CN107849091A - 能够在人脂肪衍生的干细胞和肝细胞中抑制丙肝病毒复制的肽及其衍生物 - Google Patents
能够在人脂肪衍生的干细胞和肝细胞中抑制丙肝病毒复制的肽及其衍生物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107849091A CN107849091A CN201580078911.9A CN201580078911A CN107849091A CN 107849091 A CN107849091 A CN 107849091A CN 201580078911 A CN201580078911 A CN 201580078911A CN 107849091 A CN107849091 A CN 107849091A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- hcv
- acid sequence
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
Abstract
本发明提供了具有序列DEAQETAVSSHEQD的肽(兔α1‑抗蛋白酶F的片段)及其衍生物DEAQETAVSSHEQ和QETACSSHEQD,其在hADSC和人肝细胞中显著抑制血清携带的HCV复制。
Description
发明领域
本发明涉及能够抑制丙肝病毒复制的肽及其衍生物、其编码多肽、载体、宿主细胞以及包含所述肽的药物组合物以及它们的用途。
发明背景
HCV为黄病毒科(Flaviviridae)的包膜正链RNA病毒。它含有9.6kb基因组,其始于非翻译区(5’-UTR),接着是编码结构蛋白(core、E1和E2)和包括p7、NS2、NS3、NS4A和4B、NS5A和5B在内的非结构(NS)蛋白的序列(关于综述,参见参考文献1)。至少1亿7千万的人被HCV长期感染,导致每年超过350,000人死亡2。现行治疗例如PEG-干扰素和抗病毒药利巴韦林的组合使用具有许多副作用,并且仅在部分感染患者中有效。已严谨地尝试新的抗HCV治疗的开发(关于综述,参见参考文献3),然而对于该开发,缺乏可靠和生理学的细胞培养系统来生长血清携带的HCV(HCVser)仍然是一个障碍。例如,HCVser的直接感染仅在原代人和黑猩猩肝细胞中显示,并且感染是瞬时且低效的4。最近设计的体外基于细胞的培养方法利用HCV基因组的分子克隆,而非天然病毒(关于综述,参见参考文献5)。此外,这些模型在非原代人细胞例如肝癌细胞系6或神经上皮细胞系7中繁殖HCV。因此,关于将结果外推至临床病毒-宿主相互作用存在忧虑。动物模型例如黑猩猩、人-肝嵌合小鼠8或遗传修饰成易感于HCV感染的小鼠9难以获得或建立。为克服此,在共同待审申请(PCT/CN2015/070243)中,我们成功地开发了一个平台,其中人脂肪衍生的干细胞(hADSC)的亚类支持血清源HCV基因型1a、1b、2a、2b和混合的2a+2b的完全复制。此外,新产生的病毒对于幼稚hADSC具有感染性,并且对幼稚hADSC的系列“再感染”保持病毒复制并且总病毒滴度在6个再感染循环后可逐步放大至超过1x1011个拷贝。有重大意义的是,由血清携带的HCV感染的hADSC产生的病毒对原代人肝细胞具有感染性。
仍对具有较少的副作用的有效药物和治疗存在需求。最近已在设计小分子作为新一代的抗HCV治疗方面作出了进步,然而产生这些HCV特异性酶抑制剂是昂贵的。此外,其长期不利作用要求进一步监测。因而仍需要开发新的抗HCV疗法,其由天然产物组成或来源于天然产物,会令人信服地导致更安全的特征,并且具有较低的生产成本。
发明概述
提供本概述以呈现本发明的概述,从而简要地指出本发明的性质和实质。在理解其不用于解释或限制权利要求的范围或含义的情况下提出该概述。
在一方面,本公开内容提供用于在受试者中治疗或预防HCV感染或抑制HCV复制的方法,其中所述方法包括给予所述受试者有效量的肽或其变体、衍生物、突变体或片段,所述肽包含具有与氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述肽的氨基酸序列具有与氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述肽包含氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ。在一些实施方案中,所述肽的序列基本上由或由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ组成。在一些实施方案中,所述肽包含至少一个氨基酸添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中,所述氨基酸添加、缺失和/或取代在C端和/或N端进行。在一些实施方案中,所述肽具有1-5、优选1-3个氨基酸添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中,所述方法进一步包含给予另一种抗HCV剂。这种抗HCV剂可在本发明肽之前、之后或与之同时给予。在一些实施方案中,HCV具有基因型1a、1b、2a或2b或基因型3或基因型4。
