CN114295759A - 用于治疗偏头痛的细辛或细辛提取物的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药材质量检测技术领域，具体涉及一种用于治疗偏头痛的细辛或细辛提取物的质量检测方法。本发明通过网络药理学的方法研究了中药材细辛治疗偏头痛的物质基础，并基于此提出了通过检测细辛或细辛提取物中去甲乌药碱和樱桃苷的含量对其进行质量检测的方法。利用本发明的质量检测方法，能够有效选择出对偏头痛治疗效果更好的细辛提取物、细辛药材或细辛炮制品，在临床应用中具有很好的前景。
Description
技术领域
本发明属于药材质量检测技术领域，具体涉及一种用于治疗偏头痛的细辛或细辛提取物的质量检测方法。
背景技术
为了更好地储存或使用中药材，人们通常会对中药材进行炮制。例如，中药材细辛常用的炮制方法有炒焦、蜜制、醋制、甘草制、酒制、米泔水制、盐制、姜制、碱制和碱醋制等等。而经过炮制的中药材中，活性物质的种类及含量通常会发生变化，导致其对各种适用症的使用功效发生变化。另一方面，药材本身的产地和生长状况等也会明显影响其使用功效。
因此，为了更好地使用中药材，了解药物中对各种适用症产生疗效的活性物质，并以这些活性物质的含量作为标准对中药材及其炮制物进行质量检测就显得非常的重要。
细辛，中药名。又名：华细辛、小辛、少辛、盆草细辛等，属马兜铃目，马兜铃科多年生草本。有祛风，散寒，行水，开窍等功效。常用于风冷头痛，鼻渊，齿痛，痰饮咳逆，风湿痹痛等。细辛既能外散风寒，又能内祛阴寒，同时止痛、镇咳功效较佳。
《中国药典》中规定了对细辛药材的质量检测标准，包括检测水分、总灰分、酸不溶性灰分和马兜铃酸Ⅰ的含量等指标。然而，该质量检测标准针对的是所有的细辛药材。而对于治疗偏头痛等具体适应症的细辛药材的质量检测标准，《中国药典》也未作出明确的规定。
针对细辛中治疗偏头痛的活性物质的研究，中国发明专利申请“CN105147756A治疗血管性头痛、神经性头痛、顽固性头痛的中药”提出了：偏头痛属于偏头风、脑风范畴，病因多由风、寒、湿三者侵入引起，加之外感六淫之邪或肝阳上亢、肝肾气血亏虚，气滞、血瘀、痰灼上扰等因素所致；宜采用清热、散风、化浊、滋补肝肾、活血化瘀执法治疗。从细辛中分离的消旋去甲乌药碱具有强心、扩张血管、松弛平滑肌、增强脂质代谢和升高血糖等作用。消旋去甲乌药碱呈现的药理作用与中药散寒或祛寒功效相吻合，因此可将其视为散寒药效的重要物质基础之一。
然而，该文献公开的细辛治疗偏头痛的物质基础仍然不够全面，因而无法指导细辛药材的质量检测标准的建立。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于治疗偏头痛的细辛或细辛提取物的质量检测方法，目的在于：根据细辛治疗偏头痛的物质基础，提出新的质量检测方法。使得在细辛用于治疗偏头痛的临床用药中取得更好的治疗效果。
本发明还提供一种用于治疗偏头痛的细辛或细辛提取物的质量检测方法，它是通过检测细辛中去甲乌药碱和樱桃苷的含量对细辛进行质量检测。
优选的，判断细辛合格的标准是：去甲乌药碱的含量大于等于0.005％，樱桃苷的含量大于等于0.007％。
优选的，所述细辛为细辛药材或其炮制品，所述炮制品为炒焦细辛、蜜制细辛、醋制细辛、甘草制细辛、酒制细辛、米泔水制细辛、盐制细辛、姜制细辛、碱制细辛或碱醋制细辛。
优选的，所述细辛为细辛药材的炮制品，所述炮制品为甘草制细辛。
优选的，所述去甲乌药碱和樱桃苷的含量的检测方法为：将细辛制成供试品溶液后，采用高效液相色谱法进行检测。
优选的，所述高效液相色谱法检测的色谱条件包括：以乙腈-体积分数0.05～0.2％磷酸为流动相，以C18柱为色谱柱。
优选的，所述高效液相色谱法检测的色谱条件包括：以乙腈-体积分数0.1％磷酸为流动相。
优选的，所述高效液相色谱法检测的色谱条件还包括：柱温30～35℃；流速0.8～1.2mL·min-1；检测波长210～330nm；进样量5～20μL。
优选的，所述高效液相色谱法检测的色谱条件还包括：梯度洗脱程序：0～8min，5～7％乙腈；8～13min，7％乙腈；13～14min，7～21％乙腈；14～30min，21％乙腈；30～32min，21～50％乙腈；32～40min，50～90％乙腈。
