CN115916321A - 用于原位接种细胞的微针贴片 - Google Patents

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Abstract

嵌合抗原受体T细胞(CAR T)疗法在根除B细胞恶性肿瘤方面达到了一个里程碑，但尚未获得对实体瘤的有益效果。公开了一种多孔微针贴片，其可将CAR T细胞携带至实体瘤(或其它细胞类型)。该装置是一种蜂窝状多孔微针贴片，其可容纳CAR T细胞并允许在实体瘤手术切除后原位渗透介质接种CAR T细胞。加载在微针尖端孔中的CAR T细胞很容易以均匀分散的方式被护送至肿瘤，而不会失去它们的活性。与直接瘤内注射相比，这种微针介导的局部递送增强CAR T细胞的浸润和免疫刺激。这种可定制的贴片为用于治疗多种疾病的活细胞的分散接种提供了转化平台。可以将其它细胞类型加载到多孔微针中。

Description

用于原位接种细胞的微针贴片
相关申请
本申请要求2020年6月12日提交的美国临时专利申请号63/038,724的优先权，其通过引用并入本文。根据35U.S.C.§119和任何其他适用的法规要求优选权。
技术领域一般地涉及结合微针的贴片，其用于递送哺乳动物组织中的细胞，该细胞包括但不限于实体瘤中嵌合抗原受体T细胞(CAR T)。关于联邦政府资助的研究与开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号CA234343下的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
工程化有特异性肿瘤相关抗原(TAA)靶向能力的嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞在血液恶性肿瘤中显示出显著的效力。2017年，美国食品和药物管理局(FDA)批准使用CD19-靶向CAR T细胞疗法来治疗小儿急性淋巴细胞白血病。相比之下，使用CAR T细胞治疗实体瘤的临床评估尚未显示出显著的抗肿瘤效果。实体瘤的特点是独特的微环境(TME)，具有阻碍CAR T细胞的抗肿瘤效应的物理和生理化学屏障。例如，这包括异常的脉管系统、致密的细胞外基质和间质，以及间质液压力和防止CAR T细胞浸润肿瘤床的物理屏障。此外，TME中的免疫抑制细胞和可溶性因子阻碍CAR T细胞的增殖和效应功能。
CAR T细胞的术后原位给予为克服实体瘤中的物理障碍提供了一种潜在的解决方案。手术切除大块肿瘤延迟肿瘤复发、解除物理屏障并将残留的癌细胞暴露于内源性效应T细胞。然而，手术后残留微肿瘤的局部扩散对过继转移的CAR T细胞的精确递送造成了严重的障碍。需要其它治疗方式。
发明内容
在一个实施方式中，提供了一种聚合物蜂窝状多孔微针(PMN)贴片，其可以在其中容纳细胞如CAR T细胞，并允许在外科肿瘤切除术后分散接种这些细胞，这可以充分覆盖残留肿瘤并提供CAR T细胞的广泛分布以引发TAA特异性细胞毒性。在一个实施方式中，微针支架由生物相容性的交联聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)形成，并在用盐酸蚀刻掉其中含有的牺牲性CaCO3微粒(～8μm直径)后提供足够的机械力，在微针结构中留下蜂窝状的孔。在肿瘤插入过程中，驻留在孔中的CAR T细胞免受刮擦(scraping)，同时微针(高达15×15阵列)提供144mm2的插入面积，其中均匀的递送点(225个尖端)确保充足的分散细胞递送。据推测，多孔微针贴片介导的CAR T细胞递送在实体瘤手术后促进CAR T细胞的分布和渗透，从而导致肿瘤根除。
在一个实施方式中，用于将活的嵌合抗原受体T(CAR T)细胞局部递送至活组织的多孔微针贴片包括基部(base)，基部具有从基部的表面延伸出的多个微针，其中多个微针由其中形成有孔的可生物降解或可溶解的聚合物形成，其中孔中含有活的CAR T细胞。微针可由不同的可聚合聚合物形成。这些例如包括聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或壳聚糖。在一个优选实施方式中，所使用的聚合物是甲基丙烯酰氯修饰的多臂PLGA。孔径使得孔可以容纳细胞。例如，在一些实施方式中，孔的平均直径在约5-20μm的尺寸范围内。
在另一个实施方式中，用于将活细胞局部递送至活组织的多孔微针贴片包括基部，基部具有从基部的表面延伸出的多个微针，其中多个微针包括其中形成有孔的交联的甲基丙烯酰氯修饰的多臂聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，其中孔中含有活细胞。在各种实施方式中，细胞可以包括CAR T细胞、多能干细胞和树突细胞。
在另一个实施方式中，一种制造用于将活细胞局部递送至活组织的多孔微针贴片的方法，包括：提供其中含有多个针形空腔的模具；将含有可聚合聚合物、交联剂和牺牲性微粒的溶液施加到模具；交联该溶液以创建贴片；从模具中取出贴片并将其放入溶胀溶液中；将溶胀的贴片放入蚀刻溶液中以去除牺牲性微粒并在多孔微针贴片中形成孔；和将细胞加载到多孔微针贴片的孔中。
