BR112020023977A2

BR112020023977A2 - método para preparar tecido biológico para implante cirúrgico

Info

Publication number: BR112020023977A2
Application number: BR112020023977-1A
Authority: BR
Inventors: Katharina Kiss; Guilherme Agreli
Original assignee: P+F Products + Features Gmbh
Priority date: 2019-02-07
Filing date: 2020-02-06
Publication date: 2021-02-23
Also published as: US20220072202A1; EP3765105A1; WO2020161243A1; CN112236175A; JP2022519407A; KR20210124886A; JP7448491B2; EP3693030A1

Abstract

MÉTODO PARA PREPARAR TECIDO BIOLÓGICO PARA IMPLANTE CIRÚRGICO. A presenta invenção se refere a um método para tratar tecido biológico e a um tecido biológico obtido pelo método de tratamento, e, especificamente, a um método para tratar tecido biológico com a finalidade de suprimir a calcificação, risco de biofilme aderente sobre o pericárdio e redução de resistência do tecido devido ao tratamento. A invenção também é direcionada a bioprótese e válvulas cardíacas transcateter contendo o tecido biológico.

Description

“MÉTODO PARA PREPARAR TECIDO BIOLÓGICO PARA IMPLANTE CIRÚRGICO” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção é direcionada a um método para tratar tecido biológico e a um tecido biológico obtido pelo método de tratamento, e, especificamente, a um método para tratar tecido biológico com a finalidade de suprimir a calcificação, risco de biofilme aderente sobre o pericárdio e redução de resistência do tecido devido ao tratamento. A invenção também é direcionada a bioprótese e válvulas cardíacas transcateter contendo o tecido biológico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Tecidos biológicos são usados amplamente para fabricar substituições protéticas para válvulas cardíacas e vasos sanguíneos assim como para válvulas cardíacas transcateter. Os mesmos são tecidos conjuntivos compreendendo colágeno como o principal componente. Dentre esses tecidos, o pericárdio bovino é um dos empregados mais amplamente. O tecido pericárdico é o saco que circunda o coração que fornece uma barreira natural para infecção para o coração e previne adesão ao tecido circundante. O pericárdio também desempenha papéis mecânicos, por exemplo, ao prevenir dilatação excessiva do coração, mantendo a posição anatômica correta do coração, e regulando a razão de pressão para volume no ventrículo esquerdo durante a diástole. A estrutura do tecido determina seu comportamento sob carga tanto em condições fisiológicas para o pericárdio quanto como um dispositivo protético.

[0003] Entretanto, tecidos biológicos obtidos a partir do abatedouro, em particular, cadáveres suínos e bovinos, começam a degradar imediatamente. Portanto, a fim de ter capacidade de explorar tecidos biológicos como material clínico essa deterioração precisa ser interrompida. O objetivo consiste em prolongar a estrutura original e a integridade mecânica do material e remover ou pelo menos neutralizar as propriedades antigênicas atribuídas a esses materiais. Os métodos se concentram tipicamente em criar novas ligações químicas adicionais entre as moléculas de colágeno. Esses elos suplementares reforçam o tecido para gerar um material resistente e forte, mas o material não viável que mantém o formato original do tecido. Com esse propósito, um tecido biológico como, por exemplo, pericárdio bovino ou suíno ou uma válvula cardíaca, é tratado quimicamente para aprimorar seu desempenho mecânico e propriedades imunogênicas, reduzir trombogenicidade e degradação, preservar a esterilidade e prolongar o período de armazenamento permissível.

[0004] Consequentemente, é de importância significativa selecionar um método de tratamento de um tecido biológico usado para implantação que torna o tecido prontamente disponível para a equipe médica com preparação mínima antes da cirurgia. Isso reduz as oportunidades de erro e também o tempo de implantação.

[0005] São conhecidos vários estudos nesse contexto da técnica anterior, nos quais tecidos biológicos foram tratados por diferentes métodos. Faz-se referência nesse contexto às referências a seguir:

[0006] O documento US 2008/0102439 A1 é direcionado à preparação ou ao armazenamento de tecidos biológicos, em particular, tecido de mamífero, usados para implante cirúrgico, em que o dito método de preparação compreende colocar em contato o tecido biológico com uma solução de tratamento não aquosa compreendendo um álcool poli-hídrico como glicerol, e um C1-C3 álcool, e remover uma porção da solução de tratamento do tecido biológico tratado com solução. O tecido do mamífero é selecionado a partir do grupo que consiste em pericárdio, raízes ou válvulas aórticas e pulmonares, tendões, ligamentos, pele, dura- máter e peritônio.

[0007] O documento US 2018/0133365 A1 introduziu um método de preparação de um material de tecido de fibra de colágeno de origem animal seco compreendendo as etapas de enxaguar um material de tecido de fibra de colágeno de origem animal que foi tratado com um agente de reticulação, imergir o material de tecido enxaguado em uma solução alcoólica não aquosa para desidratação, imergir sucessivamente o material de tecido que foi desidratado com a solução alcoólica não aquosa em soluções de sacarídeo de diferentes gradientes de concentrações para desidratação de gradiente, retirar e secar o tecido desidratado de gradiente, embalar hermeticamente o material de tecido seco e esterilizar.

[0008] O documento US 2011/0300625 A1 descreve um método de preparação de um tecido, em particular, um tecido pericárdico, em que o método compreende fornecer uma seção de tecido colhido de um organismo de mamífero, e causar choque osmótico da seção de tecido ao realizar múltiplos enxágues da seção de tecido com água destilada, e enxaguar adicionalmente a seção de tecido com álcool isopropílico e colocar em contato a seção de tecido com uma dentre uma solução de formalina ou uma solução de glutaraldeído.

[0009] O documento US 5 413 798 revela um processo para preparar materiais de pericárdio bovino e o uso dos materiais assim preparados como transplantes ou implantes em medicina humana e medicina veterinária. Em particular, o dito documento descreve o processo para tratar tecido pericárdico bovino compreendendo as etapas de processar quimicamente de modo úmido o tecido pericárdico, secar o tecido pericárdico e esterilizar o tecido pericárdico, em que o processamento químico úmido compreender separar da superfície do dito tecido qualquer gordura aderente e membrana basal, colocar em contato o dito tecido com uma solução alcalina aquosa, colocar em contato o dito tecido com uma solução de um agente de complexação de íon metálico contendo EDTA dissódico e colocar em contato o dito tecido com uma solução tampão aquosa que tem um pH de 4,5 a 6,0 e enxaguar com água.

