CN108586604A

CN108586604A - 促成骨生物活性肽及其筛选方法

Info

Publication number: CN108586604A
Application number: CN201810631331.3A
Authority: CN
Inventors: 杜明; 石璞洁; 王震宇; 涂茂林; 陈慧; 樊凤娇; 许喆
Original assignee: Dalian Polytechnic University
Current assignee: Dalian Polytechnic University
Priority date: 2018-06-19
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2018-09-28

Abstract

促成骨生物活性肽及其筛选方法，本发明涉及多种促成骨生物活性肽及其筛选方法，它要解决现有预防和治疗骨质疏松的药物长期服用会引起不适反应症状，成本较高的问题。本发明促成骨生物活性肽包含4种多肽。筛选方法：一、配置乳铁蛋白水溶液；二、通过胰蛋白酶进行水解反应；三、离心和超滤；四、对过滤后的酶解溶液进行脱盐处理，冷冻干燥后得到混合促成骨多肽；五、多肽序列鉴定；六、选用半柔性对接中的CDocker方法将鉴定到的多肽与表皮生长因子受体行对接，选取打分函数大于130分的多肽。本发明利用牛乳中的有效成分开发了多种具有明显促进成骨细胞增殖活性的多肽，确定了其中的功效机制，这些多肽对骨质疏松症有较强的预防作用。

Description

促成骨生物活性肽及其筛选方法

技术领域

本发明涉及多种促成骨生物活性肽及其筛选方法。

背景技术

骨骼是人体的重要组成部分，它不仅构成了人体的支架起着保护、支持和运动的作用，还与机体的钙、磷等矿质元素的代谢密切相关。随着现代社会人口寿命的延长，高龄人口不断增加，人类老化的同时，由于骨量丢失、骨微观结构破坏导致的骨质疏松及其骨折发病率逐年上升。骨质疏松症在全球常见病中已上升至第7位，成为人类重点关注的健康问题之一。引起骨质疏松的主要原因是体内分泌激素水平下降，成骨细胞活力降低，破骨细胞活跃，成骨细胞与破骨细胞之间的动态平衡被打破，造成骨缺失和骨组织钙含量下降，从而产生各部位骨折等并发症，严重制约患者的活动。骨质疏松症及其相关性骨折的高发病率、高致残率以及高死亡率不仅严重影响了老年人的生活质量，而且门诊就诊、外科手术和护理等治疗手段会导致高昂的医疗费用，并由此带来巨大的经济和社会健康负担。

目前，传统骨质疏松症治疗药物主要包括骨吸收抑制剂和骨形成促进剂。骨吸收抑制剂主要是通过抑制破骨细胞的形成和活性，从而抑制骨的吸收来减缓骨钙的丢失，但由于骨质疏松症患者通常都会钙吸收不足，若单独应用此类药物则可能造成低钙血症。而骨形成促进剂目前研究较少，主要包括甲状旁腺激素、细胞因子、氟化物和锶制剂等，但其来源有限，靶向性差也限制了其应用。随着现代患者在饮食与健康方面的意识提高，食源性生物活性肽因其具有安全、无毒副作用、价格竞争力强和易于吸收等优点在预防和治疗治骨质疏松领域受到了越来越广泛的关注。

骨质疏松的发病与生活习惯、激素调控及遗传多种因素有关，是多因素共同作用的结果。目前研究学者大都从引起骨吸收和骨形成平衡被打破的因素找起。成骨细胞主要参与骨形成，破骨细胞参与骨吸收，从细胞生物学角度讲，骨平衡就是成骨细胞和破骨细胞在骨成熟过程中的相互制约关系。成骨细胞作为骨形成过程中的最关键的功能细胞，其所分泌的骨基质，在骨重建的过程中是必不可少的，并且成骨细胞的增殖也可以生成丰富的胶原，通过基质钙化的方式生成更多的新的骨组织。此外若成骨细胞的数目减少，生物功能降低，将会导致骨形成的减少，骨密度的降低，骨小梁逐渐变窄，又因为成骨细胞聚集至骨陷窝处的能力减弱，被破骨细胞吸收的骨陷窝无法得到修补，最终导致骨的减少。所以骨质疏松发生的一个很重要的原因是成骨细胞的数量与功能相对不足。近年来通过对雌激素缺乏中后期的深入研究，证实了雌激素缺乏确实抑制了成骨细胞介导的骨形成。通过体外成骨克隆形成实验，发现雌激素缺乏短期内虽然成骨细胞数量有一定增加，但随着后期破骨活性的降低，成骨细胞数量逐渐减少，骨代谢呈现为低转换型。骨质疏松后期分离获得的成骨细胞骨形成能力明显低于正常组。而成骨细胞功能异常导致骨修复和重建减慢，是造成骨质疏松骨形成缺陷的重要原因。