优选的，所述供试品溶液的制备方法为：将所述细辛制成粉末后，用体积分数40-70％甲醇提取。
优选的，所述提取的方法为超声提取，提取的时间为30-60min。
本发明通过网络药理学的方法研究了中药材细辛治疗偏头痛的物质基础，并基于此提出了一种新的细辛质量检测方法。该质量检测方法适用于治疗偏头痛用的细辛药材或其炮制物。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1中278个偏头痛靶标的PPI网络；
图2为实施例1中细辛“成分-靶点”互作网络图，其中，绿色代表偏头痛核心基因，蓝色代表细辛活性化学成分，黄色代表预测抗偏头痛主要活性成分；
图3为去甲乌药碱190～400nm的波长扫描图；
图4为樱桃苷190～400nm的波长扫描图；
图5为混合对照品及细辛供试品的HPLC图，其中，A.混合对照品，B.细辛供试品，峰1为去甲乌药碱，峰2为樱桃苷。
具体实施方式
以下实施例中采用的试剂和材料，无特别说明的，均为市售品。
实施例1细辛抗偏头痛物质基础的预测
1、数据库及软件
本实施例所用的数据库及软件如下表所示：
表1数据库信息
表2分析软件信息
2、实验方法
2.1.细辛成分数据库的建立及活性成分筛选
通过中国知网、万方数据和百度学术检索现存文献，结合公共数据库SymMap、TCMSP和ETCM，收集细辛所含化学成分，并保留唯一值，建立细辛成分数据库；通过PubChem查找各化合物的PubChem CID、3D结构和Smiles；将化学成分的Smiles式导入FAF-Drugs4对所有化合物进行ADMET评估筛选，设置“Filtering options”为“Drug-Like Soft.”，筛选并保留“result”为“Accepted”的化合物，用于分子对接。
2.2.偏头痛靶标数据库的建立
通过在线检索OMIM、DisGeNET、TCMSP和TTD数据库，输入“migraine”、“hemicrania”、“cephalagra”等关键词，寻找与偏头痛相关的靶标，建立偏头痛靶标数据库。通过Uniprot数据库将基因名称规范化，设置“organisms”为“human”。
2.3.PPI网络构建与分析
基于靶标的Gene Symbol，通过String数据库对偏头痛相关基因进行蛋白互作(PPI)网络分析，设置“organisms”为“Homo sapiens”，设置置信度为0.4，导出关系数据，结果保存为TSV格式；利用Cytoscape3.7.1对重叠基因的PPI网络进行可视化，分析网络拓扑结构，根据Degree、ClosenessCentrality和BetweennessCentrality值(值越大代表改节点在网络中越重要，即该节点所代表的靶标在偏头痛中越重要)筛选偏头痛的关键靶标。最后从RCSB PDB上确定并收集各关键靶标的蛋白晶体结构。
2.4.分子对接
通过分子对接技术建立细辛活性成分与偏头痛核心基因的相互作关系，采用Discovery Studio软件进行分子对接操作，根据对接打分结果保留成分与基因的相互作用关系，对接得分越高，亲和力越强。具体操作如下：
(1)配体处理：将ADMET筛选出的化学成分的3D结构导入Discovery Studio软件中，进行加氢和能量优化操作。
(2)受体处理：将RCSB PDB中收集到的关键靶标的蛋白晶体结构导入DiscoveryStudio软件，进行删除水分子和配体分子、去除蛋白多构象、补充非完整的氨基酸残基、加氢、能量优化、定义受体以及定义活性位点操作。活性位点根据蛋白质的原始配体位置或Discovery Studio软件计算来确定。
(3)对接方法：通过Discovery Studio软件的LibDock工具进行配体和受体的分子对接，保留对接打分大于90分的结果。
2.5.“成分-靶点”网络图构建及分析
基于“2.4.分子对接”所得成分与关键靶点的相互作用关系，采用Cytoscape3.7.1构建“成分-靶点”作用网络图，并通过“Analyze Network”工具分析网络拓扑结构。根据Degree值对细辛的抗偏头痛主要成分进行筛选，选取Degree值最高的成分作为细辛的主要抗偏头痛成分。
3.实验结果
3.1.细辛成分数据库的建立及活性成分筛选
