KR20210124886A

KR20210124886A - 외과적 이식용 생물 조직의 준비 방법

Info

Publication number: KR20210124886A
Application number: KR1020207036453A
Authority: KR
Inventors: 카타리나 키스; 길례르미 아그렐리
Original assignee: 피＋에프 프로덕츠 ＋ 피쳐스 게엠베하
Priority date: 2019-02-07
Filing date: 2020-02-06
Publication date: 2021-10-15
Also published as: WO2020161243A1; BR112020023977A2; EP3765105A1; EP3693030A1; CN112236175A; JP7448491B2; JP2022519407A; CN112236175B; US20220072202A1

Abstract

본 발명은 생물 조직의 처리 방법 및 처리 방법에 의해 수득되는 생물 조직에 관한 것으로, 보다 상세하게는 석회 침착, 심막 상의 유착성 생물막 발생 위험 및 처리로 인한 조직의 강도 저하를 억제하기 위한 생물 조직의 처리 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물 조직을 함유한 생체인공삽입물 및 경도관 심장 판막에 관한 것이다.

Description

외과적 이식용 생물 조직의 준비 방법

본 발명은 생물 조직 (biological tissue)의 처리 방법 및 처리 방법에 의해 수득되는 생물 조직에 관한 것이며, 보다 상세하게는 석회 침착 (calcification), 심막 상의 유착성 생물막의 발생 위험 및 처리로 인한 조직의 강도 저하를 억제하기 위한 생물 조직의 처리 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물 조직을 함유한 생체인공삽입물 (bioprosthesis) 및 경도관 심장 판막 (transcatheter heart valves)에 관한 것이다.

생물 조직은 심장 판막 및 혈관뿐 아니라 경도관 심장 판막에 대한 인공삽입 대체물을 제조하는데 널리 사용된다. 이는 주 성분으로 콜라겐을 포함하는 결합 조직이다. 이러한 조직들 중에서도 가장 널리 사용되는 조직은 소 심막이다. 심막 조직은 심장 감염에 대한 천연적인 장벽을 제공하고 주변 조직으로의 유착을 방지하는 심장을 둘러싼 주머니이다. 심막은 또한 예를 들어 심장의 과도한 팽창을 방지하고 심장의 올바른 해부학적 위치를 유지시키고 확장기에 좌심실의 압력/부피 비를 제어함으로써, 몇가지 기계적인 역할을 수행한다. 조직의 구조는 심막에 대한 생리학적 환경에서 그리고 인공삽입 장치로서 탑재시 이의 거동을 결정한다.

그러나, 도살장으로부터, 특히 돼지 및 소 사체로부터 수득된 생물 조직은 즉각적으로 분해되기 시작한다. 따라서, 임상 재료로서 생물 조직을 이용할 수 있게 하기 위해, 이러한 열화를 중단시켜야 한다. 목표는 재료의 본래의 구조와 기계적 완전성을 연장시키고, 이들 재료에 기인한 항원 특성을 제거하거나 또는 적어도 중화하는 것이다. 방법은 전형적으로 콜라겐 분자들 간에 새로운 부가적인 화학 결합을 구축하는데 집중한다. 이러한 보조적인 연결이 조직을 보강하여, 조직 본래의 형태를 유지하는 견고하고 강하지만 생존 불가능한 재료를 만들어준다. 이러한 목적으로, 예를 들어 소 또는 돼지 심막 또는 심장 판막과 같은 생물 조직을 화학적으로 처리하여, 이의 기계적 성능과 면역원성 특성은 개선하고, 혈전생성 및 분해는 감소시키고, 무균성은 보존하고, 허용가능한 저장 기간은 연장한다.

이에, 수술하기 전 최소한의 준비로 조직을 의료진이 쉽게 이용가능하게 만드는, 이식용 생물 조직의 처리 방법을 선택하는 것이 매우 중요하다. 이는 실패 가능성을 낮추고, 또한 이식 시간을 단축한다.

생물 조직을 여러가지 방법으로 처리하는 다양한 연구들이 종래 기술 분야의 맥락에서 공지되어 있다. 이러한 맥락에서 다음과 같은 참조 문헌이 참조된다:

US 2008/0102439 A1은, 생물 조직에 글리세롤 및 C1-C3 알코올과 같은 다가 알코올을 포함하는 비-수성 처리액을 접촉시키는 단계, 및 용액-처리된 생물 조직으로부터 처리액의 일부를 제거하는 단계를 포함하는, 외과적 이식에 사용되는 생물 조직, 특히 포유류 조직의 준비 또는 보관에 관한 것이다. 포유류 조직은 심막, 대동맥 및 폐 근 (root) 및 판 (valve), 힘줄, 인대, 피부, 경막 및 복막으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

US 2018/0133365 A1은, 가교제 처리된 동물-유래 콜라겐 섬유 조직 재료를 헹구는 단계, 헹군 조직 재료를 탈수 처리를 위해 비-수성 알코올 용액에 침지하는 단계, 비-수성 알코올 용액으로 탈수 처리된 조직 재료를 점진적인 탈수를 위해 여러가지 농도 구배의 사카라이드 용액에 연속적으로 침지하는 단계, 점진적으로 탈수 처리된 조직 재료를 취하여 건조하는 단계, 건조된 조직 재료를 밀폐 포장하는 단계 및 살균 처리하는 단계를 포함하는, 동물-유래 콜라겐 섬유 조직 재료 건조물의 제조 방법을 소개한다.

US 2011/0300625 A1은, 포유류 유기체로부터 회수한 조직의 단편을 제공하는 단계 및 조직의 단편을 증류수로 수회 헹구고, 조직 단편을 이소프로필 알코올로 추가적으로 헹군 후, 조직 단편을 포르말린 용액 또는 글루타르알데하이드 용액과 접촉시켜 수행되는 조직 단편의 삼투성 충격을 유발하는 단계를 포함하는, 조직, 특히 심막 조직의 준비 방법을 기술한다.