[0010] Em uma outra abordagem, o documento WO 01/41828 descreve um método para tratar um biomaterial compreendendo colocar em contato o biomaterial com uma solução de tratamento anticalcificação, a dita solução de tratamento anticalcificação sendo selecionada a partir do grupo que consiste em soluções alcoólicas superiores, soluções de poliol e soluções de solvente orgânico aprótico polar.

[0011] Adicionalmente, o documento US 2001/0023372 A1 revela um método de preparação de um componente de tecido para armazenamento a seco compreendendo fornecer um componente de tecido animal, tratar o dito componente de tecido com uma solução de tratamento aquosa que compreende um estabilizador dimensional como glicerol ou um derivado do mesmo, armazenar o dito componente de tecido tratado em um recipiente que é essencialmente livre de líquido.

[0012] Consequentemente, cada um dos pedidos de patente mencionados acima foi elaborado para desenvolver um tecido biológico que possa ser usado como dispositivos bioprotéticos que podem ser armazenados a seco antes de serem usados para aplicações clínicas. Entretanto, há certas desvantagens associadas aos métodos de preparação de tecido mencionados acima. Por exemplo, após a implantação, um tecido biológico, especialmente, tecido fixado com aldeído, é suscetível à formação de depósitos de cálcio degenerativos. A calcificação, em particular, calcificação patológica, de tecidos biológicos moles devido à deposição de sais minerais de fosfato de cálcio em um tecido implantado é indesejável e a deposição dos depósitos de cálcio pode ter consequências graves no desempenho de dispositivo. A calcificação de implantes pode levar ao enrijecimento, instabilidade estrutural e, por fim, falha de dispositivo.

[0013] Portanto, é de suma importância fornecer tecidos biológicos que têm resistência à calcificação, especialmente, devido ao fato de que doenças de válvula cardíaca necessitam de cirurgia de substituição de válvula em mais que várias centenas da população mundial a cada ano.

[0014] A maior parte de válvulas cardíacas bioprotéticas clinicamente disponíveis é composta de tecido pericárdico bovino fixado com glutaraldeído montado em stent. A fixação com glutaraldeído reticula de modo eficaz o colágeno no tecido e elimina em grandes proporções a imunogenicidade e a trombogenicidade da bioprótese. Entretanto, uma grande quantidade de válvulas cardíacas bioprotéticas falha devido à calcificação patológica da válvula que causa enrijecimento e ruptura de tecido.

[0015] Consequentemente, é desejável fornecer uma abordagem anticalcificação inovadora com eficácia aprimorada e facilidade de uso. Assim, há uma necessidade de um método eficaz para conferir propriedades de anticalcificação a tecidos biológicos usados para implantes cirúrgicos que não são acompanhadas por efeito deletério e também fornece características mecânicas aprimoradas de um tecido biológico durante seu armazenamento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] Por esse motivo, um objetivo da presente invenção consiste em fornecer um método inovador para preparar tecido biológico adequado para armazenamento seco estéril, isto é, sem ser imerso em uma solução de conservação líquida. Um objetivo adicional da presente invenção consiste em fornecer um método inovador que torna tecidos biológicos disponíveis para implantes cirúrgicos de uma forma mais próxima possível de prontos para uso. Um objetivo adicional da presente invenção consiste em fornecer um método de tratamento de tecido biológico que reduz calcificação do tecido biológico, risco de aderência de biofilme sobre pericárdio e fornece propriedades mecânicas a uma bioprótese compreendendo o tecido biológico.

[0017] Esse objetivo é satisfeito por um método compreendendo os recursos da reivindicação 1. Modalidades específicas da invenção são descritas nas reivindicações dependentes.

[0018] Nesse contexto, em um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de tecido biológico compreendendo as etapas de: (1) embeber o tecido biológico tratado com um agente de reticulação com uma solução salina; (2) colocar em contato o tecido biológico embebido com uma solução aquosa compreendendo Peróxido de Hidrogênio; (3) colocar em contato o tecido biológico com uma solução aquosa compreendendo PBS e EDTA; (4) colocar em contato o tecido biológico com uma solução compreendendo glicerol, etanol e EDTA; e (5) colocar em contato o tecido biológico com uma solução de glicerol.

[0019] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente as etapas (3a) e/ou (5a) de colocar em contato o tecido biológico com etanol dentro de uma concentração de pelo menos 70 % em volume.

[0020] De preferência, o agente de reticulação usado de acordo com o método reivindicado é glutaraldeído, por exemplo, que tem uma concentração selecionada na faixa de 0,1 % a 5,0 % em volume.

[0021] É preferencial que o tecido biológico de acordo com o método reivindicado seja pericárdio bovino ou suíno ou uma válvula cardíaca.

[0022] Vantajosamente, a solução salina de acordo com o método reivindicado é uma solução aquosa compreendendo 0,9 % de cloreto de sódio em volume.

[0023] É preferencial que a concentração de peróxido de hidrogênio na etapa (2) de acordo com o método reivindicado seja de 0,05 a 5,0 % em volume.

[0024] É preferencial que uma razão de volume de glicerol para etanol na etapa (4) de acordo com o método reivindicado seja de 1:5 a 5:1.

[0025] Vantajosamente, a concentração de EDTA nas etapas (3) e (4) de acordo com o método reivindicado é de 0,01 % a 10,0 % em peso.

[0026] É adicionalmente preferencial que o método compreenda adicionalmente as etapas de (6) secar o tecido biológico, (7) colocar o tecido biológico em uma embalagem, (8) vedar a embalagem e (9) esterilizar a embalagem.

[0027] É adicionalmente preferencial que as etapas (1) a (9) sejam executadas de uma forma contínua, isto é, uma após a outra ou sequencialmente.

