CN109991340B - 基于谱效关系的制首乌的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药质量标准检测的技术领域，公开了制首乌的质量检测方法。本发明所述制首乌的质量检测方法基于HPLC‑DPPH联用技术，将制首乌的指纹图谱及清除DPPH活性指纹图谱与活性共有峰进行谱效相关性研究，以制首乌抗氧化效果来判断制首乌品质优劣，建立科学、完善的制首乌抗氧化质量评控标准。本发明所述质量检测方法响应快速、结果直观、定性准确、操作简单、重现性良好。

Description

基于谱效关系的制首乌的质量检测方法

技术领域

本发明属于中药质量标准检测的技术领域，具体是涉及制首乌的质量检测方法，尤其是基于谱效关系的制首乌的质量检测方法。

背景技术

何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)又名多花蓼、紫乌藤、夜交藤等，是蓼科蓼族何首乌属多年生缠绕藤本植物，块根肥厚，长椭圆形，黑褐色。何首乌其块根又称生首乌，可以直接入药。生首乌味苦、甘、色，性微温，归肝、心、肾经，具有解毒、消痈、截疟和润肠通便的功效，临床上常用于疮痈、瘰疬、风疹瘙痒、久疟体虚、肠燥便秘等。

生首乌经过深加工，可得制首乌。生首乌经清蒸或用黑豆汁拌匀后蒸至内外均呈棕褐色，成为制首乌。制首乌表面黑褐色或棕褐色，凹凸不平。质坚硬，断面角质样，棕褐色或黑色。气微，味微甘而苦涩。制首乌功偏补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂，临床上为血虚微黄、眩晕耳鸣、须发早白、腰膝酸软常用药。制首乌微温不燥，补而不腻，《本草纲目》云：“养血益肝，固精益肾，健筋骨，乌须发，为滋补良药”。制首乌作为传统的抗衰老中草药，功效卓著。文献报道制首乌具有延长细胞周期、提高DNA损伤后修复能力的作用，从而发挥延长机体平均寿命的功效。现代化学研究表明，制首乌主要含有蒽醌、二苯乙烯苷、磷脂、羟基蒽醌类衍生物及非淀粉多糖，还含有17种游离氨基酸，以及少量的铜、锌、铁、锰等人体必需微量元素。此外现代研究表明制首乌还具有较强的抗氧化作用，能降低心、肝、脑等组织中脂质过氧化物(LPO)的含量，提高机体组织细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及减少氧自由基对组织细胞的损害。

然而目前针对制首乌的质量标准均仅着眼于少数活性成分的定性分析，目前仍缺乏一个与药效明显关联并且具体量化的标准与方法。故而，目前尚缺乏对制首乌药材优劣性的有效科学的质量评估方法，尤其是检测制首乌药材抗氧化的优劣性的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于谱效关系的制首乌的质量检测方法，借助活性部位和统计学方法，将制首乌的指纹图谱及清除DPPH活性指纹图谱与活性共有峰进行谱效相关性研究，以制首乌抗氧化效果来判断其品质优劣的质量检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种制首乌的质量检测方法，包括如下步骤：

1)制备制首乌的醇溶部位；

2)建立HPLC色谱检测条件；

3)优化DPPH条件；

4)利用HPLC-DPPH联用技术进行在线抗氧化制首乌活性分析，根据制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱选取制首乌抗氧化活性共有峰，建立制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱和抗氧化活性的峰效函数关系；

5)以制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱和制首乌抗氧化活性共有峰建立质量标准，利用所建立的质量标准直接评价制首乌质量。

其中，制首乌的醇溶部位为水提醇沉上清液过大孔树脂后经95％乙醇洗脱的部位，制首乌水部位为水提醇沉上清液过大孔树脂后经水洗脱的部位。只有制首乌的醇溶部位、制首乌的水部位检测才能连接抗氧化活性检测装置。而且申请人前期实验表明，制首乌的醇溶部位的抗氧化IC50值比其他部位低10倍至近1000倍，其反应最灵敏，且检测抗氧化能力的检测器只能和PDA检测器搭建，因此本发明以制首乌的醇溶部位作为检测样品进行质量检测方法。

