BE1027448B1 - Un procédé d'évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique - Google Patents
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Abstract
La présente invention rend public un procédé d'évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, comprenant les étapes suivantes : étape un, dépistage des peptides à activité ostéogénique potentielle ; étape deux, création d'une librairie de ligands polypeptidiques d'amarrage de réserve ; étape trois, obtention de structures cristallines des protéines cibles, retrait des proligands des structures cristallines des protéines cibles comme protéines réceptrices cibles ; étape quatre, amarrage de liaison respective de chaque protéine réceptrice cible aux polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d'amarrage de réserve, sélection des polypeptides dont l'énergie libre des sites de liaison est inférieure aux premières valeurs prédéfinies, pour former des agrégats de polypeptides à liaisons stables ; étape cinq, calcul du nombre de répétitions de séquences aminoacides dans les agrégats de polypeptides, sélection des séquences aminoacides dont le nombre de répétitions est supérieur aux deuxièmes valeurs prédéfinies, et identification des polypeptides contenant ces séquences aminoacides comme polypeptides à activité ostéogénique potentielle. La présente invention se base sur les techniques de simulation d'amarrage moléculaire assistée par ordinateur pour évaluer l'activité de prolifération des ostéoblastes des polypeptides, elle permet d'économiser efficacement temps et coûts d'identification et les données de résultat d'évaluation sont de haute fiabilité.
Description
Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique Domaine technique La présente invention concerne le domaine de la bioinformatique, elle concerne concrètement un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique. État de la technique L’ostéoporose est une maladie généralisée du métabolisme osseux caractérisée par une diminution de la substance osseuse, une régression de la structure microscopique osseuse et un accroissement de la fragilité osseuse. Les médicaments cliniques utilisés pour traiter l’ostéoporose comprennent le risédronate, l’acide téréphtalique, l’acide alendronique, les biphosphonates, le zolédronate et le teriparatide, cependant la prise de ces médicaments engendre souvent des effets secondaires tels que les inflammations de l’æsophage, les nausées, les diarrhées voire le cancer du système reproducteur, leur toxicité latente et leurs effets secondaires limitent dans une certaine mesure la généralisation de leur emploi. C’est pourquoi, la recherche d’un produit de remplacement plus sûr et de ressource alimentaire naturelle stimulant la formation osseuse et inversant les lésions de la structure osseuse suscite une attention de plus en plus prononcée.
Les os de volailles sont riches en collagène (principalement de type I, représentant environ 20% du poids des os des animaux), le collagène est une protéine structurelle unique, des études ont montré que l’apport en peptides de collagène permet d’accroître la régularité et la solidité du réseau de fibres de collagène osseux, de stimuler la sédimentation ordonnée des sels de calcium, d’accroître la rigidité et la densité osseuses, c’est une source idéale de peptides à activité potentielle anti-ostéoporose. Avec le développement et l’approfondissement des études bioinformatiques, un nombre de plus en plus important de structures de protéines et de leurs séquences aminoacides est mis en lumière, ce qui offre des bases à la fourniture de séquences aminoacides à la recherche de peptides à activité biologique dans des matières premières protéiniques. Précédemment, des laboratoires ont isolé, purifié et obtenu des peptides de collagène osseux à partir d’os de bovins, et identifié leurs structures aminoacides, pour créer une librairie de peptides à activité proliférative des ostéoblastes (activité ostéogénique), et se fondant sur les types de forces de liaison avec les a | a | u ___ BE2020/5816 protéines cibles, le nombre et le type de résidus aminoacides des sites de liaison et clarifié les spécificités structurelles des séquences aminoacides des peptides à activité ostéogénique.
Les procédés classiques d’évaluation des peptides à activité ostéogénique nécessitent la synthèse artificielle de tous les polypeptides, tous les polypeptides identifiés obtenus sont respectivement synthétisés artificiellement et cultivés en culture cellulaire in vitro pour vérification, ainsi les polypeptides à activité ostéogénique dépistés obtenus nécessitent un temps très long et des coûts économiques très élevés.
Contenu de l’invention L’un des buts de la présente invention est de résoudre les problèmes susmentionnés et de fournir les points avantageux décrits ci-après.
Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, celui-ci étant basé sur les techniques de simulation d’amarrage moléculaire assistée par ordinateur pour évaluer l’activité proliférative des ostéoblastes des polypeptides, surmontant les défauts des procédé classiques d’évaluation des peptides à activité ostéogénique en termes de temps, de ressources humaines et de coûts élevés et permettant de réduire la durée et d’économiser en ressources humaines et coûts matériels d’identification des polypeptides à activité ostéogénique, ses données de résultat d’évaluation sont de haute fiabilité, c’est un excellent procédé de pronostic et d’évaluation des peptides à activité ostéogénique.
