CN108872442B - 一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽质量标准技术领域，特别涉及一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法。该方法包括以下步骤：(1)建立待检测骨胶原肽供试品的HPLC指纹图谱；(2)然后筛选出特征色谱峰；(3)测定待检测骨胶原肽供试品的抗炎作用；(4)采用灰色关联度分析的方法建立谱效相关性分析，以评价共有峰的抗炎活性。通过采用本发明的方法，得知骨胶原肽中7号峰、1号峰、5号峰与抗炎活性关联度较高。本发明具有方法简便、客观性强、特征峰多等优点，有利于对骨胶原肽进行质量控制。

Description

一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法
技术领域
本发明涉及多肽质量标准技术领域，特别涉及一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)又称退行性骨关节病，是最常见的关节疾病，尤其危害老年人健康，并给社会带来沉重负担。骨胶原肽主要存在于软骨中，从动物软骨组织中经酶解提取所得的活性多肽物质，能起到修复骨组织，缓解骨质疏松的症状，促进身体健康的作用。研究表明：胶原多肽具有很多活性功能，例如抗高血压、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松等。作用于儿童：骨胶原肽与钙质结合，促进骨质发育，增强骨骼成长。作用于对成人：骨胶原肽通过促进造骨细胞作用，促进骨质积累，预防骨质疏松。作用于老人：骨胶原肽通过抑制破骨细胞的形成，促进造骨细胞生产，恢复骨骼原动力，减缓骨质流失。目前，骨胶原肽主要应用于以下几方面：
1、应用于化妆品中，补充组织流失的胶原蛋白，防衰抗老，减少色斑。
2、应用在乳制品，奶粉，钙片，与乳蛋白和钙质结合助吸收。
3、应用于普通食品中，改善食品的营养结构及产品质量，助消化。
4、添加到各种运动食品，运动饮料中，迅速补充人体内所需的蛋白质及氨基酸，保护关节。
5、应用于医药保健品中，降血压和除血栓。防止老年骨质疏松，保健胃、肝和治疗内科疾病。
对于不同产地、不同生产工艺的骨胶原肽的质量是有差异的；即便同一产地、相同的生产工艺，不同批次下的骨胶原肽的质量也是有差异的，在这种情况下，对骨胶原肽的质量控制显得尤为重要。目前还未见有对骨胶原肽质量控制方法进行研究的报道。
中药指纹图谱是通过对样品进行色谱、光谱分析后利用软件进行处理以最大限度地获取有用信息，并结合化学计量学的方法对样品的特征信息进行有效的提取和对比从而建立的一种评价方法。目前，谱效关系的研究主要涉及中药领域，对于多肽谱效学方面的研究尚处于空白阶段，因此，对骨胶原肽等多肽质量控制的研究方法有待进一步发展。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法。本发明提供的HPLC指纹图谱的检测方法可有效的将各有效成分分离开；本发明质量检测方法具有方法简便、客观性强、特征峰多等优点，有利于对骨胶原肽进行质量控制。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种骨胶原肽的HPLC指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：将骨胶原肽供试品与稀盐酸混合，取滤液作为供试品溶液；
衍生化：将供试品溶液、三乙胺的乙腈溶液和异硫氰酸苯酯的乙腈溶液混合后进行衍生反应，再加入正己烷，混匀后静置分层，将下层溶液过滤后得到衍生化的供试品溶液；
色谱检测：采用高效液相色谱对衍生化的供试品溶液进行检测，色谱条件为：色谱柱为氨基酸专用柱Sepax AAA；流动相A为醋酸铵溶液与乙腈的混合溶液，醋酸铵溶液与乙腈的体积比为(90～95)：(5～10)；流动相B为体积百分含量为70％～90％的乙腈水溶液；梯度洗脱程序为：
0min→15min，流动相A：100％→80％；流动相B：0％→20％；
15min→18min，流动相A：80％→72％；流动相B：20％→28％；
18min→25min，流动相A：72％→50％；流动相B：28％→50％；
25min→30min，流动相A：50％→50％；流动相B：50％→50％；
30min→30.01min，流动相A：50％→0％；流动相B：50％→100％；
30.01min→40min，流动相A：0％→0％；流动相B：100％→100％。
优选地，流动相A中醋酸铵溶液与乙腈的体积比为93：7。
优选地，流动相B为体积百分含量为80％的乙腈水溶液。
作为优选，以g/mL计，骨胶原肽供试品与稀盐酸的比例为0.1：(9～11)，稀盐酸的浓度为0.08～0.12mol/L。
优选地，以g/mL计，骨胶原肽供试品与稀盐酸的比例为0.1：10，稀盐酸的浓度为0.1mol/L。
作为优选，供试品溶液、三乙胺的乙腈溶液与异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的体积比为(1.0～4.0)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，三乙胺的乙腈溶液的浓度为130～150μL/mL，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的浓度为12～13μL/mL。