[0028] De preferência, a esterilização da embalagem compreendendo o tecido biológico de acordo com o método reivindicado é executada ao expor a embalagem a gás de óxido de etileno.

[0029] É adicionalmente preferencial que as etapas (1) a (7) do método reivindicado sejam executadas a uma temperatura de 10 °C a 25 °C, de preferência, a uma temperatura de 15 °C a 25 °C, com mais preferência, a uma temperatura de 18 °C a 22 °C.

[0030] De preferência, as etapas (4) e (5) do método reivindicado são executadas durante a agitação por pelo menos 60 minutos.

[0031] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a um tecido biológico compreendendo um tecido biológico preparado de acordo com o método reivindicado.

[0032] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um tecido biológico preparado de acordo com o método reivindicado para implante cirúrgico assim como ao uso do tecido biológico como uma bioprótese e em válvulas cardíacas transcateter.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0033] Fig. 1: Calcificação de amostras de pericárdio bovino de teste dos exemplos 1-1 a 1-3.

[0034] Fig. 2: Imagens de Microscópio Eletrônico de Varredura (SEM) do pericárdio bovino: (a) e (c) sem SBF, (b) e (d) imerso em soluções de SBF por 24 horas.

[0035] Fig. 3: Resistência à tração de amostras de pericárdio bovino de teste de diferentes etapas de preparação.

[0036] Fig. 4: Uma imagem de Microscópio Óptico (Eclipse E-200 Nikon com vídeo digital full HD Lite 1080p Tucsen) de avaliação histológica com uso de coloração de uma amostra de pericárdio bovino seco.

[0037] Fig. 5: Uma imagem de Microscópio Óptico (Eclipse E-200 Nikon com vídeo digital full HD Lite 1080p Tucsen) de avaliação histológica com uso de coloração de uma amostra de pericárdio bovino padrão.

[0038] Fig. 6: Uma imagem de Microscópio Eletrônico de Varredura (200x) de uma amostra de pericárdio bovino seco.

[0039] Fig. 7: Uma imagem de Microscópio Eletrônico de Varredura (3000x) de uma amostra de pericárdio bovino seco.

[0040] Fig. 8: Uma imagem de Microscópio Eletrônico de Varredura (50000x) de uma amostra de pericárdio bovino seco.

[0041] Fig. 9: Uma imagem de Microscópio Eletrônico de

Varredura (100000x) de uma amostra de pericárdio bovino seco.

[0042] Fig. 10: Uma imagem de Microscópio Eletrônico de Varredura (200x) de uma amostra de pericárdio bovino padrão.

[0043] Fig. 11: Uma imagem de Microscópio Eletrônico de Varredura (3000x) de uma amostra de pericárdio bovino padrão.

[0044] Fig. 12: Uma imagem de Microscópio Eletrônico de Varredura (50000x) de uma amostra de pericárdio bovino padrão.

[0045] Fig. 13: Uma imagem de Microscópio Eletrônico de Varredura (100000x) de uma amostra de pericárdio bovino padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0046] Em um primeiro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de tratamento de tecido biológico. De preferência, o método fornece tecido biológico contendo tal tecido tratado na forma pronta para uso para implantes cirúrgicos.

[0047] O termo "tecido biológico" é usado no presente documento para se referir, em geral, a materiais animais ou humanos biologicamente derivados contendo colágeno tratados ou não tratados.

[0048] Na presente invenção, é preferencial usar um pericárdio ou uma válvula cardíaca como um material de tecido biológico animal, em particular, obtido a partir de um coração suíno ou bovino, que foi tratado com o agente de reticulação. As válvulas cardíacas humanas naturais são identificadas como válvulas aórticas, mitrais, tricúspides e pulmonares. O tecido pericárdico ou tecidos de válvula cardíaca são usados para substituir válvulas cardíacas danificadas ou com doença e substituir qualquer uma das válvulas que ocorrem naturalmente mencionadas acima.

[0049] Quanto a isso, os tecidos biológicos produzidos de acordo com o método inventivo são usados para construção de um "dispositivo bioprotético" ou uma "bioprótese" que tem uma função muito semelhante a uma válvula cardíaca humana natural, com a bioprótese imitando a ação natural dos folhetos flexíveis de válvula cardíaca. As válvulas cardíacas do tipo tecido também são significativamente difíceis e demoradas para fabricar, devido ao fato de que as mesmas precisam ser fabricadas exatamente como os padrões e tolerâncias a fim de funcionar por anos dentro do ambiente dinâmico de um coração do paciente vivo.

[0050] O componente principal dos tecidos biológicos é colágeno. As moléculas de colágeno consistem em três cadeias de poliaminoácidos dispostos em uma configuração tri-helicoidal que termina em terminais carboxila e amino não helicoidais. Essas moléculas de colágeno se reúnem para formar microfibrilas, que, por sua vez, se reúnem em fibrilas, resultando em fibras de colágeno. Devido ao fato de que os tecidos colagenosos se degradam rapidamente mediante a implantação em um recipiente hospedeiro, é necessário estabilizar o tecido se o mesmo for usado para aplicações clínicas. A estabilização química por reticulação de tecido, também conhecida como fixação de tecido, foi alcançada com o uso de uma variedade de compostos.

[0051] Mais tipicamente, a fixação química empregou moléculas polifuncionais que têm dois ou mais grupos reativos que têm capacidade de formar ligações químicas intramoleculares e intermoleculares irreversíveis e estáveis com os grupos laterais de aminoácido reativos que estão presentes nas moléculas de colágeno.

[0052] A molécula mais amplamente usada dessas moléculas polifuncionais é glutaraldeído, que tem um aldeído em cada extremidade de uma cadeia alifática linear. Os grupos aldeído de glutaraldeído e outras moléculas semelhantes reagem sob condições fisiológicas com os grupos amina primária de moléculas de colágeno para reticular o material. O tecido reticulado de glutaraldeído produzido dessa forma exibe resistência aumentada à degradação enzimática, imunogenicidade reduzida e estabilidade aumentada.