针对以上原因，目前临床上主要采用药物治疗，治疗药物主要分为两类，抑制骨吸收的药物和促进骨形成的药物，主要包括二磷酸盐类、选择性雌激素受体调节剂、降钙素、氟化物以及激素替代疗法等。甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)是维持机体钙磷代谢平衡的一种重要的调钙激素和骨形成促进剂。PTH与受体结合后，通过活化cAMP依赖的蛋白激酶A以及钙离子依赖的蛋白激酶C信号传导途径发挥生物作用。PTH通过促进成骨祖细胞增殖分化、直接抑制成骨细胞调亡延长成骨作用时间、促进成骨细胞转化及刺激成骨细胞产生促进IGF-1和TGF。临床研究表明，PTH可使骨密度增加，再次发生骨折的危险性降低。降钙素是一种由32个氨基酸残基构成的多肽激素，在人体内由甲状腺滤泡旁细胞分泌。降钙素降低血钙的功能是通过其作用于破骨细胞来实现的。降钙素能抑制破骨细胞的活性，减少骨中的Ca²⁺向血液中的释放，从而降低了血液中Ca²⁺的浓度。锶是一种化学性质类似于钙的元素，低剂量的锶对成骨细胞有促进作用和对破骨细胞有抑制作用。锶制剂可以促进成骨细胞分化，阻碍破骨细胞形成，通过促进骨形成抑制骨吸收来増加骨强度，从而使骨交换达到平衡。因此，口服锶制剂对治疗骨质疏松症也是一种有效的方法。

虽然这些药物都能取得较好的效果，但它们的应用都存在一定的限制和并发症，这就影响了它们的长期使用效果。近些年来，内源性的细胞因子对骨质疏松的防治作用受到很多关注。骨形态发生蛋白2(BMP-2)是目前研究比较透彻的促进成骨的细胞生长因子，经过大量研究发现其诱导成骨作用最强，目前已经应用于临床实验。BMP-2可以结合细胞膜表面特异性抗体，促进骨髓间充质干细胞BMSCs等具有成骨潜能的细胞向成骨细胞分化，其在诱导BMSCs成骨方面的作用得到国内外学者一致的认可。但是此类内源性的细胞因子主要是通过基因工程学和分子生物学等技术手段获得，不但其生产设备繁复，而且其制备工艺也相当复杂，因此造成其制作成本高，价格昂贵，难以大规模生产，限制了其在实验及临床中的广泛应用。因而关于提供来源广泛的骨生长因子的研究和产品开发，凸显了重要的意义。

乳铁蛋白(LF)是一种广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中的铁结合糖蛋白。牛乳中LF的浓度约为1.0～3.2mg/mL，其含量仅次于酪蛋白，占普通母乳总蛋白的20％，易于获取。并且有研究表明，LF对成骨细胞的增值有良好的促进作用，且该作用呈剂量依赖关系。另外已有研究报道了LF对体外骨细胞的影响以及局部注射LF对骨细胞的影响和作用机制，Grey等人也研究报道了LF对于鼠前体成骨细胞DNA的合成具有促进作用，说明LF对于成骨样细胞的有丝分裂具有促进作用。这些研究确定了LF是一种新型的骨生长因子，它对成骨细胞和破骨细胞的总作用效果是增加了骨含量，即促进了骨形成又抑制了骨吸收。因此可以作为具有促骨生成活性多肽的原料。