作为优选，步骤1)中所述制首乌醇溶部位的制备方法为取制首乌粉末加水提取，浓缩提取液，加入无水乙醇至含醇量为50％，离心；上清液加无水乙醇浓缩至含醇量为80％，离心；浓缩上清液，用D101型大孔树脂富集，水洗脱后，以95％乙醇洗脱即得制首乌醇溶部位。

本发明所述制首乌的质量检测方法采用的HPLC-DPPH联用技术。

其中，作为优选，所述HPLC色谱条件为采用Agela Venusil MP C18(250mm×46mm×5μm)色谱柱，检测波长254nm，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量15μL，按如下条件进行梯度洗脱

时间(min)	乙腈(％)	0.1磷酸水(％)
			0	6	94
6	6	94
			10	10	90
15	10	90
			25	15	85
45	20	80
			70	30	70
75	35	65
			85	60	40
90	65	35
			100	65	35
105	100	0
			110	100	0

进一步的，在本发明一些实施方案中，对DPPH条件进行优化。所述DPPH条件的优化为分别测试P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入的DPPH流速、DPPH浓度、PEEK管长度、PEEK管内径对抗氧化活性测定的影响。具体为：

1)DPPH流速考察：分别测试P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入的DPPH流速为0.3～0.9mL/min时，对抗氧化活性测定的影响；

2)DPPH浓度考察：分别测试P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入的DPPH浓度为1×10^-5～1×10^-4mol/L时，对抗氧化活性测定的影响；

3)PEEK管长度考察：分别测试连接长度为1～6m的PEEK管，对抗氧化活性测定的影响；

4)PEEK管内径考察：分别测试连接内径为0.1～0.5mm的PEEK管，对抗氧化活性测定的影响。

作为优选，所述优化的DPPH条件为P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入的DPPH流速为0.4mL/min，DPPH浓度为1.0×10^-4mol/L，PEEK管长度为6m，PEEK管内径为0.1mm。

本发明所述质量检测方法步骤4)利用HPLC-DPPH联用技术进行在线抗氧化制首乌活性分析，根据制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱选取制首乌抗氧化活性共有峰，建立制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱和抗氧化活性的峰效函数关系。

其中，作为优选，所述制首乌抗氧化活性共有峰为二苯乙烯苷类成分。

进一步的，所述制首乌抗氧化活性共有峰具体为反式2,3,5,4-四羟基二苯乙烯四羟基芪-2-O-β-d葡萄糖苷、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷和甲氧基-乙酰基-甲基胡桃醌-葡萄糖苷。

作为优选，所述峰效函数关系的建立是以二苯乙烯苷为阳性参比，建立二苯乙烯苷清除DPPH的峰效数学模型，以X为二苯乙烯苷浓度(mg/mL)，Y为活性共有峰峰面积，得到函数关系：Y＝280226.05X-9523.83X²+123.44X³+25866.5，R²＝0.9992。

本发明所述质量检测方法步骤5)以制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱和制首乌抗氧化活性共有峰建立质量标准，利用所建立的质量标准直接评价制首乌质量。

其中，所述质量标准的建立是结合多批制首乌的化学指纹图谱和活性指纹图谱，以其中的活性共有峰对色谱共有峰总峰面积平均占比的80％为质量标准；运用中药指纹图谱相似度评价软件，对多批制首乌进行相似度分析，选取相似度最小值为质量标准。

作为优选，所述质量标准是以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷为特征峰，以活性共有峰峰面积对色谱共有峰总峰面积平均占比的80％作为质控下限，醇溶部位活性成分峰占比不得低于53.16％；

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度不得低于0.99；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸水为流动相，按上述条件进行梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长254nm，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷与相邻峰的分离度应大于2.5。

本发明所述制首乌的质量检测方法基于HPLC-DPPH联用技术，将制首乌的指纹图谱及清除DPPH活性指纹图谱与活性共有峰进行谱效相关性研究，以制首乌抗氧化效果来判断制首乌品质优劣，建立科学、完善的制首乌抗氧化质量评控标准。本发明所述质量检测方法响应快速、结果直观、定性准确、操作简单、重现性良好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为制首乌样品对不同浓度DPPH的清除作用比较图，其中A：2×10^-4mol/L；B：1×10^-4mol/L；C：7×10^-5mol/L；D：5×10^-5mol/L；E：3×10^-5mol/L；F：1×10^-5mol/L；