[0053] Apesar de seu uso difundido, há certas desvantagens associadas à reticulação de tecido com glutaraldeído. Por exemplo, mediante o implante, o tecido fixado com aldeído é suscetível à formação de depósitos de cálcio degenerativos, isto é, calcificação. A calcificação é a deposição indesejável de sais minerais de fosfato de cálcio em um tecido implantado e é o fator mais significativo de falha de tecidos biológicos fixados com glutaraldeído usados como dispositivos bioprotéticos.

[0054] Uma modalidade da presente invenção utilizou embeber o tecido biológico tratado com um agente de reticulação com uma solução salina.

[0055] Como usado no presente documento, um agente de reticulação é glutaraldeído que é, de preferência, usado em aplicações bioquímicas e médicas como um reticulante homobifuncional reativo com amina. Como já mencionado acima, o tratamento com glutaraldeído produz reticulações estáveis em proteínas de matriz celular e extracelular, o que reduz substancialmente a imunogenicidade de enxerto. Entretanto, tal tecido tem propriedade mecânica alterada, falha mecânica precoce, citotoxicidade e supressão incompleta de reconhecimento imunológico. Além disso, essa calcificação grave foi observada em pericárdio bovino tratado com glutaraldeído. Uma alternativa decorrente ao tratamento com glutaraldeído é adicionalmente o tratamento de acordo com o método da presente invenção, isto é, um método que permite reduzir a calcificação de tecido biológico.

[0056] Na presente invenção, é preferencial usar o agente de reticulação em uma quantidade de 0,1 % a 5,0 % em volume, com mais preferência, de 0,2 % a 3,0 % em volume, ainda com mais preferência, de 0,3 % a 2,0 % em volume e, especialmente, de preferência, de 0,5 % a 1,0 % em volume.

[0057] Quanto a isso, como uma primeira etapa, é executada uma embebição do tecido biológico com uma solução salina aquosa compreendendo 0,9 % de cloreto de sódio (9,0 g por litro). Tal solução também é denominada comumente como solução salina normal, solução salina fisiológica ou solução salina isotônica.

[0058] Em uma segunda etapa da presente invenção, o tecido biológico embebido é colocado em contato com uma solução aquosa compreendendo Peróxido de Hidrogênio. É preferencial que a concentração de peróxido de hidrogênio seja de 0,05 % em volume a 5,0 % em volume, de preferência, de 0,1 % em volume a 3,0 % em volume, com mais preferência,

de 0,2 % em volume a 2,0 % em volume.

[0059] Em uma terceira etapa da presente invenção, o tecido biológico é colocado em contato com uma solução aquosa compreendendo PBS e EDTA.

[0060] Como usado no presente documento, o termo "colocado em contato" significa tratamento, imersão, exposição a, enxágue do tecido biológico usado no método inventivo.

[0061] Como usado no presente documento, o termo "PBS" é direcionado a uma solução salina tamponada com fosfato que tem um pH de 7,4 e contendo solução salina à base de água de hidrogenofosfato dissódico, cloreto de sódio e, em algumas formulações, cloreto de potássio e di- hidrogenofosfato de potássio. A PBS é usada em aplicações biológicas e médicas como lavagem de células, transporte de tecidos e diluições, devido ao fato de que PBS imita proximamente o pH, a osmolaridade e as concentrações iônicas do corpo humano.

[0062] O termo "solução aquosa" se refere a uma solução compreendendo uma substância ou um composto e água que foi purificada para remover contaminantes que têm capacidade de influenciar o produto final. De preferência, água destilada, água duplamente destilada ou água deionizada é usada em um método da presente invenção.

[0063] O termo "EDTA" é usado no presente documento para se referir a ácido etilenodiaminotetra-acético que é um agente quelante complexante que tem capacidade de sequestrar íons metálicos, especialmente como Fe2+/Fe3+, Al3+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+ e outros e remover os mesmos da solução que forma os assim chamados complexos de EDTA.

[0064] De acordo com a presente invenção, é especialmente importante remover íons de cálcio da solução ao formar quelante de cálcio que demonstrou inibição da mineralização de tecidos biológicos, em particular, tecido pericárdico bovino ou suíno. Sugere-se que o EDTA se liga a íons de cálcio na carcaça externa de cristais de hidroxiapatita que são formados a partir de cristais de fosfato de cálcio, quelando e removendo, desse modo, íons de cálcio dos cristais, fazendo com que o material de tecido se encolha, desmineralizando, assim, o material.

[0065] Por conseguinte, o tratamento de tecidos biológicos com EDTA desacelera a progressão de calcificação por ligação de cálcio antes de os mesmos reagirem para formar hidroxiapatita. Uma vez que a calcificação de tecidos biológicos usados, por exemplo, como válvulas cardíacas bioprotéticas é um problema clinicamente significativo que contribui para a falha de implante, é de importância significativa reduzir o nível de cálcio em tecidos biológicos usados como um implante. Portanto, na presente invenção, o tratamento com EDTA pode reduzir o nível de cálcio em tecidos biológicos, especialmente, em pericárdio bovino ou suíno ou uma válvula cardíaca, de preferência, em 20 %, com mais preferência, em 30 %, ainda com mais preferência, em 40 % e, especialmente, de preferência, em 50 %. Adicionalmente, é preferencial usar EDTA em combinação com PBS a fim de aumentar a desmineralização e a compatibilidade com um corpo humano.

[0066] Adicionalmente, na presente invenção, é preferencial usar EDTA, em particular, nas etapas (3) e (4), com uma concentração de mais que 0,01 % em peso, de preferência, de mais que 0,05 % em peso, com mais preferência, de mais que 0,10 % em peso, ainda com mais preferência, de mais que 0,15 % em peso, e de menos que 10,0 % em peso, de preferência, de menos que 8,0 % em peso, com mais preferência, de menos que 6,0 % em peso, ainda com mais preferência, de menos que 5,0 % em peso, ainda com mais preferência, de menos que 3,0 % em peso. Ainda adicionalmente, na presente invenção, é preferencial usar EDTA dissódico.

