CN112236175A - 制备用于外科手术植入的生物组织的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种处理生物组织的方法和通过该处理方法获得的生物组织，具体涉及一种处理生物组织的方法，以通过处理抑制该组织的钙化、降低心包上附着生物膜的风险和减少强度下降。本发明还涉及含有该生物组织的生物假体和经导管心脏瓣膜。
Description
技术领域
本发明涉及一种处理生物组织的方法和通过该处理方法获得的生物组织，具体涉及一种处理生物组织的方法，以通过处理抑制该组织的钙化、降低心包上附着生物膜的风险和减少强度下降。本发明还涉及含有该生物组织的生物假体和经导管心脏瓣膜。
背景技术
生物组织被广泛用于制造心脏瓣膜和血管的置换假体以及经导管心脏瓣膜的置换假体。它们是包含胶原作为主要成分的结缔组织。在这些组织当中，牛心包是最广泛使用的组织之一。心包组织是包围心脏的囊，它为心脏提供防止感染的天然屏障，并防止粘附到周围组织。心包还例如通过防止心脏过度扩张、维持心脏的正确解剖学位置以及在舒张期期间调节左心室的压力体积比，而起到机械作用。该组织的结构决定了其在心包生理的条件下和作为假体装置的条件下在负荷下行为。
然而，从屠宰场获得的生物组织，特别是猪和牛尸体，一开始就立即降解。因此，为了能够利用生物组织作为临床材料，必须停止这种变质，目的是延长材料的原始结构和机械完整性，并消除或至少中和归因于这些材料的抗原特性。采用的方法通常聚焦于在胶原分子之间产生新的额外的化学键。这些辅助连接可增强该组织，得到可维持该组织原始形状的坚韧但失活的材料。为了这个目的，将生物组织例如牛或猪的心包或者心脏瓣膜进行化学处理，以改善其机械性能和免疫原性，减少血栓形成和降解，保持无菌状态并延长允许的保存期限。
因此，非常重要的是选择这样一种处理用于植入的生物组织的方法，该方法能使该组织在进行外科手术前作极少的准备就可供医务人员使用。这可减少出错几率及植入时间。
关于这一点，已知现有技术存在各种研究，通过不同的方法来处理生物组织，例如以下参考文献：
US2008/0102439A1涉及用于外科手术植入的生物组织特别是哺乳动物组织的制备或保藏，其中所述制备方法包括使生物组织与包含多元醇（如甘油）和C1-C3醇的非水处理溶液接触，然后从该处理溶液处理过的生物组织中除去该处理溶液的一部分。哺乳动物的组织选自心包、主动脉根和瓣及肺动脉根和瓣、肌腱、韧带、皮肤、硬脑膜和腹膜。
US2018/0133365A1介绍了一种制备干燥的动物来源的胶原纤维组织材料的方法，该方法包括以下步骤：漂洗已经用交联剂处理过的动物来源的胶原纤维组织材料，将漂洗后的组织材料浸入在非水醇溶液中进行脱水，接着将已用非水醇溶液脱水的组织材料浸入在具有不同浓度梯度的糖溶液中进行梯度脱水，取出并干燥经梯度脱水的组织材料，密封包装经干燥的组织材料并灭菌。
US2011/0300625A1描述了一种制备组织特别是心包组织的方法，其中该方法包括提供从哺乳动物生物体获取的组织切片，通过用蒸馏水对该组织切片进行多次漂洗来引起该组织切片的渗透性休克，再用异丙醇漂洗该组织切片，并使该组织切片与福尔马林溶液或戊二醛溶液之一接触。
US5413798公开了一种制备牛心包材料的方法，以及由此制备的材料在人类医学和兽医学中作为移植物或植入物的用途。具体地，所述文件描述了处理牛心包组织的方法，该方法包括以下步骤：对该心包组织进行湿化学处理，干燥该心包组织并对该心包组织进行灭菌，其中湿化学处理包括从所述组织的表面分离任何粘附脂肪和基底膜，使所述组织与碱性水溶液接触，使所述组织与含有EDTA二钠的金属离子络合剂的溶液接触，使所述组织与pH为4.5至6.0的缓冲水溶液接触，并用水漂洗。
在另一种方法中，WO01/41828描述了一种处理生物材料的方法，该方法包括使该生物材料与抗钙化处理溶液接触，所述抗钙化处理溶液选自高级醇溶液、多元醇溶液和极性非质子有机溶剂溶液。
此外，US2001/0023372A1公开了一种制备用于干藏的组织成分的方法，该方法包括提供动物组织成分，用包含尺寸稳定剂例如甘油或其衍生物的水性处理溶液处理所述组织成分，将所述处理过的组织成分保藏在基本上没有液体的容器中。
