMA單體數量會受到限制，故隨著SBMA比例的增加，水凝膠的交聯密度降低。由於IPN水凝膠的孔徑與共聚物的交聯密度成反比，觀察到相對較大的孔徑為3：1的比率(圖4C)。另一方面，隨著藻酸鈉比例的降低，IPN水凝膠的離子交聯密度降低，其內部孔隙增加。然而，需要具有更好機械性能的水凝膠來製造穿透皮膚的強微針，並且選擇具有更高交聯密度(1：1比例)的水凝膠進行進一步的實驗。

因此，使用1：1莫耳比的SBMA和藻酸鹽單體用於使用微針模具製造微針，並使用光學顯微鏡和FESEM影像確認微針的形狀。如圖5A至圖5C所示，乾燥的微針的光學和FESEM影像均證實形成具有指定排列的微針陣列的均勻尺寸和形狀。FESEM影像的能量分散光譜(EDS)分析也證實聚合物在微針陣列中的均勻分佈。微針的尖端相當長；例如，針高至少為600μm、針基座至少為300μm、針尖間距至少為600μm以及陣列數至少為11×11=121。微針的尖端足夠鋒利，可以穿透皮膚的表皮。

表1：IPN水凝膠製備的微針陣列規格

IPN水凝膠的機械強度

使用萬能試驗機(UTM)研究IPN水凝膠在不同條件下的機械性能，例如交聯類型(離子交聯、光交聯或兩者的組合)和用於聚合的單體莫耳比。

如圖6A和下表2所示，評估具有不同交聯方法的IPN水凝膠的機械性能。與藉由離子交聯(1M Ca²⁺ 30分鐘)(2.302MPa)或依序光離子交聯(2.71MPa)所形成的水凝膠相比，藉由光交聯(UV持續60分鐘)形成的水凝膠具有最高的最大拉伸強度3.449MPa。然而，與離子交聯(113%)或依序光離子交聯(80%)水凝膠相比，其應變較低(20%)。在本文中，僅由化學交聯網路形成的水凝膠表現出極高的機械結構，具有高拉伸強度但易碎。相反地，僅由離子交聯形成的水凝膠具有最高的延伸率(應變=113%)但拉伸強度最低(應力=2.301MPa)，表明物理交聯的水凝膠機械強度低、結構柔軟、韌性突出。就本質而言，本揭露中藉由依序光聚合(化學交聯)和離子相互作用(物理交聯)形成的水凝膠表現具有最佳拉伸強度(2.71MPa)和應變(81%)及最高楊氏模數(1.32MPa)，其足夠堅固和硬以使針穿透皮膚。

進一步檢驗不同莫耳比的SBMA和藻酸鈉單體(1：1、2：1和3：1)的IPN水凝膠的機械性能。圖6B中的拉伸試驗描繪IPN水凝膠的機械強度和韌性隨著SBMA：藻酸鈉的比例從1：1增加至2：1和3： 1而逐漸降低，這歸因於交聯網絡的密度。如圖4所示，在IPN水凝膠的FESEM結果中，交聯網絡的密度隨著SBMA與藻酸鈉比例的增加而降低，隨後內部孔徑增加。由圖6B和表2可看出，本揭露中1：1莫耳比的單體具有較好的交聯網絡密度，能夠得到機械強度相對較好的水凝膠(2.71MPa最大拉伸強度、81%應變和1.31MPa楊氏模數)。一般而言，SBMA和藻酸鈉的莫耳比為1：1的依序光交聯(60分鐘)和離子交聯(1M Ca²⁺持續30分鐘)會產生具有更好機械強度的緻密IPN水凝膠，同時保持良好的延展性。