在另一方面,本公开内容提供肽或其变体、衍生物、突变体或片段,所述肽包含与氨基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述肽的氨基酸序列与氨基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更多同一性。在一些实施方案中,所述肽包含氨基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ、基本上由氨基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ组成或由氨基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ组成。在一些实施方案中,所述肽包含至少一个氨基酸添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中,所述氨基酸添加、缺失和/或取代在C端和/或N端进行。在一些实施方案中,所述肽具有1-5、优选1-3个氨基酸添加、缺失和/或取代。在一些实施方案中,所述肽具有对HCV复制的抑制作用。在一些实施方案中,所述肽为分离的或通过化学合成获得的。
在另一方面,本公开内容提供编码本发明肽的多核苷酸。
在另一方面,本公开内容提供包含本发明多核苷酸的载体。
在另一方面,本公开内容提供包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。
在另一方面,本公开内容提供包含有效量的本发明肽、多核苷酸、载体或宿主细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一方面,本公开内容提供本发明肽、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于在受试者中治疗或预防HCV感染或抑制HCV复制的药物中的用途。在一些实施方案中,所述药物进一步包含另一种抗HCV剂。在一些实施方案中,HCV具有基因型1a、1b、2a或2b或基因型3或基因型4。
其它方面描述于下文。
附图简述
当结合通过举例而非限制的方式所包含的附图阅读时能更好地理解前述概述和详述。
图1:DEAQETAVSSHEQD及其衍生物有效地抑制hADSC和原代肝细胞中血清携带的HCV的复制。(A和B)将1、10和100μg/ml浓度的DEA、DEA-Q和QET肽加入p5 hADSC的培养物中1小时,然后暴露于HCV(+)血清(基因型1b)。HLA-A11限制的埃-巴病毒特异性肽表位CSSCSSCPLSK用作对照(无关)肽。在感染后第21天,通过qRT-PCR定量上清液(A)和细胞裂解物(B)中的5’-UTR拷贝数。数据表示为3个实验的平均值±SD。(C)将1、10和100μg/ml浓度的DEA、DEA-Q和QET肽加入原代人肝细胞的培养物中,然后暴露于HCVser(基因型1b)。感染5天后,将细胞RNA提取出用于5’-UTR的RT-PCR。数据表示为3个实验的平均值±SD。在某些浓度(例如10和100μg/ml)DEA、DEA-Q和QET下的HCV拷贝数低于检测限。
发明实施方案的详述
下面参照用于说明的实例应用来描述本发明的数个方面。应当理解的是,本文给出许多具体细节、关系和方法以供全面理解本发明。然而,相关领域普通技术人员应易了解的是,不需要一个或多个具体细节或者用其它方法便可实施本发明。本发明不受行动或事件的顺序的限制,因为某些行动可以不同顺序发生和/或与其它行动或事件同时发生。此外,并不是所有列举的行动或事件都是实施本发明的方法所必需的。
除非另外定义,本文所用的所有科学和技术术语和命名与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。通常,用于细胞培养、感染、分子生物学方法等的程序是本领域中所用的常用方法。这种标准技术可见于参考手册例如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories)和Ausubel等人(1994,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,New York)。
本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在还包括复数形式,除非上下文明确另外指出。
本文所用的术语“约”当提及可测量的值例如量、时距等时,意在包括自所规定的值的±20%或±10%、更优选±5%、甚至更优选±1%和仍更优选±0.1%的变化,因为这样的变化对于执行所公开的方法而言是合适的。
本公开内容的肽可以是重组、天然或合成肽。本公开内容的肽可以是纯化的天然产物或化学合成的产物。可替代地,它可以使用重组技术由原核或真核宿主产生,例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产中使用的宿主,肽可以是糖基化或非糖基化的。在一个实施方案中,本公开内容的肽来源于兔α1-抗蛋白酶F的片段及其衍生物。
如本文使用的,术语“衍生物”、“变体”、“突变体”和“片段”意指基本上保留与本发明肽的相同生物功能或活性的肽。