图2为制首乌药材化学指纹图谱；

图3为制首乌药材活性指纹图谱；

图4为制首乌药材活性共有峰指纹图谱；

图5为二苯乙烯苷抗氧化能力峰效函数关系曲线；

图6为不同批次制首乌共有峰抗氧化活性对比图。

具体实施方式

本发明公开了基于谱效关系的制首乌的质量检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1.溶液制备：

1)制首乌醇溶部位：取一定量制首乌粉末，以10倍量去离子水加热回流提取两次，旋蒸减压浓缩提取液至料液比1:2；浓缩液加无水乙醇至含醇量为50％，离心；上清液加无水乙醇浓缩至含醇量为80％，离心；浓缩上清液，用D101型大孔树脂富集，水洗脱后，以95％乙醇洗脱，即得制首乌醇溶部位；

2)对照品溶液：称取二苯乙烯苷对照品适量，50％乙醇溶解，配置成10mg/mL的二苯乙烯苷对照品溶液；

3)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液：称取DPPH适量，溶解于甲醇中，配置成浓度为1×10^-3mol/L的DPPH母液，4℃避光存放。

实施例2.HPLC色谱条件的建立：

采用Agela Venusil MP C18(250mm×46mm×5μm)色谱柱，检测波长254nm，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量15μL，洗脱条件见表1

表1梯度洗脱条件

时间(min)	乙腈(％)	0.1磷酸水(％)
			0	6	94
6	6	94
			10	10	90
15	10	90
			25	15	85
45	20	80
			70	30	70
75	35	65
			85	60	40
90	65	35
			100	65	35
105	100	0
			110	100	0

实施例3.DPPH条件的优化：

1)DPPH流速考察：

外接泵流速影响样品与DPPH的反应程度，样品流速一定的情况下，外接泵流速过快会导致样品和DPPH反应时间缩短，响应时间达不到系统要求，则使DPPH清除不完全。流速过慢又使响应时间过长，致使样品冗余流失而DPPH不足，导致清除效果反而减弱。

分别测试P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入的DPPH流速为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL/min时，对抗氧化活性测定的影响，结果如表2所示，选择0.4mL/min为最佳流速。

表2不同流速的DPPH对样品测定的影响

流速(mL/min)	倒峰面积
		0.3	774665
0.4	833195
		0.5	777425
0.6	698287
		0.7	621828
0.8	504944
		0.9	464807

2)DPPH浓度考察：

DPPH浓度过低，导致DPPH与样品反应不完全，活性峰峰面积过小；DPPH浓度过高，致使样品清除DPPH不完全。随着DPPH浓度增加，其倒峰面积也随即增加，当浓度到达峰值，其倒峰面积也趋于而稳定。

分别测试P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入的DPPH浓度为1×10^-5、3×10^-5、5×10^-5、7×10^-5、1×10^-4mol/L时，对抗氧化活性测定的影响，结果如表3所示，暂定1.0×10^-4mol/L为DPPH浓度，后续以样品代替二苯乙烯苷对照品进样以考察DPPH最佳浓度。

表3不同浓度的DPPH对样品测定的影响

浓度(mol/L)	倒峰面积
		1×10<sup>-5</sup>	191518
3×10<sup>-5</sup>	563171
		5×10<sup>-5</sup>	880774
7×10<sup>-5</sup>	1263688
		1×10<sup>-4</sup>	151004

3)PEEK管长度及内径考察：

PEEK管长度越长，样品与DPPH的反应时间越长，反应越完全，但相应的系统压力越大，因此本实验以系统能承受最大压力内的最大长度为选取标准，分别测试连接长度为1、3、4.5、6m，内径为0.1、0.5mm的PEEK管，对抗氧化活性测定的影响，结果如表4所示，选择倒峰面积最大时对应的PEEK管长度6m进行后续研究。而PEEK管内径则决定活性峰的峰展宽，根据表5结果，选择0.1mm PEEK管进行后续研究。

