CN102946916A - 通过化学修饰抗原性碳水化合物稳定生物假体组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于这样的方法，其通过氧化邻二醇以形成醛或酸并随后还原胺化醛以形成稳定的仲胺或酰胺化或酯化酸以形成稳定的酰胺或酯来修饰异种生物假体组织内的抗原性碳水化合物表位。有利地，本文提供的方法减轻生物假体组织的抗原性同时使整体组织结构基本上不受干扰，从而增强生物假体植入物的耐用性、安全性和性能。

Description

通过化学修饰抗原性碳水化合物稳定生物假体组织的方法
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2010年6月17日提交的美国临时申请号61/355,948的优先权。
领域
本文提供的方法涉及生物假体植入物的领域，更具体而言，涉及处理生物假体组织以减少宿主对象中的植入后的抗原性和钙化。
背景
由动物组织制成的生物假体植入物的主要限制是移植受体中超急性排斥反应的发生。这种反应主要是由移植组织内抗原性碳水化合物（糖类，carbohydrate）表位的存在而驱动，最常见的抗原性碳水化合物表位是α-GAL糖蛋白表位：D半乳糖(α1-3)半乳糖(β1-4)N乙酰基葡糖氨-R-基序(α-GAL)，其被发现于除旧大陆猴(old world monkey)、大猿和人以外的所有物种的血管内皮组织上。在移植到人中以后，α-GAL在收获的动物供体组织上的存在引起直接和强烈的免疫反应，其会迅速毁坏周围组织和/或器官。排斥反应的迅速是由于在人对象中非常高水平的预形成的抗-α-GAL抗体(人血液中几乎所有抗体的1%是抗-α-GAL抗体)。高水平的抗-α-GAL是对在人消化道中普遍存在的携带α-GAL表位的细菌的适应性反应。
用于异种(xenographic)生物假体组织的最常见的组织源是马科动物（马）、绵羊、猪和牛组织，其均携带α-GAL表位并且潜在地是抗原性性的。用于限制生物假体组织的抗原性的一种途径是化学修饰（改变，modify）抗原性表位，以便它们不再被宿主抗体识别。这通常通过化学固定完成，所述化学固定包括使生物假体组织暴露于固定剂(或鞣剂)，其在组织的多肽内形成交联(分子内交联)和/或在组织的多肽间形成交联(分子间交联)。用于处理生物假体组织的固定剂的实例包括：甲醛、戊二醛、双醛淀粉、六亚甲基二异氰酸酯和聚环氧化合物。戊二醛是最广泛使用的固定剂，并且，戊二醛处理是当前用于稳定临床有用的生物假体组织的标准方法。戊二醛固定的生物假体心瓣膜的实例包括Carpentier-
Figure BDA00002598203300011
带支架的猪生物假体、Carpentier-
Figure BDA00002598203300012
Figure BDA00002598203300013
围心生物假体和EdwardsPRIMA PlusTM无支架主动脉生物假体，其均可从Edwards Lifesciences,Irvine,Calif.92614得到。
尽管化学固定可以很大程度地限制生物假体组织的抗原性，但固定的组织，尤其是戊二醛固定的组织存在若干缺点。例如，戊二醛固定的保护作用在生物假体植入物的预期使用期限内由于不稳定的席夫碱（Schiff Base）交联而趋于退化，导致免疫原性提高以及长期稳定性和性能受损。另外，戊二醛处理使生物假体组织更容易受到钙化，尤其在植入物保留在适当的位置持续延长的时间段(例如，大于10年)时，这是由于其高水平的残留醛基团。结构性瓣膜退化(SVD)是早期瓣膜外植的最常见原因，其中组织钙化是生物假体植入物失败的主要原因。这些戊二醛衍生的醛伴随着高水平的钙矿化。
Levy和Vyavahare的美国专利号6,861,211描述了通过化学交联稳定生物假体组织的方法，所述化学交联通过用剂诸如高碘酸盐处理组织而受影响，所述剂氧化葡胺聚糖(GAG)的碳水化合物部分以产生醛，然后，用与碳水化合物醛以及邻近蛋白质上的反应基团反应的双官能剂处理组织，以使GAG交联到周围组织基质。像常规戊二醛固定一样，该方法产生残留的反应性醛基团，其充当潜在的钙结合位点，因而由于最终损害材料的生物机械性能而使组织不稳定。
美国专利号6,383,732(Stone)，描述化学修饰的替代方案，其利用酶α-半乳糖苷酶(galactosiadase)破坏α-GAL表位来限制生物假体组织的抗原性。酶方法遭受酶制备的普遍高成本以及这样的事实，即，大尺寸的α-半乳糖苷酶和其它酶防止这些蛋白质结构深深穿透到组织诸如围心生物假体组织的胞外基质。因此，基于酶的处理并不消除由酶靶向的所有表位，尤其在生物假体植入物内部。另外，α-半乳糖苷酶和其它酶对于特定的表位是特异性的(例如，在α半乳糖苷酶的情况下，α-GAL)，致使其非常难以限制包含多个和/或未知表位的组织的抗原性。酶促去除细胞组分和组织结构也会使组织的生物机械特性退化。此外，这些酶处理不能与戊二醛固定的组织一起应用，因为酶的蛋白质结构将与残留的醛反应并与材料共价结合。结果是外源蛋白质增加和组织性能的进一步退化。
因此，在本领域中仍需要开发新的和改进的方法，用于减小抗原性和限制异种组织的钙化，从而增强组织的耐用性、稳定性和性能。这些增强的特性与体内生物假体组织的要求一致，其包括维持，例如心脏瓣膜的结构、机械和生物相容性质。
发明简述
本文提供这样的方法，其通过化学修饰生物假体组织内的抗原性碳水化合物来提高异种生物假体组织植入物的稳定性、耐用性和/或性能。
在一些方面，所述方法包括以下步骤：用氧化剂处理所述生物假体组织，所述氧化剂氧化抗原性碳水化合物的邻二醇部分以形成醛或酸，和用封端剂处理生物假体组织，所述封端剂包括伯胺或醇，其与醛或酸结合以形成亚胺、酰胺或酯。
在一些方面，所述方法包括以下步骤：用封端剂处理生物假体组织，封端剂包括伯胺或醇，其与醛或酸结合以形成亚胺、酰胺或酯，和用稳定剂处理生物假体组织，稳定剂将亚胺转换成仲胺或将酯转换成酰胺。
在一些方面，所述方法包括以下步骤：用氧化剂处理生物假体组织，所述氧化剂氧化抗原性碳水化合物的邻二醇部分以形成醛或酸；用封端剂处理生物假体组织，所述封端剂包括伯胺或醇，其与醛或酸结合以形成亚胺、酰胺或酯；和用稳定剂处理生物假体组织，所述稳定剂将亚胺转换成仲胺或将酯转换成酰胺。
在一些方面，抗原性碳水化合物是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，在一些方面，抗原性碳水化合物是福斯曼抗原（嗜异性抗原，Forssman antigen）(GalNAc α1,3 GalNAc β1,3 Gal α1,4 Gal β1,4 Glc-Cer)。在进一步的方面，抗原性碳水化合物包含α-半乳糖基(α-Gal)表位。
在一些方面，氧化剂是高碘酸盐。在一些方面，高碘酸盐相对于构成生物假体组织的β-氨基醇和/或邻二酮基团，选择性地氧化抗原性碳水化合物的邻二醇。
在一些方面，封端剂是伯胺。在进一步的方面，伯胺与生物假体组织上的醛反应以形成亚胺。
在一些方面，封端剂是醇。在进一步的方面，醇与生物假体组织上的酸反应以形成酯。
在一些方面，稳定剂是还原剂。在进一步的方面，还原剂将生物假体组织亚胺转换成仲胺和将酯转换成酰胺。
在一些方面，生物假体组织在封端剂的存在下用氧化剂处理。在进一步的方面，生物假体组织在用还原剂处理之前被充分洗涤，以除去氧化剂。
在一些方面，生物假体组织在伯胺或醇封端剂的存在下用稳定剂处理。在进一步的方面，生物假体组织用封端剂和稳定剂同时处理。在再进一步的方面，生物假体组织在用封端剂和/或稳定剂处之前被洗涤，以去除氧化剂。
在一些方面，生物假体组织用一种或多种表面活性剂和/或固定剂处理过。在各个方面，固定剂选自醛、二醛、聚醛、二异氰酸酯、碳二亚胺、光氧化剂和聚环氧化合物，表面活性剂选自阴离子表面活性剂、烷基磺酸盐、聚氧乙烯醚、谱朗尼克或丁炔表面活性剂和烷基化的苯氧基聚乙氧基醇。
在一些优选方面，生物假体组织用戊二醛处理过。
在一些优选方面，生物假体植入物是心脏瓣膜。在进一步的方面，生物假体组织是牛心包膜或猪主动脉瓣。在再进一步的方面，生物假体植入物是儿童心瓣膜。
在一些方面，被氧化的生物假体组织在人宿主中基本上是非免疫原性的。在进一步的方面，被处理的生物假体组织的抗原性碳水化合物在人宿主中基本上是非抗原性的。在再进一步的方面，被处理的生物假体组织在人宿主中基本上是非钙化的。在一些方面，人宿主是儿童患者。
在一些方面，氧化剂是高碘酸盐。在进一步的方面，高碘酸盐是高碘酸钠。在一些方面，高碘酸钠以20nM的浓度被使用。在一些方面，生物假体组织在约25°C用高碘酸钠处理约3小时。
在一些方面，所述方法还包括用一种或多种表面活性剂和固定剂处理生物假体组织。在进一步的方面，所述方法包括用醛固定剂处理生物假体组织。在再进一步的方面，所述方法包括用戊二醛处理生物假体组织。在一些方面，固定剂是碳二亚胺(如EDC)。在一些方面，固定剂是双环氧化物(diepoxy)。
在一些方面，生物假体组织是新鲜组织。
在一些方面，所述方法还包括用生物负载还原溶液处理生物假体组织，该生物负载还原溶液包括甲醛、乙醇和吐温溶液。在一些方面，所述方法还包括用乙醇和丙三醇干燥生物假体组织。在一些方面，所述方法还包括用环氧乙烷对所述生物假体组织灭菌。
在一些方面，方法还包括用去细胞化方法使生物假体组织去细胞化，所述去细胞化方法包括用0.1%SDS处理组织、冲洗组织和用DNAse处理组织。在一些方面，所述方法还包括干燥和电泳清洗生物假体组织。在一些方面，所述方法还包括用戊二醛对所述生物假体组织灭菌。
在一些方面，所述方法还包括用生物负载还原溶液处理生物假体组织，所述生物负载还原溶液包含乙醇和吐温
Figure BDA00002598203300042
溶液。
其它方面描述在共同拥有的2008年12月18日提交的美国公布号2009/0164005中，其在此通过引用其整体被并入本文，用于所有目的。
附图简介
图1显示本公开内容中提供的组织处理方法的各个方面。如图1所示，该方法一般包括邻二醇（即，vic二醇）氧化、用封端剂处理和/或用稳定剂处理。
图2显示处理未固定组织后α-Gal表达的免疫组织化学。蓝色是DNA(DAPI染色)和绿色是α-Gal(同工凝集素IB4染色)。图2A显示在用本文所述的方法(邻二醇氧化、封端剂和还原剂)处理的、新鲜未固定组织中的最小染色。图2B显示在仅用高碘酸盐处理的、新鲜未固定组织中密集α-Gal (同工凝集素IB4染色)的较浅区域。