多孔微针贴片可通过将贴片(含有活细胞)应用于哺乳动物组织来使用。组织可包括患病或未患病组织。多孔微针贴片(其含有CAR T细胞)可应用于例如已从活组织切除或切离肿瘤的区域邻近或周围的组织。多孔微针贴片也可以直接应用于肿瘤组织。一个特定的应用是使用CAR T细胞，但其它类型的细胞可以加载到多孔微针贴片中并递送到组织。
附图说明
图1A示出了根据一个实施方式的用于递送CAR T细胞的贴片的平面图。该贴片包括基部或基底(substrate)以及从其表面延伸出的多个微针。还示出了可选的背衬。
图1B示出了贴片的截面图，其示出了基部或基底和从其表面延伸出的多个微针。CAR T细胞被示出为设置在微针和基部或基底内。图1B中也可以看到可选的背衬。
图1C示出了一种用于经皮治疗剂递送的贴片，其被施用于哺乳动物(例如人类)的组织。
图1D示出了用于递送CAR T细胞的贴片的替代实施方式的平面图。
图2A示出了多孔微针贴片(PMN)制造的示意图，包括蚀刻牺牲性微粒以在多孔微针贴片的微针中形成孔。
图2B示意性地示出了多孔微针贴片的CAR T细胞加载和CAR T细胞加载的PMN(PMN@CAR T)向手术后肿瘤床的施用。
图2C是多孔微针贴片的代表性照片，比例尺：2mm。
图2D是PMN尖端的代表性SEM图像，显示了多孔结构，比例尺：50μm。
图2E是具有不同层宽的PMN横截面的代表性SEM图像，比例尺：20μm。
图2F是PMN@CAR T共聚焦图像的3D重建。分别地，CAR T细胞用CFSE标记，并且微针贴片用罗丹明B标记，比例尺：100μm。
图3A-3F：PMN在体外促进3D肿瘤模型中的CAR T细胞浸润。图3A：用CFSE标记的CSPG4+CAR T细胞与CSPG4-表达WM115肿瘤细胞共培养三天。呈现了显示CFSE稀释的代表性流式细胞术直方图。图3B：(图3A)中CFSE的相对平均荧光强度，指示了T细胞增殖，n＝5。图3C：CSPG4+CAR T细胞与萤火虫荧光素酶标记CSPG4-表达WM115肿瘤细胞共培养三天。示出了培养三天后的相对荧光素酶强度，n＝5。图3D：用于在体外将CAR T细胞递送至3D肿瘤模型中的三种方法(逐滴、单针注射和PMN)的示意图。3D重建示出了CAR T细胞和WM115癌细胞在T细胞施用后第三天在3D肿瘤模型中的分布，比例尺：300μm。在T细胞施用于3D肿瘤模型后，第三天，人类IFN-γ(图3E)和IL-2(图3F)的细胞因子水平，n＝5。数据表示为平均值±SD，通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算统计显著性。P值：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，n.s.意指没有显著差异。
图4A-4H：PMN促进CAR T细胞在体内的更广泛分布。在(图4A)单针瘤内注射和(图4B)PMN插入后，CAR T细胞在WM115肿瘤内的分布，比例尺：1mm。CAR T细胞预先标记有DIR。图4C：接种在术后肿瘤床内的荧光素酶-表达CAR T细胞的T细胞生物发光。在切除腔内(RC注射)、使用单针瘤内注射(IT注射)或通过多孔微针辅助植入物瘤内注射(PMN注射)直接递送CAR T细胞。图4D：示出了施用后第12天的T细胞生物发光，n＝5。图4E：(图4C)中T细胞生物发光的动力学。图4F：在CAR T细胞治疗后第12天，用肿瘤裂解物检测到的人类IL-2和IFN-γ水平，n＝5。在CAR T细胞给予后第12天，肿瘤内CAR T细胞(CD3阳性)的代表性流式细胞术图(图4G)和量化(图4H)，n＝5。数据表示为平均值±SD，通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算统计显著性。P值：*P<0.05；***P<0.001。
图5A-5G：由PMN递送的CAR T细胞显示出增强的抗肿瘤作用。图5A：借助切除腔用通过RC注射、IT注射或PMN注射给药的CAR T细胞治疗的WM115-携带小鼠的代表性肿瘤生物发光。(图5B)肿瘤生物发光的动力学和(图5C)治疗后第15天的肿瘤生物发光。图5D：使用卡尺测量的肿瘤生长动力学，治疗后取下的肿瘤的(图5E)重量和(图5F)尺寸，n＝5。(图5G)显示治疗后肿瘤内的CD4+和CD8+T细胞的代表性免疫荧光，比例尺为100μm。数据表示为平均值±SD，通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算统计显著性。P值：*P< 0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图6示出了4-臂-PLGA的1H NMR光谱。还示出了4-臂-PLGA的分子结构。
图7A示出了CaCO3微粒的SEM图像，比例尺：10μm。
图7B示出了CaCO3微粒的尺寸分布。
图8示出了含CaCO3的微针贴片在1,4-二氧己环中溶胀之前(左)和之后(右)的图像。
图9示出了多孔微针贴片的SEM图像；比例尺：200μm。
图10示出了未蚀刻的多孔微针的截面的SEM图像；比例尺：20μm。
图11示出了未蚀刻的实心微针(SMN)、多孔微针(PMN)和加载CAR T细胞的PMN(PMN@CAR T)的机械强度图。
图12A是用计数珠计算的CAR T细胞的代表性流式细胞术定量。
图12B是显示CAR T细胞在多孔微针贴片中的加载量和加载效率的直方图。