表4不同长度的DPPH对样品测定的影响

长度(m)	倒峰面积
		1	23018
3	242310
		4.5	306478
6	391153

表5不同内径的DPPH对样品测定的影响

内径(mm)	峰宽
		0.1	1.007
0.5	4.235

4)样品进样考察：随机选择一批制首乌醇溶部位样品(生药量0.5g/mL)进样，全面考察样品对浓度分别为1×10^-5、3×10^-5、5×10^-5、7×10^-5、1×10^-4、2×10^-4mol/L的DPPH溶液的抗氧化作用，结果如表6所示。

表6不同浓度的DPPH对样品测定的影响

浓度(mol/L)	倒峰面积
		1×10<sup>-5</sup>	179381
3×10<sup>-5</sup>	565166
		5×10<sup>-5</sup>	874686
7×10<sup>-5</sup>	1278461
		1×10<sup>-4</sup>	1783738
2×10<sup>-4</sup>	4073053

结果表明，当DPPH溶液浓度为1×10^-4mol/L时，其倒峰面积较大，且基线相对平稳，噪音小(见图1)；而当DPPH浓度继续升高，倒峰面积增大，但基线不平且噪音明显变大，因此选择1×10^-4mol/L作为DPPH浓度。

实施例4.HPLC-DPPH联用系统在线分析

运用已搭建的HPLC-DPPH联用系统，选择优化后的最优分析条件，对16批不同批次、不同炮制方法的制首乌的醇溶部位进行在线抗氧化活性分析，并鉴定其中抗氧化活性成分。制首乌样品信息见上述表7。

表7制首乌样品信息

编号	炮制方法	批号	编号	炮制方法	批号
						S01	黑豆	201506001	S09	高压	201506008
S02	黑豆	201506002	S10	高压	201506009
						S03	黑豆	201506003	S11	黑豆黄酒	201506004
S04	黑豆	201512001	S12	黑豆黄酒	201506005
						S05	黑豆	201512003	S13	黑豆黄酒	201506006
S06	黑豆	201512005	S14	黑豆黄酒	201512002
						S07	黑豆	201512007	S15	黑豆黄酒	201512004
S08	高压	201506007	S16	黑豆黄酒	201512006

注：相同炮制方法下不同编号代表各炮制方法下分不同批次生产的炮制品

其中黑豆制何首乌的方法为：取何首乌饮片20.0kg，共8桶，置容器中，按照《中国药典》2015年版蒸法通则(0213)，加黑豆汁5.0L拌匀，不断搅拌使何首乌饮片均匀吸附黑豆汁，待黑豆汁吸尽(约9h)，将何首乌饮片置于不锈钢桶内(不加盖)，连续蒸制32h，于不同时间点取样，取样同时将剩余样品趁热翻动后继续蒸制。每次取出2桶，晾凉，拌回蒸液，晾干表面水分，50℃烘箱吹风干燥至含水量小于12％。

高压制何首乌的方法为：取何首乌饮片20.0kg，置容器中，按照《中国药典》2015年版蒸法通则(0213)，加水5.0L拌匀，不断搅拌使何首乌饮片均匀吸水，待水吸尽(约9h)，将何首乌饮片置于不锈钢桶内(不加盖)，连续蒸制32h，于不同时间点取样，取样同时将剩余样品趁热翻动后继续蒸制。每次取出2桶，晾凉，拌回蒸液，晾干表面水分，50℃烘箱吹风干燥至含水量小于12％。

黑豆黄酒制何首乌的方法为：取何首乌饮片20.0kg，置容器中，按照《中国药典》2015年版蒸法通则(0213)，加豆汁黄酒5.0L拌匀，不断搅拌使何首乌饮片均匀吸附豆汁黄酒，待豆汁黄酒吸尽(约9h)，置于不锈钢桶内(不加盖)，连续蒸制32h，于不同时间点取样，取样同时将剩余样品趁热翻动后继续蒸制。每次取出2桶，晾凉，拌回蒸液，晾干表面水分，50℃烘箱吹风干燥至含水量小于12％。

1)色谱条件：同实施例2色谱条件

2)外接设备条件：P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入DPPH流速0.4mL/min，浓度1.0×10^{- 4}mol/L；PEEK管长度6m，内径0.1mm。