优选地，供试品溶液、三乙胺的乙腈溶液与异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的体积比为2.0：1.0：1.0，三乙胺的乙腈溶液的浓度为140μL/mL，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的浓度为12.5μL/mL。
作为优选，衍生反应的温度为38～42℃，时间为0.8～1.2h，供试品溶液与正己烷的体积比为(0.5～1.2)：(1.0～2.4)。
优选地，衍生反应的温度为40℃，时间为1h，供试品溶液与正己烷的体积比为1.0：1.0。
作为优选，色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，填充颗粒大小为5μm。
作为优选，流动相A中醋酸铵溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，pH值为6.5。
优选地，流动相A中醋酸铵溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为6.5。
作为优选，色谱条件中流速为0.8～1.2mL/min，检测器为二极管阵列检测器；检测波长为253～255nm；柱温为35～37℃；进样量为8～12μL，总时间不少于40min。
在本发明具体实施例中，流动相A中醋酸铵溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为6.5；色谱条件中流速为1.0mL/min，检测器为二极管阵列检测器；检测波长为254nm；柱温为36℃；进样量为10μL，总时间为40min。
本发明还提供了一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法，包括如下步骤：
(1)建立骨胶原肽的HPLC指纹图谱；HPLC指纹图谱的检测方法为本发明的HPLC检测方法；
(2)提取特征色谱峰；
(3)测定骨胶原肽的抗炎活性；
(4)将步骤(2)所识别特征峰的峰面积和步骤(3)所得的抗炎活性进行灰色关联度分析，并计算各共有峰与抗炎活性之间的关联度，评价特征峰的抗炎活性。
本发明通过建立多肽的HPLC指纹图谱得到共有特征峰、通过建立细胞抗炎模型来测定多肽的抗炎因子指标，再根据HPLC指纹图谱特征峰的峰面积和抗炎指标建立灰色关联度分析，然后利用所建立的灰色关联度分析方法来评价化学成分与抗炎活性的关联度大小。
在本发明中，建立了13批骨胶原肽的HPLC指纹图谱。
作为优选，步骤(3)测定骨胶原肽的抗炎活性为：
将膝关节软骨细胞接种，加入LPS诱导细胞炎症，将骨胶原肽供试品溶液加入到细胞中，培养2.5～3.5h后，测定细胞上清液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平。
优选地，步骤(3)测定骨胶原肽的抗炎活性为：
将膝关节软骨细胞接种，加入LPS诱导细胞炎症，将骨胶原肽供试品溶液加入到细胞中，培养3h后，测定细胞上清液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平。
优选地，步骤(3)测定骨胶原肽的抗炎活性中，骨胶原肽供试品溶液中骨胶原肽的浓度为2.0mg/mL。
作为优选，灰色关联度分析步骤如下：
1)将各差异样品的抗炎活性指标组成参考数列，将各差异样品的指纹图谱中的各特征峰峰面积组成比较数列；
2)对参考数列和比较数列进行无量纲化处理，处理为采用均值化方法进行处理；
3)根据步骤2)所得无量纲化的参考数列和比较数列，计算各共有峰与抗炎活性之间的关联度；
4)对步骤3)所得关联度进行排序，评价共有峰的抗炎活性。
在本发明中，关联度的计算方法为：
采用下式计算关联系数：
Figure BDA0001769045350000041
其中，y(k)表示参考数列，xi(k)表示比较数列，ρ为分辨系数，ρ值取0.5；
然后再按照下式计算关联度：
Figure BDA0001769045350000051
均值化方法，在本领域通常是指将每一变量值除以该变量的平均值。该方法在消除量纲和数量级影响的同时，保留了各变量取值差异程度上的信息，也保留了数据的可比性。
作为优选，步骤(2)提取特征色谱峰的保留时间分别为：3.3～3.5min、4.7～4.9min、5.3～5.5min、5.9～6.1min、7.8～8.0min、9.9～10.1min、10.5～10.7min、11.4～11.6min、11.8～12.0min、12.5～12.7min、13.2～13.4min、14.3～14.5min、15.0～15.2min、15.4～15.6min、17.0～17.2min、22.3～22.5min、23.7～23.9min、24.7～24.9min、25.1～25.3min、25.8～26.0min、26.5～26.7min、26.8～27.0min、27.7～28.0min、28.7～28.9min、29.2～29.4min、29.6～29.9min。
