ES2569494T3 - Un biomaterial implantable y un método de producción del mismo - Google Patents

Abstract

Un método para producir un biomaterial implantable resistente a la calcificación que comprende: (a) exponer un biomaterial que contiene colágeno a una solución que contiene alcohol durante al menos 24 horas; (b) exponer dicho biomaterial en la etapa (a) a un agente de reticulación; y (c) exponer dicho biomaterial en la etapa (b) a una solución ácida que contiene un ácido aminocarboxílico capaz de inactivar y/o modificar las fracciones de agente de reticulación fijadas y/o no fijadas presentes en el biomaterial después de la etapa (b); en el que las etapas (b) y (c) son consecutivas a la etapa (a).

Description

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DESCRIPCION

Un biomaterial implantable y un metodo de produccion del mismo Campo

La presente invencion se refiere a un biomaterial implantable y a metodos de produccion del mismo. En particular, la invencion se refiere a un metodo de tratamiento de un biomaterial que contiene colageno para reducir y/o aliviar la calcificacion y mejorar la longevidad del biomaterial, que puede usarse en o con un dispositivo implantable y a metodos de produccion del mismo.

Antecedentes

Existen numerosos metodos para cambiar y/o fijar qmmicamente la matriz de colageno de tejidos biologicos para permitir que dichos tejidos se implanten en el cuerpo de un mairfffero vivo. Los ejemplos de tejidos biologicos implantables cambiados y fijados incluyen valvulas cardiacas, vasos sangumeos, pericardio, piel, duramadre, tendones y ligamentos.

Estos tejidos biologicos consisten principalmente en colageno y elastina. La rigidez/elasticidad de la mayoffa de los tejidos biologicos es determinada en gran medida por el contenido de colageno y elastina relativo en los tejidos y/o la configuracion ffsica del armazon de tejido conectivo.

Cada molecula de colageno consiste en tres cadenas polipepffdicas entrelazadas para formar una triple helice enrollada. Los agentes qrnmicos usados para preservar tejidos biologicos generalmente forman reticulaciones entre grupos amino situados en las cadenas polipepffdicas dentro de una molecula de colageno (intramoleculares) asf como entre moleculas de colageno adyacentes (intermoleculares).

Los biomateriales a base de colageno, cuando se usan como dispositivos implantables en diferentes especies receptoras, son propensas a rechazo hiperagudo. Este rechazo hiperagudo es una respuesta inmunologica natural, desencadenada por anffgenos presentes en la estructura del biomaterial a base de colageno. El rechazo hiperagudo es un proceso degenerativo rapido, que afecta a la funcion y durabilidad de dicho dispositivo implantable.

La antigenicidad de biomateriales a base de colageno puede suprimirse mediante reticulacion ffsica o qrnmica del colageno. Los metodos de reticulacion ffsica tales como irradiacion ultravioleta o deshidratacion termica dan como resultado reticulacion de baja densidad. Agentes qrnmicos tales como formaldetffdo, glutaraldehffdo, dialdehffdo almidon y ciertos compuestos de poliepoxi se han usado como agentes de reticulacion qrnmicos en biomateriales a base de colageno.

Reticular el colageno implica la reaccion de un agente de reticulacion con grupos amino de residuos lisina o hidroxilisina en diferentes cadenas polipepffdicas. Otro metodo conocido de reticular colageno es activar los grupos carboxilo de residuos de acido glutamico y aspartico en una cadena polipepffdica para que reaccionen con los grupos amino de otra cadena polipepffdica para formar enlaces amida.

La reticulacion tambien puede realizarse uniendo grupos amino de cadenas polipepffdicas adyacentes con diisocianatos, lo que da como resultado la formacion de enlaces urea. Este metodo es menos popular debido a la toxicidad y la baja solubilidad de la mayoffa de los diisocianatos.

En los ultimos anos, el glutaraldehffdo ha sido el agente de reticulacion preferido. El glutaraldehffdo se hace bifuncional debido a la presencia de aldehffdo presente en ambos extremos de una cadena alifatica de cinco carbonos. Aparte de fijar el tejido, el glutaraldehffdo es un excelente agente esterilizante para preparar tejidos biologicos para implantacion.

En particular, biomateriales implantables permanentemente, que han sido fijados con glutaraldehffdo, incluyen valvulas cardiacas bioprotesicas porcinas, valvulas pericardicas bovinas y parches pericardicos bovinos.

Un problema asociado con la implantacion de materiales biologicos, reticulados con agentes qrnmicos, es que estos materiales, espedficamente el colageno y la elastina en estos materiales, tienden a calcificarse. La calcificacion de estos materiales puede dar como resultado rigidificacion que da como resultado la degradacion y el fallo del material. Se sabe que la calcificacion, tanto extffnseca como intrrnseca, es responsable de la calcificacion de biomateriales reticulados.

Desafortunadamente, se sabe que el glutaraldehffdo promueve la calcificacion en biomateriales. La reaccion de aldehffdo y aminas primarias en los biomateriales forma iminas inestables (base de Schiff) que posteriormente liberan glutaraldehffdo desde el biomaterial. Los aldehffdos no unidos presentes en el tejido pueden causar irritaciones graves del tejido, tales como reacciones inflamatorias, despues de la implantacion. Existe, por lo tanto, una

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necesidad de eliminar o inactivar los efectos promotores de calcificacion de los agentes de reticulacion tales como glutaraldetndo.

El mecanismo de calcificacion de biomateriales reticulados aun no se ha entendido completamente. Los datos clmicos han mostrado que factores tales como la edad del paciente, infeccion, qmmica del tejido huesped, deshidratacion, deformacion, factores dieteticos y terapia anticoagulacion inicial inadecuada pueden promover la calcificacion de biomateriales implantados.

Se han realizado muchos intentos de encontrar maneras de mitigar la calcificacion de biomateriales reticulados. La investigacion sobre la mitigacion de la calcificacion de biomateriales se ha centrado principalmente en el tratamiento de los biomateriales reticulados y se describe en la patente de Estados Unidos N.° 4.553.974 (Dewanjee et al.); la patente de Estados Unidos N.° 4.120.649 (Schechter); la patente de Estados Unidos N.° 4.648.881 (Nashef et al.); y la patente de Estados Unidos N.° 4.976.733 (Girardot) Vyavahare et al., 1997, Circulation, 95: 479-488 y Pathak et al., 2004, J. Biomed. Mater Res., 69A: 140-144. Estas publicaciones describen, en general, metodos de tratamiento de tejidos fijados con alcohol antes de la implantacion. En otras palabras, el tejido ya ha sido reticulado antes de ser expuesto al alcohol. Incluso en casos donde los tejidos se preincuban en presencia de alcohol, el periodo de exposicion es a menudo demasiado corto para ser util o la presencia de tampon y otros agentes afecta de forma adversa a la estabilidad de reticulacion (vease, por ejemplo, Vyavahare et al., 1997, supra). Procesos alternativos para fijar biomateriales con reactivos no glutaraldetndo tambien se han descrito y estos incluyen el uso de eteres poligliddicos (Imamura et al., (1988), Jpn. J. Artif. Organs, 17: 1101-1103); fotooxidacion (Moore et al., (1994), J. Biomed. Mater. Res., 28: 611-618).

El tratamiento de biomateriales reticulados con amino-difosfato y tensioactivo ha demostrado calcificacion reducida en estos biomateriales despues de la implantacion. Sin embargo, estos agentes tienen a ser arrastrados por lavado del biomaterial despues de la implantacion y solamente retardan el proceso de calcificacion.

El uso de alcohol en el tratamiento de biomateriales es bien conocido, pero esta limitado a su uso como disolvente y/o agente esterilizante. Por ejemplo, el uso de alcohol en el tratamiento de biomateriales contra calcificacion patologica esta limitado a su uso en biomateriales colagenosos previamente reticulados; patente de Estados Unidos N.° 5.746.775 (Levy et al.) y la patente internacional N.° WO84/01894.

El documento Vyavahare et al. (1997), Circulation, vol. 95, n.° 2, p. 479-488 ensena el uso de etanol como agente de esterilizacion para valvulas aorticas porcinas reticuladas con glutaraldetndo despues de que la reticulacion se ha completado. De hecho, Vyavahare et al., ensena que el tratamiento con etanol despues de la reticulacion con glutaraldetndo es mejor que el tratamiento con etanol antes de la reticulacion.

En consecuencia, existe una necesidad de un metodo de produccion de un biomaterial que tenga una resistencia a la calcificacion a largo plazo.

Sumario

Los inventores han desarrollado un metodo que supera o al menos alivia los problemas de calcificacion con biomateriales implantables que contienen colageno.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para producir un biomaterial implantable resistente a la calcificacion, que comprende:

(a) exponer un biomaterial que contiene colageno a una solucion que contiene alcohol durante al menos 24 horas;

(b) exponer dicho material en la etapa (a) a un agente de reticulacion; y

(c) exponer dicho material en la etapa (b) a una solucion acida que contiene un acido aminocarboxflico capaz de inactivar y/o modificar las fracciones de agente de reticulacion fijadas y no fijadas presentes en el material despues de la etapa (b);

en el que la etapa (b) y (c) son consecutivas a la etapa (a).

Aunque se prefiere que la etapa (a) se lleve a cabo durante al menos 24 horas, mas preferentemente al menos 36 horas y de la forma mas preferente, al menos 48 horas, sera apreciado por los expertos en la materia que, en algunas circunstancias, la etapa (a) puede llevarse a cabo durante un periodo de tiempo mas corto.

En algunas realizaciones, entre las etapas (a) y (b) y/o entre las etapas (b) y (c) de los metodos de la invencion, el biomaterial que contiene colageno se lava para eliminar el alcohol y/o agente de reticulacion residual. Preferentemente, el biomaterial que contiene colageno se lava adicionalmente despues de la etapa (c) para eliminar solucion acida residual.

En algunas realizaciones, el biomaterial es un tejido cultivado, una protesis que contiene matriz extracelular obtenida de un animal, un tejido reconstituido (por ejemplo matriz de colageno).

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Tambien se apreciara que el biomaterial podna comprender analogos sinteticos formados a partir de poKmeros sinteticos, poKmeros biologicos, o ambos, que incluyen aquellos que se encuentran generalmente en matrices de tejido natural. Los polfmeros sinteticos adecuados incluyen, por ejemplo, poliamidas y polisulfonas. Los polfmeros biologicos pueden ser de origen natural o producirse in vitro mediante, por ejemplo, fermentacion.

En algunas realizaciones, el biomaterial es de origen natural y ha sido aislado a partir de un animal. El biomaterial puede aislarse a partir de cualquier animal, ya sea de la misma especie que un receptor o de un animal de una especie diferente al receptor. Preferentemente, el animal es de uno de los ordenes de mairnferos es decir Artiodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Perissodactyla, Carnivora y Marsupialia. Mas preferentemente, el animal se selecciona entre el grupo que consiste en un ovino, un bovino, un caprino, un equino, un porcino, un marsupial y un ser humano.

El biomaterial puede ser cualquier tipo de tejido celular. Preferentemente, el tejido celular se selecciona entre el grupo que consiste en tejido cardiovascular, tejido cardiaco, valvula cardiaca, rafces aorticas, pared aortica, valvas aorticas, tejido pericardico, tejido conectivo, duramadre, tejido dermico, un tejido vascular, cartflago, pericardio, ligamento, tendon, vasos sangumeos, tejido umbilical, tejido oseo, fascias, y tejido submucosal y piel.

En algunas realizaciones, el biomaterial es y/o comprende colageno discreto, es decir aislado en lugar de un tejido que contiene colageno de origen natural. El colageno discreto puede usarse en su estado aislado o formarse en cualquier dispositivo o artfculo medico conocido en la tecnica.

El biomaterial usando en la etapa (a) no ha sido reticulado previamente.

