CN107144661A - 一种同时获得山银花中物质成分和总抗氧化活性的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时获得山银花中物质成分和总抗氧化活性的检测方法，包括：供试品溶液的制备；DPPH溶液的制备；配制一系列浓度梯度的VC溶液作为标准物质，以DPPH为清除对象，进行HPLC‑DPPH分析，建立VC浓度与自由基清除率关系的回归方程；将供试品溶液注入HPLC‑DPPH分析系统，同时得到样品的化学成分信息和样品的自由基总清除率，代入所述回归方程，得到样品总抗氧化活性。本发明采用HPLC‑DPPH在线联用的方法，可以同时得到山银花的化学指纹图谱信息和总抗氧化活性，从而实现对山银花质量控制进行“谱‑效”同时评估的优点。

Description

一种同时获得山银花中物质成分和总抗氧化活性的检测方法
技术领域
本发明涉及一种HPLC-DPPH法同时检测山银花中化学物质信息和总抗氧 化活性的方法，属于检测分析技术领域。
背景技术
山银花是忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、红 腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、华南忍冬Lonicera confusa DC.或黄褐毛忍 冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花。具有清 热解毒、凉散风热的功效，常用于治疗痈肿疗疮、喉痹，丹毒、热毒血痢、风 热感冒、温病发热。具有抗菌、抗病毒作用，为常用的大宗药材，临床应用广 泛。但是目前的研究尚未建立在线进行山银花抗氧化活性测试的方法，常采用 离线分步测定的方式进行活性测试，且单一的分析方法不能同时得到山银花物 质信息和活性信息，不利于建立全面的质量控制体系。
中药是传统医药预防、治疗疾病的物质基础，是我国人民几千年来的智慧 结晶。中药质量的提升成为了促进我国传统医药发展的基石。与化学药物不同， 中药及其相关制剂成分复杂，各物质之间的相互作用不明确。因此，通过对单 一成分进行测定的质量控制标准并不能满足中药的质量控制。本专利经过文献 查阅，发现以化学指纹图谱的方式评价中药的质量往往集中于高含量、易识别 等成分，但缺乏对其药理活性研究。通过“谱-效”相结合的方式作为质量控制 标准更具有科学性。将中药的化学指纹图谱信息与生物活性信息相结合，同时 作为中药的质量控制标准，能全面的评价中药质量的优劣。
HPLC-DPPH在线联用技术是近几年发展起来的新技术，将传统的高效液相 色谱仪和DPPH抗氧化活性系统串联，可以同时获得物质的化学指纹信息和生 物活性信息，该技术能够快速、实时、准确的获得样品的“谱-效”信息，为中 药材的质量控制分析提供了新的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简单、快速、准确的HPLC-DPPH在 线分析方法，可同时检测样品的化学物质和样品总抗氧化活性。
本发明技术方案如下：
一种同时获得山银花中物质成分(绿原酸)和总抗氧化活性的检测方法， 包括：
供试品溶液的制备；
DPPH溶液的制备；
配制一系列浓度梯度的VC(即维生素C)溶液作为标准物质，以DPPH为 清除对象，进行HPLC-DPPH分析，建立VC浓度与自由基清除率关系的回归方 程；
将供试品溶液注入HPLC-DPPH分析系统，同时得到样品的化学成分信息 和样品的自由基总清除率，代入所述回归方程，得到样品总抗氧化活性。
进一步地，制备供试品溶液时先将待测样品山银花干燥粉碎，过三号筛。
进一步地，供试品溶液的制备方法包括：精密称取山银花样品0.5g于50mL 锥形瓶中，加入10mL 60％乙醇，65℃下超声30min(功率300W)，取2.0mL 上清液于EP管中，10000r/min离心；精密移取1.0mL上清液于25.0mL容量瓶 中，定容，即得供试品溶液。
进一步地，所述DPPH溶液的制备方法包括：精密称取DPPH标准品2.0mg， 置于50mL棕色容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，避光放置，备用。
进一步地，VC(即维生素C)标准品溶液配制的制备方法包括：精确称取 2.5mg VC标准品，置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀；精确量取2.5mL、 5.0mL、7.5mL、10.0mL标准液，分别置于25mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻 度，摇匀备用。
进一步地，分析条件如下：
流动相：乙腈(A)，0.1％甲酸(B)；梯度洗脱条件：0～10min，(A)11.5％→15％； 10～12min，(A)15％→29％；12～15min，(A)29％→31％；15～20min，(A)31％→45％； 20～30min，(A)45％→100％；
进一步地，所用色谱柱：Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm,5um)；
进一步地，检测温度：20℃；
进一步地，检测波长：323nm；、
进一步地，进样量：10μL；
进一步地，流速：1.0mL/min。
本发明采用HPLC-DPPH分析系统，如图1所示，其包括高效液相色谱分 离系统、自由基清除检测系统和流动相切换分流装置，所述流动相切换分流装 置设置在高效液相分离柱前；所述高效液相色谱分离系统包括二元梯度泵、自 动进样器、色谱分析柱及柱温箱、二极管阵列(DAD)检测器；所述自由基清除检 测系统包括DPPH溶液泵、混合器、反应盘管、紫外可见光(UV)检测器；将所 述的两部分系统进行组合，系统依次连接为二元梯度泵、混合器、色谱柱、 DAD(二极管阵列)检测器、DPPH泵、反应盘管、DAD检测器；其中混合器与 自动进样器连接。所述色谱分析柱为C18反向色谱柱，型号为 (4.6mm×250mm,5um)，例如Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm,5um)。所述自由 基为化学自由基DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)。通过在高效液相分离柱前 设置流动相切换分流装置，使得能够同时对样品中化学物质和抗氧化活性进行 测定，即同时得到样品的化学谱信息和生物活性信息，建立了“谱-效”同时检 测的方法对样品进行分析。