[0067] Em uma quarta etapa da presente invenção, o tecido biológico é colocado em contato com uma solução compreendendo glicerol, etanol e EDTA, e, em uma quinta etapa, o tecido biológico é colocado em contato com uma solução de glicerol a fim de reduzir adicionalmente a calcificação de tecido biológico e desidratar o tecido biológico. As etapas a seguir descrevem uma implementação desses processos no método da presente invenção.

[0068] Após os tecidos biológicos terem sido processados através das etapas (1) a (3) do método da presente invenção, os mesmos são submetidos ao tratamento em uma solução compreendendo glicerol, etanol e EDTA.

[0069] Fosfolipídeos nas e ao redor das células de tecido biológico foram considerados os sítios de nucleação de calcificação mais proeminentes. Portanto, a remoção desses componentes de tecido foi proposta para reduzir a mineralização, em particular, a calcificação. Diferentes estudos mostraram que essas podem ser estratégias de prevenção de calcificação eficazes. Os solventes orgânicos como etanol ou glicerol ou uma mistura de etanol e glicerol podem ser usados similarmente para esse propósito. Por exemplo, o tratamento com pelo menos 70 % de etanol, de preferência, com pelo menos 80 % de etanol, com mais preferência, com pelo menos 90 % de etanol, extrai fosfolipídeos do tecido enquanto também causa uma alteração em conformação de colágeno que aumenta a resistência de bioprótese à colagenase. Assim, o tratamento com etanol permite extrair quase todos os fosfolipídeos e colesteróis da bioprótese, eliminando, assim, a calcificação das células de tecido biológico. Adicionalmente, o tratamento com etanol também previne a adsorção de fosfolipídeos e colesteróis da solução. O método pelo qual glicerol fixa o tecido biológico ainda não é entendido completamente, mas uma concentração de 98 %, de preferência, concentração de 99 %, é suficiente para tratar o tecido biológico para tornar o tecido mais biocompatível e resistente à calcificação.

[0070] A esse respeito, na presente invenção, é preferencial tratar tecido biológico em uma solução compreendendo glicerol, etanol e EDTA por pelo menos 60 minutos, de preferência, por pelo menos 75 minutos, com mais preferência, por pelo menos 90 minutos, à temperatura ambiente, em particular, a uma temperatura de 10 °C a 25 °C, de preferência, a uma temperatura de 15 °C a 25 °C, com mais preferência, a uma temperatura de 18 °C a 22 °C, sob agitação de não mais que 500 rpm, de preferência, de não mais que 300 rpm, com mais preferência, de não mais que 50 rpm. Durante esse tempo, a maior parte das moléculas de água apresentadas em tecido biológico, em particular tecido pericárdico, é substituída com glicerol.

[0071] Adicionalmente, na presente invenção, é preferencial usar uma mistura de glicerol e etanol, em que uma razão de volume de glicerol para etanol é, de preferência, de 1:5 a 5:1, com mais preferência, de 1:4 a 4:1, ainda com mais preferência, de 1:3 a 3:1, ainda com mais preferência, de 1:2 a 2:1.

[0072] Os tecidos biológicos são, então, removidos da solução e colocados em glicerol para desidratação adicional por pelo menos 60 minutos, de preferência, por pelo menos 75 minutos, com mais preferência, por pelo menos 90 minutos, à temperatura ambiente, em particular, a uma temperatura de 10 °C a 25 °C, de preferência, a uma temperatura de 15 °C a 25 °C, com mais preferência, a uma temperatura de 18 °C a 22 °C, sob agitação de não mais que 500 rpm, de preferência, de não mais que 300 rpm, com mais preferência, de não mais que 50 rpm.

[0073] Adicionalmente, na presente invenção, é preferencial usar uma etapa adicional de contato ou enxague do tecido biológico com etanol com uma concentração de pelo menos 70 % em volume, de preferência, com pelo menos 80 % em volume, com mais preferência, com pelo menos 90 % em volume. A etapa adicional, em particular, a etapa (3a) é, de preferência, executada do contato do tecido biológico com uma solução compreendendo glicerol, etanol e EDTA. É adicionalmente preferencial executar uma outra etapa adicional (5a) de contato do tecido biológico com etanol após a etapa de contato do tecido biológico com um glicerol e antes da etapa de secagem do tecido biológico. É ainda adicionalmente preferencial executar uma etapa adicional (3a) e/ou (5a) com o uso de uma mistura de etanol e EDTA com uma concentração como na etapa (3) ou (4).

[0074] Os tecidos biológicos são removidos da solução e expostos ao ar ambiente ou a um ambiente inerte, por exemplo, nitrogênio, à temperatura ambiente e à umidade com a finalidade de não afetar adversamente as propriedades de tecido. De preferência, a secagem é realizada em um ambiente limpo em condições ambientes por pelo menos 12 horas, de preferência, por pelo menos 16 horas, ainda com mais preferência, por pelo menos 20 horas. Ainda com mais preferência, a secagem é realizada sob filtro de ar particulado de alta eficiência (HEPA), em particular, sob condições de HEPA em um ambiente limpo. Como usado no presente documento, o termo "condições ambientes" é direcionado à temperatura ambiente de mais que 10 °C, de preferência, de mais que 12 °C, com mais preferência, de mais que 14 °C, especialmente, de preferência, de menos que 18 °C, e, de preferência, de menos que 25 °C, com mais preferência, de menos que 23 °C, ainda com mais preferência, de menos que 22 °C. Adicionalmente, na presente invenção, é preferencial executar cada uma das etapas (1) a (7) nas condições ambientes como descrito acima.

[0075] Os tecidos biológicos tratados e secos são, então, embalados em um recipiente ou embalagem essencialmente livre de líquido para implante cirúrgico subsequente. Como usado no presente documento, o termo "essencialmente livre de líquido" significa um ambiente sem fluido no qual a presença de água ou outras substâncias é limitada a aproximadamente o teor de tais substâncias no ar ambiente.

[0076] Um método preferencial consiste em aplicar um vácuo à embalagem para minimizar o nível de oxigênio, e pode-se utilizar adicionalmente um enchimento de um gás inerte como nitrogênio. Tais métodos de embalagem estéril são conhecidos por aqueles elementos versados na técnica.