La solucion que contiene alcohol usada en la etapa (a) es preferentemente un lfquido, y es a base de agua, es decir es una solucion acuosa de mas de aproximadamente el 50 % de alcohol, y preferentemente entre el 60 % y el 80 % de alcohol en volumen. Puede usarse una solucion que contiene alcohol tamponada o no tamponada; sin embargo, es preferible que se use una solucion que contiene alcohol no tamponada, dado que se ha descubierto que las soluciones que contienen alcohol tamponadas afectan adversamente a posteriores procedimientos de reticulacion que producen un biomaterial amarillento.

Los metodos de la invencion pueden usarse cualquier alcohol conocido en la tecnica en la solucion que contiene alcohol. Preferentemente, el alcohol es un alcohol inferior de C1-C6 en una solucion sin tampon. Aun mas preferentemente, el alcohol se selecciona entre el grupo que consiste en metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec-butanol y t-butanol.

En algunas realizaciones, la solucion que contiene alcohol comprende una mezcla de dos o mas alcoholes, siempre que el volumen combinado del sea mayor del 50 %. Por ejemplo, una mezcla de aproximadamente el 70 % de etanol y aproximadamente el 10 % de isobutanol es eficaz.

El biomaterial en la etapa (a) puede exponerse a la solucion que contiene alcohol durante cualquier periodo de tiempo siempre que sea suficiente para hacer al biomaterial resistente a la calcificacion patogena in vivo. Preferentemente, el biomaterial permanece en contacto con la solucion que contiene alcohol durante tiempo suficiente para permitir que el alcohol se difunda y penetre en el biomaterial. Mas preferentemente, el biomaterial es expuesto a la solucion que contiene alcohol durante al menos 24 horas, aun mas preferentemente al menos 36 horas y de la forma mas preferente, al menos 48 horas.

En algunas realizaciones, el biomaterial, despues de la exposicion a la solucion que contiene alcohol, se retira y se expone a uno o mas agentes de reticulacion. Puede usarse cualquier forma de agente de reticulacion conocida en la tecnica o combinacion de los mismos, siempre que sea capaz de reticular colageno. Por consiguiente, se apreciara que los agentes de reticulacion incluyen divinilsulfona (DVS), polietilenglicol divinilsulfona (VS-PEG-VS), metacrilato de hidroxietilo divinilsulfona (HEMA-DIS-HEMA), formaldehudo, glutaraldehudo, aldehudos, isocianatos, haluros de alquilo y arilo, imidoesteres, maleimidas N-sustituidas, compuestos acilantes, carbodiimida, hidroxicloruro, N- hidroxisuccinimida, luz (por ejemplo, luz azul y luz UV), pH, temperatura, y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el agente de reticulacion es un agente de reticulacion qmmico seleccionado entre el grupo que consiste en carbodiimida, eteres de poliepoxi, divinilsulfona (DVS), polialdehudo y difenilfosforil azida (DPPA).

En algunas realizaciones, el polialdehudo es un bi-, tri- o dialdehudo. El glutaraldehudo es especialmente preferido.

En algunas realizaciones, la etapa de reticulacion (b) es seguida por la etapa (c), con o sin una etapa de lavado intermedia. La solucion acida usada en la etapa (c) contiene cualquier acido capaz de inactivar y/o modificar las fracciones de agente de reticulacion fijadas y/o no fijadas presentes en el biomaterial despues de la etapa (b) para eliminar o reducir sitios de union a calcio disponibles. Como alternativa o ademas de, la solucion acida usada en la etapa (c) contiene cualquier acido capaz de reticular adicionalmente los grupos carboxilo activados con los grupos amino activados en el colageno para formar enlaces amida. Preferentemente, el acido en la solucion acida comprende un acido aminocarboxflico. Preferentemente, el acido aminocarboxflico es un acido que tiene al menos

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un grupo amino y al menos un sustituyente de acido carboxflico. Mas preferentemente, el acido aminocarbox^lico se selecciona entre el grupo que consiste en L-arginina, L-lisina, L-histidina, L-glutamato o L-aspartato.

En algunas realizaciones, la etapa (c) del metodo desvelado se sustituye por o se suplementa con un metodo de inhibicion de la formacion de metaloproteinasa en moleculas de elastina presentes en el biomaterial. Espedficamente, en tejido tal como tejido aortico esta presente un mayor porcentaje de elastina que en otro tejido. Estas moleculas de elastina pueden proporcionar sitios para la formacion de metaloproteinasa, por lo tanto estos sitios necesitan reducirse, eliminarse o inactivarse. Tal como se muestra en el ejemplo 1 infra, una solucion libre de tampon, que contiene un cation multivalente tal como magnesio, sales ferricas y de aluminio puede usarse para reducir la formacion de metaloproteinasa.

La etapa de lavar el biomaterial se lleva a cabo usando una solucion libre de fosfato de solucion salina al 0,9 %.

En una realizacion preferida, el biomaterial despues de la etapa (c) se esteriliza adicionalmente. Mas preferentemente, el biomaterial se esteriliza despues de haberlo lavado.

Aunque sera apreciado por los expertos en la materia que la temperatura a la que cada una de las etapas de la presente invencion se lleva a cabo no es cntica, se entendera que preferentemente, la temperatura esta entre 2 °C y 40 °C, mas preferentemente, entre 4 °C y 30 °C y de la forma mas preferente, entre 5 °C y 25 °C.

En una realizacion, el alcohol, el agente de reticulacion y la solucion acida, la solucion de lavado y la solucion esterilizante estan todas libres de tampon.

Sera apreciado por los expertos en la materia que el metodo desvelado en el presente documento es capaz de producir un biomaterial resistente a la calcificacion, que retiene menos de 50 |ig de calcio por mg de tejido durante mas de 200 dfas post-implantacion in vivo. En otras palabras, el biomaterial resistente a la calcificacion de la presente invencion es capaz de ser implantado durante mas de 200 dfas sin que el biomaterial incremente su contenido de calcio por encima de 50 |ig/mg de tejido.

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un biomaterial resistente a la calcificacion que comprende colageno reticulado, en el que dicho biomaterial tiene un contenido de calcio de menos de aproximadamente 50 |ig por mg de biomaterial y en el que dicho biomaterial es capaz de ser implantado durante al menos 200 dfas sin que el biomaterial incremente su contenido de calcio por encima de 50 |ig/mg de biomaterial.

Sin desear estar limitado por ninguna teona o hipotesis, se considera que la resistencia a la calcificacion observada es proporcionada en parte por la presencia de aminas secundarias en el colageno proporcionado mediante los metodos de produccion del biomaterial tal como se desvela en el presente documento.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona un dispositivo biologico implantable que comprende un biomaterial implantable resistente a la calcificacion que comprende colageno reticulado, en el que dicho colageno comprende aminas secundarias.

En algunas realizaciones, el biomaterial resistente a la calcificacion se extiende formando un revestimiento sobre una superficie de un dispositivo medico. En una realizacion adicional, el dispositivo comprende ademas al menos un segundo revestimiento.

Sera apreciado por los expertos en la materia, que el al menos segundo revestimiento puede comprender agentes tales como agente antimicrobiano, agentes antivirales, factores de crecimiento, agentes antideshidratacion o agentes antisepticos.

Preferentemente, el agente antimicrobiano se selecciona entre el grupo que consiste en isoniazida, etambutol, pirazinamida, estreptomicina, clofazimina, rifabutina, fluoroquinolonas, ofloxacina, esparfloxacina, rifampicina, azitromicina, claritromicina, dapsona, tetraciclina, eritromicina, ciprofloxacina, doxiciclina, ampicilina, anfotericina B, ketoconazol, fluconazol, pirimetamina, sulfadiazina, clindamicina, lincomicina, pentamidina, atovacuona, paromomicina, diclazaril, aciclovir, trifluorouridina, foscarnet, penicilina, gentamicina, ganciclovir, iatroconazol, miconazol, Zn-piritiona, metales pesados, incluyendo oro, platino, plata, zinc y cobre, y sus formas combinadas que incluyen, sales, tales como cloruro, bromuro, yoduro y peryodato, y complejos con portadores y otras formas.

Preferentemente, el agente factor de crecimiento se selecciona entre el grupo que consiste en hidroxiapatita, factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblastos acido (aFGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factores de crecimiento similares a insulina 1 y 2, (IGF-1 e IGF-2), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de angiogenesis tumoral (TAF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de liberacion de corticotropina (CRF), factores de crecimiento transformante a y p (TGF-a y TGF-P) interleuquina-8 (IL-8); factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF); interleuquinas e interferones

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En algunas realizaciones, el dispositivo de la presente invencion comprende ademas un material bioabsorbible seleccionado entre el grupo que consiste en acido polilactico, acido poliglicolico, copoKmeros de acido polilactico- acido poliglicolico, polidioxanona, policaprolactona, polipeptidos, policarbonatos, polihidroxibutirato, poli(oxalato de alquileno), copolfmeros de acetatos de vinilo con acidos carbox^licos insaturados, derivados de celulosa solubles o dispersables en agua, polfmeros de oxido de etileno, poliacrilamida, colageno, gelatina, poli(ortoester), poliamidas de aminoacidos, alcohol polivimlico, polivinilpirrolidona, polieteretercetona, fosfato tricalcico, y mezclas de los mismos.

Se apreciara que los dispositivos de la presente invencion pueden ser cualquier dispositivo para el cual sena deseable resistencia a la calcificacion. Preferentemente, el dispositivo se selecciona entre el grupo que consiste en un corazon artificial, un dispositivo de compresion extracardiaco, un dispositivo de compresion intra o extravascular, una protesis de valvula cardiaca, un anillo de anuloplastia, un injerto dermico, un injerto vascular, una endoprotesis vascular, una endoprotesis estructural, una derivacion vascular, una derivacion cardiovascular, un injerto de duramadre, un injerto de cartflago, un implante de cartflago, un injerto de pericardio, una protesis de ligamento, una protesis de tendon, una protesis de vejiga urinaria, una compresa, una sutura, un dispositivo percutaneo implantado de forma permanente, un parche quirurgico, una endoprotesis cardiovascular, una endoprotesis revestida y un cateter revestido. Mas preferentemente, el dispositivo es una protesis de valvula cardiaca.

En algunas realizaciones, el dispositivo comprendera ademas un fragmento de tejido extrafdo de un animal o un analogo sintetico de un tejido.

Preferentemente, el fragmento de tejido incluira una pluralidad de celulas, que, en el momento de la implantacion en un sitio quirurgico, proliferara y se integrara en el tejido circundante.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un implante biocompatible, que comprende una matriz de soporte biocompatible que comprende un biomaterial resistente a la calcificacion que comprende colageno reticulado, en el que dicho biomaterial tiene un contenido de calcio de menos de aproximadamente 50 |ig por mg de biomaterial y en el que dicho biomaterial es capaz de ser implantado durante al menos 200 dfas sin que el biomaterial incremente su contenido de calcio por encima de 50 |ig/mg de biomaterial.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un implante biocompatible, que comprende una matriz de soporte biocompatible que comprende un biomaterial implantable resistente a la calcificacion que comprende colageno reticulado, en el que dicho colageno comprende aminas secundarias.

Preferentemente, los implantes de la presente invencion comprenderan ademas un polfmero sintetico, un polfmero natural, un gel inyectable, un material ceramico, tejido autogeno, tejido alogeno, tejido xenogeno y combinaciones de los mismos.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un kit para reparar una lesion tisular, que comprende:

(a) un recipiente esteril que tiene uno o mas biomateriales resistentes a la calcificacion que comprenden colageno reticulado, en el que dicho colageno comprende aminas secundarias; y

(b) instrucciones para su uso en un sujeto herido.

En un decimo aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de tratamiento de tejido vivo, que comprende:

(a) proporcionar un biomaterial resistente a la calcificacion que comprende colageno reticulado, en el que dicho colageno comprende aminas secundarias; y

(b) implantar el biomaterial en o sobre un sujeto que necesita tratamiento.

El metodo de tratamiento puede ser cualquier tratamiento, incluir tratamientos profilacticos y terapeuticos. Preferentemente, el metodo de tratamiento se selecciona entre el grupo que consiste en reparacion tisular, proteccion de tejido profundo, incremento del volumen tisular, tales como cosmetico, tratamiento terapeutico, aumento del tejido y sellado tisular.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un aposito para heridas que comprende un biomaterial implantable resistente a la calcificacion que comprende colageno reticulado, en el que dicho colageno comprende aminas secundarias.