因此，已经做出了上述每个专利申请以开发可用作生物假体装置的生物组织，该生物假体装置在用于临床应用之前可以干藏。但是，上述组织制备方法存在某些缺点。例如，在植入时，生物组织特别是醛固定的组织易于形成变性钙化沉积物。磷酸钙无机盐在植入的组织中的沉积所导致的软生物组织钙化（特别是病理性钙化）是人们不希望的，钙化沉积物的沉积会对装置性能造成严重后果。植入物的钙化会导致僵硬、结构不稳，并最终导致装置故障。
因此，特别重要的是提供能抵抗钙化的生物组织，特别是因为心脏瓣膜疾病造成全世界每年有数十万人需要进行瓣膜置换手术。
大多数临床上可用的生物假体心脏瓣膜由支架安装的戊二醛固定的牛心包组织组成。戊二醛固定可有效地交联该组织中的胶原，并大大消除生物假体的免疫原性和血栓形成性。然而，由于瓣膜的病理性钙化导致组织僵硬和撕裂，大量的生物假体心脏瓣膜发生故障。
因此，期望提供具有改善的功效且易于使用的新的抗钙化方法。因此，需要一种有效的方法来赋予用于外科手术植入的生物组织以抗钙化特性，该方法不伴有有害作用，并且能改善生物组织在其保藏过程中的机械特性。
发明内容
为此，本发明的一个目的是提供一种用于制备适合无菌干藏（即不浸入液体保藏液中）的生物组织的新方法。本发明的另一个目的是提供一种以尽可能接近即用型的形式制备可供外科手术植入的生物组织的新方法。本发明的又一个目的是提供一种处理生物组织的方法，该方法可以减少生物组织的钙化，降低心包上附着生物膜的风险，并且为包含该生物组织的生物假体提供改进的机械性能。
通过包括权利要求1的特征的方法实现了该目的。本发明的具体实施方案在独立权利要求中描述。
就此而言，在本发明的第一方面，提供一种处理生物组织的方法，该方法包括以下步骤：
（1）用盐水溶液浸泡经交联剂处理的生物组织；
（2）使该经浸泡的生物组织与包含过氧化氢的水溶液接触；
（3）使该生物组织与包含PBS和EDTA的水溶液接触；
（4）使该生物组织与包含甘油、乙醇和EDTA的溶液接触；
（5）使该生物组织与甘油溶液接触。
在一个实施方案中，该方法还包括步骤(3a)和/或(5a)：使该生物组织与体积百分比浓度（体积%）在至少70%内的乙醇接触。
优选地，根据该所请求保护的方法使用的交联剂为戊二醛，其浓度例如在0.1体积%至5.0体积%的范围内选择。
优选的是，根据该所请求保护的方法的生物组织是牛或猪心包或者心脏瓣膜。
有利地，根据该所请求保护的方法的盐水溶液为包含0.9体积%的氯化钠的水溶液。
优选的是，根据该所请求保护的方法的步骤（2）中的过氧化氢的浓度为0.05体积%至5.0体积%。
优选地是，根据该所请求保护的方法的步骤（4）中甘油与乙醇的体积比为1:5至5:1。
有利地，根据该所请求保护的方法的步骤（3）和（4）中的EDTA的浓度为0.01重量%至10.0重量%。
进一步优选的是，该方法还包括步骤（6）干燥该生物组织、步骤（7）将该生物组织装进包装中、步骤（8）将该包装密封和步骤（9）将该包装灭菌。
进一步优选地，步骤（1）至（9）以连续的方式进行，即一个步骤接一个步骤进行或者依序进行。
优选地，将包含根据该所请求保护的方法的该生物组织的包装进行灭菌，是通过将该包装暴露于环氧乙烷气体来进行。
进一步优选的是，根据该所请求保护的方法的步骤（1）至（7）在10°C至25°C的温度下、优选地在15°C至25°C的温度下、更优选地在18°C至22°C的温度下进行。
优选地，根据该所请求保护的方法的步骤（4）和（5）在搅拌下进行至少60分钟。
在第二方面，本发明涉及一种包含根据该所请求保护的方法制备的生物组织的生物组织。
在第三方面，本发明涉及根据该所请求保护的方法制备的生物组织用于外科手术植入的用途，以及该生物组织用作生物假体的用途和在经导管心脏瓣膜中的用途。
附图说明
图1：实施例1-1至1-3的牛心包测试样品的钙化。
图2：牛心包的扫描电子显微镜(SEM)图像：(a)和(c)：无SBF，(b)和(d)：浸入SBF溶液中24小时。
图3：不同制备步骤的牛心包测试样品的抗拉强度。
图4：使用染色剂对干燥的牛心包样品进行组织学评估的光学显微镜（Eclipse E-200 Nikon，带有video digital full HD Lite 1080p Tucsen）图像。
图5：使用染色剂对标准的牛心包样品进行组织学评估的光学显微镜（Eclipse E-200 Nikon，带有video digital full HD Lite 1080p Tucsen）图像。