表2：不同交聯條件和單體比例下IPN水凝膠的機械性能

1：1-Uv 60=1：1莫耳比的SBMA和藻酸鈉光聚合60分鐘。

1：1-Ca²⁺ 30=1：1莫耳比的SBMA和藻酸鈉與Ca²⁺(1M)離子交聯30分鐘

D/t=不同

此外，如圖6C所示，由IPN水凝膠以1：1-Uv60、Ca²⁺ 30(即，單體比例1：1以及光交聯60分鐘，然後Ca²⁺離子交聯30分鐘)製備之微針配方可承受76.8N(0.64N/針)的壓縮應力值，證實微針有效穿透皮膚。水凝膠的這種依序雙重交聯提供比由PLA/PLGA共聚物製成之微針更強的微針陣列(~0.15N/針)(Li等人Nat Biomed Eng 3(3)(2019)220-229)和PVA/PVP共聚物(~0.17N/針)(Song等人，ACS Biomater Sci Eng 6(7)(2020)4116-4125)。

膨脹和降解特性

微針的膨脹行為藉由將其浸泡在37℃的PBS溶液(pH 7.4)中進行評估，並在顯微影像觀察形態變化。如圖7所示，微針吸水並膨脹，隨著時間的推移，結構逐漸鬆動。24小時後，IPN水凝膠的內部結構解體，大部分微針的形狀塌陷。微針結構的這種膨脹和隨後的塌陷歸因於PBS溶液中鈉離子的存在，這是與藻酸鈣水凝膠網絡的離子交換反應。IPN水凝膠中藻酸鹽COO^-基團上的鈣離子逐漸被鈉離子取代，COO^-基團上的靜電排斥力增加。結果，水凝膠的互穿網絡逐漸鬆散且水凝膠的膨脹增加，隨後微針的結構塌陷。這是從微針中穩定經皮藥物釋放的基本現象。

微針的二硫化物交聯基底的可分離性

微針的二硫化物交聯基底的可分離性取決於二硫化物交聯IPN水凝膠的分解速率。將水凝膠浸泡在還原劑(DTT)和/或金屬螯合劑(EDTA)溶液中，藉由在不同時間間隔1小時測量剩餘重量以確定可分離二硫化物交聯IPN水凝膠的崩解速率。在固定崩解劑濃度下的不同單體：交聯劑比例下或在不同崩解劑濃度下保持單體與交聯劑比例下檢查降解速率。

交聯劑濃度對可分離IPN水凝膠降解速率的影響示於圖8A和圖8B。將交聯劑濃度為百分之一的水凝膠浸入DTT和EDTA的混合物 (DTT 20mM，EDTA 100mM)中，1小時後完全崩解，而交聯劑濃度為單體的十分之一時，大約41%的水凝膠在相同的時間間隔內(1小時)保留。高濃度交聯劑的水凝膠內部結構相對緻密，不易在短時間內崩解。然而，在低交聯劑濃度下，內部結構中存在的空隙和表面積的增加導致IPN水凝膠的崩解率更高。

亦在不同的水性環境中研究以1：100的交聯劑與單體比例製備之可分離水凝膠的降解速率，該水性環境包含PBS、DTT 20mM、DTT 40mM、DTT 60mM、EDTA 100mM、EDTA 200mM、EDTA 300mM和EDTA 300mM+DTT 60mM水溶液。如圖8C和8D所示，水凝膠在PBS溶液中的分解最少，而在30分鐘的培育過程中，只有不到10%的水凝膠保留在EDTA 300mM和DTT 60mM的混合溶液中。因此，可藉由調節崩解劑的濃度以提高雙硫鍵連接的IPN水凝膠的崩解率和微針的可分離性。

皮膚穿透測試

以C57BL/6小鼠皮膚測試微針是否穿透皮膚。用固定的施力裝置將微針擠入皮膚並用台盼藍染色後，在光學顯微鏡下觀察皮膚上的圓孔(圖9B)。用H&E染色以進一步檢驗微針穿透後皮膚組織的組織學，以研究微針穿透到皮膚中的深度。如圖9C所示，可能是角質層之皮膚外層被微針完全穿透(紅色箭頭)。這結果表明，基於IPN水凝膠的微針陣列具有足夠的機械強度，可穿透小鼠皮膚的外層，以實現有效的經皮施用。如圖9E所示，穿透後微針陣列的形狀沒有明顯變形，進一步證明微針的高機械強度。