Preferentemente, el colageno en el biomaterial se selecciona entre el grupo que consiste en colageno ovino, colageno bovino, colageno caprino, colageno equino, colageno porcino, colageno de marsupial y colageno humano.

En algunas realizaciones, el aposito para heridas comprende ademas un polisacarido sulfatado seleccionado entre el grupo que consiste en heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dextrano, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de queratano, sulfato de hexuronil hexosaminoglicano, hexasulfato de inositol y octasulfato de sacarosa. Preferentemente, el aposito para heridas comprende ademas un agente antimicrobiano, un agente antiviral, un factor de crecimiento, un agente antideshidratacion o un agente antiseptico.

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Preferentemente, el biomaterial comprende al menos el 50 % de colageno, mas preferentemente, al menos el 70 % de colageno, aun mas preferentemente, al menos el 90 % de colageno y de la forma mas preferente, consiste esencialmente en colageno.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra tejido de pericardio de canguro que se trato previamente con alcohol y a continuacion se fijo con glutaraldehndo en comparacion con tejido fijado con glutaraldehndo, es decir sin pretratamiento con alcohol y tejido “fresco”.

La figura 2 muestra tejido aortico de canguro que se trato previamente con alcohol y a continuacion se fijo con glutaraldehndo en comparacion con tejido fijado con glutaraldehndo, es decir sin pretratamiento con alcohol y tejido “fresco”.

La figura 3 muestra la resistencia a la degradacion enzimatica de (A) cuspide porcina y (B) tejidos de la pared aortica.

La figura 4 muestra los niveles de calcio cuantitativos de (A) cuspides de valvula porcina explantadas y (B) tejido de la pared aortica porcina despues de ocho semanas en un modelo en rata subcutaneo.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

Las publicaciones mencionadas en el presente documento se mencionan para los fines de describir y desvelar los protocolos y reactivos que se mencionan en las publicaciones y que podnan usarse en relacion con la invencion. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admision que de la invencion no tiene derecho a anteceder dicha divulgacion en virtud de la invencion anterior.

Ademas, la puesta en practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique otra cosa, tecnicas inmunologicas convencionales, qrnmica y farmacologfa dentro del alcance de la tecnica. Dichas tecnicas son bien conocidas por el experto en la materia, y se explican completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher y Wingfield “Current protocols in Protein Science” (1999) Volumen I y II (John Wiley & Sons Inc.); t Bailey, J.E. y Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumenes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986).

Debe observarse que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “uno” y “el/la” incluyen referencia en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a “un agente de reticulacion” incluye una pluralidad de dichos agentes, y una referencia a “un alcohol” es una referencia a uno o mas alcoholes, y asf sucesivamente. A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los entendidos habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invencion. Aunque cualesquiera materiales y metodos similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse para poner en practica o a prueba la presente invencion, los materiales y metodos preferidos se describen a continuacion.

En uno de los aspectos mas amplios, la presente invencion se refiere a un metodo para producir un biomaterial implantable.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “biomaterial” se refiere a cualquier material que tiene potencialmente un uso biologico, en el que el material comprende algo de colageno. El colageno podna ser cualquier tipo de colageno de cualquier fuente y podna estar presente en solitario o en combinacion con otros materiales. Por consiguiente, el colageno podna representar tan solo el 1 % p/p del peso total del biomaterial o hasta el 100 %.

El termino “colageno” tal como se usa en el presente documento se refiere a la familia extracelular de protemas fibrosas que se caracterizan por su estructura helicoidal tricatenaria ngida. Tres cadenas polipetfdicas de colageno (“cadenas a”) se enrollan unas alrededor de otras para formar esta molecula helicoidal. El termino tambien pretende abarcar los diversos tipos de colageno.

La parte mayor de la parte helicoidal de colageno vana poco entre especies de mairnfero. De hecho, una serie de tipos de colageno tienen altos grados de homologfas en la secuencia de nucleotidos y aminoacidos. Por ejemplo, la homologfa de secuencia de nucleotidos para colageno de tipo II, alfa 1 es al menos el 88 % cuando se comparan seres humanos, equinos y murino. Los seres humanos y los equinos tienen un 93 % de homologfa de secuencia a nivel de nucleotidos, mientras que el raton y el equino tienen un 89 % de homologfa de secuencia. La homologfa de secuencia de nucleotidos para ser humano y raton es del 88 % (vease, los numeros de entrada de NCBI U62528 (Equino), NM033150 (Ser humano) y NM031163 (raton)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Otros tipos de colageno tienen niveles similares de homologfa de aminoacidos. Por ejemplo, la homologfa de secuencia de nucleotidos entre

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colageno de tipo I, alfa 1 porcino y colageno de tipo I, alfa 1 ovino es del 90 % (vease, los numeros de entrada de NCBI AF29287 (Ovino) y AF201723 (Porcino)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Dado el nivel de ascendencia y biologfa comunes para muchos de los animales anteriores, el alto grado de homolog^a de secuencia de aminoacidos y nucleotidos para el colageno entre una serie de especies tales como vacas, ovejas, ratones y cerdos, un experto en la materia apreciana que los metodos para producir el biomaterial tal como se desvela en el presente documento son aplicables para material colagenoso asilado de todos los animales mairnferos.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el biomaterial se afsla o se extrae de un animal de uno de los ordenes de marnffero, es decir, Artiodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Perissodactyla, Carnivora y Marsupialia. El animal es preferentemente un ovino, un bovino, un caprino, un equino, un porcino, un marsupial o un ser humano. Aunque el biomaterial se afsla preferentemente de la misma especie animal que el receptor, esta previsto que el biomaterial pudiera aislarse de una especie diferente del receptor.

Como alternativa, en algunas realizaciones, el biomaterial comprende un tejido cultivado, un tejido reconstituido o similar.

El biomaterial podna ser cualquier tipo de tejido celular. Por ejemplo, el tejido celular podna ser tejido cardiovascular, tejido del suelo pelvico, tejido cardiaco, valvula cardiaca, rafces aorticas, pared aortica, valvas aorticas, tejido pericardico, tejido conectivo, la matriz de organos blandos o macizos, duramadre, tejido dermico, un tejido vascular, duramadre, cartflago, pericardio, ligamento, tendon, vasos sangumeos, tejido umbilical, tejido oseo, fascias, y tejido submucosal o piel, dado que todos estos comprenden algo de colageno.

Tambien se apreciara que el biomaterial podna comprender ademas analogos sinteticos formados de polfmeros sinteticos, polfmeros biologicos purificados, o ambos, incluyendo aquellos que se encuentran generalmente en matrices de tejido natural. Los polfmeros sinteticos adecuados incluyen, por ejemplo, poliamidas y polisulfonas. Los polfmeros biologicos pueden ser de origen natural o producirse in vitro mediante, por ejemplo, fermentacion.

Polfmeros biologicos purificados pueden formarse apropiadamente en un sustrato mediante tecnicas tales como tejido, tricotado, colado, moldeo, extrusion, alineamiento celular y alineamiento magnetico. Los polfmeros biologicos adecuados incluyen, sin limitacion, colageno, elastina, seda, queratina, gelatina, poliaminoacidos, polisacaridos (por ejemplo celulosa y almidon), y copolfmeros de cualquiera de estos. Por ejemplo, polfmeros de colageno y elastina pueden formarse en un material implantable sintetico mediante cualquiera de diversas tecnicas, tal como tejido y moldeo. Los analogos de tejido sinteticos imitan una matriz de tejido natural. Como alternativa, pueden usarse sustratos sinteticos para formar un analogo de tejido, en solitario o junto con ejemplos de sustrato de origen natural incluyen, polipropileno, acido polilactico, poliester, nylon y silicona.

Se apreciara que, aunque los metodos desvelados en el presente documento podnan tener algun efecto sobre biomaterial reticulado previamente, los metodos desvelados en el presente documento estan concebidos para usarlos en material no reticulado es decir “nativo” o “virgen”.

Una vez que se ha adquirido el biomaterial, se prepara para la implantacion. Los terminos “implantacion”, “implantable” e “implante” se usan en el presente documento de forma intercambiable y todos se refieren a la capacidad del biomaterial, dispositivos etc., de la presente invencion para ser colocados dentro de o sobre tejido vivo de un animal sin causar rechazo, infeccion o problemas toxicos. Debe entenderse que el termino “implantable” puede incluir una pluralidad de biomateriales o dispositivos y tambien incluye dispositivos parcialmente implantados etc., tales como lentes de contacto.

En una etapa inicial del metodo de la presente invencion, el biomaterial se expone a una solucion que contiene alcohol. Tal como se usa en el presente documento, el termino “expone”, o “exponer” se refiere a la etapa activa de poner en contacto el biomaterial que contiene colageno con una solucion que contiene alcohol tal como se describe aqrn, o tal como se describe infra, posteriormente poner en contacto el biomaterial con el agente de reticulacion, la solucion acida u otra materia durante un periodo de tiempo suficiente para proporcionar aproximadamente un resultado deseado. Los metodos para exponer el biomaterial a, por ejemplo, la solucion que contiene alcohol se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, en general, el biomaterial se puede “exponer” a alcohol, pulverizando, banando o sumergiendo el biomaterial en una solucion que comprende un alcohol.

El termino “alcohol”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier alcohol conocido en la tecnica que es capaz de eliminar o reducir la cantidad de trigliceridos y esterificar al menos parcialmente los grupos carboxilo encontrados en colageno. Preferentemente, el alcohol es un alcohol soluble en agua. Mas preferentemente, el alcohol es un alcohol inferior de C1-C6 en una solucion libre de tampon. Aun mas preferentemente, el alcohol se selecciona entre el grupo que consiste en metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec-butanol y t-butanol.

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Sin desear estar limitados por ninguna teona o hipotesis particular, los inventores consideran que la solucion que contiene alcohol ayuda a aflojar la triple helice de colageno y, de este modo, exponer los sitios hidrofobos (vease, Karube & Nishida, 1979, Biochim Biophys Acta., 23; 581(1): 106-13). Tambien consideran que los grupos carboxilo y amina descubiertos en el colageno se esterifican en presencia de la solucion que contiene alcohol, de modo que se vuelvan disponibles para reticulacion en etapas posteriores. Por lo tanto, una solucion alcoholica preferida es una que comprende al menos aproximadamente el 50 % v/v, mas preferentemente al menos aproximadamente el 70 % v/v y de la forma mas preferente al menos aproximadamente el 80 % v/v de alcohol con respecto a la solucion acuosa libre de tampon. En una realizacion, la solucion alcoholica es el 70 % de etanol v/v en solucion salina al 0,9 % (que contiene PMSF 0,5 mM)

En una realizacion, el metodo de la presente invencion proporciona un metodo para producir un biomaterial implantable que comprende exponer un biomaterial a una solucion libre de tampon que contiene alcohol que comprende menos del 100 % de alcohol durante al menos 24 horas.

En algunas realizaciones, la solucion que contiene alcohol, asf como otras soluciones y reactivos estan “libres de tampon” dado que se formula la hipotesis de que el agente de reticulaciones que contiene aldehfdo reacciona con el tampon durante la fijacion causando despolimerizacion del aldetndo.

La etapa de exponer el biomaterial a la solucion que contiene alcohol puede llevarse a cabo durante cualquier periodo de tiempo, siempre que sea suficiente para hacer al biomaterial resistente a la calcificacion patogena in vivo y que la mayona (es decir un elevado porcentaje) de los grupos carboxilo y amina que se encuentran en el colageno esten esterificados. Preferentemente, el biomaterial permanece en contacto con la solucion que contiene alcohol durante el tiempo suficiente para permitir que el alcohol se difunda y penetre en el biomaterial. Mas preferentemente, el biomaterial se expone a la solucion que contiene alcohol durante al menos 24 horas, aun mas preferentemente al menos 36 horas y de la forma mas preferente, al menos 48 horas.

