CN110136774A - 成骨活性多肽的构效评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种成骨活性多肽的构效评价方法，包括以下步骤：步骤一、筛选出具有潜在成骨活性肽；步骤二、构建预备对接多肽配体库；步骤三、获得靶点蛋白晶体结构，移除靶点蛋白晶体结构中的原配体作为靶点受体蛋白；步骤四、将预备对接多肽配体库中的每个多肽靶点受体蛋白分别结合对接，选取结合位点自由能小于第一预设值的多肽，形成稳定结合多肽集群；步骤五、计算多肽集群中氨基酸序列重复出现的次数，筛选出氨基酸序列重复出现次数高于第二预设值的氨基酸序列，并将含有该氨基酸序列的多肽认定为潜在的成骨活性多肽。本发明基于计算机辅助模拟分子对接技术评价多肽的促成骨细胞增殖活性，有效节省鉴定时间和成本，评价结果数据可靠性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物信息学领域，具体是一种成骨活性多肽的构效评价方法。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨质量减少、骨显微结构发生退化、骨脆性增加为特征的全身性机体骨代谢性疾病。临床上，治疗骨质疏松症药物包括利塞膦酸盐、对苯二甲酸、阿仑膦酸、二磷酸盐、唑来膦酸、特立帕肽等，但服用这些药物往往存在诸如食道发炎、恶心、腹痛甚至有罹患生殖系统癌变的副作用，其潜在的毒性和副作用在一定程度上限制了大范围应用。因此，寻找能够促进骨形成和逆转骨结构损伤的更安全、食物源的天然替代品正受到越来越多的关注。
畜禽骨中含有丰富的胶原蛋白(主要为I型，含量约占动物鲜骨重的20％)，胶原蛋白是一种独特的结构蛋白，研究表明补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性，促进钙盐有序沉积，增加骨强度和骨密度，是一种潜在的抗骨质疏松活性肽的理想来源。随着生物信息学的发展及深入研究，越来越多的蛋白质结构及其氨基酸序列得到阐明，这为从原料蛋白中寻找生物活性肽提供了氨基酸序列基础。前期实验室率先从牛骨中分离、纯化制备得到较高纯度的牛骨胶原蛋白肽，并对其氨基酸序列进行结构鉴定，构建了促成骨细胞增殖活性(成骨活性)肽库，依据与靶点蛋白结合力类型、结合位点氨基酸残基个数和种类明确了成骨活性肽氨基酸序列结构特征。
传统成骨活性肽评价方法需对所有的多肽都进行人工合成，然后将所有鉴定得到的多肽分别进行人工合成和体外细胞培养验证，从而筛选获得具有成骨活性的多肽，需耗费大量时间、经济成本较高。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种成骨活性多肽的构效评价方法，其基于计算机辅助模拟分子对接技术评价多肽的促成骨细胞增殖活性，克服传统成骨活性肽评价方法费时、费力、经济成本较高的缺点，有效节省成骨活性肽鉴定时间和人力、物力成本，评价结果数据可靠性高，是一种具有较好的预测和评价成骨活性肽的方法。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种成骨活性多肽的构效评价方法，包括以下步骤：
步骤一、从畜禽的骨胶原蛋白中分离出多肽，然后筛选出具有潜在成骨活性的多肽；
步骤二、将步骤一中筛选出的具有潜在生物活性的多肽构建预备对接多肽配体库，并对预备对接多肽配体库中的多肽进行能量最小化处理；
步骤三、从蛋白质数据库中获得靶点蛋白晶体结构，该靶点蛋白晶体结构能够参与细胞增殖，移除靶点蛋白晶体结构中的原配体作为靶点受体蛋白；
步骤四、以原配体和靶点蛋白晶体结构的结合位点为活性中心，将预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接，计算结合位点自由能，选取结合位点自由能小于第一预设值的多肽，形成稳定结合多肽集群；
步骤五、计算稳定结合多肽集群中氨基酸序列重复出现的次数，筛选出氨基酸序列重复出现次数高于第二预设值的氨基酸序列，并将含有该氨基酸序列的多肽认定为潜在的成骨活性多肽。
优选的是，还包括：
步骤六、将步骤五中获得的潜在的成骨活性多肽通过体外化学合成经HPLC纯化得到纯度大于98％的成骨活性多肽，再进行体外促成骨细胞增殖培养。
优选的是，步骤三中的靶点受体蛋白为表皮生长因子受体。
优选的是，步骤一中筛选时依次分为两次，第一次筛选的条件为：氨基酸数目介于5-25，且多肽分子量介于500-2500Da，且经Mascot评价得分大于40，第二次筛选的条件为：氨基酸数目介于10-25，或者氨基酸序列为GDR、GPA、GP或GA，或者特征氨基酸Gly和Pro丰度分别介于15-35％、10-40％。
优选的是，步骤二中构建预备对接多肽配体库之前对具有潜在生物活性的多肽分别绘制三维结构，能量最小化处理根据CHARMm能量场进行。
优选的是，步骤三中的靶点受体蛋白进行了去水、加氢处理。