图13示出了在WM115细胞上表达的CSPG4的流式细胞术分析。
图14A示出了在不同条件下T细胞与WM115细胞共温育后人类IFN-γ的细胞因子水平，n＝5。数据表示为平均值±SD，通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算统计显著性。P值：***P<0.001，n.s.意指没有显著差异。
图14B示出了在不同条件下T细胞与WM115细胞共温育后人类IL-2的细胞因子水平，n＝5。数据表示为平均值±SD，通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算统计显著性。P值：***P<0.001，n.s.意指没有显著差异。
图15示出了在手术后第3天、第6天和第9天，在肿瘤部位给予荧光素酶-表达CAR T细胞的小鼠的生物发光图像。
图16示出了用CAR T细胞处理后12天，外周血中CD3阳性T细胞的代表性流式细胞术，n＝5。右侧的直方图显示了RC注射、IT注射和多孔微针贴片(PMN)注射的外周血中CAR T细胞的％。数据表示为平均值±SD，通过单因素方差分析和Tukey事后检验计算统计显著性。P值：***P<0.001。
图17示出了肿瘤的代表性免疫荧光图像，显示了用TUNEL处理后的凋亡细胞，比例尺：100μm。
具体实施方式
图1A和1B示出了用于将活细胞30(见图1B)递送至如图1C所示哺乳动物组织100的多孔微针贴片10(在本文中有时也称为PMN)。在一个特定实施方式中，递送的细胞30是CART细胞。然而，在其它实施方式中，细胞30可包括干细胞，例如用于组织再生的多能干细胞。其它细胞30包括用于免疫疗法应用的树突细胞。哺乳动物组织100可包括患病组织，例如实体瘤组织。组织100也可以包括健康组织。在一个实施方式中，多孔微针贴片10可施用于患病组织周围或邻近(例如围绕肿瘤边缘)的组织，其可能含有残余肿瘤细胞(例如其中细胞30是CAR T细胞)。图2C示出了多孔微针贴片10的一个实例的摄影影像。
如图1A和1B所示，多孔微针贴片10包括基部或基底12，其包括从基底12延伸出或突出的多个微针14。在一些实施方式中，多孔微针贴片10或其组件(例如微针14和/或基部或基底12)可以部分地或完全地可生物降解。多个微针14通常从基部或基底12的表面沿垂直方向延伸出或突出(见图1B)。多个微针14可以布置成如图1A所示的规则重复阵列，或者，可替换地，它们可以以随机图案布置。在一个实施方式中，形成在基部或基底12上的多个微针14可以具有基本相似的形状和尺寸。然而，在其它实施方式中，多个微针14可具有不同的形状和/或尺寸。例如，从基部或基底12延伸出的微针14的阵列或场地的周边区域可以比多孔微针贴片10的中心区域的那些更长或具有不同的形状，以更好地将多孔微针贴片10固定到施用部位。其它配置也是可以的。
在一个特定实施方式中，微针14具有针状形状。例如，微针14可包括有助于刺入组织100(见图1C)的尖锐尖端16(见图1B)。微针14的长度(L)可以变化，尽管典型地微针14从基部或基底12延伸出小于约2.0mm(图1B)。微针14的典型长度为约500-1,500μm，尽管尺寸可以超出该范围。微针14的基部18比尖端16宽。通常，微针14的基部18的直径或宽度(W)可以小于约600μm(例如250μm的基部和约1,500μm的高度)(图1B)。微针14可以以可以是数百μm(例如200μm)的节距或间距彼此分开。微针14的特定数量、密度、尺寸和形状由用于形成多孔微针贴片10的模具的特定构造控制，这在下面进行了更详细地描述。
仍然参考图1A和1B，保持微针14的基部或基底12可以任选地结合或以其它方式粘附到背衬材料20(例如通过使用粘合剂、化学连接等)。背衬材料20可以由机织织物(wovenfabric)、塑料材料(诸如聚氯乙烯、聚乙烯或聚氨酯)或乳胶制成。背衬材料20可以是柔性的，使得多孔微针贴片10在施用时可以共形地覆盖组织100(见图1C)。任选地，背衬材料20可包括覆盖背衬材料20的全部或部分面向组织的表面的粘合材料22。例如，可以在背衬材料20上环绕基部或基底12的周边或在背衬材料20上形成粘合剂，使得基部或基底12可以适当地固定在组织100的表面上。粘合材料22有助于将多孔微针贴片10固定到组织100。粘合材料22可以包括树脂(例如乙烯基树脂)、丙烯酸酯(例如甲基丙烯酸酯环氧二丙烯酸酯)。替代地，多孔微针贴片10可通过微针14在组织100中的接合而固定到组织100。在又一其它替代方案中，可以使用位于基部或基底12上的粘合剂或胶水将多孔微针贴片10固定到组织100。单独的绷带或包裹物也可用于将多孔微针贴片10固定到组织100。
在图1D所示的一个替代实施方式中，可以将多个子贴片24整合到背衬材料20中以制成最终的多孔微针贴片10。这对于可能对基部或基底12造成破损风险的大覆盖区域或弯曲表面可能是有用的。由于柔性背衬材料20能够使整个多孔微针贴片10弯曲，因此各种子贴片24虽然具有一定的刚性，但仍然能够适形至组织100的表面(例如图1C)。由于单个子贴片24的尺寸较小，因此它们不会受到显著的弯曲应力，这种弯曲应力否则会导致较大的刚性结构而响应于弯曲和/或操作而破裂。在子贴片24所在的位置之间(例如在子贴片24的行以及列之间)，可能在背衬材料20内发生弯曲或挠曲。