图6：干燥的牛心包样品的扫描电子显微镜图像(200x)。
图7：干燥的牛心包样品的扫描电子显微镜图像(3000x)。
图8：干燥的牛心包样品的扫描电子显微镜图像(50000x)。
图9：干燥的牛心包样品的扫描电子显微镜图像(100000x)。
图10：标准的牛心包样品的扫描电子显微镜图像(200x)。
图11：标准的牛心包样品的扫描电子显微镜图像(3000x)。
图12：标准的牛心包样品的扫描电子显微镜图像(50000x)。
图13：标准的牛心包样品的扫描电子显微镜图像(100000x)。
具体实施方式
在第一方面，本发明涉及一种处理生物组织的方法。优选地，该方法以即用型的形式提供含有这种经处理的组织的生物组织，以供用于外科手术植入。
本文所用的术语“生物组织”通常指经处理的或未经处理的、含有胶原的、生物来源的人或动物材料。
在本发明中，优选使用心包或者心脏瓣膜作为动物生物组织材料，该心包或者心脏瓣膜尤其获自猪或牛心脏，已用交联剂处理过。天然的人心脏瓣膜分为主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣和肺动脉瓣。心包组织或心脏瓣膜组织用于置换受损的或者患病的心脏瓣膜，并用于置换任何上述天然瓣膜。
就此而言，根据本发明的方法生产的生物组织被用于构建具有与天然人心脏瓣膜非常相近的功能的“生物假体装置”或“生物假体”，该生物假体能模拟柔性心脏瓣叶的天然动作。组织型心脏瓣膜的制造也是十分困难和费时的，因为它们必须按精确的标准和公差制造，以在有生命的患者的心脏的动态环境中工作多年。
这类生物组织的主要成分是胶原。胶原分子由三条聚氨基酸链组成，这三条聚氨基酸链按三螺旋构型排列，以非螺旋的羧基末端和氨基末端结尾。这些胶原分子组装形成微原纤维，微原纤维进而组装成原纤维，得到胶原纤维。由于含胶原的组织在植入到宿主受体体内时快速降解，如果要将该组织用于临床应用的话，有必要使该组织稳定化。已使用多种化合物来实现通过组织交联（也称为组织固定）进行的化学稳定化。
最通常的是，化学固定采用了具有两个或更多个反应性基团的多官能分子，这些反应性基团能够与胶原分子上存在的反应性氨基酸侧基形成不可逆且稳定的分子内和分子间化学键。
这些多官能分子中最常用的是戊二醛，其在脂族直链的两侧具有醛基。戊二醛和其他类似的分子的醛基在生理条件下与胶原分子的伯胺基团反应以使材料发生交联。按此方式生产的戊二醛交联组织表现出对酶促降解的抗性提高，免疫原性降低，稳定性提高。
用戊二醛交联的组织尽管被广泛使用，但也具有一些缺点。例如，在植入时，醛固定的组织易于形成变性钙沉积物，即发生钙化。钙化是磷酸钙无机盐不期望地沉积在植入的组织中，是用作生物假体装置的戊二醛固定生物组织发生失效的最主要因素。
本发明的一个实施方案涉及用盐水溶液浸泡经交联剂处理的生物组织。
本文所用的交联剂是戊二醛，其优选地在生化应用和医学应用中用作胺反应性同双官能团交联剂(amine-reactive homobifunctional crosslinker)。如上已述，戊二醛处理在细胞基质蛋白和胞外基质蛋白中产生稳定的交联，这可极大地降低移植物免疫原性。但是，这种组织发生机械性能改变，机械失效过早，具有细胞毒性，并且免疫识别抑制不完全。除此之外，在戊二醛处理的牛心包中也观察到严重的钙化。新出现的替代戊二醛处理的处理法是根据本发明的方法进行进一步处理，本发明的方法是一种能降低生物组织的钙化的方法。
在本发明中，优选的是按0.1体积%至5.0体积%、更优选0.2体积%至3.0体积%、还更优选0.3体积%至2.0体积%、特别优选0.5体积%至1.0体积%的量来使用交联剂。
就此而言，作为第一个步骤，用包含0.9%氯化钠（9.0g/L）的盐水溶液对生物组织进行浸泡。这种溶液也常称为生理盐水或等渗盐溶液。
在本发明的第二个步骤中，使经浸泡的生物组织与包含过氧化氢的水溶液接触。优选的是，过氧化氢的浓度为0.05体积%至5.0体积%，优选0.1体积%至3.0体积%，更优选0.2体积%至2.0体积%。
在本发明的第三个步骤中，使生物组织与包含PBS和EDTA的水溶液接触。
本文所用的术语“接触”意指处理、浸渍、暴露于、漂洗本发明方法中所使用的生物组织。