Una vez que el biomaterial ha sido expuesto a alcohol, este se elimina. En algunas realizaciones, el biomaterial se lava despues de la exposicion a alcohol en una solucion de lavado que comprende una solucion libre de fosfato de solucion salina al 0,9 %. Sin embargo, puede usarse cualquier solucion fisiologicamente aceptable no tamponada como solucion de lavado. El fin de la solucion de lavado es principalmente eliminar el exceso de alcohol y, por lo tanto, no es cntica.

Despues de que el biomaterial que contiene colageno ha sido expuesto a alcohol durante mas de 24 horas, puede usarse directamente para la implantacion. Aunque la prefijacion con alcohol ha sido usada previamente por otros, tradicionalmente ha sido usada para esterilizar tejido en lugar de la esterificacion de los grupos carboxilo y amina descubiertos en el colageno. Por lo tanto, el tiempo de exposicion al alcohol ha sido relativamente corto, por ejemplo, menos de 24 horas y no suficiente para permitir la penetracion completa del tejido por parte del alcohol. Como resultado, no ha habido apreciacion, antes de la presente invencion, de que un biomaterial resistente a la calcificacion (vease la definicion infra) pudiera producirse mediante exposicion prolongada es decir mayor de 24 horas, de un biomaterial a una solucion que contiene alcohol. Esto significa que el biomaterial, despues de la exposicion a la solucion que contiene alcohol durante mas de 24 horas, podna implantarse directamente (descrita infra) como un biomaterial resistente a la calcificacion. Sin embargo, sera apreciado por los expertos en la materia que una forma superior de biomaterial resistente a la calcificacion puede producirse reticulando el biomaterial despues de la etapa (a).

Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente invencion, el biomaterial que contiene colageno despues de la exposicion a alcohol se expone a continuacion a uno o mas agentes de reticulacion bifuncionales. El termino “bifuncional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a los dos grupos aldetndo funcionales, presentes en ambos extremos de las cinco cadenas de carbono. La reticulacion puede emprenderse mediante cualquier tecnica conocida en la tecnica, con cualquier forma de agente de reticulacion siempre que este sea capaz de reticular colageno. Los agentes de reticulacion incluyen compuestos acilantes, cloruro de adipilo, aldehndos, haluros de alquilo y arilo, bisimidatos, carbodiimidas, divinilsulfona (DVS), formaldehndo, glutaraldehndo, glioxal, diisocianato de hexametileno, hidroxicloruro, metacrilato de hidroxietilo divinilsulfona (HEMA-DIS-HEMA), imidoesteres, isocianatos, luz (por ejemplo luz azul y luz UV), N-hidroxisuccinimida, maleimidas N-sustituidas, pH, polialdehndo, difenilfosforil azida (DPPA), compuestos de poliepoxi que comprenden un esqueleto de 17-25 carbonos y 4-5 grupos epoxi, eteres de poliepoxi, polietilenglicol divinilsulfona (VS-PEG-VS), eter poliglicidflico de poliglicerol y temperatura y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el agente de reticulacion es un agente de reticulacion qrnmico tal como carbodiimida, eteres de poliepoxi, divinilsulfona (DVS), genipina, glutaraldehndo, formaldehndo y difenilfosforil azida (DPPA).

Tambien se ha demostrado que compuestos de poliepoxi que comprenden un esqueleto de 17-25 carbonos y 4-5 grupos epoxi muestran una elevada eficiencia para reticular colageno (vease, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 20040059430 (S/N 10/618.447). Tambien se ha mostrado que la toxicidad de los compuestos de poliepoxi es menor que la del glutaraldehndo, y la antigenicidad o induccion de la respuesta inmunitaria de tejidos disminuye en proporcion al tiempo de reaccion, en caso de reaccionar con moleculas polipeptfdicas helicoidales

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tales como colageno. Naturalmente, este muestra relativamente buena biocompatibilidad (vease, por ejemplo, Lohre et al., (1992), Artif. Organs, 16: 630-633; Uematsu et al., (1998), Artif. Organs, 22: 909-913). En consecuencia, los compuestos de poliepoxi, tal como se describen, son un agente de reticulacion preferido.

En algunas realizaciones, el agente de reticulacion comprende aproximadamente el 1 % de glutaraldelddo y el periodo de exposicion es de al menos aproximadamente 24 horas. Se apreciara que el periodo de tiempo para la exposicion del biomaterial al agente de reticulacion depende del agente usado, la concentracion y la temperatura. Normalmente, el periodo de exposicion esta entre 24 horas y 28 dfas. La determinacion de la cantidad precisa de tiempo de exposicion para el biomaterial al agente de reticulacion esta perfectamente dentro del alcance de un experto en la materia.

De nuevo, sin desear estar limitados por ninguna teona o hipotesis particular, los inventores consideran que exponiendo el biomaterial que ha sido expuesto a alcohol a un agente de reticulacion, los grupos carboxilo esterificados y los grupos amino en el colageno presente en el biomaterial se reticulan.

Aunque sera apreciado por los expertos en la materia que la temperatura a la que cada una de las etapas de la presente invencion se lleva a cabo no es cntica, se entendera que preferentemente, la temperatura esta entre 2 °C y 40 °C, mas preferentemente, entre 4 °C y 30 °C y de la forma mas preferente, entre 5 °C y 25 °C.

Una vez mas, despues de la etapa de reticulacion, el biomaterial se lava preferentemente en solucion de lavado, tal como la usada despues de la etapa de exposicion a alcohol (a). Sin embargo, se apreciara de nuevo que la etapa de lavado es meramente una promocion.

Despues de la etapa de reticulacion, o si se utiliza la etapa de lavado despues de la etapa de reticulacion, el biomaterial puede exponerse a continuacion a una solucion acida que contiene cualquier acido capaz de inactivar y/o modificar las fracciones de agente de reticulacion fijadas y/o no fijadas presentes en el biomaterial despues de la etapa (b) para eliminar o reducir sitios de union a calcio disponibles. Como alternativa o ademas de, la solucion acida usada en la etapa (c) contiene cualquier acido capaz de reticular adicionalmente los grupos carboxilo activados con los grupos amino activados en el colageno para formar enlaces amida.

Preferentemente, la solucion acida comprende al menos un acido aminocarboxflico. La expresion “acido aminocarboxflico”, tal como se usa en el presente documento, es cualquier acido que tiene al menos un grupo amino y al menos un sustituyente de acido carboxflico. Los ejemplos representativos de acidos aminocarboxflicos que son utiles en la presente invencion incluyen L-glutamato, L-aspartato, L-lisina, L-arginina, L-histidina. El fin de la solucion acida es doble: en primer lugar, el acido aminocarboxflico ayuda en la inactivacion y/o modificacion de las fracciones de agente de reticulacion fijadas y no fijadas, reduciendo o aliviando de este modo cualesquiera efectos biologicos adversos. En segundo lugar, el acido aminocarboxflico reticula adicionalmente los grupos carboxilo activados con los grupos amino activados en el colageno para enlaces amida.

La concentracion del acido aminocarboxflico dependera del acido real usado y otros parametros tales como masa total del biomaterial usado. Ademas, una relacion de peso neto minima de acido aminocarboxflico con respecto a biomaterial sena de aproximadamente 1:4. El aspecto mas importante de la solucion acida es el pH. El pH debe estar por debajo de pH 7, preferentemente por debajo de pH 6, mas preferentemente por debajo de pH 5 y de la forma mas preferente por debajo de aproximadamente pH 4,6.

En una realizacion, la solucion acida es 8 mg de acido aminocarboxflico por mililitro de agua desionizada, que es libre de fosfato y aproximadamente pH 4.

El biomaterial se expone al acido aminocarboxflico durante al menos 6 horas, mas preferentemente al menos 24 horas, aun mas preferentemente mas de 48 horas. Aunque la temperatura de incubacion no es cntica, esta preferentemente entre 5 °C y 55 °C, mas preferentemente entre 10 °C y 45 °C, de la forma mas preferente aproximadamente 45 °C.

En algunas realizaciones, la etapa (c) del metodo desvelados se sustituye por o se suplementa con un metodo de inhibicion de la formacion de metaloproteinasa sobre moleculas de elastina presentes en el biomaterial. Espedficamente, en tejido tal como tejido aortico, esta presente un mayor porcentaje de elastina que en otro tejido. Estas moleculas de elastina pueden proporcionar sitios para la formacion de metaloproteinasa tales como estos sitios que es necesario reducir, eliminar o inactivar. Tal como se muestra en el ejemplo 1 infra, una solucion libre de tampon, que contiene un cation multivalente tal como sales de magnesio, ferricas y de aluminio, puede usarse para reducir la formacion de metaloproteinasa.

El biomaterial, despues de la etapa de exponer el biomaterial que contiene colageno a la solucion acida y/o solucion libre de tampon que contiene un cation multivalente, de nuevo se lava preferentemente en solucion de lavado. En algunas realizaciones, el biomaterial tambien se esteriliza.

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La etapa de esterilizar el biomaterial es mediante cualquier metodo de esterilizacion conocido en la tecnica para material que contiene colageno. Por ejemplo, el biomaterial puede someterse a un agente esterilizante (por ejemplo, un esterilizante lfquido tal como el 0,2-2,0 % en peso de solucion de glutaraldehndo) durante un periodo de tiempo de esterilizacion. Una solucion de glutaraldehndo al 0,625 % puede usarse en combinacion con calor (es decir calentar por encima de la temperatura ambiente, pero por debajo de una temperatura que causana danos al biomaterial), como esterilizante. Como alternativa, una solucion esterilizante adecuada puede comprender una solucion acuosa osmoticamente equilibrada en solitario o en combinacion con una fuente de esterilizacion sin contacto (por ejemplo, radiacion, haz de electrones, UV, u otro recurso similar), o incluir una solucion acuosa de glutaraldehndo en combinacion con solucion salina tamponada con fosfato. En casos en los que se usa una solucion de glutaraldehndo al 0,625 % como esterilizante, el periodo de tiempo de esterilizacion puede ser de 1-6 dfas a 37 °C o 1-2 dfas a 50 °C). Esta etapa de esterilizacion terminal puede realizarse despues del envasado del biomaterial en su recipiente final, eliminando de este modo la necesidad de cualquier manipulacion posterior del biomaterial hasta el momento de la implantacion.

En una realizacion preferida, el biomaterial se esteriliza exponiendo el biomaterial a glutaraldehndo al 0,25 % en agua desionizada que contiene 9,07 g/l de tampon dihidrogeno fosfato potasico.

La etapa de esterilizacion puede llevarse a cabo durante cualquier periodo de tiempo y puede incluir almacenamiento. La temperatura de esterilizacion se lleva a cabo preferentemente entre 40-50 °C durante mas de 60 minutos.

El biomaterial, despues del tratamiento con los metodos desvelados en el presente documento, tiene un alto nivel de resistencia a la calcificacion, es decir es un “biomaterial resistente a la calcificacion”. El termino “calcificacion”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno de los mayores problemas patologicos asociados con biomaterial producido de forma tradicional que comprende protemas de tejido conectivo (es decir, colageno y elastina). Se ha mostrado previamente que estos materiales pueden volverse calcificados despues de la implantacion dentro del cuerpo. Dicha calcificacion puede dar como resultado rigidificacion o degradacion indeseable del biomaterial. Se sabe que dos (2) tipos de calcificacion: intrmseca y extrmseca se producen en biomaterial colagenoso fijado, aunque el uno o varios mecanismos mediante los cuales dicha calcificacion se producen se desconoce. La calcificacion intrmseca se caracteriza por la precipitacion de iones de calcio y fosfato dentro del tejido bioprotesico fijado, incluyendo la matriz de colageno y las celulas remanentes. La calcificacion extrmseca se caracteriza por la precipitacion de iones de calcio y fosfato dentro del trombo adherente, incluyendo celulas adherentes (por ejemplo, plaquetas) al biomaterial y el desarrollo de placas superficiales que contienen fosfato de calcio sobre el biomaterial.