本发明方法中，供试品溶液注入HPLC-DPPH分析系统后分别进入色谱分 析柱和紫外可见光(UV)检测器，即柱前分离，其优点在于能够实现对样品的化 学物质和生物活性进行同时检测，建立一种“谱-效”同时检测的分析方法。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)由于本发明采用HPLC-DPPH在线联用的方法测定山银花的化学物质和抗 氧化活性，具有无需分步进行实验，所用试剂量少，操作简单方便，灵敏度高， 精密度高，稳定性好等特点。
(2)本发明采用HPLC-DPPH在线联用的方法，可以同时得到山银花的化学指 纹图谱信息和总抗氧化活性。因此，可同时获得样品各成分化学信息和总抗氧 化活性，从而实现对山银花质量进行“谱-效”同时评估的优点。
(3)本发明操作简单，快速，易于推广。
附图说明
图1HPLC-DPPH在线联用系统装置示意图；其中，Acetomitrile：乙腈；formicacid：甲酸；Inject:进样；Peek tube：盘管；Waste：废液；Computer：计算机； C18 column：碳十八色谱柱；DAD：二极管阵列检测器；TM：混合器；HPLC： 高效液相色谱仪；LC：液相色谱仪；DPPH：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼；UV： 紫外可见分光光度计。
图2山银花HPLC化学成分图谱(检测波长323nm)；
图3山银花抗氧化性图谱；
图4维生素C抗氧化性标准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注 明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产 品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购 买得到的常规产品。
以下使用的试验材料、试剂和仪器如下：
试验材料：
对照品绿原酸(批号110753-201415)，维生素C(批号100425-200702) 上述对照品均购于中国食品药品检定研究院，纯度大于98％，供含量测定用；药 材均经湖南中医药大学龚力民副教授鉴定，山银花来源于忍冬科植物灰毡毛忍 冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.
药材信息：
序号 植物来源 产地
1-50 灰毡毛忍冬 湖南隆回
51-100 红腺忍冬 重庆秀山
试剂：
DPPH试剂(梯希爱(上海)化成工业公司)；甲酸(AR,天津光复精细化工研究 所)；乙醇(AR,国药集团化学试剂公司)；乙睛(HPLC级，美国Sigma公司)；怡宝纯 净水。
仪器：HPLC-DPPH分析系统，结构如图1所示。其中色谱分析柱为C18 反向色谱柱即Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm,5um)。
Agilent1260高效液相色谱仪，配置分流头及色谱工作站；LC-10AT色谱仪 单元泵、SPD-10A UV-Vis检测器(日本岛津公司)，高速离心机。
实施例1
一种同时获得山银花中物质成分(绿原酸)和总抗氧化活性的检测方法， 包括：
供试品溶液配制：精密称取山银花样品0.5g于50mL锥形瓶中，加入 10mL60％乙醇，65℃下超声30min(功率300W)，取2.0mL上清液于EP管中， 10000r/min离心；精密移取1.0mL上清液于25mL容量瓶中，定容，即得供试 品溶液。
DPPH溶液的制备：精密称取DPPH标准品2.0mg，置于50mL棕色容量瓶 中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，避光放置，备用。
VC(维生素C)标准品溶液配制：精确称取2.5mgVC标准品，置于50mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀；精确量取2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL 标准液，分别置于25mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。
获得维生素C清除自由基浓度回归方程：
1)精密移取1mL不同浓度VC标准溶液与4mLDPPH溶液于试管中，摇匀， 避光放置30min，于517nm波长处测定吸光度A1；
2)精密移取1mL不同浓度VC标准溶液与4mL无水乙醇于试管中，摇匀， 避光放置30min，于517nm波长处测定吸光度A2；
3)精密移取1mL蒸馏水与4mLDPPH溶液于试管中，摇匀，避光放置30min， 于517nm波长处测定吸光度A0；按下式计算清除率(指自由基清除率)：
清除率＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
以清除率为纵坐标，VC溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线(即VC清除 DPPH自由基浓度曲线，见图4)，获得维生素C清除自由基浓度回归方程： Y＝192.2X+0.1272，在0.0005-0.004mg/mL范围内线性关系良好R2＝0.9996。
化学指纹图谱和总抗氧化活性测定：将供试品溶液注入HPLC-DPPH分析 系统，得到样品的化学成分信息和总抗氧化活性信息(见图2和图3)，并得到 样品的自由基总清除率，代入维生素C清除自由基浓度回归方程，得到样品总 抗氧化活性。