近年来，计算机辅助药物设计领域发展迅速，分子对接是其中一项重要技术。分子对接是依据配体与受体作用的“锁-钥原理”模拟小分子配体与受体生物大分子相互作用。配体与受体相互作用是分子识别的过程，主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华力等。通过计算，可以预测两者间的结合模式和亲和力，从而进行活性物质的虚拟筛选以及机制分析。本发明从提高成骨细胞增殖活性的角度入手，以来源较广的牛LF为原料，通过酶解的方式，获得了一种促成骨生物活性肽，并利用分子对接的方法对其中的有效成分进行了高效筛选与鉴定。该方法条件温和，成本低，副产物少，机制明确，所得产品活性高，消化吸收性强，不会对人体产生副作用，对骨质疏松有较强的预防作用。

发明内容

本发明的目的是要解决现有预防和治疗骨质疏松的药物长期服用会引起不适反应症状，成本较高，且会有一定的毒副作用的问题，而提供促成骨生物活性肽及其筛选方法。

本发明促成骨生物活性肽包含以下多肽，分别为多肽A、多肽B、多肽C、多肽D，其中：

多肽A的氨基酸序列：Glu-Asn-Leu-Pro-Glu-Lys-Ala-Asp-Arg-Asp-Gln-Tyr-Glu-Leu；

多肽B的氨基酸序列：Asn-Leu-Arg-Glu-Thr-Ala-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Arg；

多肽C的氨基酸序列：Lys-Ala-Asn-Glu-Gly-Leu-Thr-Trp-Asn-Ser-Leu-Lys；

多肽D的氨基酸序列：Asn-Leu-Arg-Glu-Thr-Ala-Glu-Glu-Val-Lys。

本发明促成骨生物活性肽的筛选方法按以下步骤实现：

一、乳铁蛋白水溶液的配置：将乳铁蛋白溶于水(pH＝7.0)中，加热至20～30℃处理2～10min，冷却至室温后得到乳铁蛋白溶液；

二、乳铁蛋白酶解液的制备：使用碱性调节剂调节乳铁蛋白溶液体系的pH至8.0～9.0，然后在30～40℃恒温水浴条件下加入胰蛋白酶进行水解反应，灭酶处理后得到酶解液；

三、离心和超滤：对酶解溶液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量1K～3KDa的膜进行超滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、混合多肽粉的制备：对过滤后的酶解溶液进行脱盐处理，经杀菌、冷冻干燥后得到混合促成骨多肽；

五、序列鉴定：对过滤后的酶解溶液进行多肽序列鉴定；

六、功效组分的确定：在Discovery Studio软件中，选用半柔性对接中的CDocker方法将鉴定到的多肽与表皮生长因子受体EGFR(PDB:1IVO)进行对接，选用-CDOCKER_Energy打分函数评定对接结果，选取打分函数大于130分的多肽，作为后续成骨细胞增殖活性验证实验的样品。

本发明促成骨生物活性肽及其筛选方法包含以下有益效果：

1、将来源广泛的乳铁蛋白作为生产防治骨质疏松症药物的原料，解决了目前各种骨生长因子获取较难，价格昂贵的问题，显著降低了生产成本，可满足大规模生产的需要；

2、将生物酶解与分子对接技术结合，达到了高效筛选小分子多肽药物的目的，该方法操作简单，生产条件温和，产品安全性高，机制明确，解决了防治骨质疏松药物开发困难的问题；

3、利用牛乳中的有效成分开发了多种具有明显促进成骨细胞增殖活性的多肽，并确定了其中的功效机制。这些多肽对骨质疏松症有较强的预防作用，解决了目前临床上骨质疏松药物毒副作用大的问题。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式促成骨生物活性肽包含以下多肽，分别为多肽A、多肽B、多肽C、多肽D，其中：

多肽B的氨基酸序列：Asn-Leu-Arg-Glu-Thr-Ala-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Arg；

多肽C的氨基酸序列：Lys-Ala-Asn-Glu-Gly-Leu-Thr-Trp-Asn-Ser-Leu-Lys；

多肽D的氨基酸序列：Asn-Leu-Arg-Glu-Thr-Ala-Glu-Glu-Val-Lys。

本实施方式开发了多种具有促进成骨细胞增殖活性的多肽。以来源广泛的乳铁蛋白为原料，取材容易，安全无副作用，可显著降低生产成本，满足大规模生产的需要。将生物酶解与分子对接技术结合，达到了高效筛选小分子多肽药物的目的，操作简单，生产条件温和，产品安全性高，机制明确。利用牛乳中的有效成分开发了一种具有明显促成骨活性的多肽，对骨质疏松症有较强的预防作用。