3)图谱结果：

如图2所示，各批次制首乌共有峰基本相同，但不同批次的总峰数有差别，样品S07、S09和S10在主峰之前的峰数多于其他批次，样品S04、S05、S07、S09和S10在主峰之后的峰数多于其他批次，这可能是由于制首乌品种及炮制方法的不同所致。各批次制首乌化学指纹图谱数据见表8。

表8不同批次制首乌各化学共有峰峰面积

峰样品	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													S01	48260	39344	268561	523555	12725842	183623	34921	360458	1090127	878592	91344	37724
S02	47185	27030	243307	654517	13078456	203933	39165	359157	992643	782948	122499	38378
													S03	45268	25160	282281	409306	11464385	140863	33097	321668	734687	574054	81756	34411
S04	59069	50181	173611	155734	11558504	106104	28727	193779	548033	422654	282901	41063
													S05	31729	80081	164684	185394	12398937	186683	81946	228156	726733	566226	214073	31078
S06	41608	30785	285276	148732	11271069	180138	37178	221245	577333	433510	124202	40360
													S07	56778	81727	306526	616001	14234069	137493	57646	260342	720929	582942	355315	59388
S08	50310	54597	250313	179963	13707486	254466	36236	308485	1184002	942999	216416	69278
													S09	53182	70305	277951	179383	14823207	347928	39354	379822	1420226	1150095	208801	33613
S10	66076	79393	316450	252069	15665689	334331	43924	416880	1178343	962565	206271	73506
													S11	48808	36266	210233	96011	11501669	260265	42781	227698	1183488	941332	143901	30608
S12	50830	26251	210662	147648	11688444	249656	42285	221294	1116042	885507	145406	20764
													S13	56018	44305	188166	236898	12113632	293830	46342	225987	1198429	956232	169235	35227
S14	49397	78085	254404	185359	9458847	110714	29978	179947	481002	374856	75560	33583
													S15	45403	63286	239197	402943	14324392	325962	33304	358121	1248473	1005854	209074	28331
S16	35062	49308	244686	187080	10157092	152401	35101	193248	501431	399778	89728	36790

通过运用HPLC-DPPH联用系统对16批制首乌样品进行分析，得到各批次制首乌抗氧化活性图谱，如图3所示。由图可知，不同批次不同炮制方法的制首乌均具有抗氧化活性，根据活性峰数及峰面积可以判断各批次制首乌抗氧化活性强弱不同。各批次制首乌活性共有峰峰面积见表9。

表9不同批次制首乌各活性共有峰峰面积

峰样品	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													S01	103965	54199	117995	69863	2149152	452186	32978	671876	54340	53536	69185	84481
S02	131772	80228	159003	69767	2014658	467318	55683	635293	54000	58360	77902	84976
													S03	137765	65425	151930	57110	1899679	409608	59878	635562	29885	29113	59284	82151
S04	116577	122657	144314	88397	1701805	285882	41802	350889	22613	10597	33773	51546
													S05	118419	180674	161969	78941	1823457	394870	53173	426412	27508	30451	61947	58993
S06	122328	120897	182902	72602	1723058	422938	54628	391285	24790	27078	67317	76536
													S07	119793	143504	132720	64876	1632890	280013	41936	327563	/	/	30879	87067
S08	134239	/	93110	62043	1685687	448216	32751	449722	32604	33933	64495	136777
													S09	147241	134889	169181	54271	1806337	500489	46985	520058	47125	36897	75860	138313
S10	97665	100666	108115	39115	1692224	420279	35598	459588	19740	20488	59151	108630
													S11	151407	54850	165266	47837	1796806	561880	48053	442403	56397	52120	99543	90381
S12	143189	35297	145107	67602	1795921	550557	46464	438904	60432	57564	95672	89843
													S13	64377	33795	134928	64059	1679755	588669	42366	416583	46868	46387	91221	102816
S14	122518	31879	118311	52311	1412121	312991	28093	347127	27325	27127	42229	60281
													S15	110862	133573	166474	58441	1864547	544078	57240	533890	39882	40374	101374	105895
S16	100191	83393	124455	51034	1455501	378441	37301	345742	23110	19887	42671	59615

根据表9数据，各活性共有峰峰面积相对活性共有峰总面积贡献度见表10，结果表明峰5、6、8对总峰面积贡献度较高。

表10各活性共有峰面积相对活性共有峰总面积贡献度(％)