图3显示用各种类型高碘酸盐处理的、未固定组织上α-Gal表达的免疫组织化学。染色区域显示为相对于较深背景的较浅区域。蓝色是DNA(DAPI染色)和绿色是α-Gal(同工凝集素IB4染色)。图3A显示用1%SDS/DNAse去细胞化程序处理的未固定组织。图3B显示用商业可得的去细胞化的胶原组织处理的未固定组织。图3C显示用另一商业可得的去细胞化的胶原组织处理的未固定组织。
图4显示用戊二醛固定的组织具有严重的自身荧光。
图5显示在仅用ThermaFix(TFX)处理的固定组织上，α-Gal和DNA表达为较深的区域。棕色是α-Gal(同工凝集素-IB4，DAB)和蓝色是核(苏木精染色)。图5还显示用于该试验的方法的流程图。
图6显示在利用TFX和本文所述方法的固定组织的组合处理处理的固定组织上，α-Gal和DNA表达为较深区域。上面的图显示用乙醇胺处理的组织。下面的图显示用牛磺酸处理的组织。棕色是α-Gal(同工凝集素-IB4，DAB)和蓝色是核(苏木精染色)。
图7显示在用封端、还原和干燥方法处理的固定组织上，α-Gal和DNA表达为较深的区域。图7还显示用于该试验的方法的流程图。棕色是α-Gal(同工凝集素-IB4，DAB)和蓝色是核(苏木精染色)。
图8显示在用TFX以及如本文所述的邻二醇氧化、用封端剂处理、用还原/稳定剂处理和干燥的组合处理处理的固定组织上，α-Gal和DNA表达为较深区域。上面的图显示用乙醇胺处理的组织。下面的图显示用牛磺酸处理的组织。棕色是α-Gal(同工凝集素-IB4，DAB)和蓝色是核(苏木精染色)。
图9显示由各种组织处理引起并与对照相比的、全部同工凝集素-B4-α-Gal结合抑制的百分比。
图10显示针对在灵长类对象中进行的以下处理的抗-α-Gal反应：戊二醛；TFX；邻二醇氧化、用封端剂处理和用稳定剂处理；和封端、还原和干燥处理。数据作为与初始值相比吸光度的百分比增长或下降被提供。
发明详述
在本文中提供对本发明的描述是为了描述各个方面的目的，而并不意图是穷尽性的或限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。相关领域的技术人员会理解，根据这些方面的教导，许多修改和变化是可能的。
除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。虽然本文中描述了示例性的方法和材料，但应该理解，也可以使用与那些被描述的方法和材料类似或相当的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用被并入，以公开和描述与它们被引用的有关的方法和/或材料。
必需注意，如在本说明书中所用的，单数形式“一(“a”、“an”)”和“该(“the”)”包括复数指代，除非上下文另有明确相反的说明。
本文提供这样的方法，其通过化学修饰组织内的一种或多种抗原性碳水化合物同时使整体组织结构基本上未被修饰来减轻异种生物假体组织的免疫原性。
在一些方面，所述方法包括以下步骤：用氧化剂处理所述生物假体组织，所述氧化剂氧化抗原性碳水化合物的邻二醇部分以形成醛或酸，和用封端剂处理生物假体组织，该封端剂包括伯胺或醇，其与醛或酸结合以形成亚胺、酰胺或酯。
在一些方面，所述方法包括以下步骤：用封端剂处理生物假体组织，该封端剂包括伯胺或醇，其与醛或酸结合以形成亚胺或酯，和用稳定剂处理生物假体组织，该稳定剂将亚胺转换成仲胺或将酯转换成酰胺。
在一些方面，所述方法包括以下步骤：用氧化剂处理所述生物假体组织，所述氧化剂氧化抗原性碳水化合物的邻二醇部分以形成醛或酸；用封端剂处理生物假体组织，所述封端剂包括伯胺或醇，其与醛或酸结合以形成亚胺或酯；和用稳定剂处理生物假体组织，所述稳定剂将亚胺转换成仲胺或将酯转换成酰胺。
不受具体理论限制，据信用于稳定异种组织的戊二醛固定和其它确立的方法遭受与生物假体植入物的抗原性、钙化和长期失败有关的若干限制。戊二醛和其它固定剂通过在组织内的某些反应性部分之间形成交联来稳定组织，而不必改变或消除抗原性表位。由于宿主免疫细胞、抗体和血清蛋白对戊二醛固定组织表面上的富集的（集中的，concentrated）醛基团的吸收，戊二醛固定在很大程度上以间接的方式降低抗原性，形成隔离组织与宿主免疫因子的天然分子的包衣。然而，这种蛋白质包衣随着时间退化，使组织暴露于宿主免疫系统。另外，由于戊二醛通过被处理组织的缓慢穿透和扩散速率，戊二醛固定组织的内部常常含有高水平的“潜在抗原”。结果，戊二醛固定的生物假体组织可随着时间变得越来越具有抗原性，导致生物假体植入物的钙化、组织疲劳和最终的故障。
有利地，本文提供的方法通过解决与戊二醛固定和/或其它确立的方法有关的一个或多个限制，降低生物假体组织的抗原性和/或钙化。根据本发明方法用高碘酸盐处理生物假体组织选择性地氧化抗原性碳水化合物，导致对异种抗原的共价修饰。另外，高碘酸盐和其它化学剂均是小分子，其容易扩散通过生物假体组织——包括化学固定的组织，以消除遍及组织的潜在抗原。本文提供的方法应用封端剂将由高碘酸盐氧化和/或戊二醛固定产生的醛基团转换成亚胺，和使用还原剂将水解不稳定性亚胺转换成稳定的和基本上非抗原性仲胺。所述方法因而消除反应性和毒性醛并防止醛进一步氧化成作为潜在钙结合位点的酸。此外，通过修饰潜在抗原和产生的生物假体组织降低的免疫原性，钙化被进一步降低。有利地，本文提供的方法提高生物假体组织植入物的稳定性、耐用性和/或性能。
在一些方面，被本发明方法靶向修饰的“抗原性碳水化合物”是葡胺聚糖(GAG)多糖，其被发现于异种组织的糖蛋白和/或糖脂上并被人对象的免疫系统识别为外源的。生物假体组织内的抗原性碳水化合物可以触发改变免疫反应的水平，这会降低植入物的性能、耐用性和/或预期使用期限并潜在地要求直接医疗干涉来取代植入物。在一些方面，根据本文提供的方法修饰的抗原性碳水化合物是“对高碘酸盐不稳定的(periodate labile)”，因为它们包含一个或多个暴露的邻二醇(R1-CH(OH)CH(OH)-R2)部分，其能够被高碘酸盐氧化，以产生侧(pendant)醛(R1CHO)。有利地，对抗原性碳水化合物的高碘酸盐氧化修饰其结构，以便其不再被循环抗体识别。在一些优选方面，根据本文提供的方法用高碘酸盐处理戊二醛固定组织基本上消除对高碘酸盐不稳定的抗原性碳水化合物表位。在进一步的方面，根据本文提供的方法用高碘酸盐处理戊二醛固定组织致使组织基本上是非抗原性的。
在一些方面，根据本发明方法修饰的抗原性碳水化合物是α-GAL表位(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R)。根据本文提供的方法用高碘酸盐处理表达α-GAL的异种组织导致α-GAL端半乳糖的邻二醇的氧化，产生两个侧醛。侧醛优选被含有伯胺的“封端剂”转换成亚胺，并且亚胺被还原剂转换成稳定的仲胺。有利地，对端半乳糖单元的高碘酸盐氧化修饰α-GAL表位，以便它不再被人抗-α-GAL(“抗-GAL”)抗体识别，从而基本上降低生物假体组织的抗原性性。
在进一步的方面，根据本发明方法修饰的抗原性碳水化合物是唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，即所谓的Hanganutziu-Deicher(HD)抗原，其包含具有对高碘酸盐不稳定的邻二醇的九-碳糖。Neu5Gc常见于哺乳动物组织，尤其是猪组织中，但不是由人内源合成的。然而，由于对人糖蛋白中少量Neu5Gc的饮食摄取和可能的代谢掺入(metabolic incorporation)，有时在人中检测到Neu5Gc处于相对稳定的水平。人对象具有不同水平的循环抗体抵抗Neu5Gc，其中最高水平可与抗-GAL抗体的水平相当。有利地，对异种组织中Neu5Gc唾液酸残基的高碘酸盐氧化修饰Neu5Gc表位，以便它对于人对象不再是抗原性的。
在进一步的方面，抗原性碳水化合物是福斯曼抗原(GalNAc α1,3GalNAcβ1,3Gal α1,4Gal β1,4Glc-Cer)。M.Ezzelarab等，Immunology and Cell Biology 83,396-404(2005)。
在一些优选方面，根据本文提供的方法处理生物假体组织显著降低人对象中组织的抗原性。在进一步的方面，根据本文提供的方法处理生物假体组织使该组织在人对象中基本上是非抗原性的。在再进一步的方面，本文提供的方法显著降低人儿童对象中组织的抗原性和/或致使组织在人儿童对象中基本上是非抗原性的。
在一些方面，根据本发明方法处理的生物假体组织用固定剂处理过。如本文中所使用的，术语“固定的”或“固定”一般是指用化学剂(固定剂)处理生物组织的过程，其在结构内和结构间形成分子间和分子内交联，以稳定组织结构并防止降解。例如，通过防止蛋白酶接近可能的底物蛋白所需的解折叠和变性，固定降低组织对蛋白酶剪切的易感性。戊二醛、甲醛、双醛淀粉和其它醛交联剂是在准备外科手术植入过程中用于处理生物假体组织的最常用的固定剂。虽然用固定剂进行固定对于稳定组织是期望的，但固定也会在组织中产生反应性化学部分，其能够结合钙、磷酸盐、免疫原性因子或其它的钙化前体。例如，戊二醛固定产生高浓度的游离醛，其本质上是有毒性的，而且可以进一步被氧化，以形成带负电荷的羧酸基团，该羧酸基团充当带正电荷的钙离子的可能结合位点。
如本文中所使用的，术语“钙化”意为一种或多种钙化合物诸如磷酸钙、钙羟基磷灰石和/或碳酸钙在生物假体组织内的沉积，其会导致不期望的生物假体的硬化和/或降解。尽管钙化的确切机制还不清楚，但通常已知钙化是由血浆钙离子与游离醛、磷脂和其它组织成分的相互作用而发生在生物假体组织中。另外，生物假体组织在儿童对象中尤其易于钙化。钙化就生物假体组织而言可以是内在的或外在的。内在的钙化以钙和磷酸盐离子在生物假体组织诸如胞外基质和剩余细胞内的位点沉淀为特征。外在的钙化以钙和磷酸盐离子通过，例如血栓形成或表面斑块的发展，在生物假体组织上外部位点上的沉淀为特征。有利地，本文提供的方法同时降低内在和外在形式的钙化。