本文所用的术语“PBS”是指pH7.4并且含有磷酸氢二钠、氯化钠（在某些配方中含有氯化钾和磷酸二氢钾）的水基盐溶液的磷酸盐缓冲盐水。PBS因为与人体的pH、摩尔渗透压浓度和离子浓度非常相近，被用于生物学应用和医学应用中，如细胞洗涤、组织和稀释液的运输。
术语“水溶液”是指包含某种物质或某种化合物和经过纯化的水的溶液，水纯化是为了去除能够对最终产物造成影响的污染物。优选地，在本发明的方法中使用蒸馏水、双蒸水或去离子水。
本文所用的术语“EDTA”是指乙二胺四乙酸，其是一种络合螯合剂，能够结合金属离子，特别是Fe2+/Fe3+、Al3+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+及其他金属离子，并形成所谓的EDTA复合物而将这些金属离子从溶液中去除。
根据本发明，尤其重要的是通过形成钙螯合剂而从溶液中去除钙离子，已证实钙螯合剂可抑制生物组织特别是牛或猪心包组织的矿化。据认为，EDTA结合由磷酸钙晶体形成的羟基磷灰石晶体的外壳上的钙离子，从而螯合钙离子并将其从晶体上去除，导致组织材料收缩，从而使组织材料去矿化。
因此，用EDTA处理生物组织，EDTA将钙结合使其不能反应形成羟基磷灰石，从而减缓钙化的进展。由于例如用作生物假体心脏瓣膜的生物组织的钙化是造成植入物失效的临床上重大的问题，因此非常重要的是降低用作植入物的生物组织中的钙水平。因此在本发明中，EDTA处理可降低生物组织中特别是牛或猪心包或者心脏瓣膜中的钙水平达20%，更优选达30%，还更优选达40%，特别优选达50%。此外，优选的是将EDTA与PBS组合使用以提高去矿化作用和与人体的相容性。
进一步地在本发明中，优选的是使用具有如下浓度的EDTA，特别是在步骤（3）和步骤（4）中：超过0.01重量%，优选超过0.05重量%，更优选超过0.10重量%，还更优选超过0.15重量%，并且小于10.0重量%，优选小于8.0重量%，更优选小于6.0重量%，还更优选小于5.0重量%，进一步优选小于3.0重量%。还进一步地在本发明中，优选的是使用EDTA二钠。
在本发明的第四个步骤中，使生物组织与包含甘油、乙醇和EDTA的溶液接触，并且在第五个步骤中，使生物组织与甘油溶液接触以进一步降低生物组织的钙化并使生物组织脱水。后续步骤描述本发明的方法中的这些过程的执行。
生物组织经过本发明方法的步骤（1）至（3）处理后，在包含甘油、乙醇和EDTA的溶液中进行处理。
已发现生物组织中及生物组织周围的磷脂是最明显的钙化成核位点。因此，已提出去除这些组织成分以降低矿化特别是钙化。不同的研究已证实这些是有效的防钙化策略。有机溶剂如乙醇或甘油或乙醇和甘油的混合物可以类似地用于这个目的。例如，用至少70%乙醇处理、优选用至少80%乙醇处理、更优选用至少90%乙醇处理可从组织萃取磷脂，同时还造成胶原构象发生变化，从而提高生物假体对胶原酶的抗性。因此，乙醇处理可以从生物假体中萃取几乎全部磷脂和胆固醇，从而消除生物组织细胞的钙化。另外，乙醇处理还可防止从溶液中吸附磷脂和胆固醇。人们尚未完全认识甘油固定生物组织的方法，但是98%浓度、优选99%浓度足以处理生物组织以使生物组织更具有生物相容性并更加抵抗钙化。
就此而言，在本发明中，优选的是使生物组织在包含甘油、乙醇和EDTA的溶液中，在室温下，特别是在10°C至25°C的温度下、优选15°C至25°C的温度下，更优选18°C至22°C的温度下，在不超过500rpm、优选不超过300rpm、更优选不超过50rpm的搅拌下，处理至少60分钟，优选至少75分钟，更优选至少90分钟。在此时间内，生物组织中特别是心包组织中存在的水分子大部分被甘油置换。
进一步地在本发明中，优选的是使用甘油和乙醇的混合物，其中甘油与乙醇的体积比优选为1:5至5:1，更优选为1:4至4:1，还更优选为1:3至3:1，进一步优选为1:2至2:1。
然后，将生物组织从该溶液中取出，并将其放入甘油中，以在室温下，特别是在10°C至25°C的温度下、优选15°C至25°C的温度下，更优选18°C至22°C的温度下，在不超过500rpm、优选不超过300rpm、更优选不超过50rpm的搅拌下，进一步脱水至少60分钟，优选至少75分钟，更优选至少90分钟。