优选的是，步骤四中预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接前，先设置了对接活性域中心坐标以及对接的半径，并采用CDOCKER半柔性对接。
优选的是，其中，对接活性域中心的坐标分别为X＝124.403，Y＝75.629，Z＝51.305，对接半径选择15-25之间的任意值；CDOCKER半柔性对接的参数设置如下：Top Hit设置为10，Random Conformations设置为10，Orientations to Refine设置为10，Forcefield设置为CHARMm，其他参数选择缺省值。
优选的是，步骤四中采用CDOCKER半柔性对接后，还获得了预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白的结合力类型，以及结合位点氨基酸残基个数和种类，其中，结合力类型包括氢键、疏水作用、范德华力、离子键作用，结合位点的氨基酸残基包括Ser11、Asn12、Lys13、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Leu325、Val350、Asp355、Phe357、His409。
优选的是，第一预设值为-100kcal/mol。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过计算机模拟分子对接技术主要依据配体与受体的“锁-匙原理”研究二者之间的相互作用方式，其遵循能量匹配和几何匹配的原则。配体与受体相互作用主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等。在执行分子对接过程中，将具有初始三维立体结构的配体放置在受体的活性位点处，根据几何互补及能量匹配的原则，对配体与受体的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角、蛋白骨架等参数进行优化，从而找出配体与受体的最佳结合模式。
本发明克服传统成骨活性肽评价方法费时、费力、经济成本较高的缺点，提供一种基于计算机辅助模拟分子对接技术研究多肽配体分子与受体大分子之间的作用模式和作用机制，有效节省成骨活性肽鉴定时间和人力、物力成本，评价结果数据可靠性高，是一种具有较好的预测和评价成骨活性肽的方法。
本发明对于成骨活性多肽的构效评价方法可简化为筛选具有促成骨细胞增殖活性多肽的程序。本发明的方法还可以预测各氨基酸数目及组成在成骨活性肽中的贡献以及对各氨基酸的序列位置在成骨活性肽中的作用进行分析。
本发明所述方法具有快速、高效、准确评价多肽的成骨活性强弱的优点，可操作性较强、无需大量人力物力投入，可广泛应用于具有成骨活性多肽的评价，为抗骨质疏松活性功能健康食品的开发提供新的理论和数据支撑，不仅可以满足功能健康食品加工企业前期筛查成骨活性肽的需要，还可以为今后其他生物活性肽的构效评价提供有益参考和借鉴。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中筛选出的具有潜在生物活性的多肽的氨基酸序列及所在I型胶原蛋白肽链位置的示意图。；
图2为本发明中的靶点蛋白晶体结构1IVO的三维晶体结构图；
图3为本发明中预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白对接的结合自由能小于-100kcal/mol的多肽中重复序列的肽段(GP-16和GD-18)与表皮生长因子受体EGFR相互作用的示意图；
图4为本发明中预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白对接的结合自由能小于-100kcal/mol的多肽中重复序列(GP-16和GD-18)的肽段体进行外促成骨细胞增殖活性的对比图；
图5为本发明所述方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供一种成骨活性多肽的构效评价方法，其是基于计算机辅助模拟分子对接技术评价多肽的促成骨细胞增殖活性，包括以下步骤，如图5所示：
步骤一、从畜禽的骨胶原蛋白中分离出多肽，然后基于肽段氨基酸序列特征分析初步筛选出具有潜在成骨活性的多肽；本发明选用牛骨，从牛骨胶原蛋白中获得多肽，此过程一般需要加入酶进行处理，然后多肽依次经过两次筛选，第一次筛选的条件是氨基酸数目介于5-25，且多肽分子量介于500-2500Da，且经Mascot评价得分大于40，第一次筛选后能够确保第一次筛选后的多肽都是来自于牛骨，不是来自于酶，第二次筛选的条件为：氨基酸数目介于10-25，或者氨基酸序列为GDR、GPA、GP或GA，或者特征氨基酸Gly和Pro丰度分别介于15-35％、10-40％，第二次筛选后共获得的59条具有潜在生物活性的多肽，包括牛骨胶原蛋白α1链上的多肽和牛骨胶原蛋白α2链上是多肽(如图1所示)；