通过查询SymMap、TCMSP、ETCM等公共数据库及文献检索获取细辛所含化学成分共计259个，并建立细辛化学成分数据库，通过PubChem确定并收集了各成分的PubChem CID、3D结构和Smiles；基于成分的Smiles式，利用FAF-Drugs4的Drug-Like Soft过滤器对所有化学成分进行ADMET评估，从259个成分中筛选出138个成分，作为细辛的潜在活性成分，用于分子对接。
3.2.偏头痛靶标数据库的建立及PPI网络构建与分析
通过OMIM、DisGeNET、TCMSP、TTD等数据库收集到278个偏头痛相关靶标，并建立了偏头痛靶标数据库。将278个靶标的基因名称导入Sring数据库中，建立靶标间的两两互作关系，结果显示278个偏头痛靶标的PPI网络中包括257个节点和2305条边，各节点的网络拓扑性质见附录表1-2。节点代表基因，边是节点之间的连线，代表基因间的相互作用关系。通过Cytoscape3.7.1进行网络可视化分析，结果见图1。以Degree≥40、ClosenessCentrality≥0.48和BetweennessCentrality≥0.02为条件筛选关键靶标，得到15个基因。其中13个基因的蛋白晶体结构可从RCSB PDB网站查得，另外2个基因(GNB3和TAC1)的蛋白晶体结构未查找到。13个关键靶标的信息及其网络拓扑性质结果见表3。
表3 13个关键靶标的信息及其网络拓扑性质
3.3.分子对接
通过Discovery Studio对“3.1细辛成分数据库的建立及活性成分筛选”项下所得138个化学成分与“3.2偏头痛靶标数据库的建立及PPI网络构建与分析”项下的13个关键靶标的蛋白晶体结构分别进行处理，确定蛋白活性位点。将处理后的关键蛋白与化学成分通过LibDock工具进行分子对接，以“Score>90”为条件筛选关键蛋白和成分的相互作用关系，结果表明69个成分与9关键蛋白参与构成238种互作关系。13个关键蛋白的信息及其活性位点的三维坐标和半径见表4。
表4偏头痛13个关键蛋白的信息及其活性位点的三维坐标和半径
3.4.“成分-靶点”网络图构建及分析
基于分子对接结果，通过Cytoscape3.7.1构建上述238个相互作用关系的网络图，如图2所示。“成分-靶点”网络由78个节点和238条边组成，其中78个节点分别为69个成分和9个中枢基因。根据Degree值大小可以推测各节点所代表的在网络中的重要性，Degree值越大，代表该节点在网络中越重要，因此，保留Degree值最高的成分去甲乌药碱(higenamine)、樱桃苷(naringenin-7-O-β-D-glucopyranoside)和十二烯基丁二酸酐(2,5-furandione,3-(dodecenyl)dihydro-)作为细辛抗偏头痛的主要物质基础。但是根据文献报道，十二烯基丁二酸酐主要用于化工领域，目前未见相关药理研究，因此推知樱桃苷和去甲乌药碱是细辛抗偏头痛的主要活性成分。
实施例2细辛抗偏头痛物质的药效学验证
1.实验材料
1.1.实验药物
北细辛：购自重庆市解放路中药材专业市场，经鉴定为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.的干燥根及根茎。粉碎机粉碎，过五号筛(80目)，得细辛粉末。用前以蒸馏水配制成所需浓度的药液。
1.2.实验动物
健康雄性SD大鼠90只，体重200±20g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号为SCXK(川)2015-030。实验前适应性喂养一段时间。实验动物饲养条件：室内温度20～26℃，相对湿度40％～70％，12h白天，12h夜晚，自由进食、饮水。
1.3.实验试剂与试药
表5试剂与试药信息
1.4.实验仪器
表6仪器信息
2.实验方法
2.1.分组及剂量
将90只SD雄性大鼠随机分为9组，每组10只，即：
(1)空白对照组(蒸馏水)
(2)模型对照组(蒸馏水)
(3)阳性对照组(西比灵1mg/kg)
(4)细辛低剂量组(0.08g/kg)
(5)细辛中剂量组(0.17g/kg)
(6)细辛高剂量组(0.33g/kg)
(7)细辛低剂量+樱桃苷组(0.08g/kg+20.3μg/kg)
(8)细辛低剂量+去甲乌药碱组(0.08g/kg+16.8μg/kg)