进一步地在本发明中，优选的是采用这样的额外步骤：用浓度至少70体积%、优选至少80体积%、更优选至少90体积%的乙醇接触或漂洗生物组织。该额外步骤，特别是步骤(3a)，优选地在使生物组织接触包含甘油、乙醇和EDTA的溶液之前进行。进一步优选的是，在使生物组织与甘油接触的步骤之后且在将生物组织干燥的步骤之前，进行另一额外步骤(5a)：使生物组织与乙醇接触。还进一步优选的是使用浓度如步骤（3）或（4）中一样的乙醇和EDTA混合物来进行额外步骤(3a)和/或(5a)。
将生物组织从溶液中取出，并将生物组织暴露于其温度和湿度不会对组织性质造成不利影响的环境空气或惰性环境，例如氮气。优选地，在清洁室中在环境条件下进行干燥至少12小时，优选至少16小时，还优选至少20小时。进一步优选地，在清洁室中，在高效率颗粒空气(HEPA)过滤器下特别是在HEPA条件下进行干燥。本文所用的术语“环境条件”是指超过10°C、优选超过12°C、更优选超过14°C、尤其优选超过18°C，并且低于25°C、更优选低于23°C、进一步优选低于22°C的环境温度。进一步地在本发明中，优选的是在上述的环境条件下进行步骤（1）至步骤（7）中的每一步。
然后将经处理并干燥的生物组织装入基本上无液体的容器或包装中，以供后续进行外科手术植入。本文所用的术语“基本上无液体”是指一种非流体的环境，其中水或其他物质的存在被限制至大约等于此类物质在环境空气中的含量。
一个优选的方法是向包装中施加真空以使氧含量最小化，并且另外可以回充惰性气体如氮气。这类无菌包装方法是本领域技术人员公知的。
然后可通过气体灭菌方法或者通过暴露于电离辐射将包装的经处理的组织进行灭菌。为确保在灭菌后包装腔(chamber)保持无菌，包装物件(package member)由微生物（如细菌和真菌）不能穿越的材料形成。在将该组织或者含有这种组织的生物假体装置放在该包装腔中和/或进行灭菌之后，密封该包装腔。
通过暴露于电离辐射或灭菌气体进行灭菌，特别是通过暴露于环氧乙烷气体进行灭菌，在本领域技术人员的技能范围内。在一个优选的实施方案中，通过将生物组织暴露于灭菌气体，特别是暴露于环氧乙烷气体，来对生物组织进行灭菌。用环氧乙烷气体方法灭菌通常在37°C至55°C的温度下进行，混合气体至少包含10％的环氧乙烷，并持续至少60分钟。
所得产品是以基本上干燥的形式存在的、基本上无菌和密封的可植入组织。它特别适合于通过外科手术植入人类患者体内，以治疗多种疾病或病症。在外科手术植入之前，将生物组织从包装中取出，并且任选地通过暴露于水溶液，优选无菌水溶液，来使组织成分再水化。可以通过在无菌溶液（如生理盐水）中多次浸泡来使组织再水化。组织中的甘油和乙醇很容易被盐水漂洗掉。
所描述的方法提供了一种具有尺寸稳定性的生物组织，并且其基本上准备好用于外科植入到患者体内，即所谓的即用型。
根据本发明的方法处理的生物组织通常将恢复其原始水化尺寸的至少95％，更优选至少97％，进一步优选至少99％。因此，根据本发明的方法制备的生物组织可立即用于外科手术植入，用作可植入的生物假体装置，特别是在经导管心脏瓣膜中使用。
此外，在本发明中，优选使用心包或者心脏瓣膜作为生物组织。因此，心包或者心脏瓣膜组织可以在用于外科手术植入之前根据本发明的方法进行处理。在本发明中，还优选使用获自动物组织，特别是获自猪或牛心脏的心包或者心脏瓣膜。优选地，从经认证的屠宰场获得的牛心包在用于本发明的方法之前经历清洁、整理和用戊二醛交联的程序。
本发明进一步涉及包含该生物组织的生物假体和经导管心脏瓣膜。
在一个实施方案中，本发明涉及一种生物组织，其包含根据所请求保护的方法制备的生物组织。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据所请求保护的方法制备的生物组织用于外科手术植入的用途，以及该生物组织作为生物假体的用途和在经导管心脏瓣膜中的用途。
本文所用的术语“生物假体”是指衍自经加工的生物组织以供用于植入人体中的装置。此类装置的开发起源于为了避开机械心脏瓣膜的早期开发所遇到的一些临床并发症所作出的尝试，并且此后导致了生物假体装置在各种应用中的快速扩散。当前使用或正在开发中的一些生物假体的例子包括心脏瓣膜、血管移植物、生物杂交血管移植物、韧带替代物、心包膜片等。