US 5,413,798은 소 심막 재료 및 이렇게 수득한 재료의 인간 의학 및 수의학에서의 이식편 또는 임플란트로서의 용도를 기술한다. 구체적으로, 이 문헌은 심막 조직을 습식-화학 처리하는 단계, 심막 조직을 건조하는 단계 및 심막 조직을 살균 처리하는 단계를 포함하며, 습식-화학 처리가 조직의 표면으로부터 임의의 부착된 지방과 기저막을 분리하고, 조직을 수성 알칼리 용액과 접촉시키고, 조직을 다이소듐 EDTA를 함유한 금속-이온 착화제와 접촉시키고, 조직을 pH 4.5 - 6.0의 수성 완충액과 접촉시키는 것을 포함하는, 소 심막 조직의 처리 방법을 기술하고 있다.

다른 방식으로, WO 01/41828은 생물재료를 항-석회화 처리 용액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 항-석회화 처리 용액이 고급 알코올 용액, 폴리올 용액 및 극성 비-양성자성 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생물재료의 처리 방법을 기술한다.

나아가, US 2001/0023372 A1은 동물 조직 성분을 제공하는 단계, 조직 성분을 글리세롤 또는 이의 유도체와 같은 치수 안정제를 포함하는 수성 처리액으로 처리하는 단계, 처리된 조직 성분을 본질적으로 액체가 결핍된 용기에 보관하는 것을 포함하는, 건조 보관을 위한 조직 성분의 처리 방법을 기술한다.

이에, 이들 전술한 각각의 특허는 임상 용도로 사용하기 전에 건조 보관할 수 있는, 생체인공삽입 장치로서 사용될 수 있는, 생물 조직을 개발하기 위해 수행되었다. 그러나, 전술한 조직 준비 방법과 관련하여 일부 단점들이 있다. 예를 들어, 이식시, 생물 조직, 특히 알데하이드 고정 처리된 조직은 퇴행적인 석회 침전이 발생하기 쉽다. 이식된 조직내 칼슘 포스페이트 미네랄 염의 침전으로 인한, 연질 생물 조직의 석회 침착, 특히 병리학적 석회 침착은 바람직하지 않으며, 석회성 침전물의 침전은 장치의 성능에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 임플란트의 석회 침착은 경직화, 구조적 불안정 및 궁극적으로 장치 고장을 유발할 수 있다.

따라서, 특히 심장 판막 질환으로 인해 매년 전세계적으로 수십만명이 넘는 사람들에게 판막 교체 수술이 필요하므로, 석회 침착에 저항성을 가진 생물 조직을 제공하는 것이 매우 중요하다.

임상적으로 이용가능한 생체인공삽입 심장 판막 대부분은 스텐트-탑재된 글루타르알데하이드-고정된 소 심막 조직으로 구성되어 있다. 글루타르알데하이드 고정은 조직내 콜라겐을 효과적으로 가교하고, 생체인공삽입물의 면역원성 및 혈전성 (thrombogenicity)을 상당한 수준으로 제거한다. 그러나, 생체인공삽입 심장 판막 상당수는 조직 경직 및 파열을 유발하는 판막의 병리학적 석회 침착으로 인해 고장이 발생한다.

따라서, 효능은 개선되고 사용은 용이한 새로운 항-석회 침착 방식을 제공하는 것이 요망되고 있다. 이에, 유해한 효과를 동반하지 않고 또한 보관시 생물 조직의 개선된 기계적 특징을 제공하는, 외과적 이식용으로 사용되는 생물 조직에 항-석회 침착을 부여하는 효과적인 방법이 필요한 실정이다.

이러한 이유로, 본 발명의 과제는 무균 건조 보관, 즉 액체 보존 용액에 침지하지 않고 무균 건조 보관하는데 적합한 생물 조직을 준비하는 새로운 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 과제는 가능한 레디-투-유즈 형태에 가깝게 외과적 이식에 이용가능한 생물 조직을 만드는 새로운 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 과제는 생물 조직의 석회 침착을 감소시키고, 심막 상에 생물막 부착 위험을 낮추고, 생물 조직을 포함하는 생체인공삽입물에 개선된 기계적 특성을 제공하는, 생물 조직의 처리 방법을 제공하는 것이다.

이러한 과제는 청구항 제1항의 특징을 포함하는 방법에 의해 충족된다. 본 발명의 구체적인 구현예는 종속항들에 기술된다.

이와 관련하여, 본 발명은, 제1 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 생물 조직의 처리 방법을 제공한다:

(1) 가교제로 처리된 생물 조직을 식염수 (saline solution)에 침지하는 단계;

(2) 침지한 생물 조직을 과산화수소를 포함하는 수용액과 접촉시키는 단계;

(3) 생물 조직을 PBS 및 EDTA를 포함하는 수용액과 접촉시키는 단계;

(4) 생물 조직을 글리세롤, 에탄올 및 EDTA를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및

(5) 생물 조직을 글리세롤 용액과 접촉시키는 단계.

일 구현예에서, 본 방법은 생물 조직을 70 부피% 이상 농도의 에탄올과 접촉시키는 단계 (3a) 및/또는 (5a)를 더 포함한다.

바람직하게는, 본 방법에 따라 사용되는 가교제는, 예를 들어 0.1 부피% 내지 5.0 부피% 범위에서 선택되는 농도를 가진, 글루타르알데하이드이다.

바람직하게는, 본 방법에 따른 생물 조직은 소 또는 돼지의 심막 또는 심장 판막이다.

유익하게는, 본 방법에 따른 식염수는 0.9 부피%의 염화나트륨을 포함하는 수용액이다.

바람직하게는, 본 방법에 따른 단계 (2)에서 과산화수소의 농도는 0.05 내지 5.0 부피%이다.

바람직하게는, 본 방법에 따른 단계 (4)에서 글리세롤:에탄올의 부피비는 1:5 내지 5:1이다.

유익하게는, 본 방법에 따른 단계 (3) 및 (4)에서 EDTA의 농도는 0.01 중량% 내지 10.0 중량%이다.

또한, 바람직하게는, 본 방법은 (6) 생물 조직을 건조하는 단계, (7) 생물 조직을 패키지에 넣는 단계, (8) 패키지를 밀봉하는 단계, 및 (9) 패키지를 살균 처리하는 단계를 더 포함한다.