[0077] O tecido tratado embalado pode, então, ser esterilizado por um processo de esterilização gasosa ou por uma exposição à radiação de ionização. Para garantir que a câmara permaneça estéril após a esterilização, os membros de embalagem são formados a partir de um material que é impenetrável para microrganismos como bactérias e fungos. Após o tecido ou o dispositivo bioprotético contendo tal tecido ser colocado na câmara e/ou esterilizado, a câmara é vedada.

[0078] A esterilização por exposição à radiação de ionização ou gás de esterilização, particularmente, por exposição a gás de óxido de etileno, se enquadra na habilidade da técnica. Em uma modalidade preferencial, tecidos biológicos são esterilizados ao expor o tecido biológico a gás de esterilização, em particular, a gás de óxido de etileno (ETO). A esterilização com método de ETO é executada usualmente a uma temperatura entre 37 °C e 55 °C, a mistura de gás compreendendo pelo menos 10 % de óxido de etileno e por pelo menos 60 minutos.

[0079] O produto resultante é um tecido implantável substancialmente estéril e vedado presente em uma forma substancialmente seca. O mesmo é especialmente bem adequado para implante cirúrgico em pacientes humanos para o tratamento de inúmeras doenças ou condições. Antes do implante cirúrgico, o tecido biológico é removido da embalagem, e o componente de tecido opcionalmente é reidratado por exposição a uma solução aquosa, de preferência, uma solução aquosa estéril. O tecido pode ser reidratado por múltiplas embebições em uma solução estéril como solução salina fisiológica. O glicerol e o etanol no tecido podem ser facilmente removidos por lavagem por solução salina.

[0080] O método descrito fornece um tecido biológico que tem estabilidade dimensional e que está essencialmente pronto para implante cirúrgico em um paciente, isto é, a assim chamada forma pronta para uso.

[0081] Os tecidos biológicos tratados de acordo com o método da presente invenção retornarão tipicamente para um tamanho que é pelo menos 95 %, com mais preferência, pelo menos 97 %, ainda com mais preferência, pelo menos 99 % de seu tamanho hidratado original. Como um resultado, os tecidos biológicos preparados de acordo com o método inventivo estão prontos para uso para implante cirúrgico como um dispositivo bioprotético implantável, em particular, em válvulas cardíacas transcateter.

[0082] Adicionalmente, na presente invenção, é preferencial usar um pericárdio ou uma válvula cardíaca como um tecido biológico. Consequentemente, o tecido pericárdico ou válvula cardíaca pode ser processado de acordo com o método da presente invenção antes do seu uso para implante cirúrgico. Além disso, na presente invenção, é preferencial usar um pericárdio ou uma válvula cardíaca obtida a partir de um tecido animal, em particular, a partir de um coração suíno ou bovino. De preferência, o pericárdio bovino obtido a partir de um abatedouro certificado é submetido aos procedimentos de limpeza, corte e reticulação com glutaraldeído antes do uso em um método da presente invenção.

[0083] A invenção é direcionada ainda a bioprótese e válvulas cardíacas transcateter contendo o tecido biológico.

[0084] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um tecido biológico compreendendo um tecido biológico preparado de acordo com o método reivindicado.

[0085] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere ao uso de um tecido biológico preparado de acordo com o método reivindicado para implante cirúrgico assim como ao uso do tecido biológico como uma bioprótese e em válvulas cardíacas transcateter.

[0086] Como usado no presente documento, o termo "bioprótese" significa um dispositivo derivado de tecido biológico processado a ser usado para implante em seres humanos. O desenvolvimento de tais dispositivos se originou como uma tentativa de contornar algumas das complicações clínicas associadas ao desenvolvimento precoce da válvula cardíaca mecânica, e, desde então, tem resultado em uma proliferação rápida de dispositivos bioprotéticos para uma variedade de aplicações. Exemplos de algumas das biopróteses atualmente usadas ou em desenvolvimento incluem válvulas cardíacas, enxertos vasculares, enxertos vasculares bio-híbridos, substitutos de ligamento, emplastros pericárdicos e outros.

[0087] Os exemplos a seguir são apenas para propósito de ilustração e não são destinados a limitar o escopo da presente invenção como definido nas reivindicações que são anexas à mesma:

EXEMPLO 1-1

[0088] 40 membranas com 1x1 cm de um tecido biológico selecionado a partir da "amostra 180702-1" de pericárdio bovino (P+F Brasil, certificado EDQM) foram primeiramente removidas de solução de glutaraldeído a 0,625 % (P+ F GmbH/Biocollagen) e após isso embebidas em solução salina a 0,9 % fria (JP Pharma) por 3 minutos. O tecido embebido foi, então, imerso em Peróxido de Hidrogênio 0,5 % por volume (Sigma-Aldrich) a 18 °C por 60 minutos. Como uma próxima etapa, o tecido foi colocado em contato com PBS fria (10 °C) com pH 7,4 e EDTA a 0,5 % em peso por 3 minutos (Sigma-Aldrich). Após isso, o tecido foi imerso em etanol a 99 % por volume (Sigma-Aldrich) à temperatura de 22 °C por 60 segundos com agitação intensa, e, então, imerso em uma mistura de glicerol/etanol (50/50) e EDTA a 0,5 % em peso (Sigma-Aldrich) à temperatura de 22 °C por 60 minutos com agitação lenta. Adicionalmente, o tecido foi imerso em 99 % de glicerol (Sigma-Aldrich) à temperatura de 22 °C por 120 minutos com agitação lenta. A seguir, o tecido foi embebido com etanol absoluto a 99 % por volume (Sigma-Aldrich) e EDTA a 0,5 % em peso à temperatura de 22 °C durante 60 segundo com agitação intensa. Finalmente, o tecido é submetido a um procedimento de evaporação de solvente sob insuflação de ar filtrado de HEPA durante 18 horas à temperatura de 18 °C. Então, o tecido foi embalado em bolsa Tyvek dupla e esterilizado com ETO (55 °C, 4 horas de exposição a ETO) na Sterium Company. EXEMPLO 1-2

[0089] 40 membranas com 1x1 cm de um tecido biológico selecionado a partir de "amostra 180702-2" de pericárdio bovino foram preparadas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1-1. EXEMPLO COMPARATIVO 1-3