在一些优选方面，根据本文提供的方法处理生物假体组织显著降低该组织中的钙化水平和/或该组织在人对象中钙化的倾向。在进一步优选的方面，根据本文提供的方法处理生物假体组织致使组织在人对象中基本上是非钙化的。在再进一步的方面，本文提供的方法显著降低组织钙化的水平和/或组织钙化的倾向和/或致使组织在人儿童对象中基本上是非钙化的。
本发明方法对降低和/或消除异种抗原、游离醛和/或钙化(或钙化的倾向)的作用可利用本领域技术人员已知的各种方法检测。抗原性碳水化合物的减少可以通过，例如直接半乳糖分析(α-GAL表位)、免疫组织化学染色(例如，利用抗-α-GAL和/或抗-Neu5Gc抗体)和常规组织学来监测。游离醛在组织中的水平可以利用比色试剂诸如4-氨基-3-肼基-5-巯基(mercato)-1,2,4-三唑(可以商品名PURPALD获得)经分光光度测定被测量，所述比色试剂与醛特异地反应，以产生着色的6-巯基-均三唑并-(4,3-b)-对称四嗪，其可在550nm处检测，如在例如Dickinson和Jacobsen,Cem.Commun.,1719(1970)中描述的。生物假体组织中游离醛浓度的降低也可以被测量为组织毒性的降低。例如，生物假体组织(或其样品)可用作用于接种培养的内皮细胞的底物，并且，内皮细胞单细胞层在生物假体组织底物上的生长可以提供组织中残留醛的数量和浓度的敏感生物指示物。
生物假体组织钙化的程度可以利用本领域已知的各种方法诸如分光光度法(例如，由Mirzaie等.,Ann.Thorac.Cardiovasc.Surg.,13:2(2007)所描述的)和光谱法(例如，硝酸灰化后的电感应耦合等离子体质谱(ICP-MS))进行测量。组织钙化也可以通过组织学染色(例如，Von Kossa染色)或通过使用钙化指示物(例如，铬黑T、紫脲酸铵或邻甲酚酞，如在例如Sarkar等,Anal Biochem,20:155-166(1967)中所描述的)进行分析。另外，心脏瓣膜生物假体植入物的钙化可通过组织机械特点的相关变化来检测，诸如硬化增加，其可被目测和/或利用本领域中已知的各种方法来测量。本领域的技术人员将熟悉这些和其它方法。
如本文中所使用的，术语“生物假体”是指被植入到哺乳动物对象，优选地人对象中并全部或部分源自动物或其它器官组织(一个或多个)的任何假体。本文提供的方法中应用的生物假体植入物包括组织“补片（patches）”、心脏瓣膜和其它心脏成分、心替换物、血管替换物或移植物、尿道和膀胱替换物、肠和组织切除术等等。
根据本文提供的方法处理的生物假体植入物可源自任何生物组织，包括但不限于心瓣膜、血管、皮肤、硬膜（dura mater）、心包膜、软骨、韧带和腱。在一些方面，用于制备生物假体植入物的组织根据柔韧性或刚性程度被选择，所述柔韧性或刚性随着组织内存在的胶原和弹性蛋白的相对量、组织的结缔组织构架(例如，胶原和弹性蛋白纤维的排列)的结构和构象和/或本领域技术人员已知的其因子而变化。生物假体组织具有相对高水平的胶原，诸如心瓣膜组织和围心组织，其被发现特别适于生物假体心瓣膜植入物。然而，本领域技术人员将认识到，本发明方法可以用于处理由任何合适的组织制造的生物假体植入物。
在一些优选方面，生物假体植入物是心脏瓣膜植入物，其源自异种哺乳动物供体组织并意图用于人对象。在进一步优选的方面，生物假体植入物源自除了大猿或旧大陆猴以外的异种哺乳动物供体，诸如但不限于马科动物供体、绵羊供体、猪供体或牛供体。
本领域的技术人员将认识到，本发明方法特别有益于处理植入后降解和/或钙化引起重要的临床问题的那些假体(prostheses)。例如，在一些方面，生物假体植入物是心瓣膜，其由牛心包膜或猪主动脉瓣形成并被设计用于植入人对象。在再进一步优选的方面，生物假体植入物源自异种哺乳动物供体组织并被设计用于植入人儿童对象。
根据本发明方法的“氧化剂”包括任何适于选择性氧化具有邻二醇的抗原性碳水化合物以产生游离醛或酸部分的温和氧化剂。根据本公开内容的氧化剂可以是卤素系列氧化剂或过氧化物系列氧化剂等等。氧化剂的实例包括但不限于高碘酸、高碘酸的盐诸如高碘酸钠、四乙酸铅、过氧化氢、亚氯酸钠、次氯酸钠、高锰酸钾、氧、卤素诸如溴和本领域的技术人员已知的其它氧化剂。
在一些方面，氧化剂是高碘酸盐。根据本文提供的方法，“高碘酸盐”是包含高碘酸盐离子(IO4 -)的化合物，如下面反应方案所示地，所述高碘酸盐离子能够与抗原性碳水化合物的邻二醇部分(1)进行反应，产生两个侧醛部分(2)以及甲酸和H2O。
Figure BDA00002598203300101
在一些方面，在水性溶液中，优选水性缓冲液中，在适于保持生物假体组织的结构和生物学特点的条件下，进行邻二醇的氧化。在一些方面，高碘酸盐被用于氧化邻二醇。典型地，化学计算量的高碘酸盐被用于氧化邻二醇部分，其量可以针对组织的具体体积和/或组织的具体类型根据经验被测定。可选地，可以使用化学计算过量的高碘酸盐。溶液通常被缓冲，以具有约4和约9之间的pH，其中pH在约6和约8之间对于某些pH敏感生物分子是期望的。高碘酸盐氧化通常在约0和约50℃的温度下，优选在约4和约37℃的温度下进行。根据修饰所针对的抗原性碳水化合物(一种或多种)、生物假体组织的尺寸和几何形状和/或其它考虑因素，高碘酸盐氧化可以在数分钟到长达数天的期间内完成。优选地，高碘酸盐氧化在约数小时和约24小时之间的期间完成。长期氧化反应优选在防止过氧化的条件下进行。高碘酸盐氧化的处理时间和温度趋于呈负相关，因为较高的处理温度要求相对较短的处理时间。本领域的技术人员将认识到，具体生物假体组织的确切反应条件可以通过常规实验，利用本领域已知的方法来确定。
在各个方面，氧化剂能够氧化被靶向修饰的抗原性碳水化合物内的邻二醇，形成任意一个侧醛部分——其通过本文提供的方法被转换成亚胺，然后被转换成更稳定的仲胺，或者酸，酸被直接转换成酰胺，或可选地，通过本文提供的方法被转换成酯，然后被转换成更稳定的酰胺。在一些方面，氧化剂的大小、电荷和/或其它特点使其易于在生物假体组织内穿透和扩散，并在期望的处理期间之后从组织洗掉。在一些方面，氧化剂是高碘酸盐，其是高碘酸或其盐诸如高碘酸钠、高碘酸钾或其它碱金属高碘酸盐。在一些优选方面，氧化剂是高碘酸钠。在一些方面，氧化剂是乙酸盐诸如乙酸铅。
在一些方面，根据本文提供的方法用高碘酸盐处理生物假体组织导致相对于其它反应官能性对邻二醇的选择性氧化，所述其它反应官能性包括但不限于2-氨基醇(例如，在N-末端丝氨酸、N-末端苏氨酸或5-羟基赖氨酸残基上)、1,2-氨基硫醇(例如，在N-末端半胱氨酸残基上)和邻二酮。在一些优选方面，根据本文提供的方法用氧化剂处理生物假体组织选择性地氧化一个或多个抗原性碳水化合物内的邻二醇同时使未靶向的结构基本上未被修饰。
不受限于具体理论，据信生物假体组织内的潜在反应性部分对于氧化的易感性随下面反应性的一般顺序(从最不稳定到最少不稳定)而不同：邻二醇、2-氨基醇、1,2-氨基硫醇和邻二酮。另外，氧化剂对邻二醇的选择性可通过用氧化剂在温和氧化条件下处理组织而被进一步增强。熟练的技术人员将认识到，可以利用本领域已知的各种方法诸如用碳水化合物底物的混合物在变化的条件下进行氧化反应和监测反应产物的产生速率，根据经验确定温和氧化条件。例如，可以通过调节各种反应条件诸如氧化剂浓度、处理持续时间、温度、溶液化学等等，来调节氧化的严格性。
在一些方面，在有利于氧化特定抗原性碳水化合物的条件下用氧化剂处理生物假体组织。例如，具有唾液酸末端糖诸如Neu5Gc的抗原性碳水化合物通常比具有其它末端糖诸如半乳糖(例如，α-GAL)的那些抗原性碳水化合物更易于受高碘酸盐氧化。
在一些方面，相对于构成生物假体组织的生物分子上其它潜在不稳定部分，氧化剂选择性地氧化被靶向修饰的抗原性碳水化合物的邻二醇。
根据本发明方法的“封端剂”包括能够与游离醛或酸部分反应的任何封端剂。封端剂可以是伯胺或醇。在各个方面，封端剂是R4-M-NH2，其中：R4是H、C1-6烷基、S(=O)2OR5、C1-6烷氧基、或羟基；M是接头，其中所述接头是C1-6亚烷基；和R5是H或C1-6烷基。在进一步的方面，R4是H。在再进一步的方面，R4是S(=O)2OR5和R5是H。在某些方面，封端剂是胺、烷基胺、羟基胺、氨基醚、氨基磺酸酯或其组合。
封端剂的实例包括但不限于乙醇胺；牛磺酸；氨基酸诸如甘氨酸和赖氨酸；烷氧基烷基胺诸如2-甲氧基乙胺；正烷基胺诸如乙胺和丙胺、N-羟基琥珀酰胺(Hydroxysuccinamide)(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰胺(Hydroxysulfosuccinamide)(NHSS)和本领域的技术人员已知的其它封端剂。
化学部分是指单价化学部分(例如，烷基、烷氧基等)，其还包括结构上允许的多价部分，如由本领域的技术人员所理解地。例如，虽然“烷基”部分通常是指单价自由基(例如，CH3CH2-)，但在适当的情况下，“烷基”部分也可以指二价自由基(例如，-CH2CH2-，其相当于“亚烷基”基团)。
所有原子均被理解为具有其键形成正常的价数(例如，碳为4、N为3、O为2和S为2、4或6，这取决于原子的氧化态)。有时，部分可以被限定为，例如(A)aB，其中a为0或1。在这种情况下，当a为0时，部分是B而当a为1时，部分是AB。
当取代基相同种类的原子或基团的数目可以变化(例如，烷基基团可以是C1、C2、C3等)时，被重复的原子或基团的数目可以由范围表示(例如，C1-C6烷基)，该范围包括该范围中的各个或每一个数字以及任何和所有亚范围。例如，C1-C3烷基包括C1、C2、C3、C1-2、C1-3和C2-3烷基。
如本文中所限定的，“烷氧基”是指被烷基基团取代的O原子，例如甲氧基(–OCH3，C1烷氧基)。术语“C1-6烷氧基”包括C1烷氧基、C2烷氧基、C3烷氧基、C4烷氧基、C5烷氧基、C6烷氧基及其任何亚范围。
“烷基”是指直链和支链脂肪族基团，其具有1到30个碳原子，或优选1到15个碳原子，或更优选1到6个碳原子，其每一个取决于化合价任选取代有一个、两个或三个取代基。“烷基”包括不饱和烃诸如“链烯基”和“炔基”，其分别包括一个或多个双键或三键。术语“C1-6烷基”包括C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基及其任意亚范围。这种基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、乙烯基、烯丙基、异丁烯基、乙炔基和丙炔基.