더 바람직하게는, 단계 (1) 내지 (9)는 연속적인 방식으로, 즉 차례대로 또는 순차적으로 수행된다.

바람직하게는, 본 방법에 따른 생물 조직을 포함하는 패키지의 살균 처리는 패키지를 산화에틸렌 가스에 노출시킴으로써 수행된다.

또한, 바람직하게는, 본 방법의 단계 (1) 내지 (7)은 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃, 더 바람직하게는 18℃ 내지 22℃의 온도에서 수행된다.

바람직하게는, 본 방법의 단계 (4) 및 (5)는 적어도 60분간 교반 하에 수행된다.

제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 준비된 생물 조직을 포함하는 생물 조직에 관한 것이다.

제3 측면에서, 본 발명은 본 방법에 따라 준비된 생물 조직의 외과적 이식 용도 뿐 아니라 생물 조직의 생체인공삽입물로서 및 경도관 심장 판막으로서의 용도에 관한 것이다.

도 1: 실시예 1-1 내지 1-3의 소 심막 검사 샘플의 석회 침착.
도 2: 소 심막의 주사 전자 현미경 사진 (SEM): (a) 및 (c), SBF 사용을 생략한 경우, (b) 및 (d), 24시간 SBF 용액에 침지.
도 3: 여러가지 준비 단계에서 소 심막 검사 샘플의 인장 강도.
도 4: 건조된 소 심막 샘플에 대해 염색을 이용한 조직학적 평가에 따른 광학 현미경 (비디오 디지털 풀 HD Lite 1080p Tucsen이 장착된 Eclipse E-200 Nikon) 사진.
도 5: 소 심막 표준 샘플에 대해 염색을 이용한 조직학적 평가에 따른 광학 현미경 (비디오 디지털 풀 HD Lite 1080p Tucsen이 장착된 Eclipse E-200 Nikon) 사진.
도 6: 건조된 소 심막 샘플의 주사 전자 현미경 사진 (200x).
도 7: 건조된 소 심막 샘플의 주사 전자 현미경 사진 (3000x).
도 8: 건조된 소 심막 샘플의 주사 전자 현미경 사진 (50000x).
도 9: 건조된 소 심막 샘플의 주사 전자 현미경 사진 (100000x).
도 10: 소 심막 표준 샘플의 주사 전자 현미경 사진 (200x).
도 11: 소 심막 표준 샘플의 주사 전자 현미경 사진 (3000x).
도 12: 소 심막 표준 샘플의 주사 전자 현미경 사진 (50000x).
도 13: 소 심막 표준 샘플의 주사 전자 현미경 사진 (100000x).

제1 측면에서, 본 발명은 생물 조직의 처리 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 방법은 이러한 처리된 조직을 포함하는 외과적 이식용 레디-투-유즈 형태의 생물 조직을 제공한다.

용어 "생물 조직"은 일반적으로 처리된 또는 비-처리된 콜라겐-함유성 생물-유래 인간 또는 동물 재료를 지칭하기 위해 사용된다.

본 발명에서, 동물 생물 조직 재료로서, 특히 가교제로 처리된, 돼지 또는 소 심장으로부터 수득되는, 동물 생물 조직 재료로서 심막 또는 심장 판막을 사용하는 것이 바람직하다. 천연 인간 심장 판막은 대동맥, 승모판, 삼첨판 및 폐동맥판 (pulmonary valve)으로서 식별된다. 심막 조직 또는 심장 판막은 전술한 임의의 천연 판막을 대체하고, 손상된 또는 병에 걸린 심장 판막을 대체하기 위해 사용된다.

이러한 점에서, 본 방법에 따라 생산된 생물 조직은, 유연한 심장 판막엽 (heart valve leaflet)의 본래의 기능을 모방하는, 천연 인간 심장 판막과 매우 비숫한 기능을 가진 "생체인공삽입 장치" 또는 "생체인공삽입물"을 구축하는데 사용된다. 조직 타입의 심장 판막은 또한 살아있는 환자의 심장의 다이나믹 환경에서 수년간 작동하기 위해 표준 및 허용 범위에 맞게 제작하여야 하므로, 제조하기 매우 어렵고 시간이 걸린다.

생물 조직의 주 성분은 콜라겐이다. 콜라겐 분자는 비-나선형의 카르복시 및 아미노 말단으로 종결되는 3중 나선 구조로 배열된 폴리아미노산 체인 3개로 구성된다. 이러한 콜라겐 분자는 조립하여 마이크로피브릴을 형성하고, 이는 다시 피브릴을 형성해 콜라겐 섬유가 된다. 콜라겐성 조직은 숙주 수용자에 이식된 후 빠르게 분해되므로, 임상적인 용도로 사용할 경우 조직의 안정화가 필수적이다. 조직 고정으로도 알려진 조직 가교에 의한 화학적 안정화는 다양한 화합물들을 사용해 달성된다.

가장 전형적으로, 화학적 고정은 콜라겐 분자 상에 제시된 반응성 아미노산 측기와 비가역적이고 안정적인 분자내 및 분자간 화학적 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 반응성 기를 가진 다관능성 분자를 이용한다.

이러한 다관능성 분자들 중 가장 널리 사용되는 것이 지방족 직쇄의 양 말단에 알데하이드를 가진 글루타르알데하이드이다. 글루타르알데하이드의 알데하이드기 및 기타 유사 분자는 생리학적 조건에서 콜라겐 분자의 1차 아민기와 반응해, 재료를 가교한다. 이런 방식으로 수득되는 글루타르알데하이드 가교된 조직은 효소 분해에 대한 증가된 내성을 가지며, 감소된 면역원성 및 증가된 안정성을 나타낸다.

글루타르알데하이드를 이용한 조직 가교는 광범위한 사용에도 불구하고 이와 관련한 일부 문제들이 존재한다. 예를 들어, 알데하이드로 고정된 조직은, 이식시, 퇴행성 석회성 침전, 즉 석회 침착이 생기기 쉽다. 석회 침착은 이식된 조직 내 칼슘 포스페이트 미네랄 염이 부적절하게 침전되는 것으로, 생체인공삽입 장치로서 사용되는 글루타르알데하이드-고정된 생물 조직이 고장나는 가장 중대한 요인이다.