如本文使用的,术语“衍生物”包括但不限于(i)其中氨基酸残基中的一个或多个包括取代基的那种,(ii)其中肽与另一种化合物例如增加肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的那种,(iii)其中另外的氨基酸融合至肽的那种,例如引导或分泌序列或用于纯化肽或前蛋白的序列,或(iv)其中肽通过一些修饰进行修饰的那种。基于本文的教导,此类衍生物是本技术人员已知的。
如本文使用的,术语“修饰”(其通常不改变一级序列)包括肽的体内或体外化学衍生,例如乙酰化或羧基化。还包括的是糖基化的修饰,例如修饰肽的糖基化模式产生的那些,所述修饰在其合成或加工过程中或在进一步的加工步骤中,例如通过使肽暴露于糖基化酶(例如哺乳动物糖基化或去糖基化酶)而进行。还包括的是具有磷酸化氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸的序列,以及经修饰以改善对蛋白酶解降解的抗性或最佳化可溶性性质的序列。
如本文使用的,术语“变体”包括但不限于几个氨基酸的缺失、插入和/或取代,优选几个保守的氨基酸取代(一般为1-7、优选1-6、更优选1-5、甚至更优选1-4、还更优选1-3、最优选1-2个),和在肽的C末端、N末端或内部的一个或多个氨基酸(一般小于20、优选小于10、更优选小于5个)的添加。例如,当氨基酸残基由相似或类似残基取代,例如由保守或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代时,蛋白质功能通常是未改变的。进一步地,在C末端和/或N末端一个或多个氨基酸的添加通常不改变蛋白质功能。
如本文使用的,“保守氨基酸取代”意指与原始氨基酸序列相比,通过用具有基本上相同或相似性质的氨基酸取代至多7、优选至多6、更优选5且最优选至多3个氨基酸形成的肽。天然存在的氨基酸可基于共同侧链性质分成下列类别:
1)疏水的:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2)中性亲水的:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
3)酸性的:Asp、Glu;
4)碱性的:His、Lys、Arg;
5)影响链取向的残基:Gly、Pro:和
6)芳族的:Trp、Tyr、Phe.
保守氨基酸取代可涉及这些类别之一的成员与同一类别的另一成员交换。保守氨基酸取代可包括非天然存在的氨基酸残基,其通常通过化学肽合成而不是通过生物系统的合成而掺入。这些包括肽模拟物和其它颠倒或反向的氨基酸部分。
示例性保守氨基酸取代列于表1中。
表1
保守氨基酸取代
技术人员能够使用周知的技术结合本文提供的信息确定本文所述的多肽的合适变体。本领域技术人员可通过靶定据信对于活性不重要的区域而鉴定可被改变而不破坏活性的分子的合适区域。技术人员也会能够鉴定在类似多肽间保守的分子的残基和部分。在进一步的实施方案中,甚至对于生物活性或结构重要的区域可进行保守氨基酸取代,而不破坏生物活性或不会不利地影响肽结构。
本发明的多核苷酸可呈DNA和RNA的形式。DNA包括以单链或双链形式的cDNA、基因组DNA和合成DNA等。本发明的多核苷酸可以是简并序列。如本文使用的,术语“简并序列”意指由于密码子的简并性,编码相同蛋白质的不同序列。
术语“编码肽的多核苷酸”包括编码所述肽的多核苷酸和包含额外和/或非编码序列的多核苷酸。
编码本文所述的肽的多核苷酸可以通过PCR扩增、重组方法和合成方法进行制备。对于PCR扩增,通过基于本文公开的核苷酸序列尤其是ORF设计引物,且使用商购可得或通过本领域的常规技术制备的cDNA文库作为模板,可以获得所述序列。一旦获得序列,就可以通过重组方法产生许多序列。通常,将所述序列克隆到载体内,随后将其转化到宿主细胞内。使用常规技术从扩增的宿主细胞中分离序列。
本发明进一步涉及包含本公开内容的多核苷酸的载体、用本公开内容的载体或多核苷酸转化的遗传改造的宿主细胞和用于通过重组技术产生肽的方法。
重组肽可以使用本发明的多核苷酸序列,通过常规重组DNA技术表达或产生(Science,1984;224:1431)。一般地,它包括下述步骤:
(1)用编码肽的多核苷酸或含有多核苷酸的载体转染或转化合适的宿主细胞;
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞;
(3)从培养基或细胞中分离或纯化蛋白质。
在本发明中,本文所述的多核苷酸序列可以插入重组表达载体内。术语“表达载体”意指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物病毒或哺乳动物细胞病毒例如腺病毒、逆转录病毒或本领域已知的任何其它媒介物。任何质粒或载体都可以用于构建重组表达载体,只要它可以复制且在宿主中是稳定的。表达载体的一个重要特点是表达载体一般含有复制起点、启动子、标记基因以及翻译调节组分。
已知方法可以用于构建含有本文所述的序列和合适的转录/翻译调节组分的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。将DNA序列有效连接至表达载体中的合适启动子,以指导mRNA的合成。示例性启动子是大肠杆菌的lac或trp启动子;噬菌体的PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子;HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒的LTRs和一些其它已知启动子,其控制原核细胞、真核细胞或病毒中的基因表达。表达载体可以进一步包含用于起始翻译的核糖体结合位点、转录终止子等。