步骤二、将步骤一中筛选出的具有潜在生物活性的多肽使用Chem BioDraw Ultra14.0软件分别绘制三维结构后构建预备对接多肽配体库，并根据CHARMm能量场对预备对接多肽配体库中的多肽进行能量最小化处理，最后保存为一个完整的.PDB格式文件，为下一步分子对接做前期准备；
步骤三、从蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)中获得靶点蛋白晶体结构(如图2所示，其中虚线框中为EGFR的原配体结构)，该靶点蛋白晶体结构能够参与细胞增殖，移除靶点蛋白晶体结构中的原配体作为靶点受体蛋白；本发明中的靶点蛋白受体为表皮生长因子受体EGFR，PDB ID为1IVO，运用Discovery Studio 2018软件靶点受体蛋白进行了去水、加氢处理；
如表1所示，依次考查CDOCKER，LibDock和LigandFit三种不同对接方式对多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白对接Pose数目和RMSD值，并最终筛选CDOCKER为对接最适算法。CDOCKER是基于CHARMm能量场的一种半柔性的分子对接程序(算法)，通过高温动力学搜索配体分子的柔性构效空间将配体快速、精确的对接到受体的结合位点，然后采用模拟退火对配体各个构象在受体活性位点进行优化，从而提高对接结果的精准性；
表1CDOCKER,LibDock和LigandFit三种不同对接算法下预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白作用方式及RMSD得分
*RMSD，Root-mean-square deviation，均方根偏差
步骤四、以原配体和靶点蛋白晶体结构的结合位点为活性中心，设置了对接活性域中心坐标(X＝124.403，Y＝75.629，Z＝51.305)以及对接的半径(选择15-25之间的任意值，本发明中选择22.248)，并采用CDOCKER半柔性对接，参数设置如下：Top Hit设置为10，Random Conformations设置为10，Orientations to Refine设置为10，Force field设置为CHARMm，其他参数选择缺省值，将预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接，计算结合位点自由能，选取结合位点自由能小于第一预设值(-100kcal/mol)的多肽，形成稳定结合多肽集群；结合位点的自由能越小表明二者结合越紧密、结合体越稳定；
步骤五、计算稳定结合多肽集群中氨基酸序列重复出现的次数，筛选出氨基酸序列重复出现次数高于第二预设值的氨基酸序列，并将含有该氨基酸序列的多肽认定为潜在的成骨活性多肽。第二预设值根据需要自由定义。
步骤六、将步骤五中获得的潜在的成骨活性多肽通过体外化学合成经HPLC纯化得到纯度大于98％的成骨活性多肽，再进行体外促成骨细胞增殖培养。
如表2-3所示，预备对接多肽配体库中的多肽与表皮生长因子受体EGFR的对接能量值(即：结合位点自由能)进行由低到高排序，结合位点自由能介于-29.395～-158.080kcal/mol，其中，GKSGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR与EGFR结合位点自由能最低，仅为-158.080kcal/mol。在结合位点自由能小于-100kcal/mol的多肽中，α1链上鉴定的肽段中有7条肽段含有共同的氨基酸序列GDRGETGPAGPAGPIGPV(GD-18)；α2链上鉴定的肽段中有3条肽段含有共同的氨基酸序列GPSGPAGKDGRIGQPG(GP-16)，这两条重复氨基酸序列(肽段)刚好属于预备对接多肽配体库中的多肽，结合位点自由能分别为98.992kcal/mol和112.205kcal/mol。
表2牛骨胶原蛋白α1链上多肽与EFGR分子对接结果
表3牛骨胶原蛋白α2链上多肽与EFGR分子对接结果
根据CDOCKER energy得分由低到高排序，发现具有GDRGETGPAGPAGPIGPV(GP-18)、GPSGPAGKDGRIGQPG(GP-16)氨基酸序列的多肽对表皮生长因子受体EGFR具有很好的结合能力，对接的结合自由能均小于-100kcal/mol。尤其是发现，Gly位于N端的多肽对表皮生长因子受体EGFR具有更好的结合能力，在对接结合自由能小于-100kcal/mol的多肽链中所占比重最大，达到66％以上。此外，还发现富含GDR、GPA、GP或GA重复氨基酸序列的多肽在对接结合自由能小于-100kcal/mol的多肽链中所占比重最大。表明上述重复氨基酸序列可能是决定多肽成骨活性的关键氨基酸序列。因此，本发明还提供了具有上述重复序列的多肽在制备抗骨质疏松活性功能健康食品中的应用。
对接的结合自由能小于-100kcal/mol的多肽重复序(GD-18、GP-16)对表皮生长因子受体EGFR对接结合力的可视化分析如下：