具体实施方式二：本实施方式促成骨生物活性肽的筛选方法按以下步骤实施：

一、乳铁蛋白水溶液的配置：将乳铁蛋白溶于pH 7.0的水溶液中，加热至20～30℃处理2～10min，冷却至室温后得到乳铁蛋白溶液；

五、序列鉴定：对过滤后的酶解溶液进行多肽序列鉴定；

六、功效组分的确定：在Discovery Studio 2017软件中，选用半柔性对接中的CDocker方法将鉴定到的多肽与表皮生长因子受体EGFR(PDB:1IVO)进行对接，选用-CDOCKER_Energy打分函数评定对接结果，选取打分函数大于130分的多肽，作为后续成骨细胞增殖活性验证实验的样品。

本实施方式步骤六对于选定的多肽采用从C端到N端的方法进行固相合成。

本实施方式提供了一种预防骨质疏松症的小分子多肽类药物的高效筛选方法，同时以牛乳铁蛋白为原料，开发了多种具有显著效果的促成骨生物活性肽，并明确了其中的功效组分，解决了常规药物副作用高，并发症严重的问题。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中所述的碱性调节剂为NaOH、Na₂CO₃或NaHCO₃。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤二恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％的胰蛋白酶进行水解反应。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是水解反应的时间为0.5～4h。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是步骤二所述的灭酶处理是在100℃下高温处理10min。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是步骤四混合促成骨多肽分子量低于3KDa，质量百分含量占50％～90％。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是步骤四中脱盐处理是过滤后的酶解溶液通过C₁₈-SPE柱脱盐处理。

本实施方式先利用3mL甲醇冲洗SPE柱，再加入3mL0.1％FA-H₂O活化SPE柱。然后加入1.5mL样品进行脱盐处理，最后采用1.5mL甲醇收集样品，氮吹至干燥。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是步骤五采用UPLC-Q-TOF-MS对过滤后的酶解溶液进行多肽序列鉴定。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是过滤后的酶解溶液过C₁₈-SPE柱除盐，然后用质量浓度为0.1％的甲酸-水复溶，过0.22μm除菌膜后进行UPLC-Q-TOF-MS分析，其中UPLC(Ultimate 3000，Dionex，Thermo Fisher Scientific)的条件：采用Phenomenex Luna C₁₈色谱柱(150mm*3.0mm，3.0μm)，流动相A为质量分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为质量分数0.1％的甲酸乙腈，采用从99％的A相到50％A相的梯度洗脱程序，流速0.4mL/min，柱温为45℃，进样量为20μL；Q-TOF-MS条件：飞行时间质谱仪，质谱采用电喷雾电离源(ESI)，正离子模式，质量扫描范围为80～3000m/z，毛细管电压为4.5kv。

本实施方式数据分析选用Mascot数据库。

实施例：本实施例促成骨生物活性肽的筛选方法按以下步骤实施：

一、乳铁蛋白水溶液的配置：将乳铁蛋白溶于pH 7.0的水中，加热至25℃处理5min，冷却至室温后得到乳铁蛋白溶液；

二、乳铁蛋白酶解液的制备：使用碱性调节剂调节乳铁蛋白溶液体系的pH至8.5，然后在37℃恒温水浴条件下加入E/S 5％胰蛋白酶进行水解反应4h，灭酶处理后得到酶解液；

三、离心和超滤：对酶解溶液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量2KDa的膜进行超滤，得到过滤后的酶解溶液；

五、序列鉴定：采用UPLC-Q-TOF对过滤后的酶解溶液进行多肽序列鉴定；

六、功效组分的确定：在Discovery Studio 2017，选用半柔性对接中的CDocker方法将鉴定到的多肽与表皮生长因子受体EGFR(PDB:1IVO)进行对接，选用-CDOCKER_Energy打分函数评定对接结果，选取打分函数大于130分的多肽，作为后续成骨细胞增殖活性验证实验的样品。