多孔微针贴片10被制造为多孔结构以容纳细胞30，如图1B所示。多孔微针贴片10中的孔28可以形成在至少微针14中，但也可以存在于基部12中。在制造过程中，可以通过选择性去除或蚀刻暂时包括在多孔微针贴片10中的牺牲性微粒来形成多孔微针贴片10中的孔28。在一个实施方式中，牺牲性微粒包括CaCO3微粒，然后将其蚀刻掉以在微针14和/或基部12内留下孔28。可用于形成孔28的其它牺牲性微粒包括其它碳酸盐，无机微粒如例如碳酸镁、碳酸锰、碳酸钡、氯化钠和氯化钙。
例如，在一个实施方式中，通过模塑和聚合甲基丙烯酰氯修饰的4-臂-聚(乳酸-共-乙醇酸)(4-臂-PLGA)、三乙二醇二乙酸酯、偶氮二异丁腈(AIBN)以及CaCO3微粒的混合物来制造多孔微针贴片10。虽然本文使用了4-臂PLGA，但应理解的是，可以使用不同的甲基丙烯酰氯修饰的多臂PLGA。可以任选地添加高分子量线性PLGA以控制混合物的粘度，从而确保CaCO3微粒的均匀分布。AIBN作为用于交联的引发剂，在加热时产生自由基以启动甲基丙烯酰氯修饰的PLGA和三乙二醇二乙酸酯(TEGDA)的聚合。TEGDA用于提高交联效率。可用作多孔微针贴片10的PLGA的替代物的其它聚合物材料包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或壳聚糖。应当理解的是，在这些聚合物材料的聚合中可能需要其它引发剂或交联剂。此外，可以通过施加热或光来辅助聚合。可以添加适用于特定聚合物体系的其它粘度调节剂以帮助牺牲性微粒的分布。
制造用于将活细胞30局部递送至活组织100的多孔微针贴片10的方法包括提供其中包括多个针形空腔的模具。接下来，然后将含有可聚合聚合物、引发剂或交联剂以及牺牲性微粒的溶液沉积到模具上。然后将溶液交联以创建贴片结构(此时它还不是多孔的)。然后将现在形成的贴片结构从模具中取出并放入溶胀溶液中，这会导致贴片溶胀。然后将溶胀的贴片放入蚀刻溶液中以去除牺牲性微粒并在多孔微针贴片10中形成孔28。然后将细胞30加载到多孔微针贴片10。这是通过将多孔微针贴片10暴露于含有细胞30的溶液来完成的。在一个实施方式中，使多孔微针贴片10和溶液暴露于真空，这会将气体从多孔微针贴片10中抽出并允许细胞30侵入孔28中。
在使用CaCO3微粒作为牺牲性微粒的实施方式中，例如图2A所示，在微针14和/或基部12交联之后，然后通过使多孔微针贴片10溶胀并将CaCO3微粒暴露于蚀刻溶液(例如氯化氢二氧己环溶液)来去除(即蚀刻掉)CaCO3微粒。多孔微针贴片10中的孔28的尺寸可以具有在约5-20μm尺寸范围内的平均直径，其可以容易地容纳CAR T细胞30(具有在约5-10μm范围内的尺寸)。当然，如本文所解释的，其它类型的细胞30也可以加载到多孔微针贴片10中。一旦形成多孔微针贴片10，则用CAR T细胞30加载多孔微针贴片10。CAR T细胞30的加载可以在真空下进行，以帮助将细胞加载到其中。也就是说，将多孔微针贴片10暴露于含有细胞30的溶液中。然后将真空施加到多孔微针贴片10，其去除以气泡形式包括在多孔微针贴片10中的气体(图2B)。然后，细胞30能够浸润微孔28内的微针14(如图2B所示)。
如本文所解释的，多孔微针贴片10提供CAR T细胞30接种的多点分散递送，其通过克服由实体瘤中的物理屏障引起的不良T细胞生物分布来促进在瘤床内增强的T细胞浸润。多孔微针贴片10可以直接施用于肿瘤。替代地，多孔微针贴片10可以施用于手术后切除腔，以防止局部肿瘤复发和转移扩散，并为靶向多种疾病的活细胞30递送提供平台。
多孔微针贴片10可以预加载细胞30，然后可以由医生或其它医疗保健提供者使用。在该实施方式中，具有细胞30的多孔微针贴片10可以储存在含有细胞生长培养基和适当缓冲剂的溶液中。替代地，可以提供其中没有加载细胞30的多孔微针贴片10。在该替代方案中，在现场(例如在医院、医生办公室或其它医疗机构)将细胞30添加到多孔微针贴片10。例如，在使用多孔微针贴片10之前，可以用细胞30加载溶胀的多孔微针贴片10。要加载到多孔微针贴片10的细胞30的选择由医生或其它医疗保健提供者做出并且基于多孔微针贴片10的特定应用而做出。例如，对于癌症治疗，可以将CAR T细胞30加载到多孔微针贴片10中。一旦细胞30被加载到多孔微针贴片10中，则可以将多孔微针贴片10施用于组织100。
实验
结果
通过模塑并聚合甲基丙烯酰氯修饰的4-臂-聚(乳酸-共-乙醇酸)(4-臂-PLGA，图6)、三乙二醇二乙酸酯以及尺寸范围为约2μm至约11μm(大多数范围为6-8μm)的CaCO3微粒的混合物，制造多孔微针贴片10，如图7A-7B所示。牺牲性微粒的尺寸应为微米级，并且足够大以形成可容纳细胞30的孔28。通常，这意味着牺牲性微粒的直径应在约5μm或大于约5μm。15×15锥形微针14的基部半径为250μm且间隔为200μm，以及高度高达1500μm(图1B)。随后，使微针贴片10溶胀(图8)，并在氯化氢二氧己环溶液中蚀刻CaCO3微粒。SEM图像显示出蚀刻后形成的锯齿状多孔表面(图2D、图9)。多孔微针贴片10的截面的SEM图像进一步证实了通过蚀刻CaCO3微粒形成的孔28(图2E、图10)。此外，孔28的尺寸范围为5-20μm(平均直径)，其足以加载CAR T细胞30(5-10μm)。多孔微针14表现出的机械强度略低于未蚀刻的微针，在500μm位移下的失效力为2.4N，这可归因于交联结构的机械强度增强和配方中存在的高分子PLGA(图11)。在真空(100mbar)下将CAR T细胞30加载到微针14中并且在此过程中观察到气泡形成，加载CAR T细胞30后没有检测到机械力的显著变化(图11)。