En consecuencia, la frase “alto nivel de resistencia a la calcificacion” o “resistente a la calcificacion” cuando se aplica al biomaterial de la presente invencion significa que el biomaterial, despues de la implantacion in vivo durante al menos 200 dfas, muestra menos de 50 |ig, preferentemente menos de 20 |ig, y aun mas preferentemente menos de 10 |ig de calcio por mg de tejido seco despues de su eliminacion.

Preferentemente, el biomaterial de la presente invencion tambien es resistente a la degradacion enzimatica. La expresion “resistente a la degradacion enzimatica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad del biomaterial de la presente invencion para soportar la degradacion enzimatica a un nivel comparable con el tejido fijado tradicional.

Una vez formado, el biomaterial que contiene colageno implantable de la presente invencion puede usarse a continuacion para tratar una serie de afecciones y/o trastornos.

Generalmente, los terminos “tratar”, “tratamiento” se usan en el presente documento para significar afectar a un individuo o animal, su tejido o celulas para obtener un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto es especialmente terapeutico en terminos de una cura parcial o completa de una afeccion y/o trastorno. “Tratar”, tal como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una afeccion y/o trastorno en un vertebrado, un mairnfero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) inhibir la afeccion y/o trastorno, es decir, detener su desarrollo; o (b) aliviar o mejorar los smtomas de la afeccion y/o trastorno, es decir, causar regresion de los smtomas de la degradacion enzimatica/afeccion y/o trastorno.

Los terminos “afeccion” y/o “trastorno” se usan en el presente documento de forma intercambiable y se refieren a afecciones anormales que afectan a animales, incluyendo seres humanos, que pueden tratarse usando el biomaterial de la presente invencion.

El biomaterial resistente a la calcificacion de la presente invencion tambien puede aplicarse a cualquiera de una amplia diversidad de superficies de contacto de dispositivos medicos. Las superficies de contacto incluyen superficies que estan concebidas para entrar en contacto con sangre, celulas u otros fluidos o tejidos corporales de un animal, incluyendo espedficamente un ser humano. Las superficies de contacto adecuadas incluyen una o mas superficies de dispositivos medicos que estan concebidas para entren en contacto con sangre u otros tejidos. Los dispositivos medicos incluyen bobinas para aneurismas, vasos sangumeos artificiales, corazones artificiales,

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valvulas artificiales, rinones artificiales, tendones y ligamentos artificiales, bolsas de sangre, oxigenadores de sangre, sustituciones oseas y cardiovasculares, protesis oseas, ceras oseas, injertos cardiovasculares, dispositivos de sustitucion del cartflago, cateteres , lentes de contacto, recipientes para el cultivo y la regeneracion de celulas y tejidos, partfculas de embolizacion, sistemas de filtracion, injertos, canales de gma, cateteres permanentes, instrumentos de laboratorio, microperlas, gmas de crecimiento nervioso, implantes oftalmicos, implantes ortopedicos, cables de marcapasos, sondas, protesis, derivaciones, endoprotesis, soportes para peptidos, instrumentos quirurgicos, suturas, jeringas, sustituciones del tracto urinario, vendas para heridas, apositos para heridas, dispositivos de cicatrizacion de heridas y otros dispositivos medicos conocidos en la tecnica.

Otros ejemplos de dispositivos medicos que se beneficianan de la aplicacion de la presente invencion seran facilmente evidentes para los expertos en la materia de procedimientos medicos y quirurgicos y son contemplados, por lo tanto, por la presente invencion. La superficie de contacto puede incluir una malla, bobina, alambre, globo hinchable, o cualquier otra estructura que es capaz de ser implantada en una ubicacion diana, incluyendo ubicaciones intravasculares, ubicaciones intraluminales, ubicaciones dentro de tejido macizo. El dispositivo implantable puede estar concebido para implantacion permanente o temporal. Dichos dispositivos pueden ser suministrados por o estar incorporados en cateteres intravasculares y otros cateteres medicos.

El proceso de revestir las superficies de dichos dispositivos puede realizarse mediante la tecnica de revestimiento con plasma, tal como se describe en la solicitud de patente internacional N.° WO96/24392.

En una realizacion preferida, los biomateriales de la presente invencion se usan directamente como apositos para heridas. Por ejemplo, tal como se ha descrito supra, los biomateriales pueden secarse y usarse como un aposito para heridas directamente.

Los apositos para heridas de la presente invencion estan preferentemente en forma de una forma de lamina continua, similar a apositos para heridas conocidos en la tecnica. Sin embargo, la invencion tambien puede asumir otras conformaciones particulares. Por ejemplo, los apositos para heridas de la presente invencion pueden producirse cortando un patron de diseno deseado a partir de laminas madre de biomaterial descrito anteriormente. Por ejemplo, la lamina puede cortarse con troquel a partir de laminas madre de biomaterial.

En uso, los apositos para heridas de la presente invencion se usan preferentemente como aposito primario colocado en contacto directo con el lecho de la herida, o tan cerca como sea practico contra el lecho de la herida. Los apositos pueden servir como material de envasado y, si se requiere, pueden asegurarse en posicion con cualquier aposito para heridas secundario o dispositivo adecuado tal como una envoltura, cinta, gasa, almohadilla, sutura o pinza. Los apositos pueden ser temporales o permanentes, y pueden incorporarse permanentemente en los tejidos cicatrizados. Cuando fuera necesario, los apositos para heridas se cambian eliminando en primer lugar cualquier otro material sobre el aposito y eliminando a continuacion el aposito, con lo que cualquier tejido necrotico y exudado acumulado es retirado. El aposito para heridas temporal de la presente invencion puede sustituirse por un aposito fresco u otra venda para heridas adecuada.

Los apositos pueden colocarse en su totalidad en una herida. Los apositos de la presente invencion pueden cortarse, conformarse y modificarse para acomodarse a numerosos usos y aplicaciones.

Un uso adicional para los biomateriales de la presente invencion es en la administracion de agentes terapeuticamente activos incluyendo en cualquiera de las aplicaciones mencionadas anteriormente. Los agentes terapeuticamente activos pueden participar en, y mejorar, el proceso de cicatrizacion de heridas, y pueden incluir agentes antimicrobianos, incluyendo agentes antifungicos, agentes antibacterianos, agentes antivirales y agentes antiparasitarios, factores de crecimiento, factores angiogenicos, agentes antiinflamatorios, agentes antitromboticos, anestesicos, mucopolisacaridos, metales y otros agentes de cicatrizacion de heridas.

Los ejemplos de agentes antimicrobianos que pueden usarse en la presente invencion incluyen isoniazida, etambutol, pirazinamida, estreptomicina, clofazimina, rifabutina, fluoroquinolonas, ofloxacina, esparfloxacina, rifampicina, azitromicina, claritromicina, dapsona, tetraciclina, eritromicina, ciprofloxacina, doxiciclina, ampicilina, anfotericina B, ketoconazol, fluconazol, pirimetamina, sulfadiazina, clindamicina, lincomicina, pentamidina, atovacuona, paromomicina, diclazaril, aciclovir, trifluorouridina, foscarnet, penicilina, gentamicina, ganciclovir, iatroconazol, miconazol, Zn-piritiona, metales pesados, incluyendo oro, platino, plata, zinc y cobre, y sus formas combinadas que incluyen, sales, tales como cloruro, bromuro, yoduro y peryodato, y complejos con portadores y otras formas.

Los agentes factor de crecimiento que pueden incorporarse en los dispositivos de aposito para heridas de la presente invencion incluyen factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblastos acido (aFGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factores de crecimiento similares a insulina 1 y 2, (IGF-1 e IGF-2), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de angiogenesis tumoral (TAF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de liberacion de corticotropina (CRF), factores de crecimiento transformante a y p (TGF-a y TGF-P) interleuquina-8 (IL-8); factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF); interleuquinas e interferones.

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Otros agentes que pueden incorporarse en los apositos para heridas de la presente invencion son mucopolisacaridos acidos incluyendo heparina, sulfato de heparina, heparinoides, sulfato de dermatano, polisulfato de pentosano, celulosa, agarosa, quitina, dextrano, carragenina, acido linoleico y alantoma.

Los ejemplos de agentes antiinflamatorios y antitromboticos incluyen endometicina, heparina, indometacina, ibuprofeno, aspirina, salicilato de colina, diflunisal, salicilato de magnesio, salicilato de colina y magnesio, salsalato, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno, naproxeno, naproxeno sodico, oxaprozina, diclofenaco sodico, diclofenaco misoprostol, etodolac, indocid, ketorolac, natumetona, sulindac, tolmetina, sulfinpirazona, dipiridamol, ticlopidina, valdecoxib, rofecoxib, piroxicam, meloxicam, meclofenamato sodico, acido mefenamico, ciclofosfamida, micromulsion de ciclosporina, clorambucilo, anagrelida, clopidogrel, y cilostazol; el agente antitrombotico puede ser un anticoagulante seleccionado entre el grupo que consiste en heparina, ardeparina, y enoxaparina, tinzaparina, danaparoid, elpiruden e hirudina.

Los agentes terapeuticamente activos pueden unirse, ffsica o qmmicamente, a los biomateriales de la presente invencion mediante metodos bien conocidos en la tecnica.

Por “que comprende” se entiende incluir lo que sigue a las palabras “que comprende”. Por lo tanto, el uso de la expresion “que comprende” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes. Por “que consiste en” se entiende incluir lo que sigue a la frase “que consiste en”. Por lo tanto, la frase “que consiste en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, y que ningun elemento mas puede estar presente. Por “que consiste esencialmente en” se entiende incluir cualesquiera elementos enumerados despues de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren en o contribuyen a la actividad o accion especificada en la divulgacion para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase “que consiste esencialmente en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no a la actividad o accion de los elementos enumerados.

La invencion se describira a continuacion adicionalmente por medio de referencia solamente a los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 PROCESAMIENTO BASICO DE BIOMATERIAL

Corazones de canguro de canguros gris occidental adultos fueron extrafdos por un cazador de canguros profesional en Australia occidental y fueron transportados al laboratorio en bolsas con hielo en el plazo de 4 - 6 horas de la muerte. Los corazones se lavaron dos veces en solucion salina al 0,9 % enfriada con hielo. El pericardio se extirpo y se limpio cuidadosamente de la grasa adherida y el tejido conectivo suelto. Las rafces aorticas con las valvulas aorticas se diseccionaron de los corazones y se colocaron en solucion salina al 0,9 % enfriada con hielo que contema Fluoruro de fenil-metil-sulfonilo (PMSF) 0,5 mM. El pericardio se almaceno durante una noche a 4 °C en solucion salina al 0,9 % enfriada con hielo que contema PMSF 0,5 mM y las rafces aorticas con valvula se lavaron durante 20 minutos en la solucion salina al 0,9 % que contema PMSF.

Se preparo una solucion que contiene alcohol soluble en agua del 60-80 % v/v en volumen de alcohol etanol. El pericardio se sumergio en la solucion alcoholica despues de almacenamiento durante una noche a 4 °C. Las rafces aorticas con valvula se sumergieron en la misma solucion alcoholica inmediatamente despues del lavado final en solucion salina al 0,9 % enfriada con hielo (que contema PMSF 0,5 mM). El pericardio y las rafces aorticas con valvula se mantuvieron en la solucion alcoholica a aproximadamente 5 °C durante un mmimo de 24 horas.

El pericardio y las rafces aorticas con valvula se retiraron de la solucion alcoholica y se lavaron durante aproximadamente 10 minutos con solucion salina al 0,9 %. Durante el periodo de lavado, la temperatura de la solucion de lavado se mantuvo a aproximadamente 10 °C.

El pericardio y las rafces aorticas con valvula se sumergieron en una solucion al 0,625 % de glutaraldehfdo que contema 9,07 g/l de tampon de dihidrogeno fosfato potasico en agua desionizada esteril. El pH de la solucion de glutaraldehfdo se ajusto a 7,4 con hidroxido sodico. El pericardio y las rafces aorticas con valvula se fijaron en la solucion de glutaraldehfdo a 1-5 °C durante un periodo mmimo de 24 horas para reticular protemas presentes en el colageno de los tejidos.