峰样品	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													S01	2.66	1.38	3.01	1.79	54.91	11.55	0.84	17.17	1.39	1.37	1.77	2.16
S02	3.39	2.06	4.09	1.79	51.80	12.02	1.43	16.34	1.39	1.50	2.00	2.19
													S03	3.81	1.81	4.20	1.58	52.52	11.32	1.66	17.57	0.83	0.80	1.64	2.27
S04	3.92	4.13	4.86	2.98	57.28	9.62	1.41	11.81	0.76	0.36	1.14	1.74
													S05	3.47	5.29	4.74	2.31	53.37	11.56	1.56	12.48	0.81	0.89	1.81	1.73
S06	3.72	3.68	5.57	2.21	52.43	12.87	1.66	11.91	0.75	0.82	2.05	2.33
													S07	4.19	5.02	4.64	2.27	57.07	9.79	1.47	11.45	/	/	1.08	3.04
S08	4.23	/	2.93	1.95	53.12	14.12	1.03	14.17	1.03	1.07	2.03	4.31
													S09	4.00	3.67	4.60	1.48	49.12	13.61	1.28	14.14	1.28	1.00	2.06	3.76
S10	3.09	3.18	3.42	1.24	53.53	13.29	1.13	14.54	0.62	0.65	1.87	3.44
													S11	4.24	1.54	4.63	1.34	50.37	15.75	1.35	12.40	1.58	1.46	2.79	2.53
S12	4.06	1.00	4.11	1.92	50.93	15.61	1.32	12.45	1.71	1.63	2.71	2.55
													S13	1.94	1.02	4.07	1.93	50.72	17.77	1.28	12.58	1.42	1.40	2.75	3.10
S14	4.74	1.23	4.58	2.03	54.68	12.12	1.09	13.44	1.06	1.05	1.64	2.33
													S15	2.95	3.56	4.43	1.56	49.63	14.48	1.52	14.21	1.06	1.07	2.70	2.82
S16	3.68	3.06	4.57	1.88	53.48	13.91	1.37	12.70	0.85	0.73	1.57	2.19

PDA外接检测器及HPLC自带检测器可同时获得制首乌化学指纹图谱与清除DPPH活性指纹图谱，选取各批次抗氧化能力较强的12个共有峰作为制首乌抗氧化活性共有峰，如图4所示。由结果可知，峰5、6、8对DPPH产生了较强的清除作用。根据HPLC-MS鉴定、标准品对比等，这几个活性共有峰分别为反式2,3,5,4-四羟基二苯乙烯四羟基芪-2-O-β-d葡萄糖苷(trans-2,3,5,4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside)、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(2,3,5,4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-(galloyl)-glucoside)和甲氧基-乙酰基-甲基胡桃醌-葡萄糖苷(methoxyl-acetyl-methyljuglone-glucoside)，均属二苯乙烯苷类成分。

4)活性评价：

以二苯乙烯苷为阳性参比，建立二苯乙烯苷清除DPPH的峰效数学模型，以X为二苯乙烯苷浓度(mg/mL)，Y为活性共有峰峰面积，得到函数关系：Y＝280226.05X-9523.83X²+123.44X³+25866.5(R²＝0.9992)，峰效函数关系曲线见图5。

表11标准品峰面积与抗氧化能力的峰效函数关系方程

浓度(mg/mL)	倒峰面积
		0.1	20679
0.2	41077
		1	323067
2	622623
		8	1696870
16	2561458
		24	2991964
32	3279621

假设二苯乙烯苷(1mg/mL)为一个活性单位(1U)，按表9不同批次制首乌各活性共有峰峰面积，根据峰效函数关系得出16批制首乌样品各活性共有峰的相对抗氧化活性及抗氧化总活性，结果如表12所示(见图6)。