硫酸软骨素蛋白多糖-4(CSPG4)在包括黑色素瘤、乳腺癌和间皮瘤在内的多种类型的实体瘤中过表达。将CSPG4-特异性CAR T细胞30(CAR CSPG4+T细胞)加载到多孔微针贴片10中，并使用重建的3D共聚焦图像评估。通过使用CLSM对多孔微针贴片10进行逐层扫描和3D重建，CAR T细胞驻留在微针尖端的内部空间中(图2F)。定量地，如通过流式细胞术和计数珠计算的(图12A、12B)，每个微针14加载有约22,000个细胞30。当以107个细胞/mL的密度用CAR T细胞30温育多孔微针贴片10时，实现了约20％的加载效率(图12A、12B)。
通过分析细胞增殖、细胞因子释放和细胞毒活性，将加载到多孔微针贴片10中的CAR T细胞30的生物学效应与游离CAR T细胞的生物学效应进行比较。将用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的CAR T细胞与表达CSPG4的人类黑素瘤癌细胞(WM115，图13)共培养三天。在加载到多孔微针贴片10中的CAR T细胞30和游离CAR T细胞中均观察到表明细胞分裂的CSFE稀释(图3A和3B)。类似地，在白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)释放分泌方面没有观察到差异(图14B，14B)，并且在加载到多孔微针贴片10中的CAR T细胞30和游离CART细胞之间未注意到针对CSPG4-表达靶的细胞毒活性差异(图3C)，这表明加载到多孔微针贴片10中的CAR T细胞30保持了高活力。
据推测，多孔微针贴片10的阵列结构可以覆盖广阔的区域，因此与单针介导的CART细胞注射相比，促进了CAR T细胞30更广阔的分布。因此，开发了含有WM115癌细胞的3D人工基底膜模型(圆柱体，半径×高度；3.2mm×1.5mm)以在体外模拟实体瘤(图3D)。CAR T细胞30的映射是通过逐滴(图3D左图)、凝胶内注射(图3D中图)和多孔微针贴片10(图3D右图)递送用3D人工基底膜模型确定的。温育三天后，由多孔微针贴片10介导的CAR T细胞30递送导致CAR T细胞30的均匀映射，而通过逐滴和凝胶内注射给予的CAR T细胞被限制在有限空间内(图3D)。此外，与直接注射或沉积在模拟肿瘤模型表面上相比，加载到多孔微针贴片1中的CAR T细胞30分泌了约2倍更高水平的IFN-γ(图3E)和IL-2(图3F)，这进一步证实了通过多孔微针贴片10递送的CAR T细胞30的更好分布。
然后评估了用微针贴片10递送的CAR T细胞30在体内的抗肿瘤功效。首先，在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠的WM115黑色素瘤肿瘤模型中，比较了通过瘤内注射和微针贴片介导的递送递送的DiO预标记的CAR T细胞30的瘤内分布。施用后20小时，当瘤内接种CAR T细胞时，CAR T细胞被限制在施用区域(图4A)。相比之下，通过微针贴片10递送的CAR T细胞30表现出更显著的浸润(图4B)，提供了更多遭遇癌细胞以初始CAR T细胞30激活和杀伤的机会。然后测试了CAR T细胞30在携带WM115黑色素瘤小鼠的术后模型中的增殖和持久性。去除90％的肿瘤后，萤火虫荧光素酶标记的CAR T细胞30分别通过手术部位切除腔注射、单针瘤内注射和多孔微针辅助注射。使用体内成像仪器(IVIS)光谱系统监测CAR T细胞30的增殖。如图3D和图15所示，用多孔微针贴片10植入后，游离CAR-T细胞30的生物发光迅速增加，并且CAR T细胞30生物发光信号的定量分析表明，与其它治疗相比，基于微针贴片的递送促进生物发光信号增加了3倍(图4C-4E)。与此同时，基于多孔微针递送的CAR T细胞30导致IL-2和IFN-γ的局部表达增加(图4F)。CAR T细胞30的生物发光增加对应于CAR T细胞30响应于肿瘤细胞的扩增，因为在治疗后第12天，与对照组相比，多孔微针处理的小鼠中CAR T细胞30(CD3+)的数量更高(图4G、4H)。值得注意的是，CAR T细胞30通过多孔微针贴片10的局部递送导致CAR T细胞30的全身分布，因为在外周血中检测到这些细胞(图16)。
然后研究了CAR T细胞递送策略与手术肿瘤切除相结合的情况，以及这是否有益于实体瘤治疗。将萤火虫荧光素酶标记的WM115细胞皮下移植到NSG小鼠中。在部分肿瘤切除后，将CAR T细胞30直接在切除腔内注射或瘤内注射或通过多孔微针贴片10施用递送。与沉积和瘤内注射相比，在接受通过多孔微针贴片10递送的CAR T细胞30的小鼠中，来自肿瘤的生物发光信号和肿瘤的生长动力学显著降低(图5A-5D)。通过多孔微针递送的CAR T细胞治疗，肿瘤的平均生物发光信号强度仅为接受切除腔注射的肿瘤的5％，和接受瘤内注射的肿瘤的13％。肿瘤重量(图5E)和肿瘤尺寸(图5F)(如图像所示)进一步揭示了用于CAR T应用的多孔微针贴片10的增强抗肿瘤功效。PMN/CAR T治疗组在TUNEL测定中显示出更高的癌细胞死亡(图17)，并且在免疫荧光染色下检测到更多的CD8+和CD4+T细胞(图5G)。总之，使用多孔微针贴片10的CAR T细胞30递送优于沉积给予和瘤内注射方法。