[0090] 40 membranas com 1x1 cm de um tecido biológico selecionado a partir de "amostra 180803-1" de pericárdio bovino foram removidas de solução de glutaraldeído a 0,625 % (P+ F GmbH/Biocollagen) e usadas como uma amostra comparativa sem tratamento adicional. EXEMPLO 1-4

[0091] As membranas de pericárdio bovino dos Exemplos 1- 1 a 1-3 (número de amostras: 180702-2 e 180702-1 são de acordo com a presente invenção, e 180803-1 é um exemplo comparativo) foram embebidas em solução salina por 2 minutos e, então, imersas em um Fluido Corporal Simulado (SBF), que é uma solução com concentração iônica similar à concentração de plasma sanguíneo humano como demonstrado na Tabela 3, mantida sob as mesmas condições fisiológicas de pH e temperatura (pH 7,4 e temperatura de 36,5 °C). O tempo de imersão variou entre 1 e 30 dias.

[0092] As amostras foram digeridas em um sistema de aquecimento condutivo de frasco fechado denominado CHDS. A curva de calibração foi preparada a partir da solução padrão Specsol® 1000 mg. L-1 para conter 0,0 - 20 mg. L-1 de Ca.

[0093] A determinação de Ca apresentada na Tabela 1 e na Fig. 1 foi realizada em um Espectrômetro de Absorção Atômica de Alta Resolução ContrAA 300 (HR-CS FAAS) (Analytic Jena, Jena, Alemanha), equipado com uma lâmpada de arco curto de Xe como uma fonte contínua de radiação (na Fig. 1, o sinal "," no eixo geométrico Y deve ser lido como um ponto de acordo com a Tabela 1, isto é, o valor 1000,00 deve ser entendido como 1000 ou 1000.00).

[0094] A microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi realizada nas amostras de pericárdio bovino (180803-1 conservada com glutaraldeído) com o uso de um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo (FESEM) (JEOL, modelo 7500F): (a) e (c) sem SBF, (b) e (d) imersas em soluções de SBF por 24 horas (consulte a Fig. 2). TABELA 1 180803-1 180702-2 180702-1 dias mg/kg de Ca mg/kg de Ca mg/kg de Ca 0 342,44 170,95 114,17 1 951,35 1009,33 1095,72 2 1032,68 871,74 958,13 3 1080,46 719,87 806,27 4 1046,86 879,55 965,94 5 1088,43 974,26 1060,65 10 973,81 846,86 933,25 15 2703,91 2151,70 2165,84 20 5887,85 3607,95 3623,10 25 9100,73 4145,59 4186,11 30 7812,76 4123,35 4193,58 EXEMPLO 2-1

[0095] 75 unidades de um tecido biológico selecionado a partir de pericárdio bovino (P+F Brasil) e fixado na presença de glutaraldeído (Sigma-Aldrich, 0,625 % em volume) foram colocadas em uma solução salina a 0,9 % fria (JP Farma) e, após isso, em uma solução aquosa compreendendo PBS (Sigma-Aldrich) de pH 7,4 e EDTA (Sigma- Aldrich, 0,2 % em peso) por 3 minutos com enxágue posterior com etanol (Sigma-Aldrich, 70 % em volume). O tecido embebido foi imerso, então, em etanol a uma temperatura ambiente por cerca de 1 minuto. Como uma próxima etapa, o tecido foi colocado em contato com uma mistura de glicerol (Sigma-Aldrich, 99 %), solução de EDTA e etanol (70 % de Glicerol, 29,8 % de Etanol e 0,2 % de solução de EDTA) a uma temperatura ambiente por pelo menos 90 minutos. Após isso, o tecido foi imerso em glicerol por pelo menos 90 minutos durante a agitação e com enxágue seguinte com etanol. Então, o tecido foi removido cuidadosamente da solução e seco pelo ar. Após 16 horas de secagem, o tecido foi examinado em relação à reidratação e à estabilidade mecânica.

[0096] As propriedades mecânicas de um material, em particular, resistência à tração, foram testadas sob avaliação de esforço-estresse com o uso de Máquina de Teste Universal (Oswaldo Filizzola, modelo AME-2kN). A resistência à tração das amostras de pericárdio bovino de teste de diferentes etapas de preparação é mostrada na Fig. 3, em que o grupo 1 corresponde ao pericárdio padrão, o grupo 2 corresponde ao pericárdio seco e o grupo 3 corresponde ao pericárdio seco e reidratado. EXEMPLO 2-2

[0097] 04 (4 emplastros circulares com diâmetro de 130 mm) unidades de um tecido biológico selecionado a partir de pericárdio bovino (P+F Brasil) e fixado na presença de glutaraldeído (Sigma-Aldrich, 0,625 % em volume) foram colocadas em uma solução salina a 0,9 % fria (JP Farma) e, após isso, em uma solução aquosa compreendendo PBS (Sigma- Aldrich) de pH 7,4 e EDTA (Sigma-Aldrich, 0,2 % em peso) por 3 minutos com enxágue seguinte com etanol (Sigma- Aldrich, 70 % em volume). O tecido embebido foi, então, imerso em etanol a uma temperatura ambiente por cerca de 1 minuto. Como uma próxima etapa, o tecido foi colocado em contato com uma mistura de glicerol (Sigma-Aldrich, 99 %), solução de EDTA e etanol (70 % de Glicerol, 29,8 % de Etanol e 0,2 % de solução de EDTA) a uma temperatura ambiente por pelo menos 90 minutos. Após isso, o tecido foi imerso em glicerol por pelo menos 90 minutos durante a agitação e com enxágue seguinte com etanol. Essas amostras foram submetidas à Espectrometria de Absorbância Atômica ContrAA 300 (Analytik Jena, Jena, Alemanha). A Tabela 2 demonstra o teor de cálcio dessas amostras para pericárdio bovino conservado com glutaraldeído padrão. TABELA 2 Amostra Conc. Ca (g/Kg) Conc. Ca (ppm) Seca 0,0652 65,2 Glutaraldeído 0,1452 145,2

[0098] Para comparar a absorção de cálcio de amostras de pericárdio, as amostras de pericárdio secas e padrão foram incubadas em uma Solução Sanguínea Simulada (SBF) de uma concentração iônica de acordo com a Tabela 3, que é similar ao plasma sanguíneo humano.