在本发明中，步骤(2)提取特征色谱峰的保留时间分别为：3.443min、4.825min、5.433min、6.061min、7.947min、10.099min、10.696min、11.543min、11.922min、12.640min、13.391min、14.437min、15.140min、15.533min、17.115min、22.439min、23.820min、24.811min、25.222min、25.991min、26.642min、26.903min、27.950min、28.841min、29.347min、29.806min。
本发明提供了一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法。该方法包括以下步骤：(1)建立待检测骨胶原肽供试品的HPLC指纹图谱；(2)然后筛选出特征色谱峰；(3)测定待检测骨胶原肽供试品的抗炎作用；(4)采用灰色关联度分析的方法建立谱效相关性分析，以评价共有峰的抗炎活性。本发明的有益之处为：
采用的骨胶原肽HPLC指纹图谱可以通过色谱峰的保留时间对共有特征峰进行识别，从而保证了共有峰识别的准确性与重复性；可直接通过骨胶原肽HPLC指纹图谱预测其抗炎活性，对骨胶原肽的优劣进行评价；且判别方法采用HPLC指纹图谱与数学模型结合的方法可避免人为因素造成的干扰。
通过采用本发明的方法，得知骨胶原肽中7号峰、1号峰、5号峰与抗炎活性关联度较高。本发明具有方法简便、客观性强、特征峰多等优点，有利于对骨胶原肽进行质量控制。
附图说明
图1为本发明所提供的13批骨胶原胶差异样品的HPLC指纹图谱；
图2为本发明所提供的HPLC指纹图谱对照图谱；
图3为差异样品对细胞上清液IL-1β水平测定结果；
图4为差异样品对细胞上清液TNF-α水平测定结果；
图5为差异样品对细胞上清液PGE2水平测定结果。
具体实施方式
本发明公开了一种基于谱效关系的骨胶原肽质量控制方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用技术方案如下：通过建立多肽的HPLC指纹图谱得到共有特征峰、通过建立细胞抗炎模型来测定多肽的抗炎因子指标，再根据HPLC指纹图谱特征峰的峰面积和抗炎指标建立灰色关联度分析，然后利用所建立的灰色关联度分析方法来评价化学成分与抗炎活性的关联度大小。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现，具体步骤如下：
步骤一：
(1)建立待检测骨胶原肽供试品的HPLC指纹图谱
a.供试品溶液制备方法为：称取0.1g骨胶原肽供试品，加入0.1mol/L的稀盐酸溶液溶解后转移至10mL量瓶中，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液；
b.溶液的衍生化反应：将供试品溶液和空白样品溶液分别置于离心管中，依次加入浓度为140μL/mL三乙胺的乙腈溶液和12.5μL/mL的异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，漩涡混合后，水浴40℃反应1h后，再向其中加入400μL正己烷，漩涡混合后，静置一段时间，取下层溶液，再向下层溶液中加入200μL正己烷，振摇，静置，取静置以后的下层溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤后，即得经衍生化的供试品溶液和经衍生化的空白样品溶液；
c.色谱测定：色谱条件为色谱柱采用氨基酸专用柱Sepax AAA，色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，填充颗粒大小为5μm，流动相A为0.1mol/L醋酸铵(pH6.5)∶乙腈＝93∶7，流动相B为80％乙腈水溶液，检测波长254nm，柱温36℃，体积流量1.0mL/min，进样量10μL，总时间为40min。
按以下条件进行梯度洗脱：
Figure BDA0001769045350000071
d.指纹图谱测定(根据中药色谱指纹图谱相似度筛选出特征峰)
精密吸取“步骤一：(1)a.”项下13批供试品溶液各10μL，按“步骤一：(1)d.”项下色谱条件依次测定，记录13批供试品溶液的色谱图。以峰面积较大、出峰时间居中的15号峰为参照峰，以相对保留时间标定共有峰，采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行模式识别，获得13批骨胶原肽差异样品的HPLC指纹图谱的共有模式，共标定了26个共有特征峰。以对照图谱为参照，各样品指纹图谱与对照图谱进行比较，13批差异样品指纹图谱的相似度分别为0.957、0.986、0.984、0.990、0.995、0.988、0.990、0.991、0.951、0.980、0.972、0.988、0.922。
根据“步骤一”制得13批骨胶原肽差异样品的HPLC指纹图谱，利用指纹图谱的相似度筛选出相应的特征峰，特征峰的保留时间分别为3.443min、4.825min、5.433min、6.061min、7.947min、10.099min、10.696min、11.543min、11.922min、12.640min、13.391min、14.437min、15.140min、15.533min、17.115min、22.439min、23.820min、24.811min、25.222min、25.991min、26.642min、26.903min、27.950min、28.841min、29.347min、29.806min。