본 발명의 일 구현예는 가교제로 처리된 생물 조직을 식염수에 침지하는 단계를 이용한다.

본원에서, 가교제는, 바람직하게는 생화학적 및 의학적 용도에서 아민-반응성 동종 이관능성 가교제 (amine-reactive homobifunctional crosslinker)로서 사용되는, 글루타르알데하이드이다. 앞서 전술한 바와 같이, 글루타르알데하이드 처리는 세포성 및 세포외 매트릭스 단백질에서 안정적인 가교를 형성하여, 이식편 면역원성을 실질적으로 감소시킨다. 그러나, 이러한 조직은 변형된 기계적 특성, 조기의 기계적 고장, 세포독성 및 면역학적 인지에 대한 불완전한 억제를 보인다. 그 외에도, 글루타르알데하이드-처리된 소 심막에서 심각한 석회 침착도 확인되었다. 글루타르알데하이드 처리에 대한 새로운 대안은 본 발명의 방법에 따른 추가적인 처리, 즉 생물 조직의 석회 침착을 줄일 수 있는 방법에 따른 추가적인 처리이다.

본 발명에서, 가교제는 0.1 부피% 내지 5.0 부피%, 더 바람직하게 0.2 부피% 내지 3.0 부피%, 더 바람직하게는 0.3 부피% 내지 2.0 부피%, 특히 바람직하게는 0.5 부피% 내지 1.0 부피%의 함량으로 사용하는 것이 바람직하다.

이러한 점에서, 제1 단계로서, 생물 조직을 0.9% 염화나트륨 (9.0 g/L)을 포함하는 수성 식염수에 침지한다. 이러한 용액은 또한 정상 염수 (normal saline), 생리 식염수 (physiological saline) 또는 등장성 식염수로 일반적으로 지칭된다.

본 발명의 제2 단계에서, 침지된 생물 조직을 과산화수소를 포함하는 수용액과 접촉시킨다. 바람직하게는, 과산화수소의 농도는 0.05 부피% 내지 5.0 부피%, 바람직하게는 0.1 부피% 내지 3.0 부피%, 더 바람직하게는 0.2 부피% 내지 2.0 부피%이다.

본 발명의 제3 단계에서, 생물 조직을 PBS 및 EDTA를 포함하는 수용액과 접촉시킨다.

본원에서, 용어 "접촉"은 본 발명의 방법에 사용되는 생물 조직의 처리, 침지, 노출 또는 세척을 의미한다.

본원에서, 용어 "PBS"는 인산수소이나트륨, 염화나트륨, 및 일부 제형의 경우, 염화칼륨 및 인산이수소칼륨의 수성 염 용액을 함유한 pH 7.4의 포스페이트 완충화된 식염수 (phosphate buffered saline)를 지칭한다. PBS는 인체의 pH, 삼투압 몰농도 및 이온 농도와 비슷하게 모방하므로, 세포 세척, 조직의 수송 및 희석과 같은 생물학적 및 의학적 이용에 활용된다.

용어 "수용액"은 정제하여 최종 산물에 영향을 미칠 수 있는 오염원이 제거된 물질 또는 화합물과 물을 포함하는 용액을 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서는 증류수, 이차 증류수 또는 탈이온수를 사용한다.

용어 "EDTA"는 금속 이온, 특히 Fe² ⁺/Fe³ ⁺, Al³ ⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Mn² ⁺, Zn² ⁺ 등과 같은 금속 이온을 격리하여 용질로부터 이를 제거함으로써 소위 EDTA-착물을 형성할 수 있는 착화 킬레이트제인 에틸렌다이아민테트라아세트산을 지칭한다.

본 발명에서, 생물 조직, 특히 소 또는 돼지 심막 조직의 미네랄화를 없애는 것으로 입증된 칼슘 킬레이트제를 형성함으로써 용액으로부터 칼슘 이온을 제거하는 것이 특히 중요하다. EDTA는 칼슘 포스페이트 결정으로부터 형성된 하이드록시아파티트 결정의 외부 쉘 상의 칼슘 이온에 결합하여, 조직 재료의 수축을 유발하는, 칼슘 이온을 결정으로부터 킬레이팅하여 제거함으로써, 재료를 탈미네랄화하는 것으로 여겨진다.

그래서, 생물 조직에 EDTA의 처리는, 반응하여 하이드록시아파티트를 형성할 수 있기 전에, 칼슘에 결합함으로써 석회 침착의 진행을 늦춘다. 예를 들어, 생체인공삽입 심장 판막으로서 사용되는 생물 조직의 석회 침착은 임플란트 고장에 기여하는 임상적으로 중대한 문제이기 때문에, 임플란트로서 사용되는 생물 조직 내 칼슘 농도를 줄이는 것이 매우 중요하다. 따라서, 본 발명에서, EDTA 처리는 생물 조직, 특히 소 또는 돼지 심막 또는 심장 판막의 칼슘 농도를 바람직하게는 20%까지, 더 바람직하게는 30%까지, 더 바람직하게는 40%까지, 특히 바람직하게는 50%까지 줄일 수 있다. 나아가, 탈미네랄화를 높이고 인체와의 친화성을 높이기 위해 EDTA를 PBS와 조합하여 사용하는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명에서, 특히 단계 (3) 및 (4)에서, 0.01 중량% 이상, 바람직하게는 0.05 중량% 이상, 더 바람직하게는 0.10 중량% 이상, 더 바람직하게는 0.15 중량% 이상, 및 10.0 중량% 이하, 바람직하게는 8.0 중량% 이하, 더 바람직하게는 6.0 중량% 이하, 더 바람직하게는 5.0 중량% 이하, 더 바람직하게는 3.0 중량% 이하의 농도로 EDTA를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 또한 다이소듐 EDTA를 사용하는 것도 바람직하다.