“亚烷基”是指二价自由基，其是分枝或未分枝的烃片段，含有指定数目的碳原子并具有两个附着点。实例是丙烯(-CH2CH2CH2-，C3亚烷基)。术语“C1-6亚烷基”包括C1亚烷基、C2亚烷基、C3亚烷基、C4亚烷基、C5亚烷基、C6亚烷基及其任意亚范围。
“胺”是指-N(R*)R**基团，其中R和R’独立地是氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环基或杂芳基，如本文所限定的。在伯胺的情况下，R*和R**均是H。
“取代的”部分是其中一个或多个氢原子独立地被其它化学取代基取代的部分。作为非限制性实例，取代的苯基基团包括2-氟苯基、3,4-二氯苯基、3-氯-4-氟苯基和2-氟-3-丙基苯基。在一些情况下，亚甲基基团(-CH2-)被氧取代，以形成羰基基团(-CO)。
“任选取代的”基团可以被一个到四个，或优选地，一个到三个，或更优选地，一个或两个非氢取代基取代。合适的取代基的实例包括但不限于，烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳酰基、卤、羟基、氧代、硝基、烷氧基、氨基、亚氨基、叠氮基、巯基、酰基、氨基甲酰基、羧基、羧基酰胺基、脒基、胍基、磺酰基、亚硫酰基、亚磺酰氨基、甲酰基、氰基和脲基基团。
已知羧酸基团，如在谷氨酸或γ-羧基谷氨酸中的那些结合钙原子。钙结合蛋白诸如骨涎蛋白包含富含羧酸的结构域，其被设计为吸引和结合钙，导致羟基磷灰石形成(钙化)。酸基团在这些蛋白质中的整体水平和位置决定蛋白质有效结合钙并形成羟基磷灰石的能力。术语组织的“酸潜力(acid potential)”是指固定组织内这些化学官能团的水平，所述化学官能团可以通过氧化、脱水、水合或类似方法最终形成酸基团或“结合位点”。
钙结合在生物假体材料，尤其是用于心瓣膜小叶的组织中引起明显的植入后损坏。例如，在储存和处理脱水的或“干燥”组织过程中发生的氧化损伤会产生羧酸基团，其将结合钙并导致组织故障。该渐进性小叶损坏过程会产生新的结合位点或作为钙化的前体的潜在结合位点和免疫原性相关路径。本公开内容提供用于在将基于组织的生物假体的组织植入到身体中之前将这些新形成的结合位点封端的方法。在没有被浸入到戊二醛溶液中时或在灭菌过程中，暴露于空气氧化的生物假体组织可能含有更多的酸基团，其有助于钙化和炎症。在干燥存储中，脱水的组织在没有戊二醛溶液的保护作用下被灭菌并“干燥”存储。由于不存在戊二醛存储液，处理和储存该新产物的容易性被大大促进。该技术可以通过用封端剂处理这种生物假体组织和/或在脱水阶段加入化学保护剂被改进。
如在下面反应方案中所示，在一些方面，根据本文提供的方法的“封端剂”是含有伯胺(R’NH2)的剂(3)，其能够与游离醛(R1CHO)(2)反应，以形成亚胺(R3N=CHR1)(4)。
醛封端(席夫碱反应)：
在一些方面，在约0℃和约50℃之间的温度下，封端反应独立于在中性或弱碱性溶液中的氧化而进行数分钟到若干小时的时间。优选地，反应在约6和约10之间的pH下，在约4℃和约37℃的温度下进行约1小时到约3小时的时间。本领域的技术人员将认识到，对于特定生物假体组织的确切反应条件可以通过常规实验，利用本领域已知的方法来确定。
本发明中的一个化学目标是酸基团的永久“封端”，所述酸基团显著降低其吸引钙、磷酸盐、免疫原性因子或其它基团的能力。术语“封端”是指阻断、去除或改变对生物假体特性会具有不利影响的官能团。例如，1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺氢氯化物(EDC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和乙醇胺的加入将有效地用非反应性酯封端酸基团。
优选地，在适于保持生物假体植入物的结构和功能的条件下，封端剂能够与醛或通过氧化邻二醇和/或通过用醛固定剂(例如，戊二醛)进行化学固定产生的酸进行反应，以形成亚胺或酯。在各个方面，封端剂可以是胺、烷基胺(例如，乙胺或异丙基胺)、羟基胺(例如，乙醇胺)、氨基醚(例如，2-甲氧基乙胺)、氨基磺酸酯(例如，牛磺酸、氨基硫酸盐、硫酸葡聚糖或硫酸软骨素)、氨基酸(例如，赖氨酸或β-丙氨酸)、亲水性多官能聚合物(例如，聚乙烯醇或聚乙烯亚胺)、疏水性多官能聚合物(α-二羰基、甲基乙二醛、3-脱氧葡糖醛酮(deoxyflucosone)或乙二醛)、肼(例如，己二酸酰肼)、单-、二-或聚环氧烷或其组合。
在一些方面，封端剂是单胺。不受具体理论限制，据信包含两个或更多个伯胺基团的某些剂可以介导生物假体组织内的交联和其它非特异性反应。在一些优选方面，封端剂选自乙醇胺（ethanaolamine）、牛磺酸(2-氨乙基磺酸)、2-甲氧基乙胺和乙胺。有利地，利用单胺封端剂将生物假体组织内的游离醛转换成稳定的仲胺而不形成残余的反应基团和/或改变组织的基本结构和/或化学特性。有利地，利用醇封端剂诸如乙醇胺，通过氧化邻二醇产生的酸可以被转换成稳定的酯而不形成残余反应基团和/或改变组织的基本结构和/或化学特性。
在一些方面，封端反应与邻二醇氧化同时进行，以防止相继将醛氧化成羧酸。反应可以在与上述氧化实质上类似的条件下进行。在进一步的方面，生物假体组织在用还原剂处理之前被洗涤，以去除氧化剂。
在一些优选方面，生物假体组织被化学固定剂诸如戊二醛预处理。固定通过使组织广泛地交联和/或修饰反应性官能团（reactive functionality）而限制通过氧化形成的醛和组织内的其它反应性部分之间的潜在交叉反应性。例如，在胶原蛋白和构成胞外基质的其它蛋白质的赖氨酸和羟基赖氨酸残基上发现的伯胺在与氧化邻二醇形成的醛进行反应过程中可以潜在地与封端剂竞争，并且，这种竞争反应对组织的结构和/或稳定性可以具有负面影响。用醛固定剂诸如戊二醛进行化学固定通过交联组织内的反应性胺并稳定整体组织结构而基本上消除这种竞争反应。
在一些方面，生物假体组织用与组织内的反应性部分结合并防止不期望的交联和/或其它反应的保护剂预处理。例如，赖氨酸氨基酸残基可以通过多种本领域已知的方法进行保护或阻断，所述本领域已知的方法包括但不限于，应用叔丁氧基羰基（tert butyloxycarbonyl）(Boc)、苄氧基羰基(Z)、二苯基异丙氧基羰基(Bpoc)、三苯基甲基(三苯甲基)、9-芴基甲氧基羰基（9-fluoroenylmethyloxycarbonyl）(Fmoc)保护基团。在生物假体组织与化学固定不相容的情况下，例如由于需要保存天然生物结构和/或组织活性，保护基团可以是优选的。
有利地，根据本发明方法用封端剂处理被固定的和/或被氧化的生物假体组织消除钙、磷酸盐、免疫因子和/或其它不期望因子的潜在结合位点。在进一步的方面，根据本发明方法用封端剂处理生物假体组织用化学部分取代组织内的醛和/或酸，所述化学部分赋予一个或多个有益特性给组织诸如局部和/或整体净电荷的降低、提高的血相容性(hemocompatibility)、增加的水合或改进的机械挠性。例如，用封端剂牛磺酸处理生物假体组织用磺化基团取代醛，所述磺化基团可有益于组织水合、挠性和/或与宿主组织的相容性。此外，用封端剂乙醇胺处理生物假体组织用酯部分取代酸，从而改进组织的生物相容性。
根据本发明方法的“稳定剂”包括任何能够与游离醛或酸部分反应的化学剂。在各个方面，稳定剂是还原剂。稳定剂选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氢化铝锂、直接大气或高压氢化、碳二亚胺诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)、吡啶诸如2-氯1-甲基碘代吡啶（2-chloro 1-methyl pyridinium iodide）(CMPI)和类似的Mukaiyama缩合剂以及和其它本领域的技术人员已知的稳定剂。
在一些方面，本发明封端方法可以包括组织的化学还原，该方法在封端剂存在的情况下应用于组织时，将永久地使封端剂与目标基团连接。例如，将乙醇胺加入到组织将会使醛基团封端，而还原剂(例如，硼氢化钠)减少通过使醛与乙醇胺的胺基团反应而产生的任何席夫碱。因此，醛最终被稳定的化学部分取代，这对于组织水合、挠性和相互作用可能是有益的。当然，其它封端剂可以取代乙醇胺和除了硼氢化钠以外的其它还原剂被使用，并且被本领域的技术人员悉知，其包含在本专利的范围内。本发明方法提供的其它策略是将组织醛氧化成酸，然后使酸基团封端。这可以包括加入1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺氢氯化物(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸酯(硫代-NHS)或乙醇胺。这些新的“封端”基团将减少对钙、磷酸盐、免疫原性因子或其它类似剂的吸引。
在一些方面，稳定剂是还原剂。根据本文提供的方法的“还原剂”是能够将酯转换成酰胺或将亚胺转换成仲胺的任何剂。在各个方面，稳定剂是还原剂，并可以将亚胺转换成仲胺，如在下面反应方案中所示。如下面所示，通过使用合适的还原剂，由封端剂与醛(2)的反应产生的亚胺(4)被还原，以形成仲胺(5)。
亚胺还原：
Figure BDA00002598203300161
在与上述高碘酸盐氧化和封端剂步骤实质上相同的条件下，可以进行亚胺还原。在一些方面，亚胺还原在中性或弱碱性溶液中，在约0℃和约50℃之间的温度下进行约数分钟到若干小时的期间。优选地，pH在约6和约10之间，温度在约4℃和约37℃之间，并且，反应期间在约3和到约8小时之间。在一些方面，反应的完整顺序(complete sequence)是在约24小时内完成。
醛部分(R1CHO)与封端剂的伯胺部分(R3NH2)的反应产生半缩醛胺(hemiaminal)中间体(intermediate)，其通过丢失H2O以可逆方式形成亚胺。在一些方面，生物假体组织分别用封端剂处理和用还原剂处理。分离的亚胺反应产物然后通过合适的还原剂诸如但不限于硼氢化钠被转换成仲胺。
在一些优选方面，生物假体组织用还原剂和封端剂同时处理，以便亚胺形成和水解不稳定性亚胺的还原同时发生，以形成仲胺。在一些优选方面，生物假体组织用封端剂和还原剂同时处理，所述还原剂相对于醛和/或酮对于亚胺是选择性的，所述还原剂诸如但不限于，氰基硼化钠(NaBH3CN)、三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OCOCH3)3)、或其组合。