Afin de réaliser les buts et autres avantages de la présente invention, un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, comprenant les étapes suivantes est fourni : étape un, isolation de polypeptides à partir de collagène d’os de volailles, puis dépistage des polypeptides à activité ostéogénique potentielle ; étape deux : création d’une librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve à partir des polypeptides à activité biologique potentielle dépistés à l’étape un, et traitement de minimisation énergétique des polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve ; étape trois, obtention de structures cristallines des protéines cibles à partir de la base de données de protéines, lesdites structures cristallines des protéines cibles pouvant participer à la prolifération cellulaire, retrait des proligands des structures cristallines des protéines cibles a BE2020/5816 comme proteines receptrices cibles ; étape quatre, amarrage des liaisons respectives de chaque polypeptide de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve aux protéines réceptrices cibles de l’étape trois en prenant pour centres d’activité les sites de liaison des proligands et des structures cristallines des protéines cibles, calcul de l’énergie libre des sites de liaison, sélection des polypeptides dont l’énergie libre des sites de liaison est inférieure aux premières valeurs prédéfinies, pour former des agrégats de polypeptides à liaisons stables ; étape cinq, calcul du nombre de répétitions de séquences aminoacides dans les agrégats de polypeptides à liaisons stables, sélection des séquences aminoacides dont le nombre de répétitions est supérieur aux deuxièmes valeurs prédéfinies, et identification des polypeptides contenant ces séquences aminoacides comme polypeptides à activité ostéogénique potentielle.
Préférablement, il comprend en outre une : étape six, par synthèse chimique in vitro, les polypeptides à activité ostéogénique potentielle obtenus à l’étape cinq sont purifiés par CLHP pour obtenir des polypeptides à activité ostéogénique à degré de pureté supérieur à 98%, puis culture proliférative in vitro des ostéoblastes.
Préférablement les protéines réceptrices cibles de l’étape trois sont des récepteurs de facteur de croissance épidermique.
Préférablement le dépistage de l’étape un est successivement divisé en deux fois, les conditions de premier dépistage sont : un nombre d’aminoacides situé entre 5 et 25, en outre le poids moléculaire des polypeptides est situé entre 500 et 2500, de plus l’évaluation Mascot obtenue est supérieure à 40, les conditions du deuxième dépistage sont: un nombre d’aminoacides situé entre 10 et 25, ou une séquence d’aminoacides de GDR, GPA, GP ou GA, ou une abondance d’aminoacides caractéristiques Gly et Pro respectivement située à 15-35% et 10-40%.
Préférablement des structures tridimensionnelles des polypeptides à activité biologique potentielle sont respectivement dessinées avant la création de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve de l’étape deux, le traitement de minimisation énergétique est effectué selon le champ énergétique CHARMm.
Préférablement un traitement de déshydratation et d’hydrogénation est appliqué aux protéines réceptrices cibles de l’étape trois.
Préférablement avant amarrage de liaison respectif de chaque polypeptide de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve de l’étape quatre aux protéines réceptrices cibles de l’étape trois, les coordonnées centrales de la zone d’activité d’amarrage et le rayon d’amarrage sont d’abord définis, l’amarrage semi flexible CDOCKER est ensuite utilisé. Préférablement les coordonnées centrales de la zone d’activité d’amarrage sont respectivement X = 124,403, Y = 75,629, Z = 51, 305, le rayon d’amarrage peut être une valeur arbitraire comprise entre 15 et 25; les paramètres d’amarrage semi-flexible CDOCKER sont définis comme suit : Top Hit est paramétré à 10, Random Conformations est paramétré à 10, Orientations to Refine est paramétré à 10, Force field est paramétré sur CHARMm, des valeurs par défaut sont choisies pour les autres paramètres.
Préférablement après utilisation de l’amarrage semi-flexible CDOCKER à l’étape quatre, le type de force de liaison des polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve aux protéines réceptrices cibles est en outre obtenu, ainsi que le nombre et le type de résidus aminoacides des sites de liaison, parmi lesquels les types de force de liaison comprennent les liaisons hydrogène, l’interaction hydrophobe, la force de van der Waals, l’interaction des liaisons ioniques, les résidus aminoacides des sites de liaison comprennent Serl1, Asn12, Lys13, Thr15, Gln16, Leu17, Gly18, Leu325, Val350, Asp355, Phe357 et His409.
Préférablement la première valeur prédéfinie est -100 kcal/mol. La présente invention comprend au moins les effets bénéfiques ci-dessous : La technique de simulation d’amarrage moléculaire assistée par ordinateur de la présente invention se fonde sur le « principe de serrure-clé » des ligands et récepteurs pour étudier l’interaction entre les deux, respectant le principe de compatibilité énergétique et de compatibilité géométrique. Les interactions entre ligands et récepteurs comprennent principalement les interactions électrostatiques, les interactions de liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes et les interactions de force de van der Waals. Au cours du processus d’amarrage moléculaire, les ligands à structure tri-dimensionnelle initiale sont placés sur les sites d’activité des récepteurs, une optimisation des paramètres de position des ligands et récepteurs, de conformation, de l’angle dièdre de liaison rotative interne moléculaire et de squelette protéique est effectuée selon le principe de complémentarité géométrique et de compatibilité énergétique, afin de trouver les liaisons optimales des ligands et récepteurs.