El pericardio y las rames aorticas con valvula se retiraron de la solucion de glutaraldehfdo y se lavaron en un cloruro sodico al 0,9 % esteril durante aproximadamente 15 minutos. Durante el periodo de lavado, la temperatura de la solucion de lavado se mantuvo a aproximadamente 10 °C.

El pericardio y las rafces aorticas con valvula se trataron a continuacion mediante dos procedimientos alternativos. En el primer procedimiento, el pericardio y las rafces aorticas con valvula se sumergieron en una solucion libre de tampon que contema 8 mg de acido dicarboxflico por 1 ml de volumen de agua desionizada. El pH de la solucion se ajusto a un pH de 4,5 con un volumen de acido clorhndrico diluido. El pericardio y las rames aorticas con valvula se sumergieron en la solucion a una temperatura de aproximadamente 45 °C durante aproximadamente 48 horas.

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En el segundo procedimiento el pericardio y las rafces aorticas con valvula se sumergieron en una solucion libre de tampon, que contema un cation multivalente tal como sales de magnesio, ferricas y de aluminio, disueltas en agua desionizada, a un pH 3,5 durante aproximadamente 60 minutos.

El biomaterial se esterilizo a continuacion sumergiendo el tejido en una solucion al 0,25 % de glutaraldetndo que contema 9,07 g/l de tampon de dihidrogeno fosfato potasico en agua desionizada esteril. El pH de la solucion de aldetndo se ajusto a 7,4 con hidroxido sodico. El proceso de esterilizacion se llevo a cabo a una temperatura de aproximadamente 45 °C durante aproximadamente 120 minutos.

Como alternativa, el biomaterial se esterilizo en una solucion acuosa que comprendfa epoxipropano al 2 % combinado con alcohol etflico al 20 % en peso a 37 °C durante aproximadamente 24 horas. El tejido esterilizado se almaceno a continuacion en glutaraldetndo tamponado al 0,2 % mas isopropanol al 15 %.

EJEMPLO 2 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL BIOMATERIAL

La temperatura de desnaturalizacion es una medida importante de estabilidad de reticulacion y refleja la resistencia, durabilidad e integridad del material.

Se obtuvo pericardio bovino de un matadero local en Australia occidental y se transporto al laboratorio en hielo. El pericardio se limpio tal como se describe en el ejemplo 1.

El grado de reticulacion del pericardio bovino preparado de acuerdo con los metodos descritos en el ejemplo 1, se comparo con pericardio bovino fijado en glutaraldetndo tamponado al 0,625 % (Pericardio de control).

Tiras de muestra pericardicas representativas (5 x 10 mm) en cada grupo se unieron a un transductor de fuerza isometrica (MLT0500, AD Instruments, Australia), en interfaz con un sistema de adquisicion de datos PowerLab y un ordenador personal de sobremesa. Las muestras se mantuvieron en extension constante con una carga de 90 ± 5 g y se sumergieron en un bano de agua a temperatura controlada, abierto, lleno con solucion salina al 0,9 %. La temperatura del bano de agua se incremento gradualmente a aproximadamente 1,5 °C/min de 25 °C a 95 °C. La temperatura de contraccion se indico en un punto de deflexion brusco desde extension constante cuando el material colagenoso se desnaturalizaba. Los resultados (temperatura de contraccion expresada como grados Celsius) se resumen en la tabla I.

TABLAI

Tipo de tejido:

Numero Temperatura de contraccion

Pericardio de control

10 84,10 ± 0,17

Pericardio tratado

10 85,54 ± 0,15

EJEMPLO 3 DEGRADACION ENZIMATICA DE BIOMATERIAL

El nivel de resistencia a la degradacion enzimatica del pericardio bovino, preparado de acuerdo con los metodos descritos en el ejemplo 1 (pericardio tratado), se comparo con pericardio bovino fijado en glutaraldetndo tamponado al 0,625 % (pericardio de control).

Se preparo una solucion de pronasa disolviendo 100 mg de pronasa (Streptomyces griseus) y 100 mg de cloruro calcico, en 200 ml de solucion de tampon HEPES (0,01 M, pH 7,4), que contema glicina 0,1 M. Muestras de tejido fijadas se lavaron en agua desionizada durante 3 minutos, se transfirieron, se secaron durante una noche a 70 °C y se pesaron. Estas muestras se incubaron en la solucion de pronasa a 50 °C durante 24 horas. Las muestras de tejido restantes se lavaron en agua desionizada, se secaron durante una noche a 70 °C y se pesaron. La resistencia a la digestion por pronasa se determino mediante la masa de tejido restante, expresada como un porcentaje de masa de tejido predigerido. Los resultados se resumen en la tabla II.

TABLA II

Tipo de tejido N

Numero de muestras % de tejido restante

Pericardio de control

m 10 81,98 ± 1,97

Pericardio tratado

m 10 89,13 ± 0,39

EJEMPLO 4 RESISTENCIA A LA TRACCION DEL BIOMATERIAL

La resistencia a la traccion es una medida importante de la resistencia del material y refleja la durabilidad de tejidos reticulados.

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La resistencia a la traccion de pericardio bovino, preparado de acuerdo con los metodos descritos en el ejemplo 1 (pericardio tratado), se comparo con pericardio bovino fijado en glutaraldetudo tamponado al 0,625 % (pericardio de control).

La resistencia a la traccion de tiras pericardicas representativas (8 x 80 mm) de ambos grupos de tejido se midieron con una maquina de ensayos de traccion hidraulica Zwick/Roell (Modelo 2010), equipada con una celula de carga de 10 kNewton a una velocidad de extension constante de 50 mm/min. La resistencia a la traccion y el alargamiento a la rotura se evaluaron a partir de las curvas de carga/alargamiento registradas. Los resultados se resumen en la tabla III.

TABLA III

Tipo de tejido

Numero de muestras Resistencia a la traccion (N/mm2) Alargamiento (%)

Pericardio de control

10 36,59 ± 1,33 14,18 ± 1,67

Pericardio tratado

10 71,82 ± 3,33 15,99 ± 0,61

EJEMPLO 5 PERFIL DE CALCIFICACION DE BIOMATERIAL

Se han realizado estudios experimentales en modelos en animales pequenos y grandes para valorar la eficacia del proceso descrito anteriormente para mitigar la calcificacion de biomateriales tratados que contienen colageno.

En el primer estudio animal, valvas de valvula de canguro y tejidos de la pared aortica de canguro, preparados mediante fijacion estandar solamente en glutaraldetudo tamponado al 0,625 % (tejido no tratado), se compararon con valvas de valvula de canguro y tejidos de la pared aortica de canguro tratados de acuerdo con los metodos descritos en el ejemplo 1 (tejido tratado).

Muestras de tejido de la pared aortica (10 x 5 mm de tamano) y valvas de la valvula aortica de ambos grupos se lavaron en solucion salina al 0,9 % durante 5 minutos. Los tejidos lavados se implantaron quirurgicamente en bolsillos subcutaneos (una muestra de cada grupo por rata), creados en la zona de la pared dorsal central de ratas Wistar macho en crecimiento (6 semanas de edad). Despues de 60 dfas, los tejidos explantados se diseccionaron del tejido huesped circundante y se secaron en una incubadora de Biotherm (Selby Scientific, Perth, WA) a 90 °C durante 48 h. Las muestras secas se pesaron, y el contenido de calcio se extrajo en 5,0 ml de acido clortudrico ultrapuro 6 N (Merck, Perth, WA) a 75 °C durante 24 h. El contenido de calcio extrafble se midio a continuacion usando un espectrofotometro de absorcion atomica (Varian AA1275) y se expreso como |ig de calcio por mg de tejido (peso seco). Estos datos se resumen en la tabla IV.

TABLA IV

Tipo de tejido

Numero Tejido no tratado Tejido tratado

Valva de la valvula

10 6,45 ± 4,65 1,3 ± 0,74

Pared aortica

10 28,67 ± 7,22 1,9 ± 0,15

La eficacia del nuevo proceso para mitigar la calcificacion es facilmente evidente en la tabla IV. Los niveles de calcio en los tejidos tratados eran comparables a niveles normalmente presentes en tejidos no fijados y, por lo tanto, demuestran la superioridad del nuevo proceso en comparacion con fijacion con glutaraldetudo estandar solamente.

EJEMPLO 6 ESTUDIOS DE CALCIFICACION ADICIONALES EN OVEJAS

En un estudio animal adicional, conductos aorticos con valvula de canguro, fijados en glutaraldetudo tamponado al 0,625 % tal como se describe en el ejemplo 1 (tejido tratado) se compararon con rafces aorticas con valvula extrafdas como en el ejemplo 1 (tejido no tratado). Las rafces aorticas se lavaron en solucion salina al 0,9 % durante 5 minutos y se implantaron quirurgicamente en la posicion de la arteria pulmonar de ovejas mestizas Merino-Dorset juveniles (4 meses de edad). Estos implantes con valvula se extirparon despues de 200 dfas y el contenido de calcio de las valvas de valvula y tejidos de la pared aortica se determinaron mediante espectrofotometna de absorcion atomica tal como se ha descrito anteriormente.

Los resultados (|ig de calcio por mg de tejido seco) se resumen en la tabla V.

TABLA V

Tipo de tejido

Numero Tejido no tratado Tejido tratado

Valva de valvula

12 2,54 ± 1,30 1,20 ± 0,94

Pared aortica

12 137,93 ± 12,68 3,22 ± 0,75

EJEMPLO 8 ESTUDIOS DE CALCIFICACION ADICIONALES CON TEJIDO DERIVADO DE CERDO

En un estudio animal adicional, conductos con valvula aorticos porcinos no tratados, fijados en glutaraldetudo al 0,625 % tamponado (tejido no tratado) se compararon con conductos con valvula porcinos preparados de acuerdo

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con el metodo descrito en el ejemplo 1 (tejido tratado). Los conductos con valvula porcinos se lavaron en solucion salina al 0,9 % durante 5 minutos y se implantaron quirurgicamente en la posicion de la arteria pulmonar de ovejas mestizas Merino-Dorset juveniles (4 meses de edad). Estos implantes con valvula se extirparon despues de 200 dfas y el contenido de calcio de las valvas de valvula y los tejidos de la pared aortica se determinaron mediante la espectrofotometna de absorcion atomica descrita supra.

Los resultados (|ig de calcio por mg de tejido seco) se resumen en la tabla VI.

TABLA VI

Tipo de tejido

Numero Tejido no tratado Tejido tratado

Valva de valvula

6 40,68 ± 5,39 3,60 ± 1,75

Pared aortica

5 142,62 ± 14,25 5,54 ± 1,99

EJEMPLO 8 CALCIFICATION DE PERICARDIO BOVINO

En un estudio animal adicional, el potencial de calcificacion de pericardio bovino fijado en glutaraldefudo tamponado al 0,625 % (pericardio de control) se comparo con el potencial de calcificacion de pericardio bovino preparado de acuerdo con el metodo descrito en el ejemplo 1 (pericardio tratado). Muestras representativas de cada grupo se recortaron a 1 x 1 cm de tamano y se lavaron en solucion salina al 0,9 % durante 5 minutos. Estas muestras se implantaron quirurgicamente en bolsillos subcutaneos, creados en la zona de la pared dorsal central de ratas Wistar macho en crecimiento (6 semanas de edad). Estos tejidos se extirparon despues de 60 dfas, el tejido huesped se extirpo y el contenido de calcio se determino mediante espectrofotometna de absorcion atomica. Los resultados (|ig de calcio por mg de tejido seco) se resumen en la tabla VII.

TABLA VII

Tipo de tejido

Numero Contenido de calcio

Pericardio de control

10 136,68 ± 11,39

Pericardio tratado

10 4,10 ± 2,11

EJEMPLO 10 CALCIFICACION DE PERICARDIO DE CANGURO DESCELULARIZADO

En otro estudio animal, el potencial de calcificacion de pericardio de canguro fijado en glutaraldefudo tamponado al 0,625 % (pericardio de control) se comparo con el potencial de calcificacion de pericardio de canguro, que habfa sido descelularizado y preparado de acuerdo con los metodos descritos en el ejemplo 1 (pericardio tratado).