在一些方面，通过在水性环境中用还原剂处理高碘酸盐氧化的生物假体组织，由氧化和/或化学固定产生的醛直接被还原性地氨化，而不形成中间体亚胺，例如如在Dunsmore等,J Am.Chem.Soc.,128(7):2224-2225(2006)中所描述的。
在具体方面，使用氧化/封端和稳定方案(stabilization scheme)，其涉及用高碘酸盐处理组织，以选择性地断裂碳水化合物的邻二醇，接下来用第二温和的氧化剂诸如亚氯酸钠或过氧化氢处理组织，以将醛转换成酸，然后，用选自N-羟基琥珀酰胺和N-羟基磺基琥珀酰胺的封端剂对酸进行封端，以形成酯；然后，通过碳二亚胺稳定剂诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)的作用将酯转换成酰胺，来稳定封端。
本文还提供用于提高生物假体植入物性能的方法，该方法包括：获得生物假体组织，其中所述生物假体组织是新鲜组织；使生物假体组织去细胞化；用包含戊二醛的固定剂固定所述生物假体组织；使所述组织暴露于初始生物负载还原溶液；至少部分地制备生物假体产品或装置；用第二生物负载还原溶液处理所述至少部分制备的生物假体组织产品或装置，所述第二生物负载还原溶液包含甲醛、乙醇和吐温
Figure BDA00002598203300171
溶液；用高碘酸盐处理至少部分制备的生物假体产品或装置，其中所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，和其中所述邻二醇被高碘酸盐氧化以形成醛；用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包含伯胺，和其中所述伯胺与醛反应以形成亚胺；用还原剂处理所述生物假体组织，其中所述还原剂与所述亚胺反应以形成仲胺；干燥生物假体组织；和用环氧乙烷对所述至少部分制备的生物假体产品或装置灭菌。
本文还提供用于提高生物假体植入物性能的方法，该方法包括：获得生物假体组织，其中所述生物假体组织是新鲜组织；使生物假体组织去细胞化；用包含戊二醛的固定剂固定生物假体组织；使所述组织暴露于初始生物负载还原溶液，至少部分地制备生物假体组织产品或装置；用第二生物负载还原溶液处理至少部分制备的生物假体组织产品或装置，所述第二生物负载还原溶液包括甲醛、乙醇和吐温
Figure BDA00002598203300181
溶液；用高碘酸盐处理所述至少部分制备的生物假体组织产品或装置，所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，其中所述邻二醇被高碘酸盐氧化以形成醛；用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包括伯胺，其中所述伯胺与醛相互作用以形成亚胺；用还原剂处理所述生物假体组织，其中所述还原剂与亚胺相互作用以形成仲胺；干燥和电泳清洗生物假体组织；和用环氧乙烷对所述至少部分制备的生物假体产品或装置灭菌。
本文还提供用于提高生物假体植入物性能的方法，该方法包括：获得生物假体组织，其中所述生物假体组织是新鲜组织；使生物假体组织去细胞化；用包含戊二醛的固定剂固定生物假体组织；使所述组织暴露于初始生物负载还原溶液；至少部分地制备生物假体产品或装置；用第二生物负载还原溶液处理至少部分制备的生物假体组织产品或装置，所述第二生物负载还原溶液包括甲醛、乙醇和吐温
Figure BDA00002598203300182
溶液；用高碘酸盐处理至少部分制备的生物假体产品或装置，所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，其中所述邻二醇被高碘酸盐氧化以形成醛；用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包括伯胺，其中所述伯胺与醛相互作用以形成亚胺；用还原剂处理所述生物假体组织，其中所述还原剂与亚胺相互作用以形成仲胺；干燥和电泳清洗生物假体组织；和用戊二醛对至少部分制备的生物假体产品或装置灭菌。
本文还提供用于提高生物假体植入物性能的方法，该方法包括：获得生物假体组织，其中所述生物假体组织是新鲜组织；使生物假体组织去细胞化；用包含戊二醛的固定剂固定生物假体组织；使所述组织暴露于初始生物负载还原溶液；至少部分地制备生物假体产品或装置；用第二生物负载还原溶液处理至少部分制备的生物假体组织产品或装置，所述第二生物负载还原溶液包括甲醛、乙醇和吐温
Figure BDA00002598203300183
溶液；用高碘酸盐处理至少部分制备的生物假体产品或装置，所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，其中所述邻二醇被高碘酸盐氧化以形成醛；用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包括伯胺，其中所述伯胺与醛相互作用以形成亚胺；用还原剂处理所述生物假体组织，其中所述还原剂与亚胺相互作用以形成仲胺；干燥和电泳清洗生物假体组织；和对至少部分制备的生物假体产品或装置灭菌，干燥和电泳清洗生物假体组织；和用环氧乙烷对所述生物假体组织灭菌。
在各个方面，经历本文提供的方法的生物假体组织可以被一种或多种第二稳定剂预处理，所述第二稳定剂包括但不限于固定剂和/或剥皮剂（skinning agent）。
本发明方法与新鲜的、部分和全部固定的生物假体组织相容。在本文提供的方法中应用的、对于预处理生物假体组织有用的固定剂包括但不限于，醛(例如，甲醛、戊二醛、双醛淀粉、丙烯醛、乙二醛乙醛)、聚缩水甘油醚(例如，Denacol 810)、二异氰酸酯(例如，六亚甲基二异氰酸酯)、碳二亚胺（一种或多种）、和环氧化物(例如，各种Denacols中的任一种及其单个反应种类，包括单、二、三和多官能化的环氧化物)。在一些优选方面，生物假体组织之前被戊二醛固定过，所述戊二醛已经被证明是生理学上相对惰性的并适于固定各种生物学组织，用于随后的外科手术植入(Carpentier,A.,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.58:467-68(1969))。戊二醛预处理的示例性方案提供在实施例1中。用戊二醛或其它固定剂进行固定可以提供各种益处，包括提高的稳定性、提高的耐用性、改进的保存、提高的对蛋白酶剪切的抗性。
在一些方面，生物假体植入物是商业可得的生物假体心瓣膜诸如Carpentier-
Figure BDA00002598203300191
带支架的猪生物假体，Edwards Lifesciences,Irvine,CA、Carpentier-
Figure BDA00002598203300192
围心生物假体，Edwards Lifesciences,Irvine,CA或
Figure BDA00002598203300193
PRIMA无支架动脉生物假体，Edwards Lifesciences AG,Switzerland，其已经根据本文提供的方法被处理过。
在进一步的方面，生物假体组织是从哺乳动物宿主收获的新鲜未固定的异种组织，其根据本文提供的方法被处理并被植入到宿主对象中。
待被处理的组织可以新鲜采集自屠宰场，它可以被洗涤并用各种去细胞化剂(decellurizing agent)预处理，和/或它可以通过固定剂被至少部分固定。在稳定步骤之后，也可以通过去细胞化方法、各种固定方法、生物负载降低、干燥和甘油化(glycerolization)和最终的灭菌步骤处理组织。应该理解，一般地，连续步骤中的一些或所有步骤可以被组合成同时发生的步骤，例如氧化和封端步骤、封端和稳定步骤或所有三个步骤可以一致反应。类似地，一些或所有的前-和后-碳水化合物抗原减少步骤可以被组合成各种同时发生的步骤的较小集合。
一些表面活性剂可根据本发明方法被使用，其包括但不限于，阴离子表面活性剂(例如，月桂酸的酯，包括但不限于十二烷基硫酸钠)、烷基磺酸盐(例如，1-癸烷磺酸钠盐)、非离子表面活性剂(例如，基于聚氧乙烯醚结构的化合物，包括可从Sigma Chemical,St.Louis,Mo.购买的曲拉通（Triton）X-100、114、405和N-101及相关的结构，以及可从BASF Chemicals,Mount Olive,N.J.购买的谱朗尼克（pluronic）和丁炔（tetronic）表面活性剂)、烷基化的苯氧基聚乙氧基醇(例如，NP40、Nonidet P40、Igepal、CA630、水解的/官能化的动物和植物化合物，包括吐温
Figure BDA00002598203300194
80、吐温
Figure BDA00002598203300195
20、辛基衍生物、辛基b-葡糖苷、辛基b-硫代吡喃葡萄糖苷(thioglucopyranoside)、脱氧胆酸盐及其衍生物、两性离子化合物、3-([胆酰胺丙基)]-二甲氨基-1-丙磺酸内盐（3-([3-Cholanidopropyl]dimethylammonio]-1-propanesulfonate）(CHAPS),3-([胆酰胺丙基]-二甲氨基)-2-羟基-1-丙磺酸内盐(CHAPSO))及其混合物(例如，脱氧胆酸盐/曲拉通,Micro-80/90)。
在一些方面，组织被细胞破碎剂处理。细胞破碎剂可以包括低渗盐水，其为0%到.5%的NaCl、非离子、阴离子和/或阳离子去污剂，和表面活性剂，例如，吐温、十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、十四烷基氯化铵和苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)。在一方面，在0%到5%范围的CHAPSO可用作细胞破碎剂。
在一些方面，组织用蛋白水解抑制剂处理，其包括例如Protinin或EDTA。
在一些方面，组织用脂质、磷脂、细胞膜和/或细胞残余提取剂处理。这种提取剂可以包括醇(例如，乙醇、2-丙醇或正葵醇，浓度为1%到100%)；酮(例如，丙酮、甲基·乙基酮)；醚(例如，二乙基醚、四氢呋喃、2-甲氧基乙醇)；表面活性剂和去污剂(例如，吐温十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、十四烷基氯化铵、苯扎氯铵)；CHAPSO；或超临界流体(例如，CO2、NO)。
在一些方面，组织用抗-抗原性酶(例如，DNAse、RNAse)处理。