La présente invention surmonte les défauts des procédé classiques d’évaluation des peptides à activité ostéogénique en termes de temps, de ressources humaines et de coûts élevés, se basant sur les techniques de simulation d’amarrage moléculaire assistée par
_ BE2020/5816 ordinateur pour étudier les modes et mécanismes d'interaction entre les molécules des ligands polypeptidiques et les macromolécules des récepteurs, permettant de réduire la durée et d’économiser en ressources humaines et coûts matériels d’identification des polypeptides à activité ostéogénique, ses données de résultat d’évaluation sont de haute fiabilité, c’est un 5 excellent procédé de pronostic et d’évaluation des peptides à activité ostéogénique.
La présente invention peut simplifier le procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique en un processus de dépistage des polypeptides à activité de prolifération d’ostéoblastes. Le procédé de la présente invention peut en outre pronostiquer le nombre et la part de chaque aminoacide dans les polypeptides à activité ostéogénique ainsi qu’analyser l’action de chaque position de séquence aminoacide sur les polypeptides à activité ostéogénique.
Ledit procédé de la présente invention dispose des avantages de rapidité, haute efficacité et précision d’évaluation de la force d’activité ostéogénique des polypeptides, il est de forte maniabilité, ne nécessite pas de grands investissements en ressources humaines et matérielles, peut être appliqué largement à l’évaluation des polypeptides à activité ostéogénique, il offre au développement de produits diététiques et fonctionnels à fonctions d’anti-activité ostéoporose un nouvel appui théorique et étayé de données, il répond non seulement aux besoins de dépistage des polypeptides à activité ostéogénique en phase précoce pour l’industrie des produits diététiques et fonctionnels, mais il offre des références aux autres évaluations futures de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique.
Les autres avantages, buts et caractéristiques de la présente invention sont mentionnés dans la description ci-après, dont une partie, via les études et la pratique de la présente invention, est connue de l’homme du métier.
Dessins annexes Le Dessin 1 représente le schéma des séquences aminoacides des polypeptides à activité biologique potentielle dépistés par la présente invention ainsi que les positions des chaînes de peptides de collagène de type I ; Le Dessin 2 représente le schéma structurel de cristal tri-dimensionnel 1IVO de la structure cristalline des protéines cibles de la présente invention ; Le Dessin 3 représente le schéma d’interaction des fragments de peptides des séquences répétitives de polypeptides (GP-16 et GD-18) dont les énergies libres de liaison d’amarrage
LE _ _ BE2020/5816 de polypeptide de librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve aux protéines réceptrices cibles sont inférieures à -100 kcal/mol avec les récepteurs de facteur de croissance épidermique EGFR ; Le Dessin 4 représente une comparaison de l’activité de prolifération d’ostéoblastes externe de fragments de peptides des séquences répétitives de polypeptides (GP-16 et GD-18) dont les énergies libres de liaison d’amarrage de polypeptide de librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve aux protéines réceptrices cibles sont inférieures à -100 kcal/mol avec les récepteurs de facteur de croissance épidermique EGFR ; Le Dessin 5 représente le schéma de procédé dudit procédé de la présente invention.
Modes de réalisation La présente invention est ci-dessous décrite de façon approfondie à l’aide des Dessins annexes et de modes de réalisation, afin que l’homme du métier puisse la mettre en pratique en référence à la description.
Il faut noter qu’en l’absence de mention particulière tous les procédés expérimentaux décrits dans les modes de réalisation ci-dessous sont des procédés courants, tous les réactifs et matières premières, en l’absence de mention particulière, peuvent être obtenus par voies commerciales.
La présente invention fournit un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, celui-ci est basé sur les techniques de simulation d’amarrage moléculaire assistée par ordinateur pour évaluer l’activité de prolifération des ostéoblastes des polypeptides et comprend les étapes ci-dessous, tel que représenté au Dessin 5: Étape un, isolation de polypeptides à partir de collagène d’os de volailles, puis dépistage des polypeptides à activité ostéogénique potentielle basé sur l’analyse initiale des caractéristiques des séquences aminoacides des fragments de polypeptides ; la présente invention utilise des os de bovins, des polypeptides sont obtenus à partir du collagène d’os de bovins, ce processus nécessite généralement l’ajout d’enzymes pour traitement, deux dépistages successifs sont ensuite effectués, les conditions du premier dépistage sont un nombre d’aminoacides situé à 5-25, en outre le poids moléculaire des polypeptides est situé à 500-2500 Da, de plus, l’évaluation Mascot obtenue est supérieure à 40, le premier dépistage doit garantir que les polypeptides obtenus au premier dépistage proviennent d’os de bovins et non des enzymes, les conditions du deuxième dépistage sont : un nombre d’aminoacides situé à 10-25, ou une séquence d’aminoacides de GDR, GPA, GP ou GA, ou une abondance d’aminoacides caractéristiques Gly et Pro respectivement située à 15-35% et 10-40%, 59 polypeptides à activité biologique potentielle sont obtenus après le deuxième dépistage, comprenant les polypeptides de la chaîne a; de collagène d’os de bovin et les polypeptides de la chaîne az de collagène d’os de bovin (tel que représenté au Dessin 1) ;
Étape deux, les structures tridimensionnelles des polypeptides à activité biologique potentielle dépistés à l’étape un sont respectivement dessinées à l’aide du logiciel Chem BioDraw Ultra 14.0 puis la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve est créée, les polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve subissent un traitement de minimisation énergétique selon le champ énergétique CHARMm, enfin un document intégral au format .PDB est sauvegardé pour préparation initiale de l’amarrage moléculaire de la prochaine étape ;
Étape trois, les structures cristallines des protéines cibles (tel que représenté au Dessin 2 dans les cadres en lignes pointillées, structures des proligands des EGFR) sont obtenues dans la base de données des protéines (https://www‚.rcsb.org/), ces structures cristallines des protéines cibles participent à la prolifération cellulaire, les proligands des structures cristallines des protéines cibles sont retirées comme protéines réceptrices cibles ; les récepteurs protéines cibles sont des récepteurs de facteur de croissance épidermique EGFR,
1’ID PDB est 1IVO, le logiciel Discovery Studio 2018 est utilisé pour effectuer un traitement de déshydratation et d’hydrogénation des protéines réceptrices cibles ;
Tel que représenté au Tableau 1, le nombre de Pose et les valeurs RMSD de l’amarrage des polypeptides de la librairie de ligands de polypeptides aux protéines réceptrices cibles sont vérifiés à l’aide de trois mode d’amarrage différents, CDOCKER, LibDock et LiganFit,
enfin le CDOCKER est sélectionné comme méthode de calcul la plus adaptée à l’amarrage.