表12不同批次制首乌各活性共有峰抗氧化活性

峰样品	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	总活性
														S01	0.28	0.10	0.33	0.16	11.25	1.61	0.03	2.51	0.10	0.10	0.16	0.21	16.84
S02	0.38	0.20	0.48	0.16	10.12	1.67	0.11	2.36	0.10	0.12	0.19	0.21	16.10
														S03	0.40	0.14	0.46	0.11	9.24	1.44	0.12	2.36	0.01	0.01	0.12	0.20	14.61
S04	0.33	0.35	0.43	0.22	7.87	0.96	0.06	1.21	/	/	0.03	0.09	11.55
														S05	0.33	0.56	0.49	0.19	8.69	1.38	0.10	1.50	0.01	0.02	0.13	0.12	13.52
S06	0.35	0.34	0.57	0.17	8.01	1.49	0.10	1.37	/	/	0.18	0.18	12.76
														S07	0.34	0.43	0.39	0.14	7.43	0.94	0.06	1.12	/	/	0.02	0.22	11.09
S08	0.39	/	0.24	0.13	7.77	1.59	0.02	1.60	0.02	0.03	0.14	0.40	12.33
														S09	0.44	0.39	0.52	0.10	8.57	1.80	0.08	1.88	0.08	0.04	0.18	0.41	14.49
S10	0.26	0.27	0.30	0.05	7.81	1.48	0.03	1.64	/	/	0.12	0.30	11.96
														S11	0.45	0.10	0.51	0.08	8.51	2.05	0.08	1.57	0.11	0.09	0.27	0.23	14.05
S12	0.42	0.03	0.43	0.15	8.50	2.01	0.07	1.55	0.12	0.11	0.25	0.23	13.87
														S13	0.14	0.03	0.39	0.14	7.73	2.16	0.06	1.47	0.08	0.07	0.24	0.28	12.79
S14	0.35	0.02	0.33	0.09	6.12	1.06	0.01	1.19	0.01	0.01	0.06	0.12	9.37
														S15	0.31	0.39	0.51	0.12	8.99	1,98	0.11	1.94	0.05	0.05	0.27	0.29	15.01
S16	0.27	0.21	0.36	0.09	6.37	1.32	0.04	1.19	/	/	0.06	0.12	10.03

据此进行相对抗氧化活性贡献度的分析计算(见表13)，结果表明，峰5、6、8相对抗氧化活性贡献度较高，与表10一致。

表13各活性共有峰相对抗氧化活性贡献度(％)

峰样品	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													S01	1.66	0.59	1.96	0.95	66.81	9.56	0.18	14.90	0.59	0.59	0.95	1.25
S02	2.36	1.24	2.98	0.99	62.86	10.37	0.68	14.66	0.62	0.75	1.18	1.30
													S03	2.74	0.96	3.15	0.75	63.24	9.86	0.82	16.15	0.07	0.07	0.82	1.37
S04	2.86	3.03	3.72	1.90	68.14	8.31	0.52	10.48	/	/	0.26	0.78
													S05	2.44	4.14	3.62	1.41	64.28	10.21	0.74	11.09	0.07	0.15	0.96	0.89
S06	2.74	2.66	4.47	1.33	62.77	11.68	0.78	10.74	/	/	1.41	1.41
													S07	3.07	3.88	3.52	1.26	67.00	8.48	0.54	10.10	/	/	0.18	1.98
S08	3.16	/	1.95	1.05	63.02	12.90	0.16	12.98	0.16	0.24	1.14	3.24
													S09	3.04	2.69	3.59	0.69	59.14	12.42	0.55	12.97	0.55	0.28	1.24	2.83
S10	2.17	2.26	2.51	0.42	65.30	12.37	0.25	13.71	/	/	1.00	2.51
													S11	3.20	0.71	3.63	0.57	60.57	14.59	0.57	11.17	0.78	0.64	1.92	1.64
S12	3.03	0.22	3.10	1.08	61.28	14.49	0.50	11.18	0.87	0.79	1.80	1.66
													S13	1.09	0.23	3.05	1.09	60.44	16.89	0.47	11.49	0.63	0.55	1.88	2.19
S14	3.74	0.21	3.52	0.96	65.31	11.31	0.11	12.70	0.11	0.11	0.64	1.28
													S15	2.07	2.60	3.40	0.80	59.89	13.19	0.73	12.92	0.33	0.33	1.80	1.93
S16	2.69	2.09	3.59	0.90	63.51	13.16	0.40	11.86	/	/	0.60	1.20