在一些方面，组织用生物负载还原剂处理，其包括抗生素(例如，青霉素、链霉素)；醇(例如，乙醇、2-丙醇、正葵醇，浓度为1%到100%)；醛(例如，甲醛、乙醛、戊二醛l，范围为0%到5%)。
在一个方面，组织用生物负载还原溶液处理，其是甲醛、乙醇和吐温-80(FETs)各自以大约1%/22.5%/.1%浓度的组合。
在一些方面，制造设备被用于至少部分地制备生物假体产品或装置。制造设备可以是适于组装生物假体产品或装置的任何设备。
本领域的技术人员将会理解，适于预处理生物假体组织的各种可选的剂在本领域中是已知的，其可以替代本文指明的那些剂。
现在已经大致描述了本发明，通过参考以说明方式提供的以下实施例，本发明将变得更易于理解，所述实施例并不意图限制公开的发明，除非明确说明。
实施例1
组织预处理
在化学修饰异种生物假体组织中的抗原性碳水化合物之前，可以任选地通过暴露于交联剂和/或表面活性剂来预处理组织。以下非限制性程序提出一种可能的组织预处理方案，其产生被固定的组织。本领域的技术人员将理解，各种可选方法、化学化合物或溶液可以替代那些被指明的。
步骤1：收获/制备生物组织
在屠宰场收获期望的生物组织(从宿主动物手术移除或切下)，放置在冰上并运输到将制造生物假体的地方。然后，一般修整组织并用合适的洗涤溶液诸如盐水溶液、无菌水或碱式盐溶液洗涤。例如，可以冲洗、洗涤收获的组织和/或将其储存于磷酸盐或非磷酸盐缓冲的盐水溶液中，该溶液包含有机缓冲剂，其适于将溶液维持在生理学上相容的pH而对组织没有有害作用。磷酸盐和非磷酸盐缓冲剂均适于组织处理。以下缓冲剂，浓度约为10mM到约30mM，通常适于本文中使用的非磷酸盐缓冲的盐水溶液：乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)、BES(N,N-双[2-羟乙基]-2-氨基-乙烷磺酸)、TES(N-三[羟甲基]甲基-2-氨乙基磺酸)、MOPS(吗啉丙烷磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N’-双[2-乙烷-磺酸])或MES(2-吗啉代乙烷磺酸)。缓冲剂HEPES，pKa为约7.4，非常适于组织处理。有利地，非磷酸盐缓冲的有机盐水溶液的应用通常降低钙在生物假体组织上沉淀的可能性。
在本发明方法中使用的缓冲的盐水溶液还可以包括螯合剂，其优选结合二价阳离子诸如钙、镁、锌和锰。合适的螯合剂的实例包括EDTA(乙烯二胺四乙酸)、EGTA(亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid）)、亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸、柠檬酸或其盐和柠檬酸钠，浓度为约20mM到约30mM。有利地，通过螯合剂去除二价阳离子致使组织较少受到二价离子与可能存在于组织中的磷酸盐离子的自发沉淀的影响。
在一个方面，非磷酸盐缓冲的有机盐水溶液是等渗的，其包括约0.9wt-%盐水、约10mM到约30mM HEPES缓冲液，pH 7.4，和约20mM到约30mM的EDTA。
步骤2：生物组织的戊二醛固定
将收获、修整和洗涤的组织放置在装有0.625%的戊二醛溶液的容器中，所述溶液包含约26ml/l戊二醛(25%)；大约4.863g/l HEPES缓冲液；大约2.65g/lMgCl2.6H2O；和大约4.71g/l NaCl。溶液的余量包括双重过滤的H2O。加入NaOH，调节pH至大约7.4。戊二醛溶液可任选地包含灭菌剂(例如，2%(w/w)乙醇)和/或剥皮剂(例如，1%(w/w)吐温
Figure BDA00002598203300211
80)。当戊二醛溶液含有灭菌剂和/或剥皮剂时，将组织在控制的温度(例如，约20到37℃之间)下温育，同时连续循环溶液，持续约2到24小时，通常约9小时。然后，洗涤组织，并在控制的温度(例如，50+/-5°C)下将其在不含灭菌剂或剥皮剂的戊二醛溶液中温育，同时连续循环，持续约7到14天的期间，以完成戊二醛固定。在整个过程中，允许室内空气包裹或覆盖戊二醛溶液。根据本发明方法制备的戊二醛固定的组织优选在允许组织在110℃下浸入到6N盐酸中5天同时降解最小的条件下被固定。
步骤3：假体的组装/制备
在完成步骤1和2之后，用合适的冲洗溶液诸如缓冲的盐水或0.625%戊二醛冲洗组织。此后，可将组织运输到干净的室内或无菌环境中，进一步修整或塑型(如果需要)并与非生物成分(例如，支架、框架、缝合环、导管、防止缝合线撕裂的聚酯网孔的片段等)组装，以形成期望的可植入生物假体装置。
实施例2
抗原性碳水化合物的选择性化学修饰
如本文所述地，无论组织是否被预处理，化学修饰异种生物假体组织中的抗原性碳水化合物均可以进行。以下非限制性程序示出用于在任一种情况下化学修饰选择抗原性碳水化合物的方法。
在生物假体组织被冲洗和储存后，优选将组织在室温下浸入到等渗缓冲液盐水溶液中约20分钟的期间，同时不断搅拌，所述溶液含有高碘酸盐氧化剂诸如高碘酸钠，浓度约为20mM。
用高碘酸盐氧化剂处理之后，在20%乙醇中充分冲洗组织，以完全去除高碘酸盐，优选在允许较大的溶液与组织体积比的容器中进行，以产生有利的溶质扩散梯度。
然后，将组织浸入到溶液中，所述溶液含有伯胺封端剂和还原剂，适于将组织中的任何游离醛转换成仲胺。在一种方法中，组织在室温下被浸入到等渗缓冲液盐水溶液中约10分钟，同时不断搅拌，所述溶液pH为8.5，含有由牛磺酸和异丙基胺50%/50%20mM和10mM硼氢化钠组成的封端/还原溶液。然后，洗涤组织，并且，重复用封端/还原溶液处理组织，总计三次，用封端/还原溶液处理10分钟。
从封端/还原剂溶液中移除生物假体组织，在20%乙醇中冲洗，转移到容器中并充分浸入到磷酸盐缓冲的存储溶液中，该溶液包含0.25%戊二醛、甲醛、乙醇和吐温
Figure BDA00002598203300221
(用HCl和NaOH将pH调至7.4)。此后，将容器密封并放置在烘箱中25到27小时，所述烘箱被加热到终端（terminal）灭菌温度：37.5+/-2.5℃。然后，使容器冷却到室温并储存到植入的时候。
实施例3
用高碘酸盐处理未固定的组织
组织处理
通过以下程序处理牛围心组织(National Beef，项目#192769001,WO#58745266)，以掩盖(mask)抗原。在含有10mM乙醇胺(Alfa Aesar,#36260)，pH 7.0±0.5或10mM牛磺酸，7.0±0.5pH(Sigma,#T0625)的磷酸盐缓冲液中浸泡组织。在两种处理组中，加入高碘酸钠(Sigma,#311448)，以产生20mM溶液，7.0±0.5pH。将来自两个组的组织以以下三种方式之一温育：1)在4℃下摇动18小时(NewBrunswick Scientific,Innova 4230,冷藏培养箱/摇床)；2)在室温下摇动3小时(VWR,Model 1000,轨道摇床)；和3)在37℃下摇动30分钟(VWR,Model 1570,轨道摇床/培养箱)。在处理之后，在0.9%盐水(Baxter,#2F7124)中彻底冲洗组织。然后，在乙醇胺和硼氢化钠(Sigma,#452882)中在室温下温育组织1小时，同时进行摇动。使组织再次在盐水中被彻底冲洗。将一片组织放入10%中性福尔马林缓冲液(LazerScientific,NBF-4G)中，将剩余的组织冰冻在液氮中并储存在-80℃下用于以后分析。
组织化学方法
根据标准石蜡包埋方法处理每一组的组织样品。在中性福尔马林缓冲液中固定组织过夜。然后，通过一系列梯度醇(Harleco,#65347)：70%、80%、95%和100%使组织脱水；并在包埋到石蜡(McCormick Scientific,Para-Plast Plus#502004)中之前，利用组织学组织处理机(Sakura,Tissue-Tek VIP-1000)在二甲苯(EMD Sciences,#XX0060-4)中使组织透明。然后，将每一样品包埋到蜡块(迈尔斯科学包埋站(MilesScientific embedding station))中，并利用旋转切片机(Reichert,HistoStat)以~5μm切片。所得载玻片(Fisher,#15-188-51)在染色前被热固定过夜。
针对a-半乳糖的存在，通过标准H&E方法和免疫组织化学将每一载玻片的组织染色。通过在二甲苯中温育去除石蜡，并通过一系列梯度醇：100%、95%、80%和水再水合。对于H&E，用Gill改良的苏木精(Harleco,#65065)将载玻片染色，接下来在曙红焰红（Eosin Phloxine）(ENG Scientific,#8923)中染色。染色之后，使载玻片脱水并装好(Fisher封片剂(permount),#SP-15)。将用于免疫组织化学的载玻片在37℃下，于在PBS中在结合Alexa Fluor 488的同工凝集素-GS IB4(1:500,Invitrogen,I21411)中温育2小时。
结果
使新鲜的、未固定组织经历高碘酸盐处理，该组织用本文所述的方法处理或未处理(氧化剂诸如高碘酸盐、封端剂和还原剂)。图2显示在NexGen处理未固定组织后，α-Gal表达的免疫组织化学。图2A显示根据本文所述的方法处理的新鲜的、未固定组织。图2B显示仅用高碘酸盐处理的新鲜的、未固定组织。与仅用高碘酸盐处理的对照组织相比，根据本文所述的方法对新鲜的、未固定组织的组合处理完全抑制α-Gal抗体与组织的结合。
图3显示在用各种类型高碘酸盐溶液处理的未固定组织上α-Gal表达的免疫组织化学。图3A显示用内部(in-house)去细胞高碘酸盐处理的未固定组织。图3B显示用Lifenet去细胞高碘酸盐处理的未固定组织。图3C显示用其它商业去细胞高碘酸盐处理的未固定组织。
实施例4
用高碘酸盐处理固定组织
组织处理
通过分离获得Thermafix(热处理之后的组织固定；TFX)处理的围心组织。在浸泡到含有10mM乙醇胺(Alfa Aesar,#36260)和20mM高碘酸钠(Sigma 311448)或10mM牛磺酸(Sigma,#T0625)和20mM高碘酸钠的磷酸盐缓冲液之前，以0.9%盐水(Baxter,#2F7124)冲洗组织三次。将两个组的组织均在室温下温育3小时，同时进行摇动(VWR,Model 1000,轨道摇床)。处理之后，在0.9%盐水中彻底冲洗组织。然后，将组织在0.06%乙醇胺和0.25%硼氢化钠(Sigma,#452882)中，在室温下温育1小时，同时摇动。在盐水中再次彻底冲洗组织。将每一组的组织存储在0.625%戊二醛(EW#400611)中，并且，将剩余组织在75%丙三醇(JT Baker,#4043-01)/25%乙醇(EMD,#EX0276-3)中在室温下温育1小时。然后，将组织放在吸水垫上，以去除过多的丙三醇溶液。将每一组的一片放入到10%中性福尔马林缓冲液(Lazer Scientific,NBF-4G)中。