步骤二：
(2)骨胶原肽抗炎活性的测定
a.样品溶液的处理
精密称取13批差异样品粉末4.0mg于无菌EP管中，在超净工作台中用移液枪分别定量加入2000μL的含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，涡旋振荡，待样品完全溶解于培养基后，用0.22μm的无菌微孔滤膜过滤，除菌，备用，样品浓度为2.0mg/mL。
b.细胞炎症模型的建立与给药
将对数生长期的C518大鼠膝关节软骨细胞均匀接种于96孔培养板，待培养24h细胞贴壁后，分组处理，对照组加完全培养基培养，模型组加入浓度为10.0mg/L的LPS，给药组同时加入10.0mg/L的LPS和2.0mg/mL的13批差异样品溶液，每组设3个复孔，于37℃、5％CO2条件下培养。
c.细胞上清液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平的抗炎指标评价
于37℃、5％CO2条件下培养3h后将细胞上清液转至EP管中，离心，取上清液，用Elisa试剂盒检测细胞上清液中IL-1β、PGE2和TNF-α含量，操作步骤按试剂盒说明书进行。
表1上清液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平测定结果
Figure BDA0001769045350000081
Figure BDA0001769045350000091
注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
步骤三：
(3)谱效关系分析
以13批骨胶原肽样品的HPLC指纹图谱为发明对象，采用灰色关联度分析对各特征峰与其抗炎活性进行谱效分析，以评价共有峰与抗炎活性指标之间的关联度，并进行关联度排序。
所述灰色关联分析，在本领域通常是指根据各比较数列构成的曲线与参考数列构成的曲线之间的几何相似程度来确定比较数列与参考数列间的关联度。几何形状越接近，关联程度越大。在本发明中，发明人将各抗炎活性指标处理为参考数列，将各差异样品的各共有峰面积处理为比较数列，用于计算各共有峰与抗炎活性指标之间的关联度，并进行排序。
根据本发明的方法，其中，在步骤(4)中，所述灰色关联分析(GRA)包括如下步骤：
1)将各差异样品的抗炎活性指标组成参考数列，将各差异样品的HPLC指纹图谱中各共有特征峰的峰面积组成比较数列；
2)对所述参考数列和比较数列进行无量纲化处理，优选采用均值化方法进行处理；
3)根据步骤2)所得无量纲化的参考数列和比较数列，计算各共有峰与抗炎活性之间的关联度；
4)对步骤3)所得关联度进行排序，以评价共有峰的抗炎活性。
更具体地，在计算关联度的过程中，可以按照本领域技术人员常用的下式计算关联系数：
Figure BDA0001769045350000092
其中，y(k)表示参考数列，xi(k)表示比较数列，ρ为分辨系数，通常取0.5。
然后再按照下式计算关联度：
Figure BDA0001769045350000093
所述的均值化方法，在本领域通常是指将每一变量值除以该变量的平均值。该方法在消除量纲和数量级影响的同时，保留了各变量取值差异程度上的信息，也保留了数据的可比性。
根据本发明的方法，其中，对于细胞上清液IL-1β水平，各自变量所代表的化学物质与抗炎活性间的关联度排序如下：P7＞P17＞P6＞P21＞P22＞P26＞P12＞P25＞P18＞P4＞P23＞P5＞P13＞P16＞P1＞P14＞P9＞P24＞P2＞P3＞P10＞P15＞P11＞P20＞P8＞P19，优选的，7号峰对应的化学物质对IL-1β的关联度最大。
根据本发明的方法，其中，对于细胞上清液TNF-α水平，各自变量所代表的化学物质与药效间的关联度排序如下：P5＞P7＞P4＞P14＞P1＞P3＞P2＞P21＞P6＞P22＞P13＞P12＞P15＞P26＞P16＞P17＞P9＞P10＞P8＞P24＞P11＞P18＞P25＞P23＞P20＞P19，优选的，5号峰对应的化学物质对TNF-α的关联度最大。
根据本发明的方法，其中，对于细胞上清液PGE2水平，各自变量所代表的化学物质与药效间的关联度排序如下：P1＞P15＞P4＞P7＞P13＞P22＞P3＞P21＞P14＞P12＞P6＞P2＞P5＞P8＞P16＞P26＞P9＞P17＞P10＞P24＞P18＞P25＞P23＞P11＞P20＞P19，优选的，1号峰对应的化学物质对PGE2的关联度最大。
本发明的有益之处：采用的骨胶原肽HPLC指纹图谱可以通过色谱峰的保留时间对共有特征峰进行识别，从而保证了共有峰识别的准确性与重复性；可直接通过骨胶原肽HPLC指纹图谱预测其抗炎活性，对骨胶原肽的优劣进行评价；且判别方法采用HPLC指纹图谱与数学模型结合的方法可避免人为因素造成的干扰。
本发明提供的基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
本发明在具体的实施方式中可采用的试验材料和仪器的相关信息如下：
1.细胞株：