Muestras representadas de cada grupo se recortaron a 1 x 1 cm de tamano y se lavaron en solucion salina al 0,9 % durante 5 minutos. Estas muestras se implantaron a continuacion quirurgicamente en bolsillos subcutaneos, creados en la zona de la pared dorsal abdominal media de ratas Wistar macho en crecimiento (6 semanas de edad). Estos tejidos se extirparon despues de 60 dfas, el tejido huesped se extirpo y el contenido de calcio se determino mediante espectrofotometna de absorcion atomica mediante procedimientos estandar. Los resultados (|ig de calcio por mg de tejido seco) se resumen en la tabla VIII.

TABLA VIII

Tipo de tejido

Numero Contenido de calcio

Pericardio de control

5 2,440 ± 0,600

Pericardio tratado

7 0,406 ± 0,029

EJEMPLO 11 RECELULARIZACION DE PERICARDIO DE CANGURO DESCELULARIZADO

En el sexto estudio animal, el potencial de recelularizacion de pericardio de canguro descelularizado fijado en glutaraldefudo tamponado al 0,625 % (pericardio de control) se comparo con el potencial de recelularizacion de pericardio de canguro descelularizado preparado de acuerdo con el metodo descrito en el ejemplo 1 (pericardio tratado). El pericardio de canguro se descelularizo durante 24 horas a temperatura ambiente en Triton x-100 al 0,25 % y Dodecil sulfato sodico al 0,25 % y se lavo en medio de cultivo durante 20 minutos. Muestras representadas (n=5) de cada grupo de pericardio se recortaron a 2 x 2 cm de tamano y se lavaron en solucion salina al 0,9 % durante 5 minutos. Estas muestras se sembraron en condiciones esteriles con 3,0 x 105 fibroblastos humanos/cm1 2 3 4, extrafdos de la vena safena humana. El pericardio sembrado se incubo a 37 °C en condiciones de cultivo celular estaticas estandar durante 21 dfas. El cultivo celular se valoro microscopicamente cada 7 dfas y se clasifico de acuerdo con la siguiente escala visual de:

1) . No hay fibroblastos viables presentes en la superficie de la matriz;

2) . Menos del 50 % de superficie de la matriz cubierta por fibroblastos (+);

3) . Mas del 50 % de superficie de la matriz cubierta por fibroblastos (++);

4) . Matriz completamente cubierta por multiples capas de fibroblastos (+++).

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Un ensayo colorimetrico rapido, ensayo MTT con bromuro de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5difeniltertrazolio se empleo el d^a 21 para confirmar la ausencia de fibroblastos viables en el pericardio de control y la presencia de fibroblastos viables en el pericardio tratado (para el metodo MTT vease, por ejemplo, el documento Zund et al., 1999, Eur J Cardiothorac Surg., 15(4): 519-24). Los resultados se resumen en la tabla IX.

TABLA IX

Tiempo Pericardio de control______Pericardio tratado

Dfa 0

+ + + + + + + + + +

Dfa 7

+ 0 0 0 0 + ++ + ++ ++

Dfa 14

0 0 0 0 0 ++ +++ ++ +++ +++

Dfa 21

0 0 0 0 0 +++ +++ ++ +++ +++

EJEMPLO 12 ESTABILIDAD DE RETICULACION DE TEJIDO DE CANGURO

Dos tipos de tejido de canguro, tejido de pared aortica y pericardio de canguro, se trataron usando el procedimiento perfilado en el ejemplo 1 hasta e incluyendo la etapa (b) es decir pretratamiento con solucion alcoholica y a continuacion reticulacion con glutaraldehndo. Estos tejidos tratados se compararon a continuacion con tejido fijado con glutaraldehndo, es decir sin pretratamiento con alcohol y tejido “fresco”. La figura 1 y la figura 2 muestran la estabilidad de reticulacion del pericardio (figura 1) y tejido de la pared aortica (figura 2). Puede verse que el pretratamiento con etanol tema un efecto significativo sobre la estabilidad de la reticulacion a ~85 °C-86 °C. Estos datos tambien pueden verse en la Tabla X.

TABLA X

ESTABILIDAD DE RETICULACION - PERICARDIO DE CANGURO

Temp. de contraccion ( °C) : n = 5 Fresco

66,55 ± 1,200

Fijado con glutaraldehndo

80,74 + 1,047

Alcohol + Fijacion con glutaraldehndo

84,62 ± 0,465

p = 0,016 (Fij. con glut. frente a alcohol

+ fij. con glut.)

ESTABILIDAD DE RETICULACION - PARED AORTICA DESC. DE CANGURO

Temp. de contraccion ( °C) : n = 5

Fresco

65 +1 o o CO CM

Fijado con glutaraldehndo

80 11 ± 1,281

Alcohol + Fijacion con glutaraldehndo

86, 21 ± 0,449

p = 0,002 (Fij. con glut. frente a alcohol

+ fij. con glut.)

EJEMPLO 13 ESTABILIDAD DE RETICULACION Y COMPORTAMIENTO DE CALCIFICACION EN UN MODELO EN RATA SUBCUTANEO

Este estudio pretendfa comparar la estabilidad de reticulacion y el comportamiento de calcificacion de tejido porcino (cuspide y pared), tratado con el metodo desvelado en el ejemplo 1 en comparacion con un control de tejido fijado con glutaraldehndo y tejidos bioprotesicos Freestyle® y PrimaPlus® preparados comercialmente.

Rafces aorticas con valvula porcinas frescas se extrajeron y se transportaron a 4 °C en solucion salina tamponada con fosfato (PBS; 0,1 M, pH 7,4). Cuspides de valvula aortica (n = 30) y muestras de pared aortica (n = 30; 10 m x 15 mm) representativas se retiraron de las rafces aorticas y se dividieron en dos grupos. El grupo I inclma cuspides de valvula (n = 15) y muestras de pared aortica representativas (n = 15; 10 mm x 15 mm) almacenadas en glutaraldetndo tamponado al 0,25 %. El grupo II inclma cuspides de valvula (n = 15) y muestras de pared aortica representativas (n = 15; 10 mm x 15 mm) expuestas al metodo desvelado en el ejemplo 1 y almacenadas en glutaraldehndo tamponado al 0,25 %. Para comparacion, un tercer grupo (III) consistfa en cuspides de valvula (n = 10) y muestras de pared aortica (n = 10; 10 mm x 15 mm) de bioprotesis Freestyle®, mientras que el grupo IV consistfa en cuspides de valvula (n = 10) y tejido de pared aortica (n = 10; 10 mm x 15 mm) de bioprotesis Prima Plus®.

La medicion de la temperatura de contraccion se uso para valorar la estabilidad de la reticulaciones de colageno del tejido (Levy et al., 1986, Am. J. Pathol., 122: 71-82). Tiras de tejido de muestra de la cuspide y la pared aortica (5 x 10 mm; n = 10) en cada grupo se unieron a un transductor de fuerza isometrica (MLT0500; AD Instruments, Australia), en interfaz con un sistema de adquisicion de datos PowerLab y un ordenador personal de sobremesa.

Las muestras se mantuvieron en extension constante con una carga de 90 ± 5 g y se sumergieron en un bano de agua a temperatura controlada, abierto lleno con solucion salina al 0,9 %. La temperatura del bano de agua se

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incremento gradualmente a aproximadamente 1,5 °C min de 25 °C a 95 °C. La temperatura de contraccion se indico como un punto de deflexion brusco desde extension constante cuando el material colagenoso se desnaturalizaba.

Las temperaturas de contraccion para cuspides de valvula y tejidos de la pared aortica se enumeran en la tabla XI. No se identificaron diferencias significativas entre cuspides de control, del procedimiento de ensayo de control del ejemplo 1 (“ensayo”), Freestyle® y Prima Plus®. Procedimiento de ensayo - tejido de pared aortica tratado mostraba una temperatura de contraccion significativamente (p < 0,05) mas elevada en comparacion con tejidos de pared de control, Freestyle® y Prima Plus®.

TABLA XI

TEMPERATURAS DE CONTRACCION ( °C) DE CUSPIDE DE VALVULA Y TEJIDO DE PARED AORTICA

Muestra

Cuspide Pared aortica

Control

84,6 ± 1,40 86,73 ± 0,26

Ensayo

85,5 ± 0,24 89,34 ± 0,19*

Freestyle

85,7 ± 0,35 86,16 ± 0,40

Prima Plus

84,3 ± 0,18 86,37 ± 0,34

n = 10 por grupo) Los valores son la media ± SE. *p <0,05 (ensayo frente a control, Freestyle, Prima Plus).

La resistencia a la digestion por enzima proteolftica se basaba en el metodo de Girardot & Girardot (J. Heart Valve Dis., 1996, 122: 71-82). Se preparo una solucion de pronasa disolviendo 10 mg de pronasa E (tipo XIV de Streptomyces griseus; Sigma) y 100 mg de cloruro calcico, en 200 ml de solucion de tampon HEPES (0,01 M, pH 7,4), que contema glicina 0,1 M. Muestras de tejido fijadas se lavaron en agua desionizada durante 3 min, se transfirieron, se secaron durante una noche a 70 °C y se pesaron. Estas muestras se incubaron a continuacion en solucion de pronasa a 50 °C durante 24 h. Las muestras de tejido restantes se lavaron en agua desionizada, se secaron durante una noche a 70 °C y se pesaron. La resistencia a la digestion por pronasa se determino mediante la masa de tejido restante, expresada como un porcentaje de la masa de tejido predigerido.

La resistencia a la degradacion enzimatica se ilustra en la figura 3. Tejidos de cuspide del procedimiento de ensayo, Freestyle® y Prima Plus® mostraban incrementos significativos (p<0,0001) de la resistencia a la digestion proteolftica en comparacion con el control (figura 3A). No se observo ninguna diferencia significativa entre los tejidos de cuspide del procedimiento de ensayo, Freestyle® y Prima Plus®.

El tejido de pared aortica tratado mediante el procedimiento de ensayo mostraba resistencia igual (p = NS) a la digestion proteolftica que el tejido de control, y una resistencia significativamente (p<0,01) mayor en comparacion con tejidos de la pared Freestyle® y Prima Plus® (figura 3B).

Ratas Wistar macho jovenes (peso corporal 150-200 g) se dividieron en dos grupos; un grupo (n = 10) recibio implantes de cuspide y el segundo grupo (n = 10) recibio implantes de pared aortica. Cada animal recibio una muestra de cada uno de los cuatro grupos de tejidos, lo que hada un total de 80 implantes.

Las ratas se anestesiaron con pentobarbital (Nembutal®; 45 mg/kg, intraperitoneal). La zona del musculo dorsal se afeito y se desinfecto con gluconato de clorhexidina diluido al 15 % (ICI Pharmaceuticals, Perth, WA) y etanol (Merck Chemicals, Perth, WA).

Los implantes se lavaron cuidadosamente en agua desionizada durante 2 min para eliminar el fijador residual, y a continuacion se implantaron en bolsillos subcutaneos a traves de una incision de 2,5 cm en la pared muscular posterior. La incision se cerro con suturas Prolene de calibre 5-0.

Las ratas se sacrificaron despues de ocho semanas con una sobredosis de barbituricos (Euthenase®), y la pared del musculo dorsal, que contema los implantes subcutaneos, se extirpo para analisis cuantitativos y cualitativos del calcio tisular. Cada muestra recuperada se dividio en dos mitades anatomicamente simetricas. Una mitad se uso para espectrofotometna de absorcion atomica, y la otra mitad se fijo en formaldehido tamponado al 10 % y se proceso para histologfa.

Las muestras fijadas se incluyeron en cera de parafina, se seccionaron a 3 |im, y se trataron con tincion de Von Kossa para analisis cualitativo de calcio. Se realizaron examenes histologicos usando un microscopio optico Olympus BHS.