以下实施例仅用于说明目的，无意限制如所附权利要求书所限定的本发明的范围：
实施例1-1
首先从0.625％戊二醛溶液（P + F GmbH / Biocollagen）中取出40张膜，这些膜具有1x1cm的选自牛心包“样品180702-1”（P + F Brasil，EDQM认证）的生物组织。将这些膜浸入冷的0.9％盐水溶液（JP Pharma）中3分钟。然后将经浸泡的组织在18°C下浸入0.5体积％过氧化氢（Sigma-Aldrich）中60分钟。下一步，将组织与冷（10°C）PBS pH7.4和0.5重量％EDTA（Sigma-Aldrich）接触3分钟。之后，将组织在22°C温度下浸入99体积％乙醇（Sigma-Aldrich）中60秒，剧烈搅拌。然后在22℃温度下浸入甘油/乙醇（50/50）和0.5重量％EDTA（Sigma-Aldrich）的混合物中60分钟，缓慢搅拌。进一步地，将组织在22℃温度下浸入99％甘油（Sigma-Aldrich）中120分钟，缓慢搅拌。接下来，将组织在22°C温度下用99体积％无水乙醇（Sigma-Aldrich）和0.5重量％EDTA浸泡60秒，剧烈搅拌。最后，将组织在18°C温度下并在经HEPA过滤的空气吹入下进行溶剂蒸发程序18小时。然后，将组织包装在double Tyvekpouch中，并在Sterium Company进行环氧乙烷灭菌（55°C，暴露于环氧乙烷4小时）。
实施例1-2
根据实施例1-1中描述的程序制备了40张膜，这些膜具有1x1cm的选自牛心包“样品180702-2”的生物组织。
比较例1-3
从0.625％戊二醛溶液（P + F GmbH / Biocollagen）中取出40张膜，这些膜具有1x1cm的选自牛心包“样品180803-1”的生物组织，这些膜不经进一步处理就用作比较样品。
实施例1-4
将实施例1-1至1-3的牛心包膜（样品编号180702-2和180702-1属本发明，180803-1属对比例）在盐水溶液中浸泡2分钟，然后浸入模拟体液中。模拟体液是一种具有与人血浆的离子浓度相似的离子浓度的溶液，如表3所示，维持在相同的pH和温度（pH7.4和36.5°C温度）生理条件下。浸泡时间在1至30天之间。
将样品在称为CHDS的封闭烧瓶传导加热系统中进行消化。由Specsol® 1000 mg.L-1标准溶液配制含有0.0 - 20 mg. L-1 Ca的溶液，以制备校准曲线。
表1和图1中所示的Ca测定是在ContrAA 300高分辨率连续源原子吸收光谱仪（HR-CS FAAS）（Analytic Jena，耶拿，德国）上进行的，该原子吸收光谱仪配备有Xe短弧灯作为连续辐射源（在图1中，Y轴上的符号“，”要根据表1作为小数点来阅读，即数值1000,00要理解为1000或1000.00）。
使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）（JEOL，7500F型）对牛心包样品（180803-1，用戊二醛保存）进行扫描电子显微镜检（SEM）：（a）和（c）无SBF，（b）和（d）在SBF溶液中浸泡24小时（见图2）。
表1
| 天数 | 180803-1 Ca mg/kg | 180702-2 Ca mg/Kg | 180702-1 Ca mg/kg |
| 0 | 342.44 | 170.95 | 114.17 |
| 1 | 951.35 | 1009.33 | 1095.72 |
| 2 | 1032.68 | 871.74 | 958.13 |
| 3 | 1080.46 | 719.87 | 806.27 |
| 4 | 1046.86 | 879.55 | 965.94 |
| 5 | 1088.43 | 974.26 | 1060.65 |
| 10 | 973.81 | 846.86 | 933.25 |
| 15 | 2703.91 | 2151.70 | 2165.84 |
| 20 | 5887.85 | 3607.95 | 3623.10 |
| 25 | 9100.73 | 4145.59 | 4186.11 |
| 30 | 7812.76 | 4123.35 | 4193.58 |
实施例2-1