C518大鼠膝关节软骨细胞，购自上海赛齐生物工程有限公司。
2.试剂：
脂多糖LPS(Sigma，冻干粉，规格10mg)；二甲基亚砜DMSO；DMEM培养基(Gibco，规格500mL)；胎牛血清FBS(Gibco，规格500mL)；胰蛋白酶(Hyclone，规格100mL)；双抗(Hyclone，规格100mL)；异硫氰酸苯酯(阿拉丁)；H2O2；醋酸铵；冰醋酸；三乙胺；乙腈；盐酸；超纯水。
3.试剂盒：
大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫分析(ELISA)；大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫分析(ELISA)；大鼠前列腺素(PGE2)酶联免疫分析(ELISA)。
4.供试品：
由无限极(中国)有限公司提供的13批骨胶原肽差异样品。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：待检测骨胶原肽供试品HPLC指纹图谱的建立
1.实验方法
1)供试品溶液制备方法：称取0.1g骨胶原肽样品，加0.1mol/L的稀盐酸溶液溶解后转移至10mL量瓶中，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液；
2)溶液的衍生化：将200μL空白样品溶液和供试品溶液分别置于离心管中，依次加入100μL浓度为140μL/mL三乙胺的乙腈溶液和100μL浓度为12.5μL/mL的异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，漩涡混合后，水浴40℃反应1h后，再向其中加入400μL正己烷，漩涡混合后，静置一段时间，取下层溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤后，即得经衍生化的空白样品溶液和经衍生化的供试品溶液。
3)色谱测定：色谱条件为色谱柱采用氨基酸专用柱Sepax AAA，色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，填充颗粒大小为5μm，流动相A为0.1mol/L醋酸铵(pH6.5)∶乙腈＝93∶7，流动相B为80％乙腈水溶液，检测波长254nm，柱温36℃，体积流量1.0mL/min，进样量10μL，总时间为40min。
2.实验结果
以峰面积较大、出峰时间居中的15号峰为参照峰，以相对保留时间标定共有峰，采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行模式识别，获得13批骨胶原肽差异样品指纹图谱的共有模式，并标定了26个特征共有峰。以对照图谱为参照，各样品指纹图谱与对照图谱进行比较，13批骨胶原肽差异样品指纹图谱的相似度分别为0.957、0.986、0.984、0.990、0.995、0.988、0.990、0.991、0.951、0.980、0.972、0.988、0.922。
实施例2：13批骨胶原肽差异样品药效学指标测定
1.实验方法
1)样品溶液的配制：
精密称取13批骨胶原肽样品粉末4.0mg于无菌EP管中，在超净工作台中用移液枪分别定量加入2000μL的含10％胎牛血清的DMEM完全培养基，涡旋振荡，待样品完全溶于培养基后，用0.22μm的无菌微孔滤膜过滤，除菌，备用，样品浓度为2.0mg/mL。
2)抗炎模型建立及给药方案
将对数生长期的C518大鼠膝关节软骨细胞均匀接种于96孔培养板，待24h细胞贴壁后，分组处理，对照组加完全培养基培养，模型组加入浓度为10.0μg/mL的LPS，给药组同时加入10.0μg/mL的LPS和2.0mg/mL的13批差异样品溶液，每组设3个复孔，于37℃、5％CO2条件下培养。
3)各抗炎活性指标测定方法
a)细胞上清液IL-1β水平试验
给药结束后，取细胞培养上清液，于4℃、3000r/min条件下离心20min，取上清液保存于-20℃。细胞上清液IL-1β水平的测定按照EILSA试剂盒说明书操作。
b)细胞上清液TNF-α水平试验
给药结束后，取细胞培养上清液，于4℃、3000r/min条件下离心20min，取上清液保存于-20℃。细胞上清液TNF-α水平的测定按照EILSA试剂盒说明书操作。
c)细胞上清液PGE2水平试验
给药结束后，取细胞培养上清液，于4℃、3000r/min条件下离心20min，取上清液保存于-20℃。细胞上清液PGE2水平的测定按照EILSA试剂盒说明书操作。
2.实验结果
1)细胞上清液IL-1β水平测定
实验结果表明：与空白对照组比较，经LPS诱导C518大鼠膝关节软骨细胞，细胞培养上清液中IL-1β含量显著升高，具有显著性差异，P<0.05，表明造模成功。给13批差异样品后，与LPS组比较，S1、S2、S10、S11、S12分泌的IL-1β含量显著降低，具有极显著性差异，P<0.01；S8、S9、S13分泌的IL-1β含量降低，具有显著性差异，P<0.05。
表2细胞上清液IL-1β水平测定结果
组别 IL-1β(ng/L)
空白组 69.66±4.32
LPS组 86.62±2.44<sup>#</sup>
S1 61.69±1.37<sup>**</sup>
S2 44.42±0.81<sup>**</sup>