생물 조직의 석회 침착을 추가적으로 감소시키고 생물 조직을 탈수하기 위해, 본 발명의 4번째 단계에서 생물 조직을 글리세롤, 에탄올 및 EDTA를 포함하는 용액과 접촉시키고, 5번째 단계에서는 생물 조직을 글리세롤 용액과 접촉시킨다. 이후 단계들은 본 발명의 방법에서 이러한 공정의 구현을 기술한다.

생물 조직을 본 발명의 방법의 단계 (1) - (3)에 의해 처리한 후, 글리세롤, 에탄올 및 EDTA를 포함하는 용액 중에 처리한다.

생물 조직 세포 내 및 주변의 인지질이 가장 두드러진 석회 침착 핵생성 부위인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 조직 성분의 제거가 미네랄화, 특히 석회 침착을 낮추는 것으로 제안되었다. 이는 석회 침착을 방지하는 효과적인 전략인 것으로 여러가지 연구들에서 입증되었다. 에탄올 또는 글리세롤 또는 에탄올과 글리세롤의 혼합물과 같은 유기 용매를 이러한 목적으로 유사하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 적어도 70% 에탄올, 바람직하게는 적어도 80% 에탄올, 더 바람직하게는 적어도 90% 에탄올을 처리하여, 조직으로부터 인지질을 추출하고, 동시에 생체인공삽입물의 콜라게나제 내성을 높이는 콜라겐 구조 변화가 유발된다. 따라서, 에탄올 처리는 생체인공삽입물로부터 인지질과 콜레스테롤을 거의 모두 추출할 수 있어, 생물 조직 세포의 석회 침착을 없앤다. 아울러, 에탄올 처리는 용액으로부터 인지질과 콜레스테롤의 흡수를 또한 방지한다. 글리세롤이 생물 조직을 고정하는 방법이 완전히 파악된 것은 아니지만, 98% 농도, 바람직하게는 99% 농도가 조직을 보다 생체적합하고 석회 침착에 저항하게 만들도록 생물 조직을 처리하는데 충분하다.

이런 점에서, 본 발명에서, 생물 조직을 글리세롤, 에탄올 및 EDTA를 포함하는 용액에 적어도 60분, 바람직하게는 적어도 75분, 더 바람직하게는 적어도 90분간, 실온에서, 특히 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃, 더 바람직하게는 18℃ 내지 22℃의 온도에서, 500 rpm 이하, 바람직하게는 300 rpm 이하, 더 바람직하게는 50 rpm 이하로 교반 하에 처리하는 것이 바람직하다. 이 기간 중에, 생물 조직, 특히 심막 조직에 존재하는 물 분자 대부분이 글리세롤로 대체된다.

아울러, 본 발명에서, 글리세롤:에탄올의 부피비가 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 더 바람직하게는 1:4 내지 4:1, 더 바람직하게는 1:3 내지 3:1, 더더 바람직하게는 1:2 내지 2:1인, 글리세롤과 에탄올의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.

그런 후, 추가적인 탈수 처리를 위해, 생물 조직을 용액에서 꺼내, 글리세롤에 적어도 60분간, 바람직하게는 적어도 75분간, 더 바람직하게는 적어도 90분간, 실온에서, 특히 10℃ 내지 25℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃, 더 바람직하게는 18℃ 내지 22℃의 온도에서, 500 rpm 이하, 바람직하게는 300 rpm 이하, 더 바람직하게는 50 rpm 이하로 교반 하에 둔다.

또한, 본 발명에서, 생물 조직을 적어도 70 부피%, 바람직하게는 적어도 80 부피%, 더 바람직하게는 적어도 90 부피% 농도의 에탄올과 접촉시키거나 또는 이것으로 헹구는 부가적인 단계를 적용하는 것이 바람직하다. 부가적인 단계는, 특히 단계 (3a)에서, 바람직하게는, 생물 조직을 글리세롤, 에탄올 및 EDTA를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계에 앞서 수행된다. 생물 조직을 글리세롤과 접촉하는 단계 후 그리고 생물 조직을 건조하는 단계 전에, 생물 조직을 에탄올과 접촉시키는 또 다른 부가적인 단계 (5a)를 수행하는 것이 더 바람직하다. 단계 (3) 또는 (4)에서와 동일한 농도를 가진 에탄올 및 EDTA의 혼합물을 사용해 부가적인 단계 (3a) 및/또는 (5a)를 수행하는 것이 보다 더 바람직하다.

생물 조직을 용액에서 꺼내, 주변 공기 또는 불활성 분위기, 예를 들어 질소에, 조직 특성에 악영향을 미치지 않는 습도 및 실온에서 노출한다. 바람직하게는, 건조는 청정실에서 주변 조건 하에 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 16시간, 더 바람직하게는 적어도 20시간 동안 수행된다. 더 바람직하게는, 건조는 고성능 입자 공기 (HEPA) 필터 하에, 특히 청정실에서 HEPA 조건 하에 수행된다. 본원에서, 용어 "주변 조건"은 10℃ 이상, 바람직하게는 12℃ 이상, 더 바람직하게는 14℃ 이상, 특히 바람직하게는 18℃ 이상, 바람직하게는 25℃ 이하, 더 바람직하게는 23℃ 이하, 더 바람직하게는 22℃ 이하인 주변 온도를 의미한다. 또한, 본 발명에서, 전술한 주변 조건에서 단계 (1) 내지 (7)을 각각 수행하는 것이 바람직하다.

처리 및 건조된 생물 조직은 이후 향후 외과적 이식을 위해 본질적으로 액체가 없는 용기 또는 패키지에 포장한다. 본원에서, 용어 "본질적으로 액체가 없는"은 물 또는 기타 성분의 존재가 대략적으로 주변 공기 중의 이들 물질의 함유량으로 제한되는 비-유체 환경 (non-fluid environment)을 의미한다.

바람직한 한가지 방법은 산소 수준을 최소화하기 위해 패키지에 진공을 적용하는 것이며, 이는 부가적으로 질소와 같은 불활성 기체의 백필 (backfill)을 활용할 수 있다. 이러한 무균 포장 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다.