将75单位的选自牛心包（P + F Brasil）并在戊二醛（Sigma-Aldrich，0.625体积％）存在下固定的生物组织放入冷的0.9％盐水溶液（JP Farma）中，然后放在包含pH 7.4 PBS（Sigma-Aldrich）和EDTA（Sigma-Aldrich，0.2重量％）的水溶液中3分钟，随后用乙醇（Sigma-Aldrich，70体积％）漂洗。然后将经浸泡的组织在环境温度下浸入乙醇中约1分钟。下一步，将组织与甘油（Sigma-Aldrich，99％）、乙醇和EDTA溶液的混合物（70％甘油、29.8％乙醇和0.2％EDTA溶液）在环境温度下接触至少90分钟。之后，将组织浸入甘油中至少90分钟，伴以搅拌，然后再用乙醇漂洗。然后将组织小心地从溶液中取出并进行空气干燥。干燥16小时后，检查组织的再水化和机械稳定性。
使用Universal Testing Machine（Oswaldo Filizzola，型号AME-2kN）按应变应力评估测试了材料的机械性能，特别是抗拉强度。不同制备步骤的牛心包测试样品的抗拉强度如图3所示，其中第1组对应于标准的心包，第2组对应于干燥的心包，第3组对应于干燥和再水化的心包。
实施例2-2
将04（4片，圆形，直径130mm）单位的选自牛心包（P + F Brasil）并在戊二醛（Sigma-Aldrich，0.625体积％）存在下固定的生物组织放入冷的0.9％盐水溶液（JP Farma）中，然后放在包含pH7.4 PBS（Sigma-Aldrich）和EDTA（Sigma-Aldrich，0.2重量％）的水溶液中3分钟，随后用乙醇（Sigma-Aldrich，70体积％）漂洗。然后将经浸泡的组织在环境温度下浸入乙醇中约1分钟。下一步，将组织与甘油（Sigma-Aldrich，99％）、乙醇和EDTA溶液的混合物（70％甘油、29.8％乙醇和0.2％EDTA溶液）在环境温度下接触至少90分钟。之后，将组织浸入甘油中至少90分钟，伴以搅拌，然后再用乙醇漂洗。将这些样品送交原子吸收光谱仪ContrAA 300（Analytik Jena，耶拿，德国）进行分析。表2将这些样品的钙含量与标准的戊二醛保存牛心包的钙含量进行比较。
表2
| 样品 | Ca浓度(g/Kg) | Ca浓度(ppm) |
| 干燥 | 0.0652 | 65.2 |
| 戊二醛 | 0.1452 | 145.2 |
为了比较心包样品的钙吸收，将干燥的和标准的心包样品在模拟血溶液（SBF）中进行温育，该模拟血溶液的离子浓度如表3所示，与人血浆相似。
表3
| Na<sup>+</sup> | K<sup>+</sup> | Ca<sup>2+</sup> | Mg<sup>2+</sup> | HCO<sub>3</sub><sup>2-</sup> | Cl<sup>-</sup> | HPO<sub>4</sub><sup>2-</sup> | SO<sub>4</sub><sup>2-</sup> | |
| SBF (mg/L) | 213.0 | 7.5 | 3.8 | 2.3 | 6.3 | 223.0 | 1.5 | 0.75 |
将样品在SBF中温育24小时，然后送交进行原子吸收光谱分析。结果在表4中显示。
表4
| 样品 | Ca浓度(g/Kg) | Ca浓度(ppm) |
| 干燥/SBF | 0.5446 | 544.6 |
| 戊二醛/SBF | 0.8251 | 825.1 |
实施例2-3
使用染色剂通过组织学评估研究了胶原纤维的完整性，以检查牛心包样品干燥过程后胶原纤维的保持情况。图像是使用Eclipse E-200（Nikon）和video digital full HD Lite1080p（Tucsen）获得的。将结果与标准的戊二醛保存材料样品进行了比较。使用不同的染色剂进行检查，如图4（干燥的牛心包）和图5（标准的牛心包）所示，其中HE表示苏木精，RE表示间苯二酚-苔红素，TM表示Masson三色，TG表示Gomory三色（所有染色剂均由Merck提供）。