體外載藥和釋放

研究IPN水凝膠的藥物釋放行為。首先，藉由與IPN水凝膠預凝膠溶液(0.5mg DOX/微針和0.2mg LPS/微針)簡單混合，隨後澆鑄微針和依序光離子交聯，將DOX和/或LPS裝載至水凝膠中，以獲得載藥固體微針陣列(裝載DOX的微針、裝載LPS的微針和裝載LPS/DOX的微針)。接著，將載藥的微針浸入10mL PBS溶液中，並保持在37℃、100rpm旋轉的迴轉式震盪培養箱中。如圖10A和圖10B所示，由於藥物在微針陣列表面的高擴散速率，觀察到在前4小時內DOX和LPS的快速釋放，接著因微針的降解而穩定釋放。PBS介質中基於IPN水凝膠的微針的降解主要歸因於水凝膠中的鈉鈣交換，增強水凝膠的膨脹和崩解以促進藥物擴散。PBS中的鈉離子與IPN水凝膠藻酸鹽片段中的鈣離子緩慢交換，導致交聯劑崩解，水凝膠結構最終完全塌陷，如圖7所示，釋放微針中殘留藥物、DOX、LPS等內容物。然而，如圖7所示，PBS中微針的快速降解伴隨24小時內分別釋放近66.1±7.4%和59.4±5.5%的DOX和LPS，其餘藥物在約7天內釋放。這種及時釋放藥物為遞送足夠劑量的藥物至目標部位並實現有效治療的優勢之一。與DOX相比，LPS的釋放速度相對較慢，部分原因在於其分子量較大，且LPS中重複的羧基和磷酸基團的化學結構可能在鈣離子存在下形成物理交聯而導致釋放緩慢。

IPN水凝膠的生物相容性

水凝膠的生物相容性是體內應用不可或缺的關注點。因此，藉由針對CT-2A-Luc細胞和NIH-3T3細胞的MTT測定在體外評估水凝膠的生物相容性。藉由與水凝膠萃取物共培養，用水凝膠處理細胞後，加入 MTT染料，並根據活細胞線粒體中570nm處紫色晶體的吸光度強度確定水凝膠的生物相容性。因此，即使在高濃度(0.1g/mL)的水凝膠樣品下，用BISS或MBAAm交聯水凝膠治療的細胞的生存率在CT-2A-Luc細胞上大於85%，在NIH-3T3細胞上大於92.6%，表明水凝膠具有顯著的生物相容性，並且在藉由經皮藥物遞送進入皮膚後不會影響細胞，如圖16所示。

裝載DOX的微針的細胞毒性

藉由MTT測定評估裝載DOX的微針對CT-2A-Luc細胞和NIH-3T3細胞的抗癌作用。如圖11A所示，隨著DOX濃度的增加，細胞生存率(%)顯著降低，導致CT-2A-Luc和NIH-3T3細胞的細胞生存率分別為35.7±4.7%和41.1±3.4% μg/mL，表明裝載DOX的微針在相當濃度下治療癌細胞的有效性。此外，使用高斯公式評估裝載DOX的微針對於CT-2A-Luc細胞的半抑制濃度(IC₅₀)為1.088μg/mL，對於NIH-3T3細胞的半抑制濃度(IC₅₀)為3.23μg/mL(圖11B)。IC₅₀值越低，藥物的細胞生長抑制能力越強。在此，與癌細胞(CT-2A-Luc細胞)不同，NIH-3T3細胞對DOX具有較高的IC₅₀值，或在相同濃度的DOX下表現出更好的細胞生存率，這表明與正常細胞相比，癌細胞中的DOX內化增強。