总的来说，多孔微针贴片10提供了CAR T细胞30接种的多点分散递送，其通过克服由实体瘤中物理屏障引起的不良T细胞生物分布来促进肿瘤床内增强的T细胞浸润。多孔微针贴片10可施用于手术后的切除腔，以防止局部肿瘤复发和转移扩散，并为针对多种疾病的活细胞递送提供平台。
材料和方法：
线性聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA，乳酸:乙醇酸75:25，WM 76,000-115,000)、甲基丙烯酰氯、三乙胺(TEA)、2-乙基己酸锡(II)、4.0M在二氧己环中的氯化氢溶液(HCl/己烷)购自Sigma Aldrich。乳酸(LA)、乙醇酸(GA)、季戊四醇、偶氮二异丁腈(AIBN)、三乙二醇二乙酸酯(TEGDA)购自TCI America。碳酸钙微粒(～6μm)获自EggTech Ltd.(Canada)。
将WM115人类黑色素瘤细胞维持在补充有10％牛胎儿血清(Invitrogen)，100U/mL青霉素(Invitrogen)和100U/mL链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco)中。在含有45％RPMI 1640培养基(Gibco)和45％Click培养基(Irvine Scientific)以及10％FBS(HyClone)、2mmol/L GlutaMAX(Gibco)、人类重组白介素7(5ng/mL，PeproTech Inc)和人类重组白介素15(10ng/mL，Pepro Tech Inc)的完全培养基中，培养用硫酸软骨素蛋白多糖4嵌合抗原受体(CSPG4 CAR T)工程化的人类T细胞。在5％CO2和90％相对湿度的气氛下，在37℃的培养箱(Thermo Fisher Scientific)中培养细胞。
4-臂-PLGA-Acry的合成
在25mL烧瓶中混合LA(7.5g)、GA(2.5g)、季戊四醇(0.14g)和2-乙基己酸锡(II)(10.0mg)，并在搅拌下在油浴中加热至130℃持续8小时。产物用DMF溶解并在DMF中透析(截止WM 3,000Da)两天。将4-臂-PLGA进一步在水中沉淀为白色固体。将4-臂-PLGA(5.0g)溶解在与TEA(1.0g)混合的二氯甲烷中，并放入冰浴中。将甲基丙烯酰氯(1.0g)溶解在二氯甲烷中，并滴加到PLGA溶液中，八小时后，产物在DMF中再透析两天进行纯化。通过在水中沉淀而获得最终产物，为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3，ppm)：δ6.20(s,4H)，5.63(s,4H)，5.02-5.32(m,93H)，4.56-4.94(m,74H)，4.17(s,8H)，1.95(s,12H)，1.35-1.75(m,300H)。1H NMR(图6)指示4-臂-PLGA-Acry的分子量为10,000Da，并且甲基丙烯酰氯修饰的效率接近100％。
多孔微针阵列贴片的制造
将4-臂-PLGA-Acry溶解在二氧己环中，终浓度为500mg/mL，将AIBN溶解在二氧己环中，浓度为100mg/mL，并且将线性PLGA溶解在二氧己环中，浓度为200mg/mL。然后，将300mg 4-臂-PLGA-Acry、150mg TEGDA、10mg AIBN、20mg PLGA和90mg CaCO3微粒混合，并且添加到将二氧己环预填充到针中的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微模具(Blueacre TechnologyLtd.)。四小时后，将微针14在90℃下交联过夜，然后剥离微针贴片10。将微针贴片10放入HCl/己烷溶液中溶胀两小时，然后加入水以引发HCl与CaCO3之间的反应，伴随有产生的CO2气泡。最后，用等离子体处理多孔微针贴片10以产生亲水表面。通过扫描电子显微镜(SEM，ZEISS Supra 40VP)来表征多孔微针贴片的形态。
将CAR T细胞加载到多孔微针贴片中
从培养基中收获CAR T细胞30并以1×107个细胞/mL浓缩，并将多孔微针贴片10在真空(100mbar)下放置到CAR T细胞30悬浮液中20分钟。然后取出多孔微针贴片10，以计数珠(Invitrogen)为内标，通过流式细胞术对CAR T细胞30的残留数量进行计数，以确定加载效率。为了观察加载到多孔微针贴片10中的CAR T细胞30，用CFSE(Thermo Fisher，cat.#C34554)将CAR T细胞30温育10分钟，然后用PBS洗涤两次。在制备多孔微针贴片10时，通过添加染料用罗丹明B标记多孔微针贴片10。在如上介绍的将CAR T细胞30加载到多孔微针贴片10中之后，将多孔微针贴片10放置在玻璃底皿中并用荧光封固培养基(Thermo Fisher,cat.#TA-030-FM)固定。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，LS880，ZESSI)检测多孔微针贴片10上的CAR T细胞30的微分布，并使用Imaris软件重建为3D图形。