(9)细辛低剂量+樱桃苷+去甲乌药碱组(0.08g/kg+20.3μg/kg+16.8μg/kg)
2.2.给药方法及模型制备
喂养期间各组大鼠每日自由进食。同时分别以60kg成人临床日用量(生药1g/60kg)的5倍(低)、10倍(中)、20倍(高)3个剂量组以及低剂量组敲入樱桃苷单体成分、低剂量敲入去甲乌药碱单体成分和低剂量同时敲入樱桃苷、去甲乌药碱单体成分(敲入单体成分量约为低剂量组中该成分含量的3倍，使之与高剂量组中该成分含量相等)3个组，给药剂量分别为0.08g/kg、0.17g/kg、0.33g/kg、0.08g/kg+20.3μg/kg(樱桃苷对照品)、0.08g/kg+16.8μg/kg(去甲乌药碱对照品)、0.08g/kg+20.3μg/kg(樱桃苷对照品)+16.8μg/kg(去甲乌药碱对照品)，空白对照组和模型对照组大鼠分别灌胃等体积蒸馏水，阳性对照组大鼠灌胃西比灵溶液1mg/kg。连续灌胃给药7d，每天1次。末次给药30min后，除空白对照组大鼠后颈部皮下注射等量生理盐水，其余各组大鼠均后颈部皮下注射硝酸甘油10mg/kg。
2.3.硝酸甘油型偏头痛大鼠行为学观察
从后颈部皮下注射硝酸甘油起，以出现双耳发红、频繁挠头和甩头为指标，连续观察并记录2.5h内各组大鼠挠头及甩头次数。
2.4.硝酸甘油型偏头痛大鼠血清中NO及血浆中CGRP检测
大鼠造模4h后，腹腔注射10％的水合氯醛(0.35ml/100g)进行麻醉，腹主动脉采血约8ml，其中5ml室温下静置20min，3000r/min离心20min，取血清，置-20℃冰箱保存，用于测定NO水平。另3ml以乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)作为抗凝剂，混合20min后，3000r/min离心20min，取血浆，置-20℃冰箱保存，用于测定CGRP。检测流程严格按照试剂盒说明书要求进行。
2.5.硝酸甘油型偏头痛大鼠脑组织中5-HT及NE检测
大鼠取血后处死，取脑组织，迅速置于液氮中冷冻，称重，按照重量体积比1g:9ml加入9倍体积的0.86％生理盐水，用手工玻璃匀浆器在冰浴上研磨匀浆，3000r/min离心20min，取上清液，置-20℃冰箱保存，用于测定5-HT和NE水平。检测流程严格按照试剂盒说明书要求进行。
2.6.统计学处理
采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，数据均采用x±s表示。服从正态分布的数据，采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD；不服从正态分布的数据，通过计算变量转换为正态分布后，进行单因素方差分析(ANOVA)。若P<0.05，则差异有统计学意义。
3.实验结果
3.1.硝酸甘油型偏头痛大鼠行为学表现
空白对照组大鼠偶有挠头、甩头动作，模型对照组大鼠与空白组大鼠比较均具有明显的挠头、甩头动作(P<0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组、细辛中剂量组、细辛高剂量组、细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组和低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组挠头、甩头次数明显减少(P<0.05或P<0.01)，其中以细辛高剂量组和细辛低剂量+樱桃苷组最为明显(P<0.01)，说明细辛、樱桃苷、去甲乌药碱均可缓解大鼠偏头痛症状；细辛低剂量+樱桃苷组挠头、甩头次数较细辛低剂量组明显减少(P<0.05)，细辛中剂量组、细辛低剂量+去甲乌药碱组和细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组挠头虽有减少，但作用不明显。结果见表7，表8。
表7硝酸甘油型偏头痛大鼠行为学(X)的组间比较(M(IQR)，n＝10)
注：行为学数据呈偏态分布，采用中位数、四分位数间距进行描述，通过lg10(X)转换后，数据呈正态分布，采用单因素方差分析(ANOVA)。
表8硝酸甘油型偏头痛大鼠行为学对数值(lg10(X))转换结果(
n＝10)