CDOCKER est un processus (méthode de calcul) d’amarrage moléculaire semi-flexible basé sur le champ énergétique CHARMm, les espaces de structure-activité flexible des molécules des ligands sont recherchés par dynamique de haute température afin d’amarrer les ligands de façon rapide et précise aux sites de liaison des récepteurs, puis chaque conformation sur site d’activité de récepteur est optimisée par recuit simulé, ce qui augmente la précision des résultats d’amarrage ;
Tableau 1 Modes d’action des polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve et des protéines réceptrices cibles et valeurs RMSD sous les trois méthodes de calcul d’amarrage différentes CDOCKER, LibDock et LigandFit CDOCKER LibDock LigandFit Valeur OO Valeur 1 Valeur N° Pose Référence RMSD Pose Référence RMSD Pose Référence RMSD (À) (À) (À) 1 1IVO-1 1IVO-1 0,0000 1IVO-1 1IVO-1 0,0000 1IVO-1 1IVO-1 0,0000 2 1IVO-2 1IVO-1 3,2411 1IVO-2 1IVO-1 13,4153 1IVO-2 1IVO-1 1,6592 3 1IVO-3 1IVO-1 1,9480 1IVO-3 1IVO-1 17,4821 1IVO-3 1IVO-1 7,2496 4 1IVO-4 1IVO-1 17,1064 1IVO-4 1IVO-1 9,8477 1IVO-5 1IVO-1 7,7512 6 1IVO-6 1IVO-1 2,9591 7 1IVO-7 1IVO-1 13,3061 8 1IVO-8 1IVO-1 22,5397 9 1IVO-9 1IVO-1 21,1556 1IVO-10 1IVO-1 11,4168 11 1IVO-11 1IVO-1 15,5136 *RMSD, Root-mean-square deviation, écart quadratique moyen Étape quatre, en prenant pour centres d’activité les sites de liaison des proligands et des 5 structures cristallines des protéines cibles, nous définissons les coordonnées centrales de la zone d’activité d’amarrage (X = 124,403, Y = 75,629, Z = 51,305) ainsi que le rayon d’amarrage (choisir une valeur arbitraire comprise entre 15 et 25, dans la présent invention nous choisissons 22,248), les paramètres d’amarrage semi-flexible CDOCKER sont définis comme suit: Top Hit est paramétré à 10, Random Conformations est paramétré à 10, 10 Orientations to Refine est paramétré à 10, Force field est paramétré sur CHARMm, des valeurs par défaut sont choisies pour les autres paramètres, chaque polypeptide de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve est respectivement amarré par liaison aux protéines réceptrices cibles de l’étape trois, l’énergie libre des sites de liaison est calculée, les polypeptides dont l’énergie libre des sites de liaison est inférieure aux premières valeurs prédéfinies (-100 kcal/mol) sont sélectionnés pour former des agrégats de polypeptides à liaisons stables ; plus l’énergie libre de sites de liaison est faible plus cela signifie que la liaison entre les deux est étroite et plus la liaison est stable ; Étape cinq, calcul du nombre de répétitions de séquences aminoacides dans les agrégats de polypeptides à liaisons stables, sélection des séquences aminoacides dont le nombre de 8 répétitions est supérieur aux deuxièmes valeurs prédéfinies, et identification des polypeptides contenant ces séquences aminoacides comme polypeptides à activité ostéogénique potentielle.
Les deuxièmes valeurs prédéfinies sont librement définies en fonction des besoins.