采用CDOCKER半柔性对接后，还获得了预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白的结合力类型，以及结合位点氨基酸残基个数和种类，其中，结合力类型包括氢键、疏水作用、范德华力、离子键作用，结合位点的氨基酸残基包括Ser11、Asn12、Lys13、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Leu325、Val350、Asp355、Phe357、His409。多肽GP-16、GD-18和表皮生长因子受体EGFR对接相互作用结果见图3，图3中(A)为GP-16与EFGR分子对接3D结构图，(B)为GD-18与EFGR分子对接3D结构图；；A1(B1)、A2(B2)和A3(B3)分别代表氢键、静电作用、疏水作用。结果表明，GP-16与表皮生长因子受体EGFR对接的结合位点为Lys13，Thr15，Gln16，Gly18，Leu325和Asp355；GD-18与表皮生长因子受体EGFR对接的结合位点为Ser11，Asn12，Thr15，Gln16，Leu17，Leu325，Val350，Asp355，Phe357和His409。其中，多肽GP-16、GD-18和表皮生长因子受体EGFR的氨基酸残基对接形成的非键相互作用包括氢键作用、静电作用、疏水作用。GP-16与表皮生长因子受体EGFR的Lys13，Thr15，Gln16，Gly18和Asp355形成11个氢键；GD-18与表皮生长因子受体EGFR的Ser11，Asn12，Thr15，Gln16，Asp355和His409形成9个氢键。这些相互作用位点氨基酸与已经报道的表皮生长因子EGFR具有2个相同的氨基酸结合位点(Val350和Phe357)一致。研究表明，乳铁蛋白肽ENLPEKADRDQYEL与表皮生长因子受体EGFR相互作用位点为Lys13，Leu14，Thr15，Gln16，Tyr45，Leu98，Ser99，His409和Ser418，多肽与乳铁蛋白肽ENLPEKADRDQYEL含有Thr15、Gln16和His409等3个相同对接结合位点，提示二者可能与乳铁蛋白肽ENLPEKADRDQYEL和表皮生长因子EGF具有相同的分子作用机制。
GP-16与表皮生长因子受体EGFR对接的结合位点为Lys13，Thr15，Gln16，Gly18，Leu325和Asp355；GD-18与表皮生长因子受体EGFR对接的结合位点为Ser11，Asn12，Thr15，Gln16，Leu17，Leu325，Val350，Asp355，Phe357和His409。根据多肽结构(氨基酸一级结构决定高级结构)决定其生物活性，对接的结合自由能小于-100kcal/mol的多肽能够与表皮生长因子受体EGFR紧密对接的结构基础可能是该类多肽含有相同氨基酸重复序列(GP-16和GD-18)，与EGFR结合在相同或相似的氨基酸残基，对接形成非键相互作用从而发挥成骨活性。
多肽GP-16、GD-18和表皮生长因子受体EGFR的氨基酸残基对接形成的非键相互作用包括氢键作用、静电作用、疏水作用。GP-16与表皮生长因子受体EGFR的Lys13，Thr15，Gln16，Gly18和Asp355形成11个氢键；GD-18与表皮生长因子受体EGFR的Ser11，Asn12，Thr15，Gln16，Asp355和His409形成9个氢键。对接相互结合的氢键越多，说明多肽与EGFR往往结合力也越强。本发明中，GP-16还与Leu325之间存在烷基疏水作用、与Asp355之间存在静电作用；GD-18肽与Leu17、Leu325、Val350、His409之间存在4个烷基疏水作用，这些相互作用键也有助于多肽GP-16、GD-18与EGFR相互作用结构的稳定。多肽GP-16、GD-18与EGFR结合作用越强，其对成骨细胞增殖的刺激作用(成骨活性)也越强。
对接的结合自由能小于-100kcal/mol的多肽(GP-16、GD-18)重复序列体外促成骨细胞增殖活性验证如下：
选取对接的结合自由能小于-100kcal/mol的多肽重复序列(GP-16、GD-18)进行体外促成骨细胞增殖活性分析，通过体外化学合成经HPLC纯化得到纯度大于98％的活性肽(上述重复氨基酸序列GP-16、GD-18)，进行体外促成骨细胞增殖活性验证,如图4所示,图4中(A)为GP-16，(B)为GD-18(*表示不同处理组间在P＜0.05水平存在显著差异)。结果表明，GP-16、GD-18肽在0.05mg/mL浓度时可显著促进成骨细胞增殖，且呈一定的浓度效应关系，连续培养96h后，成骨细胞增殖率分别高达135.0％和149.2％，提示所构建的分子对接模型、对接评价指标均能够较好预测多肽的成骨(促成骨细胞增殖)活性。