S3 78.73±1.28
S4 81.94±0.28
S5 79.22±1.84
S6 85.00±2.99
S7 75.99±2.51
S8 69.37±4.56<sup>*</sup>
S9 72.15±5.55<sup>*</sup>
S10 42.46±4.70<sup>**</sup>
S11 54.56±2.10<sup>**</sup>
S12 59.48±3.28<sup>**</sup>
S13 74.5±3.15<sup>*</sup>
注：与空白组比较，#P<0.05；与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01
2)细胞上清液TNF-α水平测定结果
实验结果表明：与空白对照组比较，经LPS诱导C518大鼠膝关节软骨细胞，细胞培养上清液中TNF-α含量显著升高，具有显著性差异，P<0.05，表明均造模成功。给13批差异样品后，与LPS组比较，13批骨胶原肽分泌的TNF-α含量均显著降低，具有显著性差异，P<0.05，其中抑制TNF-α分泌最有效的为S1、S2、S3。
表3细胞上清液TNF-α水平测定结果
Figure BDA0001769045350000131
Figure BDA0001769045350000141
注：与空白组比较，#P<0.05；与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01
3)细胞上清液PGE2水平测定结果
实验结果表明：与空白对照组比较，经LPS诱导C518大鼠膝关节软骨细胞，细胞培养上清液中PGE2含量显著升高，具有显著性差异，P<0.05，表明均造模成功。给13批差异样品后，与LPS组比较，13批骨胶原肽分泌的PGE2含量均显著降低，具有极显著性差异，P<0.01，其中抑制PGE2分泌最有效的为S1、S2、S8。
表4细胞上清液PGE2水平测定结果
组别 PGE<sub>2</sub>(ng/L)
空白组 90.35±5.15
LPS组 115.10±5.20<sup>#</sup>
S1 40.79±9.56<sup>**</sup>
S2 47.10±2.81<sup>**</sup>
S3 59.56±0.02<sup>**</sup>
S4 52.57±5.22<sup>**</sup>
S5 74.69±2.90<sup>**</sup>
S6 49.68±2.81<sup>**</sup>
S7 55.84±4.92<sup>**</sup>
S8 40.79±9.97<sup>**</sup>
S9 52.57±7.47<sup>**</sup>
S10 55.84±4.92<sup>**</sup>
S11 49.68±6.29<sup>**</sup>
S12 52.57±9.80<sup>**</sup>
S13 68.82±2.89<sup>**</sup>
注：与空白组比较，#P<0.05；与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01
发明人测定了细胞上清液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平的抗炎活性，模型成立，正常组、样品组均与模型组的差异具有统计学意义。同时，发明人发现各差异样品之间具有活性的差异，有助于进行谱效综合分析、筛选和评价各活性成分。
实施例3：谱效关系分析
本实施例采用灰色关联度分析的方法，揭示多个自变量与一个因变量之间的关系，关联度的大小用于判别变量对指标影响的大小。
表5 13批差异样品的HPLC指纹图谱特征峰面积及抗炎活性规格化处理结果
Figure BDA0001769045350000151
续表5：
Figure BDA0001769045350000152
Figure BDA0001769045350000161
续表5：
样品 IL-1β PGE<sub>2</sub> TNF-α
S1 1.314 1.214 1.478
S2 2.225 1.111 2.073
S3 0.416 0.907 1.974
S4 0.247 1.021 0.972
S5 0.390 0.660 1.082
S6 0.085 1.068 1.325
S7 0.560 0.968 0.286
S8 0.909 1.214 0.448
S9 0.763 1.021 0.652
S10 2.328 0.968 0.887
S11 1.690 1.068 0.460
S12 1.431 1.021 0.664
S13 0.639 0.756 0.724
1.实验方法
(1)灰色关联分析
灰色关联分析(GRA)的基本步骤包括：
1)以各差异样品的抗炎活性指标组成参考数列，以各差异样品的指纹图谱中的各共有峰峰面积组成比较数列；
2)对参考数列和比较数列进行无量纲化处理；优选采用均值化方法进行处理；
3)根据无量纲化的参考数列和比较数列，计算各共有峰与抗炎活性之间的关联度；
4)对步骤3)所得关联度进行排序。
更具体地，在计算关联度的过程中，可以按照本领域技术人员常用的下式计算关联系数：
Figure BDA0001769045350000171
其中，y(k)表示参考数列，xi(k)表示比较数列，ρ为分辨系数，通常取0.5。