Étape six, par synthèse chimique in vitro, les polypeptides à activité ostéogénique potentielle obtenus à l’étape cinq sont purifiés par CLHP pour obtenir des polypeptides à activité ostéogénique à degré de pureté supérieur à 98%, puis une culture proliférative in vitro des ostéoblastes est réalisée.
Tel que représenté aux Tableaux 2 et 3, les valeurs énergétiques d’amarrage (c’est-à-dire l’énergie libre de site de liaison) des polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve et des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR sont rangées par ordre croissant, l’énergie libre de site d’amarrage est située entre -29,395 et -158,080 kcal/mol, parmi lesquelles l’énergie libre de site de liaison de GKSGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR et EGFR est la plus faible, étant seulement de -158,080 kcal/mol. Parmi les polypeptides dont l’énergie libre de site de liaison est inférieure à -100 kcal/mol, 7 fragments de peptides parmi ceux identifiés sur la chaîne al comprennent la séquence aminoacide identique GDRGETGPAGPAGPIGPV (GD-18); 3 fragments de peptides parmi ceux identifiés sur la chaîne a2 comprennent la séquence aminoacide identique GPSGPAGKDGRIGQPG (GP-16), ces deux séquences aminoacides répétitives (fragments de peptides) appartiennent justement aux polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve, leurs énergies libres de site de liaison sont respectivement de 98.992 kcal/mol et 112.205 kcal/mol.
Tableau 2 Résultats d’amarrage moléculaire des polypeptides de la chaîne al de collagène d’os de bovins et des EFGR Energie Classeme Séquence aminoacide moleculai Classeme Longue Not ien a nt re nt de site ur e (Kcal/mo
D 1 GKSGDRGETGPAGPAGPIGP 2160109 1060-108 24 TA _158,080 2 GKSGDRGETGPAGPAGPIGP 2004002 1060-108 23 7 _132,928 3 SGDRGETGPAGPAGPIGPVG 1818,886 1062-108 21 75,1 _131,953 A 1 2 0 4 GKSGDRGETGPAGPAGPIGP 1172975 1000-107 9 420 -119,609 5 GKSGDRGETGPAGPAGPIGP 1875,943 1060-108 21 69,0 „117,383 V 9 0 4 6 GADGAPGKDGVRGL 140597 751764 14 9 117,184
7 GDRGETGPAGPAGPIGPVGA 1385 1007108 29 65 -108,143 8 SGDRGETGPAGPAGPIGPV 1990827 106108 19 905 „107348 9 KSGDRGETGPAGPAGPIGPV 1919777 1060108 29 775 „105,362 10 GDRGETGPAGPAGPIGPV 1909/95 1064-108 18 95 08992 11 — GPPGPAGPAGERGEQGPA 1600759 619-636 18 00 -98,003 12 GAPGADGPAGAPGTPGPQG 1990/00 934.952 19 68 89,869 13 DRGETGPAGPAGPIGPV 1940/74 1007105 ‚7 70 26238 14 STGISVPGPMGPSGPR 131700 171-186 16 > 85,072 RGETGPAGPAGPIGPVGA 1399805 100108 18 a -83,832 16 TGPAGPAGPIGPVGA 217,060 1005108 15 53° 15836 17 RGETGPAGPAGPIGPV 1931747 100108 16 900 65216 18 GERGFPGLPGPS 160382 96798 12 “2° 62,100 19 GISVPGPMGPSGPR | 1707005 173.186 14 T7! 59,186 ISVPGPMGPSGPR 1200088 174-186 13 127 _58233 21 TGPAGPAGPIGPV 108581 1008 108 13 08 -54,586 22 SVPGPMGPSGPR 39 175-186 12 se 48,188 23 GISVPGPMGPS 997,4903 173-183 11 “2° 46853 24 GPAGPAGPIGPV 988,5342 1090108 12 C3 45,080 GPAGPPGPIGNV 1030940 8aa855 12 77° 42,997 26 GPAGPIGPV 763,429 197198 9 C5 34299 27 ISVPGPM 715,3575 174-180 7 DS 2942 28 GLPGPPGAPGPQ 1947540 187-198 12 Le 29,395
Tableau 3 Résultats d’amarrage moléculaire des polypeptides de la chaîne a2 de collagène d’os de bovins et des EFGR Énergie ° , Classeme ; . . Poids . Classeme Longue Not d'amarra Séquence aminoacide moléculai . ge nt nt de site ur e re (Kcal/mol BD) | LAGHHGDQGAPGAVGPA ‚859030 1032-105 „9 471 56365 GPR 1 6 ; GPAGPSGPAGKDGRIGQP 16748438 1052-107 19 945 124.349 3 LAGHHGDOQGAPGAVGPA 1510,7277 193104 17 40 „123,166 4 GPAGPSGPAGKDGRIGQP 7458809 1052-107 „0 753 19,225 GA 1 0 GPSGPAGKDGRIGQPG 1449,7325 1050107 16 °° „112,205 6 GDRGEAGPAGPAGPAGPR 1588,7706 689-706 18 672 „104,467 49,2 7 GEKGETGLR 9454879 653-661 9 3" 96,716 8 GPAGKDGRIGQPG 1208,6262 1958107 13 os -91,074 9 LRGPRGDQGPVGR 1363,7433 816-828 13 Pa 86,889 GFDGDFYR 975,4087 1109-1116 8 ba „84,994 11 ARGSDGSVGPVGPA 1225,6051 231-244 14 Sl „82,368 12 GDQGAPGAVGPAGPR 1305,6426 1937109 15 eN „78,154 13 GARGSDGSVGPVGPA 1282,6266 230-244 15 ° -74,196 14 RGSDGSVGPVGPA 1154,5680 232-244 13 > -73,005 AVGPAGPRGPAGPS _ 1189,6204 194105 14 97 -69,936 16 GSDGSVGPVGPA 9984669 233-244 12 97 69,38] 17 GAAGPTGPIGSR | 1039,5411 596-607 12 955 65,858 18 GSDGSVGPVGPAGPI | 1265,6252 233-247 15 be „62,994
19 AAGPTGPIGSR 982,5196 597-607 11 “37 60065
20 GIDGRPGPIGPA 1105,5880 470-481 12 Le -56,523
21 GPVGPVGKH 846,4712 965-973 9 > -53,582
47,0 22 GPSGLPGER 868,4403 635-643 9 0 -52,185 45,8
23 AGPTGPIGSR 911,4825 598-607 10 3 -52,097
24 GPTGPIGSR 840,4454 599-607 9 DS -51,547
25 VGPAGPRGPAGPS 1118,5833 199719 13 92 „48,694
26 VGPRGPSGPQ 950,4934 991-1000 10 be -47,609