注：与空白对照组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型对照组比较：#P<0.05##P<0.01；
与细辛低剂量组比较：$P<0.05$$P<0.01；与细辛高剂量组比较：&P<0.05&&P<0.01。
3.2.硝酸甘油型偏头痛大鼠血清中NO及血浆中CGRP水平
与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清中NO水平及血浆中CGRP水平明显升高(P<0.01)，差异有统计学意义。与模型对照组比较，阳性对照组、细辛低剂量组、细辛中剂量组、细辛高剂量组、细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组、细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组均能不同程度的抑制血清中NO的增加(P<0.01)，同时，细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组、细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组对血清中NO的抑制作用较细辛低剂量组高(P<0.05)，较细辛高剂量组低(P<0.05)；与模型对照组比较，阳性对照组、细辛低剂量组、细辛中剂量组、细辛高剂量组、细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组、细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组均能降低大鼠中CGRP的含量(P<0.01)，其中，细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组和细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组作用明显强于细辛低剂量组(P<0.01)，结果见表9。
表9硝酸甘油型偏头痛大鼠血清中NO及血浆中CGRP含量组间比较(
n＝10)
注：与空白对照组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型对照组比较：#P<0.05##P<0.01；
与细辛低剂量组比较：$P<0.05$$P<0.01；与细辛高剂量组比较：&P<0.05&&P<0.01。
3.3.硝酸甘油型偏头痛大鼠脑组织中5-HT和NE水平
与空白对照组比较，模型对照组大鼠脑组织中5-HT、NE含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组、细辛低剂量组、细辛中剂量组、细辛高剂量组、细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组和细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组大鼠脑组织中5-HT、NE含量明显减少(P<0.01)，与细辛低剂量组比较，细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组大鼠脑组织5-HT含量明显减少(P<0.01)，细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组差异不明显，同时，与细辛高剂量组比较，细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组和细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组的5-HT水平均不同程度的升高(P<0.05)；与细辛低剂量组比较，细辛低剂量+樱桃苷组和细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组NE水平明显降低(P<0.05)，与细辛高剂量组比较，细辛低剂量+去甲乌药碱组、细辛低剂量+樱桃苷组NE水平升高(P<0.01)，细辛低剂量+去甲乌药碱+樱桃苷组差异不明显。结果见表10。