然后再按照下式计算关联度：
Figure BDA0001769045350000172
所述均值化方法，在本领域通常是指将每一变量值除以该变量的平均值。该方法在消除量纲和数量级影响的同时，保留了各变量取值差异程度上的信息，也保留了数据的可比性。
2.实验结果
1)细胞上清液IL-1β水平
进行灰色关联度分析
从表6可得，各自变量所代表的化学物质与IL-1β间的关联度排序如下：P7＞P17＞P6＞P21＞P22＞P26＞P12＞P25＞P18＞P4＞P23＞P5＞P13＞P16＞P1＞P14＞P9＞P24＞P2＞P3＞P10＞P15＞P11＞P20＞P8＞P19。
其中P7所对应的峰与IL-1β间的关联度最大，这提示7号峰与IL-1β的关系最为密切。
关联度大于0.7所对应的峰(P17＞......＞P20)对抗炎活性也起着一定协同作用。
表6细胞上清液IL-1β水平灰色关联度分析结果
Figure BDA0001769045350000173
Figure BDA0001769045350000181
2)细胞上清液TNF-α水平
进行灰色关联度分析
从表2可得，各自变量所代表的化学物质与TNF-α间的关联度排序如下：P5＞P7＞P4＞P14＞P1＞P3＞P2＞P21＞P6＞P22＞P13＞P12＞P15＞P26＞P16＞P17＞P9＞P10＞P8＞P24＞P11＞P18＞P25＞P23＞P20＞P19。
其中P5所对应的峰与TNF-α间的关联度最大，这提示5号峰与TNF-α的关系最为密切。
关联度大于0.7所对应的峰(P7＞......＞P16)对抗炎活性也起着一定协同作用。
表7细胞上清液TNF-α水平灰色关联度分析结果
峰号 tR/min 关联度
1 3.443 0.7250
2 4.825 0.7191
3 5.433 0.7217
4 6.061 0.7267
5 7.947 0.7580
6 10.099 0.7181
7 10.696 0.7347
8 11.543 0.6708
9 11.922 0.6819
10 12.640 0.6774
11 13.391 0.6495
12 14.437 0.7118
13 15.140 0.7151
14 15.533 0.7263
15 17.115 0.7069
16 22.439 0.6933
17 23.820 0.6858
18 24.811 0.6476
19 25.222 0.6013
20 25.991 0.6122
21 26.642 0.7189
22 26.903 0.7170
23 27.950 0.6448
24 28.841 0.6549
25 29.347 0.6465
26 29.806 0.7043
3)细胞上清液PGE2水平
进行灰色关联度分析
从表3可得，各自变量所代表的化学物质与PGE2间的关联度排序如下：P1＞P15＞P4＞P7＞P13＞P22＞P3＞P21＞P14＞P12＞P6＞P2＞P5＞P8＞P16＞P26＞P9＞P17＞P10＞P24＞P18＞P25＞P23＞P11＞P20＞P19。
其中P1所对应的峰与PGE2间的关联度最大，这提示1号峰与PGE2的关系最为密切。
关联度大于0.8所对应的峰(P15＞......＞P26)与抗炎活性也有着紧密联系。
表8细胞上清液PGE2水平灰色关联度分析结果
Figure BDA0001769045350000201
Figure BDA0001769045350000211
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种骨胶原肽的HPLC检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：将骨胶原肽供试品与稀盐酸混合，取滤液作为供试品溶液；
衍生化：将所述供试品溶液、三乙胺的乙腈溶液和异硫氰酸苯酯的乙腈溶液混合后进行衍生反应，再加入正己烷，混匀后静置分层，将下层溶液过滤后得到衍生化的供试品溶液；
色谱检测：采用高效液相色谱对衍生化的供试品溶液进行检测，色谱条件为：色谱柱为氨基酸专用柱Sepax AAA；流动相A为醋酸铵溶液与乙腈的混合溶液，所述醋酸铵溶液与乙腈的体积比为(90～95)：(5～10)；流动相B为体积百分含量为70％～90％的乙腈水溶液；梯度洗脱程序为：
0min→15min，流动相A：100％→80％；流动相B：0％→20％；
15min→18min，流动相A：80％→72％；流动相B：20％→28％；
18min→25min，流动相A：72％→50％；流动相B：28％→50％；
25min→30min，流动相A：50％→50％；流动相B：50％→50％；
30min→30.01min，流动相A：50％→0％；流动相B：50％→100％；
30.01min→40min，流动相A：0％→0％；流动相B：100％→100％；