TABELA 3 Na+ K+ Ca2+ Mg2+ HCO32- Cl- HPO42- SO42- SBF (mg/l) 213,0 7,5 3,8 2,3 6,3 223,0 1,5 0,75

[0099] As amostras foram incubadas em SBF durante 24 horas e, após isso, submetidas à análise de Espectrometria de Absorbância Atômica. Os resultados são demonstrados na Tabela 4. TABELA 4 Amostra Conc. Ca (g/Kg) Conc. Ca (ppm) Seco/SBF 0,5446 544,6 Glutaraldeído/SBF 0,8251 825,1 EXEMPLO 2-3

[0100] A integridade de fibra de colágeno foi estudada por avaliação histológica com o uso de coloração para examinar a conservação de fibra de colágeno após o processo de secagem em uma amostra de pericárdio bovino. As imagens foram obtidas com o uso de Eclipse E-200 (Nikon) juntamente com vídeo digital full HD Lite 1080p (Tucsen). Os resultados foram comparados com uma amostra de material conservada com glutaraldeído padrão. O exame foi feito com o uso de diferentes colorações como demonstrado na Fig. 4 (pericárdio bovino seco) e na Fig. 5 (pericárdio bovino padrão), em que HE significa Hematoxilina, RE significa Resorcina-Orceína, TM significa tricromo de Masson e TG significa tricromo de Gomory (todos as colorações foram fornecidas pela Merck).

[0101] A Fig. 4 demonstra uma imagem microscópica (sem microscopia de campo de luz) de seções histológicas transversais da membrana PF180611 -Std 05 colorida pela hematoxilina e eosina (HE, A-A"), resorcinina-orceína (RE, B-B"), tricromo de Mallory (TM, C-C") e tricromo de Gomori (TG, D-D"). As partes a seguir da amostra de pericárdio bovino seco podem ser observadas: as fibras de colágeno espessas (setas pretas menores), fibras elásticas em seções transversais ou longitudinais (setas pretas maiores), remanescentes de núcleos celulares (pontas de seta). Não há remanescentes de elementos vasculares apresentados nessa imagem. A escala mostra a ampliação real das fotomicrografias.

[0102] A Fig. 5 demonstra uma imagem microscópica (sem microscopia de campo de luz) de seções histológicas transversais da membrana PF180801-3-DRY05 colorida pela hematoxilina e eosina (HE, A-A"), resorcina-orceína (RE, B- B"), tricromo de Mallory (TM, C-C") e tricromo de Gomori (TG, D-D"). As partes a seguir da amostra de pericárdio bovino padrão podem ser observadas: as fibras de colágeno espessas (setas pretas menores), fibras elásticas em seções transversais ou longitudinais (setas pretas maiores), remanescentes de núcleos celulares (pontas de seta) e remanescentes de elementos vasculares (pontas de seta grandes e setas pontiagudas). A escala mostra a ampliação real das fotomicrografias. EXEMPLO 2-4

[0103] A estrutura de colágeno e os efeitos anticalcificação de processo de secagem de pericárdio bovino padrão e seco (ambos) foram avaliados por Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM, FESEM, JEOL, modelo 7500F) com o uso de diferentes resoluções:

(a) pericárdio bovino seco: Fig. 6: ampliação de 200x; Fig. 7: ampliação de 3000x; Fig. 8: ampliação de 50000x; Fig. 9: ampliação de 100000x; (b) pericárdio bovino padrão: Fig. 10: ampliação de 200x; Fig. 11: ampliação de 3000x; Fig. 12: ampliação de 50000x; Fig. 13: ampliação de 100000x.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento de tecido biológico caracterizado por compreender as etapas de: (1) embeber o tecido biológico tratado com um agente de reticulação com uma solução salina; (2) colocar em contato o tecido biológico embebido com uma solução aquosa compreendendo Peróxido de Hidrogênio; (3) colocar em contato o tecido biológico com uma solução aquosa compreendendo PBS e EDTA; (4) colocar em contato o tecido biológico com uma solução compreendendo glicerol, etanol e EDTA; e (5) colocar em contato o tecido biológico com uma solução de glicerol.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo o método caracterizado por compreender adicionalmente as etapas (3a) e/ou (5a) de colocar em contato o tecido biológico com etanol em uma concentração de pelo menos 70 % em volume.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de reticulação é glutaraldeído.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o tecido biológico é um pericárdio bovino ou suíno ou uma válvula cardíaca.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a solução salina é uma solução aquosa compreendendo 0,9 % de cloreto de sódio.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que uma razão de volume de glicerol:etanol na etapa (4) é de 1:5 a 5:1.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o EDTA nas etapas (3) e (4) tem uma concentração de 0,01 % a 10,0 % em peso ou em que o peróxido de hidrogênio na etapa (2) tem uma concentração de 0,05 % a 5,0 % em volume.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo o método caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de (6) secar o tecido biológico, (7) colocar o tecido biológico em uma embalagem, (8) vedar a embalagem e (9) esterilizar a embalagem.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a esterilização da embalagem compreendendo o tecido biológico é executada ao expor a embalagem a gás de óxido de etileno.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, especialmente, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as etapas (1) a (5) são executadas a uma temperatura de 10 °C a 25 °C, especialmente, em que as etapas (6) e (7) são executadas a uma temperatura de 10 °C a 25 °C.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as etapas (4) e (5) são executadas durante a agitação por pelo menos 60 minutos.

12. Tecido biológico caracterizado por compreender um tecido biológico preparado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. Uso de um tecido biológico conforme definido na reivindicação 12 caracterizado por ser para implante cirúrgico.

14. Uso de um tecido biológico conforme definido na reivindicação 12 caracterizado por ser como uma bioprótese.

15. Uso de um tecido biológico conforme definido na reivindicação 12 caracterizado por ser em válvulas cardíacas transcateter.