表10硝酸甘油型偏头痛大鼠脑组织中5-HT及NE含量组间比较(
n＝10)
注：与空白对照组比较：*P<0.05**P<0.01；与模型对照组比较：#P<0.05##P<0.01；
与细辛低剂量组比较：$P<0.05$$P<0.01；与细辛高剂量组比较：&P<0.05&&P<0.01。
从以上实验可以看到，细辛、去甲乌药碱和樱桃苷均可减少硝酸甘油诱导的大鼠挠头和甩头次数，调节体内NO、CGRP、5-HT和NE异常水平，证实了去甲乌药碱和樱桃苷是细辛抗偏头痛作用的活性物质。
实施例3细辛不同炮制品中去甲乌药碱和樱桃苷含量的对比
1.实验材料
1.1.实验药材
北细辛：购自重庆市解放路中药材专业市场，经重庆市中药研究院秦松荣研究员鉴定为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.的干燥根及根茎。
1.2.实验仪器
表11仪器信息
1.3.实验试剂
表12试剂信息
2.实验方法
2.1.细辛不同炮制品加工
2.1.1净制、切制
将细辛药材按照《中国药典》2020年版要求，切段，除去杂质。
2.1.2炮制方法
根据文献查阅，目前细辛有醋制、碱制、碱醋制、米泔水制、酒制、蜜制、甘草制、姜制、盐制和炒焦10种炮制方法，具体炮制步骤见表13。
表13细辛不同炮制品的炮制方法
2.2.去甲乌药碱和樱桃苷含量测定
2.2.1.试验条件考察
对检测波长、流动相、提取方法、提取溶剂和提取时间进行考察。
2.2.1.1.检测波长考察
对去甲乌药碱和樱桃苷对照品进行190～400nm的波长扫描。考察结果见图3，图4。结果表明，去甲乌药碱和樱桃苷的检测波长可选为283nm。
2.2.1.2.流动相考察
对以下5种流动相进行考察：①甲醇-水，②甲醇-0.05％磷酸盐缓冲液(PH＝3.0，准确量取磷酸二氢钾6.8386g，溶解于1000mL水中，用磷酸调PH值至3.0)，③甲醇-0.1％甲酸水，④甲醇-0.1％磷酸水，⑤乙腈-0.1％磷酸水。结合峰形、分离度和出峰时间，选定乙腈-0.1％磷酸为流动相。
2.2.1.3.提取方法考察
取同一批细辛粉末(过三号筛)2.0g，平行精密称定2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(250W，40kHz)1h，取出，放冷，补足失重；另一份回流提取1h，取出，放冷，补足失重。考察结果如表2-4所示，超声提取法的峰面积与取样量比值与超声提取法差异较小，同时，考虑到超声提取更加方便，故选择超声为提取方法。
2.2.1.4.提取溶剂考察
对提取溶剂(水、甲醇、10％甲醇、40％甲醇和70％甲醇)进行考察，相关步骤同“2.1.1.3.提取方法考察”。考察结果如表2-4所示，各溶剂条件下去甲乌药碱和樱桃苷的峰面积与取样量比值在40％甲醇时均较其他溶剂略高，且制样过程中40％甲醇作为提取溶剂容易过滤，故选择40％甲醇为提取溶剂。
2.2.1.5.提取时间考察
对提取时间(30min、45min和1h)进行考察，相关步骤同“2.2.1.3.提取方法考察”。考察结果如表14所示，随着提取时间的增加，峰面积与取样量比值变化较小，为节省时间，故提取时间选择30min。
表14试验条件考察结果
2.2.2.色谱条件
色谱柱为Waters Symmetry C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃；流速0.8mL·min-1；检测波长283nm；进样量10μL；流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)，梯度洗脱程序：0～8min，5～7％A；8～13min，7％A；13～14min，7～21％A；14～30min，21％A；30～32min，21～50％A；32～40min，50～90％A。对照品及样品色谱图见图5。
2.2.3.对照品溶液制备
2.2.3.1.去甲乌药碱对照品溶液
精密称取去甲乌药碱对照品10mg，置于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，配制成1mg/mL的对照品储备溶液，取对照品储备溶液1mL置于10mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀，配制成0.1mg/mL的去甲乌药碱对照品溶液。