实施例5.制首乌质量标准的建立：

建立16批制首乌的化学指纹图谱和活性指纹图谱，结合两种图谱分析而得12个活性共有峰，以活性共有峰对22个色谱共有峰总峰面积平均占比的80％为质控标准；运用中药指纹图谱相似度评价软件，对16批制首乌进行相似度分析，选取相似度最小值为质控标准；以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷为特征峰，对其指纹图谱进行分析，以16批制首乌中特征峰与其相邻主峰的最小分离度为质控标准，结果见表14。

表14 16批制首乌活性共有峰占比、相似度和分离度结果

由此，以制首乌12个活性共有峰峰面积对22个色谱共有峰峰面积平均占比的80％作为质控下限，醇溶部位活性成分峰占比不得低于53.16％；

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.99；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×46mm×5μm)，以乙腈-0.1％磷酸水为流动相，按上述表1条件进行梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长254nm。2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷与相邻峰的分离度应大于2.5。

Claims (6)

1.一种制首乌的质量检测方法，包括如下步骤：

1)制备制首乌的醇溶部位；所述制首乌醇溶部位的制备方法为取制首乌粉末加水提取，浓缩提取液，加入无水乙醇至含醇量为50％，离心；上清液加无水乙醇浓缩至含醇量为80％，离心；浓缩上清液，用D101型大孔树脂富集，水洗脱后，以95％乙醇洗脱即得制首乌醇溶部位；

2)建立HPLC色谱检测条件；

HPLC色谱条件为采用Agela Venusil MP C18250mm×4.6mm×5μm色谱柱，检测波长254nm，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量15μL，按如下条件进行梯度洗脱

时间min 乙腈％ 0.1磷酸水％ 0 6 94 6 6 94 10 10 90 15 10 90 25 15 85 45 20 80 70 30 70 75 35 65 85 60 40 90 65 35 100 65 35 105 100 0 110 100 0

3)优化DPPH条件；

4)利用HPLC-DPPH联用技术进行在线抗氧化制首乌活性分析，根据制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱选取制首乌抗氧化活性共有峰，建立制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱和抗氧化活性的峰效函数关系；所述峰效函数关系的建立是以二苯乙烯苷为阳性参比，建立二苯乙烯苷清除DPPH的峰效数学模型，以X为二苯乙烯苷浓度(mg/mL)，Y为活性共有峰峰面积，得到函数关系：Y＝280226.05X-9523.83X²+123.44X³+25866.5，R²＝0.9992；

5)以制首乌化学指纹图谱、清除DPPH活性指纹图谱和制首乌抗氧化活性共有峰建立质量标准，利用所建立的质量标准直接评价制首乌质量；所述制首乌抗氧化活性共有峰为二苯乙烯苷类成分。

2.根据权利要求1所述的质量检测方法，步骤3)中优化DPPH条件为分别测试P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入的DPPH流速、DPPH浓度、PEEK管长度、PEEK管内径对抗氧化活性测定的影响。

3.根据权利要求2所述的质量检测方法，所述优化的DPPH条件为P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入的DPPH流速为0.4mL/min，DPPH浓度为1.0×10^-4mol/L，PEEK管长度为6m，PEEK管内径为0.1mm。

4.根据权利要求1所述的质量检测方法，所述制首乌抗氧化活性共有峰为反式2,3,5,4-四羟基二苯乙烯四羟基芪-2-O-β-d葡萄糖苷、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷和甲氧基-乙酰基-甲基胡桃醌-葡萄糖苷。

5.根据权利要求1所述的质量检测方法，所述质量标准的建立是结合多批制首乌的化学指纹图谱和活性指纹图谱，以其中的活性共有峰对色谱共有峰总峰面积平均占比的80％为质量标准；运用中药指纹图谱相似度评价软件，对多批制首乌进行相似度分析，选取相似度最小值为质量标准。

6.根据权利要求5所述的质量检测方法，所述质量标准是以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷为特征峰，以活性共有峰峰面积对色谱共有峰总峰面积平均占比的80％作为质控下限，醇溶部位活性成分峰占比不得低于53.16％；

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度不得低于0.99；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸水为流动相，按权利要求3所述条件进行梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长254nm，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷与相邻峰的分离度应大于2.5。

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