雙重載藥微針的體內抗腫瘤功效

微針介導的LPS和DOX經皮共遞送的效率及其對腫瘤生長抑制的協同作用以帶有C57BL/6的神經膠質瘤小鼠評估。顯然，直接瘤內(IT)、腫瘤周邊(PT)或靜脈內(IV)注射抑制腫瘤的治療劑可能導致藥物滲漏至附近組織，從而降低治療效果和安全性。然而，微針介導的局部經皮藥物遞送可藉由改善藥物向腫瘤深處的擴散並導致高腫瘤累積以避免這些問題。此外，微針在聯合治療中發揮重要作用，多種藥物可裝載到微針中，並以持續的方式應用，以發揮協同價值。由於包含蘭格漢氏細胞(LC)、樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞的高密度免疫細胞在皮膚組織中累積，微針介導的LPS和DOX的經皮共遞送將具有癌症治療的免疫化學治療的有效協同作用，因為免疫刺激分子LPS有很好的機會與這些免疫細胞相互作用並將其活化，以增強化學治療藥物DOX的治療效果。

如上所述，將載藥可分離微針(裝載LPS的微針、裝載DOX的微針和裝載LPS/DOX的微針)和空白的可分離微針應用於皮下腫瘤，以經皮遞送抗癌藥物。24小時後用少量EDTA(300mM)和DTT(60mM)去除微針的可分離基底，其低於最小毒性劑量，接著如圖12B所示，藉由測量外部腫瘤體積監測腫瘤生長隨時間的進展18天。載藥微針陣列穿透皮膚角質層並在局部穩定釋放藥物以有效抑制腫瘤。最後，每組的腫瘤生長概況總結於圖12A和圖12B中。

如圖12A所示，與對照組(未治療)或用顯示快速腫瘤生長的空白微針治療的小鼠相比，用載藥微針治療的小鼠顯示出對腫瘤生長的顯著抑制。在治療期結束時(18天)，用裝載LPS的微針、裝載DOX的微針和裝載LPS/DOX的微針治療的小鼠的平均腫瘤體積分別為552.4±205.6mm³、345.4±220.2mm³和253.0±176.9mm³，顯著低於對照組(1696.8±447.6mm³)或空白微針(1468.31±460.68mm³)治療的小鼠。值得注意的是，用雙重藥物(LPS/DOX裝載的微針)治療的小鼠的腫瘤生長甚至比裝載DOX的微針治療的小鼠的腫瘤生長受到極大的抑制。這可歸因於化學治療藥物(DOX)的協同作用和LPS的顯著免疫刺激作用伴隨不同抗癌免疫細胞調升。圖12B中腫瘤的照片亦顯示出用裝載LPS/DOX的微針治療的腫瘤尺寸明顯小於其他配方之平行趨勢。此外，圖12C所示的腫瘤重量進一步驗證雙重藥物(裝載LPS/DOX的微針)比單一藥物(裝載LPS的微針或裝載DOX的微針)具有更好的腫瘤生長抑制。不同治療組的平均體重(21.8±1.1至23.3±0.5g)在治療期間沒有顯著改變並且沒有動物死亡。然而，如圖12D所示，與對照組不同的是，用微針治療的小鼠的體重在治療的前2天明顯下降，再與對照組平行增加。這是由於在將可分離的微針固定在腫瘤上時的麻醉注射以及微針對小鼠的不適感，直到24小時內去除可分離的基質。如本文所提供的可分離微針對於抗癌藥物在附近的經皮遞送是方便且有效的，並且提供一種最小化藥物的全身毒性和副作用的方法。

免疫組織化學

LPS能夠抑制樹突狀細胞(DC)的凋亡並增強樹突狀細胞介導的CD4+T細胞增殖，調升CD80、CD86、CD69和CD25表現以及細胞激素分泌，如TNF-α和IL-6。因此，為了闡明LPS對體內抗癌活性的免疫刺激作用，採集各組的脾臟和腫瘤組織並進行染色，以檢測CD25+、CD4+、CD69+、CD8+、TNF-α和活化的半胱天冬酶3等級作為代表性的免疫調節劑生物標誌物。組織病理學資料是藉由使用光學顯微鏡檢查H&E染色的載玻片而產生的，實驗動物增殖和非增殖變化的受影響器官的百分比是基於國際命名和診斷標準協調會(International Harmonization of Nomenclature and Diagnostic Criteria，INHAND)。