2.2.3.2.樱桃苷对照品溶液
精密称取樱桃苷对照品5mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，配制成0.5mg/mL的对照品储备溶液，取对照品储备溶液1mL置于10mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀配制成0.05mg/mL的樱桃苷对照品溶液。
2.2.4.供试品溶液制备
取细辛粉末2.0g，精密量取40％甲醇25mL，置100mL具塞锥形瓶中，称定重量，超声30min取出，放冷，补足失重，过滤，取续滤液，即得。
2.2.5.方法学验证
2.2.5.1.线性范围、检测限和定量限
2.2.5.1.1.去甲乌药碱
精密称取去甲乌药碱对照品10mg，置于10mL容量瓶中，加水使溶解并定容至刻度，摇匀，得标准溶液A；取标准溶液A置容量瓶中，逐级稀释10倍得标准溶液B、C、D。分别取适量标准溶液A、B、C和D进样，按“2.2.2.色谱条件”进行分析。结果见表15，当去甲乌药碱进样量为2.0ng时，信噪比为3.3，故检测限和定量限分别为1.8和6.1ng。以进样量0.002-0.5μg(横坐标，x)及相应的峰面积(纵坐标，y)绘制得到标准曲线：y＝11.859x-0.0364(R2＝0.9998)，表明当去甲乌药碱的进样量为0.02-0.5μg时，进样量与峰面积的线性关系良好。
表15去甲乌药碱进样量与相应峰面积及低进样量下的信噪比
注：表中“-”表示该进样量下信噪比高于最小进样量的信噪比。
2.2.5.1.2.樱桃苷
精密称取樱桃苷对照品5mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，得标准溶液A；取标准溶液A置容量瓶中，逐级稀释10倍得标准溶液B、C、D。分别取适量标准溶液A、B、C和D进样，按“2.2.2.色谱条件”进行分析。结果见表16，当樱桃苷进样量为5.0ng时，信噪比为1.0，故检测限和定量限分别为15和50ng。以进样量0.005-0.25μg(横坐标，x)及相应的峰面积(纵坐标，y)绘制得到标准曲线：y＝10.75x-0.0099(R2＝0.9999)，表明当樱桃苷的进样量为0.4ng-2.1350μg时，进样量与峰面积的线性关系良好。
表16樱桃苷进样量与相应峰面积及低进样量下的信噪比
注：表中“-”表示该进样量下信噪比高于最小进样量的信噪比。
2.2.5.2.精密度试验
精密称取同一批细辛，按“2.2.4.供试品溶液制备”项制备供试品溶液，按“2.2.2.色谱条件”进行精密度试验，取供试品溶液连续进样6次，测得样品中去甲乌药碱、樱桃苷的峰面积，计算峰面积与取样量的比值以及RSD。分析结果见表17，去甲乌药碱和樱桃苷的峰面积与取样量比值的RSD分别为0.32％和1.13％，符合要求，故可认为本方法的精密度良好。
表17精密度考察结果
2.2.5.3.稳定性试验
精密称取同一批细辛，按“2.2.4.供试品溶液制备”项制备供试品溶液，按“2.2.2.色谱条件”项分别在0、2、4、8、16和24h时进样，进行稳定性试验，测得样品中去甲乌药碱、樱桃苷的峰面积，计算峰面积与取样量的比值以及RSD。考察结果见表18，去甲乌药碱和樱桃苷的峰面积与取样量比值的RSD分别为0.25％和1.12％，符合要求，故可认为本方法的稳定性良好。
表18稳定性考察结果
2.2.5.4.重复性试验
精密称取同一批细辛，平行6份，按“2.2.4.供试品溶液制备”项制备供试品溶液，按“2.2.2.色谱条件”项对样品进行重复性试验，测得去甲乌药碱、樱桃苷的峰面积，并计算峰面积与取样量的比值以及RSD。考察结果见表19，去甲乌药碱和樱桃苷的峰面积与取样量比值的RSD分别为0.55％和0.80％，符合要求，故可认为本方法的重复性良好。
表19重复性考察结果
2.2.5.5.加样回收试验
精密称取同一批细辛1.0g，平行6份，分别精密添加“2.2.5.1.线性范围、检测限和定量限”中的标准溶液A适量，挥干，按“2.2.4.供试品溶液制备”项制备供试品溶液，按“2.2.2.色谱条件”进样分析。结果见表20，去甲乌药碱、樱桃苷的6份平行回收率均值分别为98.61％和98.58％，且各化合物的RSD均小于3％，符合要求，故可认为本方法的回收率良好。