机械强度测试
在Instron拉伸试验机上，通过将不锈钢板压在多孔微针贴片10上，确定微针14的机械强度(蚀刻前、蚀刻后和加载CAR T细胞30后)。微针(MN)14的尖端16和板之间的初始规格为2.00mm，负载传感器容量为10.00N。板接近MN的速度设置为0.1mm/s。
用微针贴片加载后CAR T细胞的体外功能和活力
将表达荧光素酶的WM115细胞(WM115-Luc，1×105个细胞/孔)分别与CAR T细胞或微针加载的CAR T细胞30(MN@CAR T，1×105个细胞/孔)在具有完全培养基的超低贴壁24孔板中温育。三天后，在荧光素酶底物存在下，通过
Figure BDA0003977371170000131
光谱体内成像系统(PerkinElmer)评估作为CAR T细胞30功能指标的WM115细胞的活力。此外，通过离心(1000g，10min，4℃)收集共温育培养基的上清液，以确定CAR T细胞30的细胞因子分泌水平。通过酶-联免疫吸附测定(ELISA，IL-2，Invitrogen，cat.#88-7025-22；IFN-γ，cat.#88-7316-22)根据制造商的说明，测量由CAR T细胞30分泌的人类IL-2和人类IFN-γ。
对于体外CAR T细胞增殖评估，在黑暗中在室温下将CAR T细胞30(1×106)与CFSE(终浓度为1μM)温育10分钟。在将标记的CAR T细胞30加载到先前引入的微针14中之前，用完全培养基洗涤过量的CFSE三次。在超低贴壁24孔板中用完全培养基将WM115细胞(1×105个细胞/孔)和CAR T细胞或多孔微针贴片加载的CAR T细胞30(1×105个细胞/孔)共培养三天。T细胞30用PE-CD3(Biolegend，cat.no.300308，克隆HIT3a)染色，并通过流式细胞术(BDLSRFortessa)检测CAR T细胞增殖。
CAR T细胞和WM115细胞在体外3D人工基底膜模型中的分布
将CFSE标记的WM115细胞(1×106个细胞mL)分散在1mL无酚红DMEM培养基(含10％FBS)中，并通过移液器与1mL无酚红人工基底膜(Corning)混合。将混合物转移至玻璃底96孔板(50μL/孔)并在37℃下温育以在24小时内形成凝胶。通过逐滴、注射和微针递送将DIO标记的CAR T细胞30施用至凝胶，随后温育三天。用CLSM(LS880，ZESSI)观察CAR T细胞30和WM 115细胞的分布。
异种移植WM115黑色素瘤肿瘤生成
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠(雌性，6-8周)购自Jackson实验室。所有动物实验均按照加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会批准的动物研究协议进行。将WM115(5×106)细胞皮下注射到NSG小鼠内。接种WM115细胞后1个月内，异种移植黑色素瘤肿瘤生长至100mm3尺寸。在治疗或其它肿瘤相关实验之前，切除实体瘤，留下～10％的肿瘤以模拟手术后残留的微小肿瘤。
CAR T细胞在肿瘤中的分布
根据制造商的说明，用DIO标记CAR T细胞30，然后通过瘤内注射或微针递送将CART细胞30施用于WM115黑色素瘤肿瘤。24小时后，收获肿瘤并将其嵌入OCT以获得冷冻切片，用CLSM(LS880，ZESSI)观察肿瘤切片的片(slide)，以展示CAR T细胞30在肿瘤中的分布。
体内CAR T细胞增殖
通过皮下注射、瘤内注射或多孔微针贴片注射，将具有荧光素酶表达的CAR T细胞30(1×106)给予至残余肿瘤。施用后，在第0天、第3天、第6天、第9天和第12天使用IVIS(Perkin)记录生物发光信号。通过Living图像软件进行信号分析。施用后十二天，收获肿瘤，消化成单个细胞，并用抗人CD3抗体(Biolegend，cat.no.300308，克隆HIT3a)标记以通过流式细胞术计数CAR T细胞30的数量。使用ELISA(Invitrogen)根据制造商的说明分析CAR T细胞30的细胞因子分泌，包括人类IL-2和人类IFN-γ。
体内抗肿瘤活性
将具有荧光素酶表达的WM115细胞(5×106)皮下注射到NSG小鼠。当达到100mm3时，手术切除90％的肿瘤。通过皮下注射、瘤内注射和多孔微针贴片注射将CAR T细胞30(1×106)给予至肿瘤部位。在CAR T细胞30施用后，在第0天、第3天、第6天、第9天、第12天和第15天用IVIS(Perkin)记录生物发光信号(参见例如图15)。通过Living图像软件进行信号分析。处理后，处死小鼠，记录肿瘤重量和肿瘤图像。
免疫荧光染色
从小鼠收获肿瘤并在最佳切割温度(OCT)培养基中冷冻，然后通过低温切片机切割。使用20μg/mL Alexa
Figure BDA0003977371170000141
594抗人类CD8a抗体(Biolegend，cat no.100758)和Alexa
Figure BDA0003977371170000142