关于序列表中编号1-28为α1链上与EFGR分子对接的多肽序列，编号29为α1链的序列，编号30-60为α2链上与EFGR分子对接的多肽序列，编号61为α2链的序列。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农产品加工研究所
<120> 成骨活性多肽的构效评价方法
<130> CN19B11351A
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<213> 牛骨胶原蛋白
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<213> 牛骨胶原蛋白
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<213> 牛骨胶原蛋白
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995 1000 1005
Pro Gly Asp Lys Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Lys Gly His
1010 1015 1020
Asn Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly His His Gly Asp
1025 1030 1035
Gln Gly Ala Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro
1040 1045 1050
Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Arg Ile Gly Gln
1055 1060 1065
Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Ile Arg Gly Ser Gln Gly Ser
1070 1075 1080
Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
1085 1090 1095
Pro Gly Pro Ser Gly Gly Gly Tyr Glu Phe Gly Phe Asp Gly Asp
1100 1105 1110
Phe Tyr Arg Ala Asp Gln Pro Arg Ser Pro Thr Ser Leu Arg Pro
1115 1120 1125
Lys Asp Tyr Glu Val Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln
1130 1135 1140
Ile Glu Thr Leu Leu Thr Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala
1145 1150 1155
Arg Thr Cys Arg Asp Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser
1160 1165 1170
Gly Tyr Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Asp Ala
1175 1180 1185
Ile Lys Val Tyr Cys Asp Phe Ser Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg
1190 1195 1200
Ala Gln Pro Glu Asp Ile Pro Val Lys Asn Trp Tyr Arg Asn Ser
1205 1210 1215
Lys Ala Lys Lys His Val Trp Val Gly Glu Thr Ile Asn Gly Gly
1220 1225 1230
Thr Gln Phe Glu Tyr Asn Val Glu Gly Val Thr Thr Lys Glu Met
1235 1240 1245
Ala Thr Gln Leu Ala Phe Met Arg Leu Leu Ala Asn His Ala Ser
1250 1255 1260
Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp
1265 1270 1275
Glu Glu Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser
1280 1285 1290
Asn Asp Val Glu Leu Val Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr
1295 1300 1305
Thr Val Leu Val Asp Gly Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gln