表20去甲乌药碱及樱桃苷回收率试验结果
2.2.6.样品测定
按“2.2.4.供试品溶液制备”项制备细辛不同炮制品的供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.2.2.色谱条件”进行测定，记录峰面积，并计算各样品中去甲乌药碱和樱桃苷的含量。
3.实验结果
细辛不同炮制品中去甲乌药碱和樱桃苷的含量测定结果如表21所示，去甲乌药碱含量变化率依次为甘草制>姜制>米泔水制>炒焦>酒制>醋制>盐制>蜜制>碱醋制>碱制，樱桃苷含量变化率依次为炒焦>甘草制>醋制>酒制>姜制>盐制>蜜制>米泔水制>碱制>碱醋制，其中，甘草制细辛中去甲乌药碱和樱桃苷的增加率分别为84.60％和41.25％，炒焦细辛中樱桃苷增加72.67％，其余炮制方法均不同程度减少去甲乌药碱和樱桃苷的含量。
表21细辛不同炮制品中去甲乌药碱和樱桃苷含量测定结果
结果显示甘草制细辛中去甲乌药碱增加84.60％，樱桃苷增加41.25％，细辛炒焦后樱桃苷增加72.67％，醋制、碱制、碱醋制、酒制、米泔水制、盐制、姜制和蜜制样品中去甲乌药碱和樱桃苷含量明显减少。可见，针对偏头痛的治疗，甘草制细辛是较优的炮制方式。
通过上述实施例可以看到，本发明通过网络药理学的方法研究得到了细辛中对偏头痛具有治疗效果的活性成分。并以此提出了用去甲乌药碱和樱桃苷含量对细辛及其炮制品进行质量检测的方法。利用本发明的质量检测方法，能够有效选择出对偏头痛治疗效果更好的细辛药材或细辛炮制品，在临床应用中具有很好的前景。
Claims (10)
1.一种用于治疗偏头痛的细辛或细辛提取物的质量检测方法，其特征在于：它是通过检测细辛中去甲乌药碱和樱桃苷的含量对细辛进行质量检测。
2.按照权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：判断细辛合格的标准是：去甲乌药碱的含量大于等于0.005％，樱桃苷的含量大于等于0.007％。
3.按照权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述细辛为细辛药材或其炮制品，所述炮制品为炒焦细辛、蜜制细辛、醋制细辛、甘草制细辛、酒制细辛、米泔水制细辛、盐制细辛、姜制细辛、碱制细辛或碱醋制细辛。
4.按照权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于：所述细辛为细辛药材的炮制品，所述炮制品为甘草制细辛。
5.按照权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述去甲乌药碱和樱桃苷的含量的检测方法为：将细辛制成供试品溶液后，采用高效液相色谱法进行检测。
6.按照权利要求5所述的质量检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱法检测的色谱条件包括：以乙腈-体积分数0.05％～0.2％磷酸为流动相，以C18柱为色谱柱。
7.按照权利要求6所述的质量检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱法检测的色谱条件还包括：柱温30～35℃；流速0.8～1.2mL·min-1；检测波长210～330nm；进样量5～20μL。
8.按照权利要求6所述的质量检测方法，其特征在于：所述高效液相色谱法检测的色谱条件还包括：梯度洗脱程序：0～8min，5～7％乙腈；8～13min，7％乙腈；13～14min，7～21％乙腈；14～30min，21％乙腈；30～32min，21～50％乙腈；32～40min，50～90％乙腈。
9.按照权利要求6所述的质量检测方法，其特征在于：所述供试品溶液的制备方法为：将所述细辛制成粉末后，用体积分数40-70％甲醇提取。
10.按照权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于：所述提取的方法为超声提取，提取的时间为30-60min。
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