27 GPRGPAGPSGPA | 10195148 1990106 12 997 43976
28 VGPAGPRGPAGP 1031,5512 1942-105 12 A „43,232
29 GPAGPRGPAGPS 1019,5148 19407105 12 La -43,228
30 VGPAGPRGPA 877,4770 19910 10 547 42,472
31 GPAGPAGPR 778,4086 698-706 9 7 -35,436 D’après le classement par ordre croissant des notes SCODKER energy, nous constatons que les polypeptides des séquences aminoacides GDRGETGPAGPAGPIGPV (GD-18) et GPSGPAGKDGRIGQPG (GP-16) ont une excellent capacité de liaison aux récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR, l’énergie libre de liaison d’amarrage est inférieure à -100 kcal/mol.
Nous constatons en particulier que les polypeptides de Gly en position N-terminal ont une capacité de liaison aux récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR encore meilleure, ils représentent la proportion la plus importante des chaînes de polypeptides dont l’énergie libre de liaison d’amarrage est inférieure à -100 kcal/mol, atteignant plus de 66%. En outre, nous avons découvert que les polypeptides contenant les séquences aminoacides répétitives GDR, GPA, GP ou Ga occupent la proportion la plus importante des chaînes de polypeptides dont l’énergie libre de liaison d’amarrage est inférieure à -100 kcal/mol.
Ce qui démontre que les séquences aminoacides susmentionnées sont des séquences aminoacides décisives quant à l’activité ostéogénique des polypeptides.
C’est pourquoi, la présente invention fournit des polypeptides dotés des séquences aminoacides susmentionnées pouvant être utilisés dans la préparation de produits diététiques fonctionnels à activité anti-ostéoporose.
L’analyse visuelle de la force de liaison d’amarrage des séquences répétitives de polypeptides (GD-18 et GP-16) dont l’énergie libre de liaison d’amarrage est inférieure à -100 kcal/mol aux récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR est la suivante : Après amarrage semi-flexible CDOCKER, le type de force de liaison entre les polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve et les protéines réceptrices cibles est en outre obtenu, ainsi que le nombre et le type de résidus aminoacides des sites de liaison, parmi lesquels, les types de forces de liaison comprennent les liaisons hydrogène, l’interaction hydrophobe, la force de van der Waals, l’interaction des liaisons ioniques, les résidus aminoacides des sites de liaison comprennent Serll, Asn12, Lys13, Thr15, Gln16, Leul7, Gly18, Leu325, Val350, Asp355, Phe357 et His409. Les résultats des interactions entre les polypeptides GP-16 et GD-18 et les récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR figurent au Dessin 3, sur le Dessin 3, (A) représente la structure 3D de l’amarrage moléculaire entre GP-16 et EFGR, (B) représente la structure 3D de l’amarrage moléculaire entre le GD-18 et EFGR; AI1(B1), A2(B2) et A3(B3) représentent respectivement les liaisons hydrogène, l’interaction électrostatique et l’interaction hydrophobe. Les résultats montrent que les sites de liaison d’amarrage entre le GP-16 et les récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR sont Lys13, Thr15, Gln16, Gly18, Leu325 et Asp355 ; les sites de liaison d’amarrage entre le GD-18 et les récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR sont Serl1, Asn12, Lys13, Thr15, Gln16, Leu17, Leu325, Val350, Asp355, Phe357 et His409. Parmi lesquels les interactions sans liaison formées par amarrage des résidus aminoacides des polypeptides GD-18 et GP-16 et des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR comprennent les liaisons hydrogène, les interactions électrostatiques et les interactions hydrophobes. Lys13, Thr15, Gln16, Gly18 et Asp355 du GP-16 et des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR forment 11 liaisons hydrogène ; Serll, Asnl2, Thr15, Gln16, Asp355, et His409 du GD-18 et des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR forment 9 liaisons hydrogène. Les aminoacides de ces sites d’interaction et les récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR disposent de deux sites de liaisons aminoacides identiques (Val350 et Phe357). Les études montrent que les sites d’interaction du ENLPEKADRDQYEL de la lactoferricine et des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR sont Lys13, Leul4, Thrl5, Gln16, Tyr45, Leu98, Ser99, His409 et Ser418, les polypeptides et le ENLPEKADRDQYEL de la lactoferricine disposent de trois sites de liaison d’amarrage identiques, Thr15, Hln16 et
His409, ce qui montre que leur mécanisme d’action moléculaire est identique à celui du ENLPEKADRDQYEL de la lactoferricine et des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR.