本实施例得到的促成骨多肽相关的研究方法如下：

(1)多肽含量的测定：

采用BCA方法对最终多肽混合物粉末进行测定。具体操作步如下：

①配制标准品和工作液：

a.梯度稀释牛血清蛋白(BSA)标准品；

b.按实验所需工作液的体积，将试剂盒中的a液与b液按照50:1的比例进行混合。

②蛋白含量测定：

a.取25μL已稀释的梯度浓度的BSA和待测蛋白质样品，加入到孔板中；

b.每个试管中加入200μL此工作液,使其充分混匀；

c.密封孔板，置于37℃培养箱中孵育30min；

d.将孔板冷却至室温，使用酶标仪测量在波长562nm处样品的吸光值。

③数据分析以在波长562nm处标准品BSA的吸光值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，制作标准曲线，以此计算待测样品蛋白质的浓度。

(2)UPLC-Q-TOF-MS/MS对多肽序列的鉴定：

过C₁₈-SPE柱除盐后的酶解液用0.1％的甲酸-水复溶，过0.22μm除菌膜后进行UPLC-Q-TOF分析。UPLC条件：Phenomenex Luna C₁₈色谱柱(150mm*3.0mm，3.0μm)，流动相A为质量分数0.1％的甲酸水溶液。流动相B为质量分数0.1％的甲酸乙腈。采用从99％的A相到50％A相的梯度洗脱程序，流速0.4mL/min，柱温为45℃，进样量为20μL。Q-TOF-MS条件：飞行时间质谱仪，质谱采用电喷雾电离源(ESI)，正离子模式。质量扫描范围为80～3000m/z。毛细管电压4.5kv；数据分析：Mascot数据库。

(3)分子对接筛选促成骨活性肽：

①准备配体：将质谱搜库结果汇总，构建乳铁蛋白多肽分子库。在DiscoveryStudio 2017软件中，根据乳铁蛋白多肽分子库绘制多肽结构，再使用CHARMm能量场优化，使其能量最小化，制备乳铁蛋白多肽分子结构库，将此多肽结构作为分子对接的配体，在DSReceptor Ligand模块中准备；

②准备受体：在Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/)中下载受体EGFR的晶体结构，将其作为分子对接的受体。在Macromolecules模块中准备蛋白具体过程包括去水、加氢并修补loop环等步骤；

③对接方式的确定：将PDB中EGFR晶体结构中受体与配体分开，重新以CDocker、Libdock以及LigandFit三种对接分别方式进行对接，计算对接成功后的构象与原有构象之间的均方根偏差(RMSD)，选取RMSD值小于1的对接方式，进行后续多肽与受体的对接；

④多肽与受体对接：将所准备的多肽配体分别于EGFR进行对接，对接位点选取EGF与EGFR结合的位点；

⑤计算打分函数并分析结合位点：将对接成功的多肽，通过-CDOCKER_Energy打分函数来计算其与受体蛋白的亲和性，并通过Receptor-Ligand interactions模块对对接结果进行分析，确定其相互作用的主要作用力，并分析各个多肽与受体蛋白EGFR的关键结合位点，并汇总结果。

(4)多肽的成骨活性：

采用MTT法分析多肽对成骨细胞增殖活性的影响，具体实验步骤如下：将成骨细胞消化计数，将细胞浓度调整为每孔l×10⁵个/mL，然后将细胞接种于96孔培养板。在多肽(浓度：100μg/mL)培养72h后进行检测。吸除培养液，用PBS反复清洗除去死细胞，每孔加入含有0.5％MTT的α-MEM 100μL，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育4h。在观察出现黑色网状物后终止孵育，弃去培养液。每孔加入150μL DMSO，振荡10min后用酶联免疫检测仪在波长490nm处测定其吸光值，用OD值表示。

(5)水分测定方法：

①根据GB50093-2010中的水分测定方法进行测定：

实验前将铝称量瓶、离心管在105℃烘箱中干燥过夜，称重前在干燥器中冷却1-2h，称量瓶的重量记为m₁。

②向匀浆机中加入100mL提前预热到30℃的去离子水，再加入3滴消泡剂，然后将4g样品加入其中(精确至0.001g)，将搅拌器转速慢慢调节到1500rpm，搅拌10min。