组织化学方法
根据标准石蜡包埋方法处理每一组的组织样品。组织在中性福尔马林缓冲液中固定过夜。然后，通过一系列梯度醇(Harleco,#65347)：70%、80%、95%和100%使组织脱水，并在包埋到石蜡(McCormick Scientific,Para-Plast Plus#502004)中之前，利用组织学组织处理机(Sakura,组织-Tek VIP-1000)在二甲苯(EMD Sciences,#XX0060-4)中使组织透明。然后，将每一样品包埋到蜡块中(迈尔斯科学包埋站)，并利用旋转切片机(Reichert,HistoStat)以~5μm切片。所得载玻片(Fisher,#15-188-51)在染色之前被热固定。
针对a-半乳糖的存在，通过H&E方法和免疫组织化学将每一载玻片的组织染色。通过在二甲苯中温育去除石蜡，并通过一系列梯度醇：100%、95%、80%和水再水合。对于H&E，用Gill改良的苏木精(Harleco,#65065)使载玻片染色，接下来在曙红焰红(ENG Scientific,#8923)中染色。染色之后，使载玻片脱水并装好(Fisher封片剂,#SP-15)。根据典型免疫组织化学染色，将用于免疫组织化学的载玻片在溶液中温育，同时用PBS(GBiosciences,#R028)在每一步骤之间进行冲洗；3%过氧化氢(Sigma,#216763)的甲醇(EMD,#MX0475P-1)中15分钟，1%牛血清白蛋白(BSA,Sigma#A7030)的PBS和吐温20(VWR,BDH4210)中30分钟，结合生物素的同工凝集素-GS IB4(1:2000,Invitrogen,I21414)的PBS在室温下1小时，Vectastain ABC剂(Vector Laboratories,PK-1600)30分钟，和二氨基-联苯胺(DAB)试剂盒(KPL#54-10-00)少于3分钟。用苏木精(Harleco,#65065)对组织进行复染1分钟，并在安装到封片剂(Fisher,SP-15)中之前在醇系列中脱水。
结果
使固定组织进行TFX，组织用高碘酸盐处理或未处理和/或用硼氢化钠和乙醇胺或牛磺酸封端或未封端。
图4显示用戊二醛固定的组织具有严重的自身荧光。显示的组织被TFX和高碘酸盐处理。同工凝集素染料被用于染色。
通过甲醛生物负载还原方法(fBReP)处理TFX组织，然后进行终端液体灭菌（terminal liquid sterilization）(TLS)后储存在戊二醛中。图5显示仅用TFX处理的固定组织上的α-Gal和DNA表达。图5还显示用于该试验的方法的流程图，其也在上面被描述过。棕色染色的存在表明单独的TFX处理不能阻断α-Gal抗体与被固定组织的结合。
使TFX/fBReP组织进行高碘酸盐处理，接下来进行封端，然后存储在戊二醛中。图6显示用TFX和高碘酸盐、封端剂和还原剂对固定组织进行的组合处理。上面的图显示用乙醇胺作为封端剂处理的组织。下面的图显示用牛磺酸作为封端剂处理的组织。棕色染色的不存在表明α-Gal抗体不能在组合处理之后结合固定组织。
对TFX组织进行封端和乙醇/丙三醇干燥，接下来进行环氧乙烷终端气体灭菌。图7显示该处理的结果，还显示用于该试验的方法的流程图，其在上面被描述过。染色的存在表明与封端组合的TFX处理不能阻断α-Gal抗体与组织的结合。
使TFX组织进行高碘酸盐、封端剂、还原剂和干燥处理。图8显示接受这种组合处理的固定组织的结果。上面的图显示用乙醇胺作为封端剂处理的组织。下面的图显示用牛磺酸作为封端剂处理的组织。深色染色的不存在表明α-Gal抗体不能在组合处理之后结合固定组织。
实施例5
组织处理的比较分析
通过ELISA分析，比较不同处理的组织中游离α-Gal的相对水平。通过以下的不同组合处理六个组织样品：固定/非固定；根据本文所述方法的处理(邻二醇氧化、用封端剂处理和用稳定剂处理)；TFX处理；封端、还原和干燥；和仅进行戊二醛处理。被比较的六个组织处理如下：(1)未被固定的牛心包膜；(2)处理A：用邻二醇氧化剂、封端剂和稳定剂处理的、未被固定的牛心包膜；(3)处理B：TFX-处理的牛心包膜；(4)处理C：用TFX处理和邻二醇氧化剂、封端剂和稳定剂的组合处理的牛心包膜；(5)处理D：用封端剂、还原剂处理、然后干燥的牛心包膜；(6)处理E：用邻二醇氧化剂、封端剂和还原/稳定剂和干燥的组合处理处理的牛心包膜；和(7)戊二醛固定的灵长类动物心包膜。
在如上和图9中所述的组织处理之后，每一样品均用同工凝集素-B4进行温育，已知同工凝集素-B4特异地结合α-Gal。在过夜温育之后，利用标准ELISA分析测量保留在溶液中的同工凝集素-B4。具体地，将组织样品切割成小片、冰冻在液氮中并研磨成粉末。将结合生物素的、IB4-同工凝集素(Invitrogen#I21414)和1%BSA(牛血清白蛋白;Sigma#A7030)的溶液加入到研磨组织中并在37℃温育过夜。然后，将样品离心，以使组织片在管底部成为球形，并将上清液转移到新的管中。在加入到板中之前，将样品稀释，用于IB4-同工凝集素定量。
利用1%BSA中的同工凝集素-B4作为标准进行ELISA分析。用合成的a-Gal-BSA(V-Labs,Cat#NGP1334)的碳酸盐缓冲液包被板，于4℃过夜。用含有吐温(0.01%)的PBS洗涤板三次，然后在1%BSA中，在37℃下封闭2小时。标准曲线利用同工凝集素，其被加入到板中，并且将上面稀释的样品以三分之一加入到板中。这些在37℃温育1小时。用PBS-吐温洗涤板三次。将Vectastain底物(Vector Labs,cat#PK-6100)加入到板中，并在室温下温育30分钟。用PBS-吐温洗涤板三次，并仅用PBS洗涤板一次。利用吸出器小心去除残留的PBS。加入Quantablu荧光底物(Pierce,Cat#15169)，并温育板20分钟。然后，加入终止溶液，并且，在读板仪（plate reader）(激发波长：320nm，发射波长：420nm)读板。
保留在溶液中的同工凝集素-B4的浓度被用于计算被处理的组织抑制的全部同工凝集素相对于对照的百分比。图9显示不同处理的组织的体外α-Gal ELISA分析的结果。如图9所示，通过本文所述的方法处理的组织表现出α-Gal和同工凝集素-B4之间结合的显著降低。这些结果表明，本文要求保护的组织处理方法大大降少游离α-Gal表位的量，从而降低被处理组织的抗原性。
实施例6
抗-α-Gal IgG灵长类动物研究
在5只灵长类动物组中进行一系列比较分析，表征抗-α-Gal IgG应答。在毒理学研究服务(MPI Research)进行动物植入。5只短尾猿被用于该研究。如下所述，测试组的不同组合被植入到动物中，以了解对用或不用α-Gal进行的组织处理的免疫应答。6个6mm组织盘(disc)被经肌肉内植入到每只动物的背部。三个盘被植入到一面上，而三个盘被植入到另一面上。在植入之前(基线)收集血液样品(每时间点2ml)，并在植入后5、10、20、45、60、75、90和125天收集血液样品。在第135天终止研究。在干冰上存储血液，并使其凝结。离心每一样品，并将血清转移到预标记的管中并存储在-70℃冷冻机中。
用合成的a-Gal-BSA(V-Labs,Cat#NGP1334)的碳酸盐缓冲液包被板，于4℃过夜。用含有吐温(0.01%)的PBS洗涤板三次，并在37℃下以1%BSA封闭2小时。来自不同猴子和不同时间点的血清以不同稀释倍数涂在板上，一个样品两个。在37℃温育血清1小时。然后以PBS-吐温洗涤板3次。第二抗体，结合HRP的鼠抗-人IgG(Invitrogen,Cat#05-4220;1:1000，在1%BSA中)，被加入到板中，并在室温下温育1小时。用PBS-吐温洗涤板3次和仅用PBS洗涤板1次。通过吸出器去除残留的PBS，并加入邻苯二胺盐酸盐（o-phenylenediaminedihydrochloride）底物(Sigma,Cat#P8806)，并在室温下温育20分钟。加入3M硫酸，以终止溶液，并利用平板读取仪(在492nm)读取板的吸光度。
第一只猴子接收三个戊二醛处理的组织样品和三个TFX处理的组织样品。两种样品类型均在猴子中产生抗-α-Gal反应。之前的试验已经显示戊二醛和TFX-处理的组织的高度钙化(数据未显示)。第二和第三只猴子均接收三个封端的/还原的/干燥的组织样品和三个根据本文所述方法处理的组织样品。观察抗-α-Gal应答。之前的试验已经显示这些类型的处理的组织样品的低钙化(数据未显示)。第四只猴子接收四个根据本文所述方法处理的组织样品和两个灵长类动物组织样品。处理的组织样品和对照均未产生抗-α-Gal应答。第五只猴子接收6个灵长类动物心包膜样品，作为对照。灵长类动物心包膜并不产生抗-α-Gal应答。
图10显示在抗-α-Gal IgG应答分析中，如上详细描述的各种组织处理中的每一个处理自基线起的百分比增长。如图10所示，本发明要求保护的组织处理显著地抑制异种组织样品中的抗-α-Gal应答。
通过这样描述本发明，相同的发明可以以许多方式进行变化，这是显而易见的。这样的变化不应该被看作是对本发明精神和范围的背离，并且，所有这样的修饰对于本领域的技术人员来说是显而易见的，其意图被包含在以下权利要求书的范围内。

Claims (51)

1.提高生物假体植入物性能的方法，所述方法包括：
用氧化剂处理生物假体组织，所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，所述邻二醇被所述氧化剂氧化以形成醛或酸，和
用封端剂处理所述生物假体组织，所述封端剂包含伯胺或醇，其与所述醛或酸结合以形成亚胺、酰胺或酯。
2.权利要求1所述的方法，还包括用稳定剂处理所述生物假体组织，所述剂将所述亚胺转换成仲胺或将所述酯转换成酰胺。
3.权利要求1所述的方法，其中所述抗原性碳水化合物是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)或福斯曼抗原(GalNAc α1,3GalNAc β1,3Gal α1,4Gal β1,4Glc-Cer)。
4.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述抗原性碳水化合物包含α-半乳糖基(α-Gal)表位。