Muestras de tejido explantado de todos los grupos se diseccionaron libres de tejido huesped circundante y se secaron en una incubadora Biotherm (Selby Scientific, Perth, WA) a 90 °C durante 48 h. Las muestras secas se pesaron, y el contenido de calcio se extrajo en 5,0 ml de acido clorlddrico ultrapuro 6 N (Merck, Perth, WA) a 75 °C

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durante 24 h. El contenido de calcio extrafole se midio usando un espectrofotometro de absorcion atomica (Varian AA1275) y se expreso como |ig de Ca por mg de tejido (peso seco).

El examen histologico indicaba la presencia de calcificacion intrmseca grave en las muestras de cuspide de control explantadas (no se muestran los datos). No se observo calcificacion visible en las cuspides de valvula de ADAPT, Freestyle o Prima Plus (no se muestran los datos).

El tejido de pared aortica explantado revelo varias calcificaciones de los medios ((no se muestran los datos) en muestras de control. No se observo calcificacion visible en el tejido de pared aortica de ensayo explantado ((no se muestran los datos). Se observo calcificacion moderada de los medios en los tejidos de la pared aortica de Freestyle (no se muestran los datos) y Prima Plus (no se muestran los datos) explantados.

Los niveles de calcio tisular cuantitativo para cuspides explantadas se ilustran en la figura 4A. Muestras de control, fijadas en glutaraldehudo solamente, mostraban el nivel mas elevado de calcio en este modelo (92,37 ± 7,9 |ig/mg). Los niveles de calcio del tejido tratado mediante el metodo del ejemplo 1 eran 2,09 ± 0,22 |ig/mg tejidos, mientras que Freestyle® era 2,03 + 0,29 |ig/mg y Prima Plus® era 1,54 ± 0,17 |ig/mg. Esto significa que las cuspides tratadas redudan significativamente los niveles de calcio (p <0,001) en comparacion con muestras de control. No se observo diferencia significativa entre los niveles de calcio tisular de cuspides del Ejemplo 1, Freestyle® y Prima Plus® despues de ocho semanas.

Los niveles de calcio tisular cuantitativo para muestras de pared aortica explantadas se ilustran en la figura 4B. El contenido de calcio de muestras de pared aortica tratadas del Ejemplo 1 (4,86 ± 0,12 |ig/mg de tejido) era significativamente (p <0,001) menor en (95,9 %) que la de muestras de control (120,11 ± 7,48 |ig/mg de tejido). Muestras de pared aortica de Freestyle® y Prima Plus® mostraban reducciones en calcificacion del 47,8 % y el 51,95 %, respectivamente.

Estos datos sugieren que el metodo desvelado en el ejemplo 1 es eficaz para reducir la calcificacion tanto en cuspides porcinas como en tejidos de la pared en un modelo en rata subcutaneo. Estos datos sugieren ademas que la reticulacion mejorada desempena un importante papel en la minimizacion de la calcificacion de la pared aortica.

Claims (46)

1. 5

   10

   15

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   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir un biomaterial implantable resistente a la calcificacion que comprende:

   (a) exponer un biomaterial que contiene colageno a una solucion que contiene alcohol durante al menos 24 horas;

   (b) exponer dicho biomaterial en la etapa (a) a un agente de reticulacion; y

   (c) exponer dicho biomaterial en la etapa (b) a una solucion acida que contiene un acido aminocarboxflico capaz de inactivar y/o modificar las fracciones de agente de reticulacion fijadas y/o no fijadas presentes en el biomaterial despues de la etapa (b);

   en el que las etapas (b) y (c) son consecutivas a la etapa (a).
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas una etapa de lavado entre las etapas (a) y (b) y/o entre las etapas (b) y (c).
3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas una etapa de lavado despues de la etapa (c).
4. 4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3, en el que la etapa de lavar el biomaterial se lleva a cabo usando una solucion libre de fosfato de solucion salina al 0,9 %.
5. 5. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el biomaterial que contiene colageno se afsla de un animal.
6. 6. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el animal se selecciona entre el grupo que consiste en un ovino, un bovino, un caprino, un equino, un porcino, un marsupial y un ser humano.
7. 7. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el biomaterial es un tejido cultivado, una protesis que contiene matriz extracelular obtenida de un animal o un tejido reconstituido.
8. 8. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el biomaterial es un tejido celular seleccionado entre el grupo que consiste en tejido cardiovascular, tejido del suelo pelvico, tejido cardiaco, valvula cardiaca, rafces aorticas, pared aortica, valvas aorticas, tejido pericardico, tejido conectivo, la matriz de organos blandos o macizos, tejido dermico, un tejido vascular, duramadre, cartflago, pericardio, ligamento, tendon, vasos sangumeos, tejido umbilical, tejido oseo, fascias, y tejido submucosal o piel.
9. 9. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la solucion que contiene alcohol usada en la etapa (a) comprende uno o mas alcoholes solubles en agua.
10. 10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el alcohol soluble en agua es un alcohol inferior de C1- C6.
11. 11. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el alcohol inferior de C1-C6 se selecciona entre el grupo que consiste en metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec- butanol, t-butanol y combinaciones de los mismos.
12. 12. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la solucion que contiene alcohol comprende menos del 100 % de alcohol es un disolvente acuoso no tamponado.
13. 13. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la etapa (a) se lleva a cabo durante al menos 36 horas.
14. 14. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la etapa (a) se lleva a cabo durante al menos 48 horas.
15. 15. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el agente de reticulacion se selecciona entre el grupo que consiste en carbodiimida, eteres de poliepoxi, divinilsulfona (DVS), genipina, polialdehfdo, difenilfosforil azida (DPPA) y combinaciones de los mismos.
16. 16. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que el polialdehfdo es glutaraldehfdo.
17. 17. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende ademas una etapa de esterilizacion despues de la etapa (c).
18. 18. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura entre 5 °C y 25 °C.

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19. 19. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la etapa (c) se lleva a cabo a una temperatura entre 5 °C y 55 °C durante al menos 6 horas, mas preferentemente al menos 24 horas, aun mas preferentemente mas de 48 horas.
20. 20. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que la solucion acida es capaz de reticular grupos carboxilo y amino activados en colageno para formar enlaces amida.
21. 21. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el acido aminocarboxflico se selecciona entre el grupo que consiste en L-histidina, L-arginina, L-lisina, L-glutamato y L-aspartato.
22. 22. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que la solucion que contiene alcohol, el agente de reticulacion y la solucion acida estan todas libres de tampon.
23. 23. Un biomaterial implantable resistente a la calcificacion producido mediante un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
24. 24. Un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con la reivindicacion 23, biomaterial que tiene un contenido de calcio de menos de aproximadamente 50 |ig por mg de biomaterial y en el que dicho biomaterial es capaz de ser implantado durante al menos 200 dfas sin que el biomaterial incremente su contenido de calcio por encima de 50 |ig/mg de biomaterial.
25. 25. Un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con la reivindicacion 24, en el que dicho biomaterial antes de la implantacion tiene un contenido de calcio de menos de aproximadamente 20 |ig por mg de biomaterial.
26. 26. Un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con la reivindicacion 24, en el que dicho biomaterial antes de la implantacion tiene un contenido de calcio de menos de aproximadamente 10 |ig por mg de biomaterial.
27. 27. Un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que dicho biomaterial comprende colageno reticulado que comprende aminas secundarias.
28. 28. Un dispositivo biologico implantable que comprende un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27.
29. 29. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 28, en el que dicho biomaterial se extiende formando un revestimiento sobre una superficie de dicho dispositivo.
30. 30. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 28 o la reivindicacion 29, que comprende ademas al menos un segundo revestimiento.
31. 31. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 30, en el que el al menos segundo revestimiento comprende uno o mas de un agente antimicrobiano, un agente antiviral, un agente antifungico, un factor de crecimiento, un agente antideshidratacion o un agente antiseptico.
32. 32. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 31, en el que el agente antimicrobiano se selecciona entre el grupo que consiste en isoniazida, etambutol, pirazinamida, estreptomicina, clofazimina, rifabutina, fluoroquinolonas, ofloxacina, esparfloxacina, rifampicina, azitromicina, claritromicina, dapsona, tetraciclina, eritromicina, ciprofloxacina, doxiciclina, ampicilina, anfotericina B, ketoconazol, fluconazol, pirimetamina, sulfadiazina, clindamicina, lincomicina, pentamidina, atovacuona, paromomicina, diclazaril, aciclovir, trifluorouridina, foscarnet, penicilina, gentamicina, ganciclovir, iatroconazol, miconazol, Zn-piritiona, metales pesados, incluyendo oro, platino, plata, zinc y cobre, y sus formas combinadas que incluyen, sales, tales como cloruro, bromuro, yoduro y peryodato, y complejos con portadores y otras formas.
33. 33. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 31, en el que el agente factor de crecimiento se selecciona entre el grupo que consiste en hidroxiapatita, factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento de fibroblastos acido (aFGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factores de crecimiento similares a insulina 1 y 2, (IGF-1 e IGF-2), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de angiogenesis tumoral (TAF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de liberacion de corticotropina (CRF), factores de crecimiento transformante a y p (TGF-a y TGF-P) interleuquina-8 (IL-8); factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF); interleuquinas e interferones.
34. 34. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 30, en el que el al menos segundo revestimiento comprende ademas material bioabsorbible seleccionado entre el grupo que consiste en acido polilactico, acido poliglicolico, copolfmeros de acido polilactico-acido poliglicolico, polidioxanona, policaprolactona, polipeptidos, policarbonatos,

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    polihidroxibutirato, poli(oxalato de alquileno), copoKmeros de acetatos de vinilo con acidos carbox^licos insaturados, derivados de celulosa solubles o dispersables en agua, poKmeros de oxido de etileno, poliacrilamida, colageno, gelatina, poli(ortoester), poliamidas de aminoacidos, alcohol polivimlico, polivinilpirrolidona, polieteretercetona, fosfato tricalcico, y mezclas de los mismos.
35. 35. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, en el que dicho dispositivo se selecciona entre el grupo que consiste en un corazon artificial, un dispositivo de asistencia cardiaca interno o externo, un protesis de valvula cardiaca, un anillo de anuloplastia, un injerto dermico, un injerto vascular, una endoprotesis vascular, una endoprotesis estructural, una derivacion vascular, una derivacion cardiovascular, un injerto de duramadre, un injerto de cartflago, un implante de cartflago, un injerto de pericardio, una protesis de ligamento, una protesis de tendon, una protesis de vejiga urinaria, una compresa, una sutura, un dispositivo percutaneo implantado de forma permanente, un parche quirurgico, una endoprotesis cardiovascular, una endoprotesis revestida, y un cateter revestido.
36. 36. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 35, en el que el dispositivo es una protesis de valvula cardiaca.
37. 37. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 36, en el que el dispositivo comprende ademas un fragmento de tejido.
38. 38. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 37, en el que el fragmento de tejido se extrae de un animal.
39. 39. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 38, en el que el animal se selecciona entre el grupo que consiste en un ser humano, una vaca, un cerdo, un perro, un ciervo y un canguro.
40. 40. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 39, en el que el dispositivo comprende ademas un analogo sintetico de un tejido.
41. 41. Un implante biocompatible, que comprende una matriz de soporte biocompatible que comprende un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27.
42. 42. Un kit para reparar una lesion tisular, que comprende:

    (a) un recipiente esteril que tiene un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 o uno o mas dispositivos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 40, en el que dicho biomaterial o dispositivo comprende colageno reticulado que comprende aminas secundarias;

    (b) instrucciones para su uso en un sujeto herido; y

    (c) una herramienta de extraccion para recoger al menos una muestra de tejido viable de un sujeto herido.
43. 43. Un kit de acuerdo con la reivindicacion 42, que comprende ademas al menos un reactivo para mantener la viabilidad de la al menos una muestra de tejido.
44. 44. Un kit de la reivindicacion 42, en el que la herramienta de extraccion comprende ademas una herramienta de procesamiento para dividir la muestra de tejido, en condiciones esteriles, en al menos un fragmento de tejido.
45. 45. Un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 o un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 40, para su uso en el tratamiento de tejido vivo.
46. 46. Un aposito para heridas que comprende un biomaterial implantable resistente a la calcificacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que dicho biomaterial comprende colageno reticulado que comprende aminas secundarias.