③立刻取5mL混合液于三个铝称量瓶中，称重记为m₂。将其放入105℃烘箱中直至恒重，称重记为m₃。按下列公式进行计算：水分含量M％＝(m₃-m₁)/(m₂-m₁)*100％。

测定结果如下：

(1)混合多肽中的序列鉴定(表中Mr.calc为理论分子量，Scores为质谱Mascot搜库结果中该肽段的打分，该表选取的是大于15分的多肽)如下表：

表1.混合多肽中的氨基酸序列

(2)分子对接确定混合多肽中的功效成分：

表2.混合多肽中功效成分氨基酸序列

序列表

<110> 大连工业大学

<120>促成骨生物活性肽及其筛选方法

<160> 4

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<223> 多肽A的氨基酸序列。

<400> 1

Glu Asn Leu Pro Glu Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu

1 5 10 14

<210>2

<211> 12

<212> PRT

<223>多肽B的氨基酸序列。

<400> 2

Asn Leu Arg Glu Thr Ala Glu Glu Val Lys Ala Arg

1 5 10 12

<210>3

<211> 12

<212> PRT

<223>多肽C的氨基酸序列。

<400> 3

Lys Ala Asn Glu Gly Leu Thr Trp Asn Ser Leu Lys

1 5 10 12

<210>4

<211>10

<212> PRT

<223>多肽D的氨基酸序列。

<400> 4

Asn Leu Arg Glu Thr Ala Glu Glu Val Lys

1 5 10

Claims

1.促成骨生物活性肽，其特征在于该促成骨生物活性肽包含以下多肽，分别为多肽A、多肽B、多肽C、多肽D，其中：

多肽B的氨基酸序列：Asn-Leu-Arg-Glu-Thr-Ala-Glu-Glu-Val-Lys-Ala-Arg；

多肽C的氨基酸序列：Lys-Ala-Asn-Glu-Gly-Leu-Thr-Trp-Asn-Ser-Leu-Lys；

多肽D的氨基酸序列：Asn-Leu-Arg-Glu-Thr-Ala-Glu-Glu-Val-Lys。

2.促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于该方法按以下步骤实现：

一、乳铁蛋白水溶液的配置：将乳铁蛋白溶于水中，加热至20～30℃处理2～10min，冷却至室温后得到乳铁蛋白溶液；

五、序列鉴定：对过滤后的酶解溶液进行多肽序列鉴定；

六、功效组分的确定：在Discovery Studio软件中，选用半柔性对接中的CDocker方法将鉴定到的多肽与表皮生长因子受体EGFR进行对接，选用-CDOCKER_Energy打分函数评定对接结果，选取打分函数大于130分的多肽，作为后续成骨细胞增殖活性验证实验的样品。

3.根据权利要求2所述的促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于步骤二中所述的碱性调节剂为NaOH、Na₂CO₃或NaHCO₃。

4.根据权利要求2所述的促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于步骤二恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％的胰蛋白酶进行水解反应。

5.根据权利要求4所述的促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于水解反应的时间为0.5～4h。

6.根据权利要求2所述的促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于步骤二所述的灭酶处理是在100℃下高温处理10min。

7.根据权利要求2所述的促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于步骤四混合促成骨多肽分子量低于3KDa，质量百分含量占50％～90％。

8.根据权利要求2所述的促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于步骤四中脱盐处理是过滤后的酶解溶液通过C₁₈-SPE柱脱盐处理。

9.根据权利要求2所述的促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于步骤五采用UPLC-Q-TOF-MS对过滤后的酶解溶液进行多肽序列鉴定。

10.根据权利要求9所述的促成骨生物活性肽的筛选方法，其特征在于过滤后的酶解溶液过C₁₈-SPE柱除盐，然后用质量浓度为0.1％的甲酸-水复溶，过0.22μm除菌膜后进行UPLC-Q-TOF-MS分析，其中UPLC的条件：采用Phenomenex Luna C₁₈色谱柱，流动相A为质量分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为质量分数0.1％的甲酸乙腈，采用从99％的A相到50％A相的梯度洗脱程序，流速0.4mL/min，柱温为45℃，进样量为20μL；Q-TOF-MS条件：飞行时间质谱仪，质谱采用电喷雾电离源，正离子模式。