Les sites de liaison d’amarrage entre le GP-16 et les récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR sont Lys13, Thr15, Gln16, Gly18, Leu325 et Asp355 ; les sites de liaison d’amarrage entre le GD-18 et les récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR sont Serll, Asn12, Thr15, Gln16, Leul7, Leu 325, Val350, Asp355, Phe357 et His409. D’après le fait que la structure des polypeptides détermine leur activité biologique (la structure aminoacide de niveau 1 détermine la structure de haut niveau), la base structurelle selon laquelle les polypeptides dont l’énergie libre de liaison d’amarrage est inférieure à -100 kcal/mol peuvent s’amarrer de façon étroite aux récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR est peut être relative au fait que ce type de polypeptide contient des séquences répétitives d’aminoacides identiques (GP-16 et GD-18), qui se lient aux résidus aminoacides identiques ou similaires, l’amarrage formant une interaction sans liaison et permettant ainsi une activité ostéogénique.
Les interactions sans liaison formée par amarrage des polypeptides GP-16 et GD-18 aux résidus aminoacides des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR comprennent les liaisons hydrogène, les interactions électrostatiques et les interactions hydrophobes. Lys13, Thr15, Gln16, Gly18 et Asp355 du GP-16 et des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR forment 11 liaisons hydrogène ; Serl1, Asn12, Thr15, Gln16, Asp355, et His409 du GD-18 et des récepteurs de facteurs de croissance épidermique EGFR forment 9 liaisons hydrogène. Plus les liaisons hydrogènes à liaisons mutuelles d’amarrage sont nombreuses, plus cela signifie que la force de liaison du polypeptide et des EGFR est puissante. Dans la présente invention, il existe en outre une interaction hydrophobe alkyle entre le GP-16 et Leu325, une interaction électrostatique avec Asp355 ; il existe 4 interactions hydrophobes alkyles entre le peptide GD-18 et Leu17, Leu325, Val350 et His409, ces liaisons interactives bénéficient également à la stabilité de la structure interactive entre les polypeptides GP-16 et GD-18 et les EGFR. Plus l’interaction de liaison entre les polypeptides GP-16 et GD-18 et les EGFR est forte, plus l’effet stimulant de prolifération des ostéoblastes (l'activité ostéogénique) est fort.
La vérification de l’activité proliférative in vitro des ostéoblastes des séquences répétitives des polypeptides GP-16 et GD-18 dont l’énergie libre de liaison d’amarrage est inférieure à -100 kcal/mol est la suivante :
Des séquences répétitives des polypeptides GP-16 et GD-18 dont l’énergie libre de liaison d’amarrage est inférieure à -100 kcal/mol sont sélectionnées pour effectuer une analyse d’activité proliférative in vitro des ostéoblastes, après purification CLHP par synthèse chimique in vitro, des peptides actifs à degré de pureté supérieur à 98% sont obtenus (séquences aminoacides répétitives de GP-16 et GD-18 susmentionnées), la vérification de l’activité proliférative in vitro des ostéoblastes est effectuée, tel que représenté au Dessin 4, dans le Dessin 4, (A) représente le GP-16, (B) représente le GD-18 (* signifie un écart significatif de niveau P < 0,05 entre les différents groupes de traitement). Les résultats montrent qu’une concentration de 0,05 mg/mL de peptides GP-16 et GD-18 stimule de façon manifeste la prolifération des ostéoblastes, en outre ils présentent un certain rapport concentration-effet, après culture continue durant 96 heures, les taux de prolifération d’ostéoblastes atteignent respectivement 135,0% et 149,2%, ce qui montre que le modèle d’amarrage moléculaire créé et les indices d’évaluation d’amarrage peuvent pronostiquer de façon satisfaisante l’activité ostéogénique (la prolifération des ostéoblastes).
Dans le tableau des séquences, les numéros 1-28 représentent les séquences de polypeptides à amarrage moléculaire aux EFGR de la chaîne al, le numéro 29 représente la séquence de la chaîne al, les numéros 30-60 représentent les séquences de polypeptides à amarrage moléculaire aux EFGR de la chaîne a2, le numéro 61 représente la séquence de la chaîne a2.