分析条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm，5um)；温度：20℃；检测波长： 323nm；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈(A)，0.1％甲酸(B)； 梯度洗脱条件：0～10min，(A)11.5％→15％；10～12min，(A)15％→29％；12～15min， (A)29％→31％；15～20min，(A)31％→45％；20～30min，(A)45％→100％。
测定结果见下表1：
表1 绿原酸含量及自由基清除率测定结果
本发明方法在对样品的测定过程中色谱峰形完整美观，无拖尾、漂移的现 象，分离度良好，方法稳定、结果准确，可以快速的对样品进行在线的化学成 分分析和抗氧化活性的评价。
实验例1山银花中绿原酸提取方法的正交试验
以提取温度(A)，乙醇浓度(B)，提取时间(C)，料液比(D)4个因数为自变量， 绿原酸提取率为响应值设计试验。试验及结果见表S1、表S2和表S3。
表S1 山银花中绿原酸提取工艺正交试验因素水平
正交试验安排及结果
表S2 实验数据
表S3 方差分析
由表S3极差分析结果可知，对于绿原酸含量而言，四个因素对其提取率的 影响主次顺序C>B>A>D，最佳提取条件为C2B2A2D1。
由表S3方差分析结果可知，F均小于F临界值，四因素对试验结果均无显 著影响。
实验例2 分析条件的确定
1)DPPH乙醇溶液的制备：
精确称取2.0mgDPPH，置于50mL棕色容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇 匀，避光放置，即得0.04mg/mL DPPH溶液。
2)维生素C系列标准溶液制备：
精确称取2.5mg VC标品，置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。 精确量取2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL标准液，分别置于25mL容量瓶中， 加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。
3)供试品溶液制备：
精密称取0.5g样品(过3号筛)于具塞锥形瓶中，加入10mL 60％乙醇， 65℃超声30min,10000r/min离心10min，取上清液1.0mL于25mL容量瓶中， 用60％乙醇溶液定容，即得。
4)色谱条件的确定
在对色谱条件进行考察时，分别选择了乙腈、甲醇、0.1％甲酸水、0.1％醋 酸水、0.1％磷酸水进行实验，结果表明乙腈-0.1％甲酸水作为流动相，得到的图 谱峰型及分离度较好，分析时间更短。进行全波长扫描后发现在323nm处绿原 酸有最大吸收，且其他组分干扰最小。
最佳的色谱条件为：色谱柱：Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm,5um)；温度： 20℃；检测波长：323nm；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈(A)， 0.1％甲酸(B)；梯度洗脱条件：0～10min，(A)11.5％→15％，10～12min， (A)15％→29％，12～15min，(A)29％→31％，15～20min，(A)31％→45％，20～30min， (A)45％→100％。
实验例3 HPLC-DPPH在线联用技术方法学验证
1)精密度
实验方法：按实验例2方法制备供试品溶液，以绿原酸为抗氧化活性对照 物，测定其峰面积；连续测定6次，实验结果见下表S4：
S4
2)重复性
实验方法：准确称量山银花粉末6份，按实验例2方法制备供试品溶液， 以绿原酸为抗氧化活性对照物，测定其峰面积；连续测定6次，实验结果见下 表S5：
S5
3)稳定性
实验方法：按实验例2方法制备供试品溶液，避光放置20min、40min、60 min、80min、120min后，以绿原酸为抗氧化活性对照物，测定其峰面积。实验 结果见下表S6：
S6
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是 显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均 属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种同时获得山银花中物质成分和总抗氧化活性的检测方法，其特征在于，包括：
供试品溶液的制备；
DPPH溶液的制备；
配制一系列浓度梯度的VC溶液作为标准物质，以DPPH为清除对象，进行HPLC-DPPH分析，建立VC浓度与自由基清除率关系的回归方程；
将供试品溶液注入HPLC-DPPH分析系统，同时得到样品的化学成分信息和样品的自由基总清除率，代入所述回归方程，得到样品总抗氧化活性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，分析条件如下：
流动相：乙腈(A)，0.1％甲酸(B)；
梯度洗脱条件：0～10min，(A)11.5％→15％；10～12min，(A)15％→29％；12～15min，(A)29％→31％；15～20min，(A)31％→45％；20～30min，(A)45％→100％。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，分析条件如下：色谱柱：Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm,5um)；和/或，温度：20℃；和/或，检测波长：323nm；和/或，进样量：10μL；和/或，流速：1.0mL/min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：精密称取山银花样品0.5g于50mL锥形瓶中，加入10mL 60％乙醇，65℃下超声30min，功率300W，取2.0mL上清液于EP管中，10000r/min离心；精密移取1.0mL上清液于25.0mL容量瓶中，定容，即得供试品溶液；