1310 1315 1320
Lys Thr Ile Ile Glu Tyr Lys Thr Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro
1325 1330 1335
Ile Leu Asp Ile Ala Pro Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp Gln Glu
1340 1345 1350
Ile Arg Leu Asn Ile Gly Pro Val Cys Phe Lys
1355 1360
Claims (10)
1.成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、从畜禽的骨胶原蛋白中分离出多肽，然后筛选出具有潜在成骨活性的多肽；
步骤二、将步骤一中筛选出的具有潜在生物活性的多肽构建预备对接多肽配体库，并对预备对接多肽配体库中的多肽进行能量最小化处理；
步骤三、从蛋白质数据库中获得靶点蛋白晶体结构，该靶点蛋白晶体结构能够参与细胞增殖，移除靶点蛋白晶体结构中的原配体作为靶点受体蛋白；
步骤四、以原配体和靶点蛋白晶体结构的结合位点为活性中心，将预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接，计算结合位点自由能，选取结合位点自由能小于第一预设值的多肽，形成稳定结合多肽集群；
步骤五、计算稳定结合多肽集群中氨基酸序列重复出现的次数，筛选出氨基酸序列重复出现次数高于第二预设值的氨基酸序列，并将含有该氨基酸序列的多肽认定为潜在的成骨活性多肽。
2.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，还包括：
步骤六、将步骤五中获得的潜在的成骨活性多肽通过体外化学合成经HPLC纯化得到纯度大于98％的成骨活性多肽，再进行体外促成骨细胞增殖培养。
3.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，步骤三中的靶点受体蛋白为表皮生长因子受体。
4.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，步骤一中筛选时依次分为两次，第一次筛选的条件为：氨基酸数目介于5-25，且多肽分子量介于500-2500Da，且经Mascot评价得分大于40，第二次筛选的条件为：氨基酸数目介于10-25，或者氨基酸序列为GDR、GPA、GP或GA，或者特征氨基酸Gly和Pro丰度分别介于15-35％、10-40％。
5.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，步骤二中构建预备对接多肽配体库之前对具有潜在生物活性的多肽分别绘制三维立体结构，能量最小化处理根据CHARMm能量场进行。
6.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，步骤三中的靶点受体蛋白进行了去水、加氢处理。
7.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，步骤四中预备对接多肽配体库中的每个多肽与步骤三中的靶点受体蛋白分别结合对接前，先设置了对接活性域中心坐标以及对接的半径，并采用CDOCKER半柔性对接。
8.如权利要求7所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，其中，对接活性域中心的坐标分别为X＝124.403，Y＝75.629，Z＝51.305，对接半径选择15-25之间的任意值；CDOCKER半柔性对接的参数设置如下：Top Hit设置为10，Random Conformations设置为10，Orientations to Refine设置为10，Force field设置为CHARMm，其他参数选择缺省值。
9.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，步骤四中采用CDOCKER半柔性对接后，还获得了预备对接多肽配体库中的多肽与靶点受体蛋白的结合力类型，以及结合位点氨基酸残基个数和种类，其中，结合力类型包括氢键、疏水作用、范德华力、离子键作用，结合位点的氨基酸残基包括Ser11、Asn12、Lys13、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Leu325、Val350、Asp355、Phe357、His409。
10.如权利要求1所述的成骨活性多肽的构效评价方法，其特征在于，第一预设值为-100kcal/mol。
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