Bien que la présente invention rende public des plans de réalisation, ceux-ci ne se limitent pas uniquement à un emploi mentionné dans la description et les modes de réalisation, ils sont tout à fait adaptés à tout domaine relatif à la présente invention, l’homme du métier peut aisément effectuer des modifications, c’est pourquoi, à la condition de ne pas s’écarter des revendications et des concepts ordinaires définis par une étendue équivalente, la présente invention n’est pas limitée à des détails spécifiques, ni aux exemples et dessins décrits ici.
Claims (10)
1. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, caractérisé en ce que, il comprend les étapes suivantes : étape un, isolation de polypeptides à partir de collagène d’os de volailles, puis dépistage des peptides à activité ostéogénique potentielle ; étape deux : création d’une librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve à partir des polypeptides à activité biologique potentielle dépistés à l’étape un, et traitement de minimisation énergétique des polypeptides de la libraire de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve ; étape trois, obtention de structures cristallines des protéines cibles à partir de la base de données de protéines, lesdites structures cristallines des protéines cibles pouvant participer à la prolifération cellulaire, retrait des proligands des structures cristallines des protéines cibles comme protéines réceptrices cibles ; étape quatre, amarrage des liaisons respectives de chaque polypeptide de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve aux protéines réceptrices cibles de l’étape trois en prenant pour centres d’activité les sites de liaison des proligands et des structures cristallines des protéines cibles, calcul de l’énergie libre des sites de liaison, sélection des polypeptides dont l’énergie libre des sites de liaison est inférieure aux premières valeurs prédéfinies, pour former des agrégats de polypeptides à liaisons stables ; étape cinq, calcul du nombre de répétitions de séquences aminoacides dans les agrégats de polypeptides à liaisons stables, sélection des séquences aminoacides dont le nombre de répétitions est supérieur aux deuxièmes valeurs prédéfinies, et identification des polypeptides contenant ces séquences aminoacides comme polypeptides à activité ostéogénique potentielle.
2. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, il comprend en outre une : étape six, par synthèse chimique in vitro, les polypeptides à activité ostéogénique potentielle obtenus à l’étape cinq sont purifiés par CLHP pour obtenir des polypeptides à activité ostéogénique à degré de pureté supérieur à 98%, puis culture proliférative in vitro des ostéoblastes.
3. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, les protéines réceptrices cibles de l’étape trois sont des récepteurs de facteur de croissance épidermique.
4. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, le dépistage de l’étape un est successivement divisé en deux, les conditions de premier dépistage sont: un nombre d’aminoacides situé entre 5 et 25, en outre le poids moléculaire des polypeptides est situé entre 500 et 2500, de plus, l’évaluation Mascot obtenue est supérieure à 40, les conditions du deuxième dépistage sont : un nombre d’aminoacides situé entre 10 et 25, ou une séquence d’aminoacides de GDR, GPA, GP ou GA, ou une abondance d’aminoacides caractéristiques Gly et Pro respectivement située à 15-35% et 10-40%.
5. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, des structures tridimensionnelles des polypeptides à activité biologique potentielle sont respectivement dessinées avant la création de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve de l’étape deux, le traitement de minimisation énergétique est effectué selon le champ énergétique CHARMm.
6. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, un traitement de déshydratation et d’hydrogénation est appliqué aux protéines réceptrices cibles de l’étape trois.
7. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, avant les amarrages de liaisons respectifs de chaque polypeptide de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve de l’étape quatre aux protéines réceptrices cibles de l’étape trois, les coordonnées centrales de la zone d’activité d’amarrage et le rayon d’amarrage sont d’abord définis, l’amarrage semi flexible CDOCKER est ensuite utilisé.
8. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 7, caractérisé en ce que, les coordonnées centrales de la zone d’activité d’amarrage sont respectivement définies comme X = 124,403, Y = 75,629, Z = 51, 305, le rayon d’amarrage peut être une valeur arbitraire comprise entre 15 et 25 ; les paramètres d’amarrage semi-flexible CDOCKER sont définis comme suit: Top Hit est paramétré à 10, Random Conformations est paramétré à 10, Orientations to Refine est paramétré à 10, Force field est paramétré sur CHARMm, des valeurs par défaut sont choisies pour les autres paramètres.
9. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, après utilisation de l’amarrage semi-flexible CDOCKER à l’étape quatre, le type de force de liaison des polypeptides de la librairie de ligands polypeptidiques d’amarrage de réserve aux protéines réceptrices cibles est en outre obtenu, ainsi que le nombre et le type de résidus aminoacides des sites de liaison, parmi lesquels les types de force de liaison comprennent les liaisons hydrogène, l’interaction hydrophobe, la force de van der Waals, l’interaction des liaisons ioniques, les résidus aminoacides des sites de liaison comprennent Ser11, Asn12, Lys13, Thr15, Gln16, Leu17, Gly18, Leu325, Val350, Asp355, Phe357 et His409.
10. Un procédé d’évaluation de la structure-activité des polypeptides à activité ostéogénique, selon la revendication 1, caractérisé en ce que, la première valeur prédéfinie est -100 kcal/mol.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20220208 |