CD25+是一種存在於活化T細胞和活化B細胞上的I型跨膜蛋白，為免疫細胞調升的可靠免疫組織化學標誌物。因此，CD25+主要在含有微針的LPS治療的小鼠中高表現，正訊號主要出現在紅髓的脾竇，但少量訊號亦出現在脾的生發中心。裝載LPS/DOX的微針治療組的正訊號主要高於其他組別。如圖13A所示，LPS(裝載LPS的微針和裝載LPS/DOX的微針)治療小鼠脾臟組織中，CD4+和CD69+T細胞顯著調升，而在對照組中相對較低，這表明藉由LPS對主要抗原呈遞細胞，B細胞，的活化和增殖。正訊號經常出現在生發中心的動脈周圍淋巴鞘(periarteriolar lymphoid sheath，PALS)或紅髓脾竇中。在LPS治療的腫瘤組織中，LPS治療的腫瘤組織中CD8+T細胞和TNF-α的表現顯著增加，並伴隨腫瘤生長抑制，表明LPS能夠局部增強癌症免疫治療的免疫細胞。LPS刺激單核細胞轉化為M1巨噬細胞，隨後M1巨噬細胞藉由直接攻擊或藉由招募其他免疫細胞或分泌各種細胞激素間接在消滅癌細胞中發揮重要作用。CD8+正訊號多見於壞死組織和腫瘤周邊區域，而TNF-α主要存在於腫瘤周邊組織的腫瘤細胞和發炎細胞中。雖然在裝載LPS/DOX的微針中沒有腫瘤細胞，但在連接組織的一些發炎細胞中觀察到顯著更高的TNF-α訊號，表明聯合藥物有效地消除癌細胞。

如圖13B所示，裂解的半胱天冬酶3或活化的半胱天冬酶3是凋亡細胞的另一種生物標誌物，能夠在細胞凋亡過程中降解多種細胞蛋白質和細胞中的DNA片段，且是從圖13B所示之IHC檢驗中所發現，表明裂解的半胱天冬酶3在第3、4和5組的腫瘤組織上的過度表現，這證實癌細胞主要響應於聯合藥物(LPS/DOX/微針)而發生凋亡，並且腫瘤的進展受到顯著抑制。結果如上圖12中所證明的減小的腫瘤尺寸一致。

正訊號多出現在中央壞死區和壞死區，在細胞質和細胞核中訊號較強。最近，儘管化學治療在臨床上取得巨大的成功，但其有效性受到異質性腫瘤微環境的強烈影響。另一方面，依賴於調節患者免疫系統來識別和破壞惡性細胞的免疫療法或癌症疫苗接種在癌症治療中具有典範轉移。然而，作為疫苗注射至循環系統中的大多數生物分子，例如肽和核酸，更容易受到體液中酶促降解的影響。因此，巧妙地使用微針作為經皮遞送免疫刺激分子或疫苗的載體是癌症免疫療法的一項重大突破，在這種療法中，生物分子免受酶促攻擊並被遞送到抗原呈遞細胞(APC)密集的皮膚中。

在此，微針陣列穿透角質層並將LPS遞送至富含免疫細胞的表皮，且引發廣泛的免疫反應，包含樹突狀細胞的成熟。接著，樹突狀細胞的成熟能分別活化B細胞和CD8+T細胞以進行體液性免疫和細胞性免疫，並為化學治療提供協同價值。因此，微針介導的經皮施用系統是一種有吸引力的癌症免疫原性和治療方法。