和/或，所述DPPH溶液的制备方法包括：精密称取DPPH标准品2.0mg，置于50mL棕色容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，避光放置，备用；
和/或，VC标准品溶液配制的制备方法包括：精确称取2.5mg VC标准品，置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀；精确量取2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL标准液，分别置于25mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，制备供试品溶液时先将待测样品山银花干燥粉碎，过三号筛。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述获得维生素C清除自由基浓度回归方程的方法包括：
1)精密移取1mL不同浓度VC标准溶液与4mL DPPH溶液于试管中，摇匀，避光放置30min，于517nm波长处测定吸光度A1；
2)精密移取1mL不同浓度VC标准溶液与4mL无水乙醇于试管中，摇匀，避光放置30min，于517nm波长处测定吸光度A2；
3)精密移取1mL蒸馏水与4mL DPPH溶液于试管中，摇匀，避光放置30min，于517nm波长处测定吸光度A0；按下式计算清除率：
清除率＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
以清除率为纵坐标，VC溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得维生素C清除自由基浓度回归方程。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，包括：
供试品溶液配制：精密称取山银花样品0.5g于50mL锥形瓶中，加入10mL60％乙醇，65℃下超声30min，功率300W，取2.0mL上清液于EP管中，10000r/min离心；精密移取1.0mL上清液于25mL容量瓶中，定容，即得供试品溶液；
DPPH溶液的制备：精密称取DPPH标准品2.0mg，置于50mL棕色容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，避光放置，备用；
VC标准品溶液配制：精确称取2.5mgVC标准品，置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀；精确量取2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL标准液，分别置于25mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用；
获得维生素C清除自由基浓度回归方程：
1)精密移取1mL不同浓度VC标准溶液与4mL DPPH溶液于试管中，摇匀，避光放置30min，于517nm波长处测定吸光度A1；
2)精密移取1mL不同浓度VC标准溶液与4mL无水乙醇于试管中，摇匀，避光放置30min，于517nm波长处测定吸光度A2；
3)精密移取1mL蒸馏水与4ml DPPH溶液于试管中，摇匀，避光放置30min，于517nm波长处测定吸光度A0；按下式计算清除率：
清除率＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
以清除率为纵坐标，VC溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得维生素C清除自由基浓度回归方程；
化学指纹图谱和总抗氧化活性测定：将供试品溶液注入HPLC-DPPH分析系统，得到样品的化学成分信息和总抗氧化活性信息，并得到样品的自由基总清除率，代入维生素C清除自由基浓度回归方程，得到样品总抗氧化活性；
分析条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm,5um)；温度：20℃；检测波长：323nm；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈(A)，0.1％甲酸(B)；梯度洗脱条件：0～10min，(A)11.5％→15％；10～12min，(A)15％→29％；12～15min，(A)29％→31％；15～20min，(A)31％→45％；20～30min，(A)45％→100％。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC-DPPH分析系统，包括高效液相色谱分离系统、自由基清除检测系统和流动相切换分流装置，所述流动相切换分流装置设置在高效液相分离柱前，使得能够同时对样品中化学物质和抗氧化活性进行测定；所述高效液相色谱分离系统包括二元梯度泵、自动进样器、色谱分析柱及柱温箱、二极管阵列检测器；所述自由基清除检测系统包括DPPH溶液泵、混合器、反应盘管、紫外可见光检测器；将所述的两部分系统进行组合，系统依次连接为二元梯度泵、混合器、色谱柱、DAD检测器、DPPH泵、反应盘管、DAD检测器；其中所述混合器与自动进样器连接。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述色谱分析柱为C18反向色谱柱，型号为(4.6mm×250mm,5um)；优选为Agilent TC-C18(2)(4.6mm×250mm,5um)。
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