所述色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，填充颗粒大小为5μm；所述流动相A中醋酸铵溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，pH值为6.5；色谱条件中流速为0.8～1.2mL/min，检测器为二极管阵列检测器；检测波长为253～255nm；柱温为35～37℃；进样量为8～12μL，总时间不少于40min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，以g/mL计，所述骨胶原肽供试品与稀盐酸的比例为0.1：(9～11)，所述稀盐酸的浓度为0.08～0.12mol/L。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，供试品溶液、三乙胺的乙腈溶液与异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的体积比为(1.0～4.0)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，三乙胺的乙腈溶液的浓度为130～150μL/mL，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的浓度为12～13μL/mL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生反应的温度为38～42℃，时间为0.8～1.2h，供试品溶液与正己烷的体积比为(0.5～1.2)：(1.0～2.4)。
5.一种基于谱效关系的骨胶原肽质量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)建立骨胶原肽的HPLC指纹图谱；所述HPLC指纹图谱的检测方法为权利要求1至4中任一项所述的检测方法；
(2)提取特征色谱峰；
(3)测定骨胶原肽的抗炎活性；
(4)将步骤(2)所识别特征峰的峰面积和步骤(3)所得的抗炎活性进行灰色关联度分析，并计算各共有峰与抗炎活性之间的关联度，评价特征峰的抗炎活性。
6.根据权利要求5所述的骨胶原肽质量检测方法，其特征在于，所述步骤(3)测定骨胶原肽的抗炎活性为：
将膝关节软骨细胞接种，加入LPS诱导细胞炎症，将骨胶原肽供试品溶液加入到细胞中，培养2.5～3.5h后，测定细胞上清液中IL-1β、TNF-α、PGE2水平。
7.根据权利要求5所述的骨胶原肽质量检测方法，其特征在于，所述灰色关联度分析步骤如下：
1)将各差异样品的抗炎活性指标组成参考数列，将各差异样品的指纹图谱中的各特征峰峰面积组成比较数列；
2)对所述参考数列和比较数列进行无量纲化处理，所述处理为采用均值化方法进行处理；
3)根据步骤2)所得无量纲化的参考数列和比较数列，计算各共有峰与抗炎活性之间的关联度；
4)对步骤3)所得关联度进行排序，评价共有峰的抗炎活性。
8.根据权利要求7所述的骨胶原肽质量检测方法，其特征在于，所述关联度的计算方法为：
采用下式计算关联系数：
Figure FDA0002883924740000031
其中，y(k)表示参考数列，xi(k)表示比较数列，ρ为分辨系数，ρ值取0.5；
然后再按照下式计算关联度：
Figure FDA0002883924740000032
9.根据权利要求5所述的骨胶原肽质量检测方法，其特征在于，所述步骤(2)提取特征色谱峰的保留时间分别为：3.3～3.5min、4.7～4.9min、5.3～5.5min、5.9～6.1min、7.8～8.0min、9.9～10.1min、10.5～10.7min、11.4～11.6min、11.8～12.0min、12.5～12.7min、13.2～13.4min、14.3～14.5min、15.0～15.2min、15.4～15.6min、17.0～17.2min、22.3～22.5min、23.7～23.9min、24.7～24.9min、25.1～25.3min、25.8～26.0min、26.5～26.7min、26.8～27.0min、27.7～28.0min、28.7～28.9min、29.2～29.4min、29.6～29.9min。
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东北林蛙皮胶原蛋白理化性质及胶原多肽活性研究;李梁;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊) 医药卫生科技辑》;20170215(第2期);第34页表3-2；第35页第3.3.4.1节，第3.3.4.2节；第42页图3-8，第42-43页表3-2；第44页第4.1节 *
李梁.东北林蛙皮胶原蛋白理化性质及胶原多肽活性研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊) 医药卫生科技辑》.2017,(第2期),第E057-277页. *
梅花鹿胶原蛋白制备及治疗骨质疏松症作用研究;张鹤;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊) 工程科技Ⅰ辑》;20120415(第4期);第B016-264页 *
龟甲中促皮肤和骨修复愈合作用成分分析研究;骆达;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊) 医药卫生科技辑》;20090115(第1期);第E057-277页 *

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