488抗人类CD4抗体(Biolegend，cat no.317408)，在4℃下将肿瘤片染色过夜。遵循标准协议，使用末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定试剂盒分析肿瘤细胞凋亡。
统计分析
如所示，所有结果均表示为平均值±标准偏差(SD)。将Tukey事后检验和单因素方差分析用于多重比较。使用对数秩(mantel-cox)检验确定生存益处。使用Prism软件包(PRISM 5.0；GraphPad Software，2007)进行所有统计分析。统计显著性的阈值为P<0.05。
虽然已经示出和描述了本发明的实施方式，但在不脱离本发明的范围的情况下可以进行各种修改。因此，除了所附权利要求及其等同物外，本发明不应受到限制。

Claims (25)

1.一种用于将活的嵌合抗原受体T(CAR T)细胞局部递送至活组织的多孔微针贴片，包括：
基部，具有从所述基部的表面延伸出的多个微针，其中所述多个微针包括其中形成有孔的可生物降解或可溶解的聚合物，其中所述孔中含有活的CAR T细胞。
2.根据权利要求1所述的多孔微针贴片，其中所述微针由选自包括以下的组的聚合物形成：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的多孔微针贴片，其中所述孔具有在约5-20μm的尺寸范围内的平均直径。
4.根据权利要求1所述的多孔微针贴片，其中所述多个微针具有小于约2.0mm的长度。
5.根据权利要求1所述的多孔微针贴片，其中所述基部粘附到背衬材料。
6.一种用于将活细胞局部递送至活组织的多孔微针贴片，包括：
基部，具有从所述基部的表面延伸出的多个微针，其中所述多个微针包括其中形成有孔的交联的甲基丙烯酰氯修饰的多臂聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，其中所述孔中含有活细胞。
7.根据权利要求6所述的多孔微针贴片，其中所述活细胞包括CAR T细胞。
8.根据权利要求6所述的多孔微针贴片，其中所述活细胞包括多能干细胞。
9.根据权利要求6所述的多孔微针贴片，其中所述活细胞包括树突细胞。
10.一种使用权利要求1-9中任一项所述的多孔微针贴片的方法，包括：
将所述多孔微针贴片放置在哺乳动物的活组织上，使得所述多个微针刺入所述组织中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述多孔微针贴片直接放置在肿瘤组织上。
12.根据权利要求10所述的方法，其中将所述多孔微针贴片放置在靠近或邻近肿瘤组织的组织上。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述活组织包括非癌性组织。
14.一种制造用于将活细胞局部递送至活组织的多孔微针贴片的方法，包括：
提供其中含有多个针状空腔的模具；
将含有可聚合聚合物、引发剂或交联剂以及牺牲性微粒的溶液施加到所述模具；
交联所述溶液以创建贴片；
从所述模具中取出所述贴片并将所述贴片放入溶胀溶液中；
将溶胀的贴片放入蚀刻溶液中以去除所述牺牲性微粒并在多孔微针贴片中形成孔；和
将细胞加载到所述多孔微针贴片的所述孔中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述可聚合聚合物选自包括以下的组：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或壳聚糖。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述可聚合聚合物包括甲基丙烯酰氯修饰的多臂-PLGA，并且所述溶液进一步包括三乙二醇二乙酸酯和偶氮二异丁腈(AIBN)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述溶液进一步包括线性PLGA。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述牺牲性微粒包括CaCO3微粒。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述牺牲性微粒包括以下中的一种：碳酸镁、碳酸锰、碳酸钡、氯化钠和氯化钙。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞包括CAR T细胞。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞包括多能干细胞。
22.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞包括树突细胞。
23.根据权利要求14所述的方法，其中溶胀溶液包括氯化氢/己烷溶液。
24.根据权利要求14所述的方法，其中通过将所述多孔微针贴片暴露于含有细胞的溶液，将所述细胞加载到所述多孔微针贴片的所述孔中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中将真空施加至所述多孔微针贴片和含有所述细胞的溶液。
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