포장된 처리 조직은 이후 기체 살균 처리에 의해 또는 이온화 방사선 (ionizing radiation)에 노출하여, 살균 처리할 수 있다. 챔버가 살균 처리 후 무균성을 유지하도록 하기 위해, 패키지 부재는 박테리아 및 진균과 같은 미생물이 침투할 수 없는 재료로 제작된다. 조직 또는 이러한 장치를 수용한 생체인공삽입 장치를 챔버에 배치 및/또는 살균 처리한 후, 챔버를 밀봉한다.

이온화 방사선 또는 살균 기체, 특히 산화에틸렌 기체에의 노출에 의한 살균 처리는 당해 기술 분야의 기술에 속한다. 바람직한 구현예에서, 생물 조직은 생물 조직을 살균 기체, 특히 산화에틸렌 기체 (ETO)에 노출시켜 살균 처리한다. ETO 방법에 의한 살균 처리는 일반적으로 37℃ 내지 55℃의 온도에서, 산화에틸렌 10%를 포함하는 기체 혼합물에서 적어도 60분간 수행된다.

수득되는 생산물은 실질적으로 무균성이며, 밀봉된 이식가능한 조직은 실질적으로 건조된 형태로 존재한다. 임의의 수많은 질환 또는 병태를 치료하기 위해 인간 환자에게 외과적으로 이식하는데 특히 매우 적합하다. 외과적 이식하기 전에, 생물 조직을 패키지에서 꺼내고, 선택적으로 조직 성분은 수용액, 바람직하게는 무균 수용액에 노출시켜 재수화한다. 조직은 생리 식염수와 같은 무균 용액에 여러번 침지하여 재수화할 수 있다. 조직내 글리세롤 및 에탄올은 식염수에 의해 쉽게 세척할 수 있다.

기술된 방법은 본질적으로 환자에게 외과적 이식하기 위해 준비된, 즉 소위 레디 투 유즈 형태인, 치수 안정성을 가진 생물 조직을 제공해준다.

본 발명의 방법에 따라 처리된 생물 조직은 전형적으로 이의 수화된 원본 크기의 95% 이상, 더 바람직하게는 97% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 크기로 회복될 것이다. 그 결과, 본 발명의 방법에 따라 준비된 생물 조직은 이식가능한 생체인공삽입 장치, 특히 경도관 심장 판막으로서 외과적 이식에 즉시 사용가능하다.

아울러, 본 발명에서, 생물 조직으로서 심막 또는 심장 판막을 이용하는 것이 바람직하다. 즉, 심막 또는 심장 판막 조직은 외과적 이식에 사용하기 전에 본 발명의 방법에 따라 가공 처리할 수 있다. 또한, 본 발명에서, 동물 조직, 특히 돼지 또는 소 심장으로부터 수득한 심막 또는 심장 판막을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 허가된 도축장으로부터 입수한 소 심막을, 본 발명의 방법에 사용하기 전에, 세척, 트리밍 (trimming) 및 글루타르알데하이드를 이용한 가교 처리를 거친다.

본 발명은 또한 생물 조직을 포함하는 생체인공삽입물 및 경도관 심장 판막에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은 청구된 방법에 따라 준비된 생물 조직을 포함하는 생물 조직에 관한 것이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 청구된 방법에 따라 준비된 생물 조직의 외과적 이식 용도 및 생체인공삽입물 및 경도관 심장 판막으로서 생물 조직의 용도에 관한 것이다.

본원에서, 용어 "생체인공삽입물"은 인간에게 이식하기 위해 사용되는 가공된 생물 조직으로부터 유래되는 장치를 의미한다. 이러한 장치의 개발은 기계적 심장 판막의 초기 개발과 관련한 일부 임상 합병증을 회피하기 위한 시도에서 기원하여, 다양한 용도의 생체인공삽입 장치의 급속한 확산으로 이어졌다. 현재 사용 중이거나 또는 개발 중인 일부 생체인공삽입물의 예로는 심장 판막, 혈관 그래프트, 바이오하이브리드 혈관 그래프트, 인대 대체물, 심막 패치 (pericardial patch) 등이 있다.

하기 실시예는 단순히 예시하기 위한 것이며, 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다:

실시예 1-1

소 심막 "샘플 180702-1" (P+F Brasil, EDQM certified)로부터 선택된 생물 조직 1x1cm 크기의 멤브레인 40개를, 먼저 0.625% 글루타르알데하이드 용액 (P+ F GmbH/ Biocollagen)에서 꺼내, 차가운 0.9% 식염수 (JP Pharma)에 3분간 침지하였다. 침지한 조직을 0.5 부피%의 과산화수소 (Sigma-Aldrich)에 60분간 침지하였다. 다음 단계로, 조직을 차가운 (10℃) PBS pH 7.4 및 0.5 중량% EDTA (Sigma-Aldrich)와 3분간 접촉시켰다. 조직을 99 부피%의 에탄올 (Sigma-Aldrich)에 22℃에서 60초간 강하게 교반하면서 침지한 다음, 글리세롤/에탄올 (50/50) 및 0.5 중량% EDTA (Sigma-Aldrich) 혼합물에 느리게 교반하면서 60분간 22℃에서 침지하였다. 아울러, 조직을 글리세롤 99% (Sigma-Aldrich)에 22℃에서 120분간 느리게 교반하면서 침지하였다. 그 후, 조직을 앱솔루트 에탄올 99 부피% (Sigma-Aldrich) 및 0.5 중량% EDTA에 22℃에서 60초간 강하게 교반하면서 침지하였다. 마지막으로, 조직에 대해 HEPA 여과한 공기 주입 하에 18℃에서 18시간 동안 용매 증발 공정을 수행하였다. 그런 후, Sterium Company에서 조직을 더블 Tyvek 파우치에 포장하고, ETO 살균 처리 (55℃, 4시간 ETO 노출)하였다.

실시예 1-2

소 심막 "샘플 180702-2"로부터 선택한 생물 조직 1x1cm 크기의 멤브레인 40개를 실시예 1-1에 기술된 공정에 따라 준비하였다.