Claims

一種經皮遞送裝置，包含：複數個突出部，各自包含由具有第一鍵聯之第一單體所形成之第一聚合物及由具有第二鍵聯之第二單體所形成之第二聚合物；基底，包含由具有第三鍵聯之該第一單體所形成之第三聚合物；以及生物活性劑，其係包含於該複數個突出部之一者中，其中，該複數個突出部耦合至該基底，並配置為至少部分地可插入有需要的個體的皮膚中，且於將該經皮遞送裝置施用至皮膚一預定時間後，用以靶向破壞形成該第三聚合物在該基底中的第三鍵聯之化合物移除該基底，其中，該第一單體係藉由化學鍵交聯，該第二單體係藉由物理鍵交聯，且該化學鍵和物理鍵形成互穿聚合物網狀，其中，該第三鍵聯為雙硫鍵。
如請求項1所述的經皮遞送裝置，其中，該第一單體為兩性離子。
如請求項2所述的經皮遞送裝置，其中，該兩性離子為磷醯膽鹼、磺基甜菜鹼、烷基磺酸吡啶鹽、羧基甜菜鹼、磷酸基甜菜鹼、膦醯基甜菜鹼、膦基甜菜鹼、硫酸銨、胺基磺醯胺、吡啶基羧酸鹽或磺基羧酸鹽。
如請求項3所述的經皮遞送裝置，其中，該磷醯膽鹼為磷醯膽鹼丙烯酸酯、磷醯膽鹼丙烯醯胺、磷醯膽鹼丙烯酸甲酯、烷氧基二氰乙烯醇酯或2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼。
如請求項3所述的經皮遞送裝置，其中，該磺基甜菜鹼為磺基甜菜鹼丙烯酸酯、磺基甜菜鹼丙烯醯胺、磺基甜菜鹼丙烯酸甲酯、磺基甜菜鹼乙烯基咪唑或磺基甜菜鹼乙烯基吡啶。
如請求項3所述的經皮遞送裝置，其中，該羧基甜菜鹼為羧基甜菜鹼丙烯酸酯、羧基甜菜鹼丙烯酸甲酯、羧基甜菜鹼丙烯醯胺、羧基甜菜鹼乙烯基咪唑、羧基甜菜鹼甲基丙烯醯胺、羧基甜菜鹼異丁烯或羧基甜菜鹼二烯丙胺。
如請求項3所述的經皮遞送裝置，其中，該烷基磺酸吡啶鹽為3-(2-乙烯基吡啶鎓-1-基)丙烷-1-磺酸鹽、N-(2-甲基丙烯醯氧基)乙基-N,N-二甲基銨基丙磺酸鹽或N-(3-甲基丙烯醯基亞胺基)丙基-N,N-二甲基胺基丙磺酸鹽。
如請求項1所述的經皮遞送裝置，其中，該第二聚合物為一種或多種選自由生物相容性合成聚合物、半合成聚合物及天然聚合物所組成之群組。
如請求項1所述的經皮遞送裝置，其中，該第二聚合物為選自由膠、多醣、多醣衍生物、包含藻酸鈉或藻酸鈣的藻酸鹽、幾丁聚醣、幾丁聚醣衍生物、膠原、明膠、聚葡萄糖、聚(乙烯基吡咯啶酮)、羥乙基(heta)澱粉、聚乙二醇、具官能基聚葡萄糖、含海藻糖之糖聚合物、玻尿酸、甲基丙烯酸化玻尿酸、聚(甲基乙烯基醚)、聚(甲基乙烯基醚-alt-馬來酸酐)、聚(乳酸)、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚碳酸酯、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、(2-羧甲基)-3-丙烯醯胺丙基二甲基溴化銨、(2-羧甲基)-3-丙烯醯胺丙基二甲基銨溴化銨-共-甲基丙烯酸羥乙酯、(2-羧甲基)-3-丙烯醯胺丙基二甲基溴化銨-共-丙烯醯胺、甲基丙烯酸化(2-羧甲基)-3-丙烯醯胺丙基二甲基溴化銨-共-丙烯醯胺、聚(ε- 己內酯)聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)、聚(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼)、聚(羧基甜菜鹼)乙烯基咪唑、聚(磺基甜菜鹼)乙烯基咪唑以及聚(磺基甜菜鹼)乙烯基吡啶所組成之群組。
如請求項1所述的經皮遞送裝置，其中，該化學鍵為藉由選自由N,N’-亞甲基雙丙烯醯胺(MBA)、胱胺酸之二丙烯醯衍生物(BISS)、辛二亞胺酸二甲酯、戊二醛、N,N-亞乙基-雙(碘乙醯胺)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDM)、聚(ε-己內酯)二丙烯酸酯、聚乳酸二丙烯酸酯、聚乳酸二甲基丙烯酸酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)二丙烯酸酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