图4显示了由苏木精和曙红（HE，AA'）、间苯二酚-苔红素（RE，BB'）、Mallory三色(TM, C-C ")和Gomori三色(TG, D-D")染色的PF180611-Std 05膜的横截组织切片的显微照片（无光场显微镜）。可以观察到干燥的牛心包样品的以下部分：粗胶原纤维（较小的黑色箭头所示）、横断面或纵截面的弹性纤维（较大的黑色箭头所示）、细胞核残留物（箭头所示）。此图片中没有显示血管元素的残留物。标尺显示显微照片的实际放大倍数。
图5显示了由苏木精和曙红（HE，AA'）、间苯二酚-苔红素（RE，BB'）、Mallory三色(TM, C-C ")和Gomori三色(TG, D-D")染色的PF180801-3-DRY05膜的横截组织切片的显微照片（无光场显微镜）。可以观察到标准的牛心包样品的以下部分：粗胶原纤维（较小的黑色箭头所示）、横断面或纵截面的弹性纤维（较大的黑色箭头所示）、细胞核残留物（箭头所示）和血管元素的残留物（大头和尖箭头）。标尺显示显微照片的实际放大倍数。
实施例2-4
通过扫描电子显微镜（SEM，FESEM，JEOL，型号7500F）使用不同的分辨率评估了标准的和干燥的（两种）牛心包的胶原结构及干燥过程的抗钙化作用：
（a）干燥的牛心包：图6：放大200倍；图7：放大3000倍；图8：放大50000倍；图9：放大100000倍；
（b）标准的牛心包：图10：放大200倍；图11：放大3000倍；图12：放大50000倍；图13：放大100000倍。
Claims (15)
1.一种处理生物组织的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）用盐水溶液浸泡经交联剂处理的所述生物组织；
（2）使所述经浸泡的生物组织与包含过氧化氢的水溶液接触；
（3）使所述生物组织与包含PBS和EDTA的水溶液接触；
（4）使所述生物组织与包含甘油、乙醇和EDTA的溶液接触；
（5）使所述生物组织与甘油溶液接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(3a)和/或(5a)：使所述生物组织与浓度在至少70体积%内的乙醇接触。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物组织为牛或猪心包或者心脏瓣膜。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述盐水溶液为包含0.9%氯化钠的水溶液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）中甘油与乙醇的体积比为1:5至5:1。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中EDTA的浓度为0.01重量%至10.0重量%，或者步骤（2）中过氧化氢的浓度为0.05体积%至5.0体积%。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤（6）干燥所述生物组织、步骤（7）将所述生物组织装进包装中、步骤（8）将所述包装密封和步骤（9）将所述包装灭菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将包含所述生物组织的所述包装进行灭菌是通过将所述包装暴露于环氧乙烷气体来进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，特别是根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）至（5）是在10°C至25°C的温度下进行，特别是所述步骤（6）和（7）是在10°C至25°C的温度下进行。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）和（5）在搅拌下进行至少60分钟。
12.一种生物组织，其特征在于，所述生物组织包含根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备的生物组织。
13.根据权利要求12所述的生物组织用于外科手术植入的用途。
14.根据权利要求12所述的生物组织作为生物假体的用途。
15.根据权利要求12所述的生物组织在经导管心脏瓣膜中的用途。
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