비교예 1-3

소 심막 "샘플 180803-1"로부터 선택한 생물 조직 1x1cm 크기의 멤브레인 40개를 0.625% 글루타르알데하이드 용액 (P+ F GmbH/ Biocollagen)에서 꺼내, 추가적인 처리없이 비교예로 사용하였다.

실시예 1-4

실시예 1-1 내지 1-3의 소 심막 멤브레인 (샘플 번호: 180702-2 및 180702-1은 본 발명에 따른 것이고, 180803-1은 비교예임)을 식염수에 2분간 침지한 다음, 생리학적 조건과 동일한 pH 및 온도 (pH7.4 및 36.5℃)에서 유지되는, 표 3에 나타낸 바와 같이 인간 혈장과 비슷한 이온 농도를 가진 용액인 인공 체액 (Simulated Body Fluid, SBF)에 침지하였다. 침지 시간은 1-30일로 다양하였다.

샘플을 CHDS로 지칭되는 밀폐된 플라스크 전도성 가열 시스템에서 분해시켰다. 0.0 - 20 mg. L^-1 Ca를 함유한 Specsol^® 1000 mg. L^-1 표준 용액으로부터 캘리브레이션 곡선을 작성하였다.

표 1 및 도 1에 제시된 Ca 결정은 방사선 연속 소스로서 Xe 숏 arc 램프가 장착된, ContrAA 300 고 해상도 연속 소스 원자 흡수 분광계 (HR-CS FAAS) (Analytic Jena, Jena, Germany)에서 수행하였다 (도 1에서, Y 축의 기호 ","는 표 1에 따른 포인트로서 해석하여야 하며, 즉 수치 1000,00는 1000 또는 1000.00으로 이해하여야 한다).

소 심막 샘플 (180803-1 글루타르알데하이드 보존 처리됨)에 대해 전계 방사형 주사 전자 현미경 (FESEM) (JEOL, model 7500F)을 사용해 주사 전자 현미경 (SEM) 검경을 수행하였다: (a) 및 (c), SBF 처리 생략, (b) 및 (d), SBF 용액에 24시간 침지 (도 2 참조).

일	180803-1 Ca mg/kg	180702-2 Ca mg/Kg	180702-1 Ca mg/kg
0	342.44	170.95	114.17
1	951.35	1009.33	1095.72
2	1032.68	871.74	958.13
3	1080.46	719.87	806.27
4	1046.86	879.55	965.94
5	1088.43	974.26	1060.65
10	973.81	846.86	933.25
15	2703.91	2151.70	2165.84
20	5887.85	3607.95	3623.10
25	9100.73	4145.59	4186.11
30	7812.76	4123.35	4193.58

실시예 2-1

소 심막 (P+F Brasil)으로부터 선택되고 글루타르알데하이드 (Sigma-Aldrich, 0.625 부피%) 존재 하에 고정 처리된 생물 조직 75 유닛을 차가운 0.9% 식염수 (JP Farma)에 둔 후, PBS (Sigma-Aldrich) pH 7.4 및 EDTA (Sigma-Aldrich, 0.2 중량%)를 포함하는 수용액에 3분간 둔 다음 에탄올 (Sigma-Aldrich, 70 부피%)로 헹구었다. 침지한 조직을 에탄올에 주변 온도에서 약 1분간 침지하였다. 다음 단계로, 조직을 글리세롤 (Sigma-Aldrich, 99%), 에탄올 및 EDTA 혼합물 (70% 글리세롤, 29.8% 에탄올 및 0.2% EDTA 용액)과 주변 온도에서 적어도 90분간 접촉시켰다. 조직을 글리세롤에 적어도 90분간 교반하면서 침지한 다음 에탄올로 헹군다. 그 후, 용액에서 조직을 조심스럽게 꺼내, 공기 중에 건조시켰다. 16시간 건조한 후, 재수화 및 기계적 안정성에 대해 조직을 검사하였다.

재료의 기계적 특성, 특히 인장 강도를 유니버셜 테스팅 머신 (Oswaldo Filizzola, model AME-2kN)을 이용한 변형-응력 평가로 검사하였다. 여러가지 준비 단계에서 소 심막 검사 샘플의 인장 강도를 도 3에 나타내며, 여기서 그룹 1은 표준 심막이고, 그룹 2는 건조한 심막이고, 그룹 3은 건조한 후 재수화한 심막이다.

실시예 2-2

소 심막 (P+F Brasil)으로부터 선택되고 글루타르알데하이드 (Sigma-Aldrich, 0.625 부피%) 존재 하에 고정 처리된 생물 조직 04 유닛 (직경 130 mm 크기의 원형 패치 4개)을 차가운 0.9% 식염수 (JP Farma)에 둔 후, PBS (Sigma-Aldrich) pH 7.4 및 EDTA (Sigma-Aldrich, 0.2 중량%)를 포함하는 수용액에 3분간 둔 다음 에탄올 (Sigma-Aldrich, 70 부피%)로 헹구었다. 침지한 조직을 에탄올에 주변 온도에서 약 1분간 침지하였다. 다음 단계로, 조직을 글리세롤 (Sigma-Aldrich, 99%), 에탄올 및 EDTA 혼합물 (70% 글리세롤, 29.8% 에탄올 및 0.2% EDTA 용액)과 주변 온도에서 적어도 90분간 접촉시켰다. 조직을 글리세롤에 적어도 90분간 교반하면서 침지한 다음 에탄올로 헹구었다. 샘플을 Atomic Absorbance Spectrometry ContrAA 300 (Analytik Jena, Jena, Germany)로 분석하였다. 표 2는 글루타르알데하이드 보존 처리된 표준 소 심막에 대한 샘플의 칼슘 함량을 보여준다.

샘플	Ca 농도 (g/Kg)	Ca 농도 (ppm)
건조된 형태	0.0652	65.2
글루타르알데하이드	0.1452	145.2

심막 샘플의 칼슘 흡착을 비교하기 위해, 건조된 심막 샘플과 표준 심막 샘플을 인간 혈장과 비슷한 표 3에 따른 이온 농도를 가진 인공 혈액 (SBF)에 인큐베이션하였다.