5.权利要求1或2所述的方法，其中所述氧化剂能够相对于构成所述生物假体组织的β-氨基醇和邻二酮基团选择性地氧化所述抗原性碳水化合物的所述邻二醇。
6.权利要求1或2所述的方法，其中所述氧化剂是高碘酸盐或乙酸盐。
7.权利要求6所述的方法，其中所述高碘酸盐是高碘酸钠。
8.权利要求7所述的方法，其中所述高碘酸钠以20nM的浓度被使用，并且其中所述生物假体组织用高碘酸钠在大约25°C下处理约4小时。
9.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述封端剂是R4-M-NH2，其中：
R4是H、C1-6烷基、S(=O)2OR5、C1-6烷氧基或羟基；
M是接头，其中所述接头是C1-6亚烷基；和
R5是H或C1-6烷基。
10.权利要求9所述的方法，其中所述封端剂是胺、烷基胺、羟基胺、氨基醚、氨基磺酸酯或其组合。
11.权利要求9所述的方法，其中R4是C1-6烷氧基。
12.权利要求9所述的方法，其中R4是H。
13.权利要求9所述的方法，其中R4是S(=O)2OR5和R5是H。
14.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述封端剂是乙醇胺、牛磺酸、乙胺或2-甲氧基乙胺。
15.权利要求2所述的方法，其中所述稳定剂是还原剂。
16.权利要求15所述的方法，其中所述还原剂选自硼氢化钠和氰基硼氢化钠。
17.权利要求1或2所述的方法，其中所述生物假体组织在所述封端剂的存在下用所述氧化剂处理。
18.权利要求1或2所述的方法，其中所述生物假体组织在用所述稳定剂处理之前被洗涤，以去除所述氧化剂。
19.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述生物假体组织已经用一种或多种表面活性剂和固定剂进行了处理。
20.权利要求19所述的方法，其中所述固定剂选自醛、二醛、二异氰酸酯、碳二亚胺、光氧化剂和聚环氧化合物。
21.权利要求19所述的方法，其中所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、烷基磺酸盐、聚氧乙烯醚、谱朗尼克或丁炔表面活性剂、和烷基化的苯氧基聚乙氧基醇。
22.权利要求19所述的方法，其中所述生物假体组织已经用戊二醛处理过。
23.权利要求19所述的方法，其中所述生物假体组织已经用表面活性剂和固定剂处理过。
24.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述生物假体植入物是心瓣膜。
25.权利要求24所述的方法，其中所述生物假体组织是牛心包膜或猪主动脉瓣。
26.权利要求25所述的方法，其中所述生物假体植入物是儿童心瓣膜。
27.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述被处理的生物假体组织在人宿主中基本上是非免疫原性的。
28.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述被处理的生物假体组织的所述抗原性碳水化合物在人宿主中基本上是非抗原性的。
29.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述被处理的生物假体组织在人宿主中基本上是非钙化的。
30.权利要求29所述的方法，其中所述人宿主是儿童患者。
31.权利要求1所述的方法，还包括用一种或多种表面活性剂和固定剂处理所述生物假体组织。
32.权利要求31所述的方法，其中所述固定剂是醛固定剂。
33.权利要求32所述的方法，其中所述醛固定剂是戊二醛。
34.权利要求31所述的方法，其中所述固定剂是二酸或具有碳二亚胺(EDC)的二胺。
35.权利要求31所述的方法，其中所述固定剂是双环氧化物。
36.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述生物假体组织是新鲜组织。
37.权利要求1-2任一项所述的方法，还包括用生物负载还原溶液处理所述生物假体组织，所述生物负载还原溶液包含甲醛、乙醇和吐温溶液。
38.权利要求1-2任一项所述的方法，还包括用乙醇和丙三醇干燥所述生物假体组织。
39.权利要求1-2任一项所述的方法，还包括用环氧乙烷对所述生物假体组织灭菌。
40.权利要求1-2任一项所述的方法，还包括用去细胞化方法使所述生物假体组织去细胞化，所述去细胞化方法包括用0.1%SDS处理所述组织、冲洗所述组织和用DNAse处理所述组织。
41.权利要求1-2任一项所述的方法，还包括干燥和电泳清洗所述生物假体组织。
42.权利要求1-2任一项所述的方法，还包括用戊二醛对所述生物假体组织灭菌。
43.权利要求1-2任一项所述的方法，还包括用生物负载还原溶液处理所述生物假体组织，所述生物负载还原溶液包含乙醇和吐温
Figure FDA00002598203200032
溶液。
44.用于提高生物假体植入物性能的方法，所述方法包括如下步骤：
获得生物假体组织，其中所述生物假体组织是新鲜组织；
用包含戊二醛的固定剂固定所述生物假体组织；
用生物负载还原溶液处理所述生物假体组织，所述生物负载还原溶液包含甲醛、乙醇和吐温
Figure FDA00002598203200041
溶液；
用氧化剂处理所述生物假体组织，所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，其中所述邻二醇被氧化剂氧化以形成醛或酸；
用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包含伯胺或醇，其中所述伯胺与醛相互作用以形成亚胺，或与酸相互作用以形成酰胺；以及所述醇与酸相互作用以形成酯；
用稳定剂处理所述生物假体组织，其中所述稳定剂与所述亚胺相互作用以形成仲胺和与酯相互作用以形成酰胺；
用乙醇和丙三醇干燥所述生物假体组织；和
用环氧乙烷对所述生物假体组织灭菌。
45.用于提高生物假体植入物性能的方法，所述方法包括如下步骤：
获得生物假体组织，其中所述生物假体组织是新鲜组织；
使所述生物假体组织去细胞化；
用包含戊二醛的固定剂固定所述生物假体组织；
用生物负载还原溶液处理所述生物假体组织，所述生物负载还原溶液包含甲醛、乙醇和吐温
Figure FDA00002598203200042
溶液；
用氧化剂处理所述生物假体组织，所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，其中所述邻二醇被氧化以形成醛或酸；
用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包含伯胺或醇，其中所述伯胺与醛相互作用以形成亚胺，或与酸相互作用以形成酰胺；和所述醇与酸相互作用以形成酯；
用稳定剂处理所述生物假体组织，其中所述稳定剂与所述亚胺相互作用以形成仲胺和与所述酯相互作用以形成酰胺；
干燥和电泳清洗所述生物假体组织；和
用环氧乙烷对所述生物假体组织灭菌。
46.用于提高生物假体植入物性能的方法，所述方法包括如下步骤：
获得生物假体组织,其中所述生物假体组织是新鲜组织;
用包含戊二醛的固定剂固定所述生物假体组织；;
用生物负载还原溶液处理所述生物假体组织，所述生物负载还原溶液包含甲醛、乙醇和吐温
Figure FDA00002598203200043
溶液；
用氧化剂处理所述生物假体组织，所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，其中所述邻二醇被氧化以形成醛或酸；
用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包含伯胺或醇，其中所述伯胺与所述醛相互作用以形成亚胺，或与酸相互作用以形成酰胺；和所述醇与所述酸相互作用以形成酯；
用稳定剂处理所述生物假体组织，其中所述稳定剂与所述亚胺相互作用以形成仲胺和与所述酯相互作用以形成酰胺；和
用戊二醛对所述生物假体组织灭菌。
47.用于提高生物假体植入物性能的方法，所述方法包括如下步骤：
获得生物假体组织，其中所述生物假体组织是新鲜组织;
使所述生物假体组织去细胞化；
用生物负载还原溶液处理所述生物假体组织，所述生物负载还原溶液包含乙醇和吐温
Figure FDA00002598203200051
溶液；
用氧化剂处理所述生物假体组织，所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，其中所述邻二醇被高碘酸盐氧化以形成醛或酸；
用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包含伯胺或醇，其中所述伯胺与所述醛相互作用以形成亚胺，或与酸相互作用以形成酰胺；和所述醇与所述酸相互作用以形成酯；
用稳定剂处理所述生物假体组织，其中所述稳定剂与所述亚胺相互作用以形成仲胺和与所述酯相互作用以形成酰胺；
干燥和电泳清洗所述生物假体组织；和
用环氧乙烷对所述生物假体组织灭菌。
48.权利要求44-47任一项所述的方法，其中所述氧化剂是高碘酸盐。
49.权利要求44-48任一项所述的方法，其中所述稳定剂是还原剂。
50.权利要求44-49任一项所述的方法，还包括利用制造设备从所述生物假体组织至少部分地制备生物假体产品或装置。
51.用于提高生物假体植入物性能的方法，所述方法包括如下步骤：
获得生物假体组织，其中所述生物假体组织是新鲜组织；
使所述生物假体组织去细胞化；
用包含戊二醛的固定剂固定所述生物假体组织；
使所述组织暴露于初始生物负载还原溶液；
利用制造设备从所述生物假体组织至少部分地制备生物假体产品或装置；
用第二生物负载还原溶液处理所述至少部分制备的生物假体组织产品或装置，所述第二生物负载还原溶液包含甲醛、乙醇和吐温
Figure FDA00002598203200052
溶液；
用高碘酸盐处理所述至少部分制备的生物假体组织产品或装置，其中所述组织表达包含邻二醇的抗原性碳水化合物，并且其中所述邻二醇被高碘酸盐氧化以形成醛；
用封端剂处理所述生物假体组织，其中所述封端剂包含伯胺，并且其中所述伯胺与所述醛反应以形成亚胺；
用还原剂处理所述生物假体组织，其中所述还原剂与所述亚胺反应以形成仲胺；
干燥所述生物假体组织；和
用环氧乙烷对所述至少部分制备的生物假体产品或装置灭菌。
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