)二甲基丙烯酸酯、聚(ε-己內酯-β-乙二醇-β-ε-己內酯)二丙烯酸酯、乙二醇-β-(乳酸-共-乙醇酸)二甲基丙烯酸酯、包含雙硫鍵、肽鍵或酯鍵之可聚合化合物、聚(ε-己內酯)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCL-MAC)、聚(ε-己內酯-β-乙二醇-β-ε-己內酯)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCL-PEG-PCL-MAC)、聚(乳酸-β-乙二醇-β-乳酸)二丙烯酸酯(AC-PLA-PEG-PLA-AC)、聚(乳酸-β-乙二醇-β-乳酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PLA-PEG-PLA-MAC)、聚[(乳酸-共-乙醇酸)-β-乙二醇-β-(乳酸-共-乙醇酸)]二丙烯酸酯(AC-PLGA-PEG-PLGA-AC)、聚[(乳酸-共-乙醇酸)-β-乙二醇-β-(乳酸-共-乙醇酸)]二甲基丙烯酸酯(MAC-PLGA-PEG-PLGA-MAC)、聚(ε-己內酯-共-乳酸)-二丙烯酸酯(AC-PCLA-AC)、聚(ε-己內酯-共-乳酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCLA-MAC)、聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)二丙烯酸酯(AC-PCGA-AC)、聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCGA-MAC)、聚(ε-己內酯-共-乳酸)-β-乙二醇-β-(ε-己內酯-共-乳酸)二丙烯酸酯(AC-PCLA-PEG-PCLA-AC)、聚(ε-己內酯-共-乳酸)-β-乙二醇-β-(ε-己內酯-共-乳酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCLA-PEG-PCLA-MAC)、聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)-β-乙二醇-β-(ε-己內酯-共-乙醇酸)二丙烯酸酯(AC-PCGA-PEG- PCGA-AC)以及聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)-β-乙二醇-β-(ε-己內酯-共-乙醇酸)二甲基丙烯酸酯(MAC-PCGA-PEG-PCGA-MAC)所組成群組的至少一種交聯劑所形成。
如請求項1所述的經皮遞送裝置，其中，該第一單體與第二單體之比例為1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、2：1、3：1、4：1或5：1。
如請求項1所述的經皮遞送裝置，其中，該用以靶向破壞形成該第三聚合物在該基底中的第三鍵聯之化合物為二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、麩胱甘肽(GSH)、β-巰基乙醇或L-半胱胺酸。
如請求項1所述的經皮遞送裝置，其中，該複數個突出部各自具有逐漸變細之形狀。
如請求項13所述的經皮遞送裝置，其中，該複數個突出部各自具有錐體形或圓錐形。
如請求項13所述的經皮遞送裝置，其中，該複數個突出部各自具有介於25μm至2,500μm之間的高度、介於50μm至250μm之間的寬度以及介於1μm至25μm之間的尖端直徑。
一種製造如請求項1之經皮遞送裝置的方法，包含：製備包含第一單體、第二單體、第一交聯劑及至少一種生物活性劑之第一溶液；製備包含該第一單體及第二交聯劑之第二溶液；將包含該至少一種生物活性劑之第一溶液施加至倒模，再離心該第一溶液；離心後，移除該第一溶液之上層並將該第二溶液施加至該倒模之頂部；用蓋模蓋住該倒模以進行離心；施加適於引起該第一溶液固化以形成複數個突出部之第一條件；施加適於引起該第二溶液固化以形成基底之第二條件；以及將該複數個突出部和基底從該倒模中脫模，以獲得該經皮遞送裝置。