	Na⁺	K⁺	Ca² ⁺	Mg² ⁺	HCO₃ ² ^-	Cl^-	HPO₄ ² ^-	SO₄ ^2-
SBF (mg/L)	213.0	7.5	3.8	2.3	6.3	223.0	1.5	0.75

샘플을 SBF 중에 24시간 인큐베이션한 다음 원자 흡수 분광측정으로 분석하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.

샘플	Ca 농도 (g/Kg)	Ca 농도 (ppm)
건조된 형태/SBF	0.5446	544.6
글루타르알데하이드/SBF	0.8251	825.1

실시예 2-3

소 심막 샘플을 건조 공정 처리 후 콜라겐 섬유 보존성을 조사하기 위해 염색으로 콜라겐 섬유의 온전성을 조사하였다. Eclipse E-200 (Nikon)과 비디오 디지털 풀 HD Lite 1080p (Tucsen)를 사용해 사진을 촬영하였다. 그 결과를 글루타르알데하이드 보존 처리된 표준 샘플과 비교하였다. 실험은 도 4 (건조된 소 심막) 및 도 5 (표준 소 심막)에 나타낸 바와 같이 여러가지 염색으로 수행하였으며, 여기서 HE는 헤마톡실린을 의미하고, RE는 레조르신-오르세인 (Resorcine-Orcein)을 의미하고, TM은 메이슨의 트리크롬 (Masson's trichrome)을 의미하고, TG는 고모리의 트리크롬 (Gomory's trichrome)을 의미한다 (모든 염색 물질은 Merck 사에서 제공받음).

도 4는 헤마톡실린 및 에오신 (HE, A-A"), 레조르신-오르세인 (RE, B-B"), 말로리의 트리크롬 (TM, C-C") 및 고모리 트리크롬 (TG, D-D")으로 염색한, PF180611-Std 05 멤브레인의 횡단 조직 단편의 현미경 사진 (라이트 필드 현미경 사용 안함)이다. 건조된 소 심막 샘플의 다음과 같은 구성들을 관찰할 수 있다: 두꺼운 콜라겐 섬유 (작은 검정색 화살표), 가로 또는 세로 단면에서의 탄성 섬유 (큰 검정색 화살표), 나머지 세포 핵 (화살촉). 사진에 나머지 혈관 요소는 표현되지 않는다. 스케일은 현미경 사진의 실제 배율이다.

도 5는 헤마톡실린 및 에오신 (HE, A-A"), 레조르신-오르세인 (RE, B-B"), 말로리의 트리크롬 (TM, C-C") 및 고모리 트리크롬 (TG, D-D")으로 염색한, PF180801-3-DRY05 멤브레인의 횡단 조직 단편의 현미경 사진 (라이트 필드 현미경 사용 안함)이다. 표준 소 심막 샘플의 다음과 같은 구성들을 관찰할 수 있다: 두꺼운 콜라겐 섬유 (작은 검정색 화살표), 가로 또는 세로 단면에서의 탄성 섬유 (큰 검정색 화살표), 나머지 세포 핵 (화살촉) 및 나머지 혈관 요소 (큰 헤드와 뾰족한 화살표). 스케일은 현미경 사진의 실제 배율이다.

실시예 2-4

표준 소 심막과 건조된 소 심막의 건조 공정의 항-석회 침착 효과와 콜라겐 구조를, 여러가지 해상도의 주사 전자 현미경 검경으로 평가하였다:

(a) 건조한 소 심막: 도 6: 200x 배율; 도 7: 3000x 배율; 도 8: 50000x 배율; 도 9: 100000x 배율;

(b) 표준 소 심막: 도 10: 200x 배율; 도 11: 3000x 배율; 도 12: 50000x 배율; 도 13: 100000x 배율.

Claims

하기 단계를 포함하는, 생물 조직의 처리 방법:
(1) 가교제로 처리된 생물 조직을 식염수 (saline solution)에 침지하는 단계;
(2) 침지한 생물 조직을 과산화수소를 포함하는 수용액과 접촉시키는 단계;
(3) 생물 조직을 PBS 및 EDTA를 포함하는 수용액과 접촉시키는 단계;
(4) 생물 조직을 글리세롤, 에탄올 및 EDTA를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및
(5) 생물 조직을 글리세롤 용액과 접촉시키는 단계.
제1항에 있어서,
상기 방법이 상기 생물 조직을 70 부피% 이상의 농도의 에탄올과 접촉시키는 단계 (3a) 및/또는 (5a)를 더 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 가교제가 글루타르알데하이드인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물 조직이 소 또는 돼지의 심막 또는 심장 판막인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 식염수가 0.9% 염화나트륨을 포함하는 수용액인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (4)에서, 상기 글리세롤:에탄올의 부피비가 1:5 내지 5:1인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (3) 및 (4)에서, EDTA의 농도가 0.01 중량% 내지 10.0 중량%이거나, 또는 단계 (2)에서 과산화수소의 농도가 0.05 부피% 내지 5.0 부피%인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이 (6) 생물 조직을 건조하는 단계, (7) 상기 생물 조직을 패키지에 넣는 단계, (8) 상기 패키지를 밀봉하는 단계, 및 (9) 상기 패키지를 살균 처리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제8항에 있어서,
상기 생물 조직을 포함하는 패키지의 살균 처리가 상기 패키지를 산화에틸렌 기체에 노출시킴으로써 수행되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항, 특히 제8항에 있어서,
단계 (1) 내지 (5)가 10℃ 내지 25℃의 온도에서 수행되고, 특히 단계 (6) 및 (7)이 10℃ 내지 25℃의 온도에서 수행되는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (4) 및 (5)가 60분 이상 교반하면서 수행되는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따라 준비된 생물 조직을 포함하는 생물 조직.
제12항에 따른 생물 조직의 외과적 이식에서의 용도.
제12항에 따른 생물 조직의 생체인공삽입물 (bioprosthesis)로서의 용도.
제12항에 따른 생물 조직의 경도관 심장 판막 (transcatheter heart valve)에서의 용도.