如本文使用的,“宿主细胞”包括原核生物例如细菌;低等真核生物例如酵母;高等真核生物例如哺乳动物细胞。代表性例子是细菌细胞例如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌;真菌细胞例如酵母;植物细胞;昆虫细胞例如果蝇S2或Sf9;动物细胞例如CHO、COS或Bowes黑素瘤等。
本发明还涉及用于在受试者中治疗或预防HCV感染或抑制HCV复制的方法,所述方法包括给予所述受试者有效量的本发明肽。这种肽可包括但不限于包含具有与氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变体、衍生物、突变体或片段。在一个实施方案中,所述肽包含氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ,基本上由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ组成或由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ组成。在一个实施方案中,所述肽可为肽DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ的变体、衍生物、突变体或片段,只要所述变体、衍生物、突变体或片段保留肽DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ对HCV的抑制作用即可。例如,所述变体、衍生物、突变体或片段对HCV的抑制作用可为肽DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ对HCV的抑制作用的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%或更多。本领域技术人员可常规地选择和确定这类变体、衍生物、突变体和片段。
本文所用的术语“有效量”是指足以显示有意义的患者益处例如持续的病毒负荷减少的活性组分的量。
本发明的HCV可为可感染hADSC或人肝细胞的任何HCV,或可自HCV感染个体分离的任何HCV。在一个实施方案中,HCV为选自以下的HCV基因型的至少一种:基因型1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a,或其任何组合。在另一实施方案中,HCV为选自以下的HCV基因型的至少一种:基因型1a、1b、2a、2b、3和4。
HCV的水平可通过本领域的任何已知技术确定。这样的技术可包括抗HCV ELISA测定(酶联免疫吸附测定),其测试HCV蛋白。可使用通过扩增测试RNA的用于HCV复制的测试(例如聚合酶链式反应或PCR,分支DNA测定)。HCV RNA的合成当然可使用设计用于实时PCR的装置在单一步骤中通过RT-PCR而分析或使用HCV特异性放射性探针通过在滤器上杂交RNA而分析。例如,分离的RNA可进行使用能够扩增HCV基因组的特异性寡核苷酸引物的偶合的反转录和扩增,例如反转录和通过聚合酶链式反应的扩增(RT-PCR)。然后,可进行直接测序以确定感染所述受试者的HCV的基因型。
本文所用的术语″人脂肪衍生的干细胞″(hADSC)为人成体干细胞,其为或者具有获自包含脂肪组织的组织来源的亲本细胞。在一些情况下,hADSC也称为基质脉管级分(SVF),其是ADSC系列的真正来源。SVF是分离自人脂肪组织的原代细胞,并且在培养中它们会自发增殖(在细胞数量上的增加)。
本文所用的术语″患者″、″受试者″、″个体″等可互换使用,并指顺应于本文所述方法的任何动物,包括人、非人哺乳动物(例如牛、绵羊、兔、狗、小鼠、大鼠、猴子等)和家禽。
本发明还提供包含有效量的本文肽、其变体、衍生物、突变体和/或片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇或它们的组合。药物制剂应适于递送方法。药物组合物可呈注射剂形式,所述注射剂使用生理盐水或包含葡萄糖或辅助物质的其它水性溶液通过常规方法制得。可通过常规方法制备呈片剂或胶囊形式的药物组合物。药物组合物例如注射剂、溶液剂、片剂和胶囊应该在无菌条件下制备。活性成分以治疗有效量给予,例如每天约1μg-50mg/kg体重或更多。
此外,本公开内容的肽可与其它抗HCV剂在组合疗法中共同地或分开地给予,或者通过将化合物组合成组合物而给予。可与本公开内容的肽一起给予的剂包括但不限于干扰素和利巴韦林、boceprevir、替拉瑞韦(telaprevirs)或sofosbuvir。干扰素可选自干扰素α2B、聚乙二醇化干扰素α、复合干扰素(consensus interferon)、干扰素α2A、干扰素λ、聚乙二醇化干扰素λ和淋巴细胞样干扰素τ。
本公开内容的肽还可用作实验室试剂。所述肽可用于提供用于设计病毒复制测定、动物测定系统的验证和结构生物学研究的研究工具以进一步增强HCV疾病机制的知识。此外,本公开内容的肽可用于建立或确定其它抗病毒剂的结合位点,例如通过竞争抑制。
本公开内容的肽还可用于治疗或预防材料的病毒污染,从而减少接触这类材料的实验室或医学人员或患者病毒感染的风险,所述材料例如血液、组织、手术仪器和衣服、实验室仪器和衣服和采血或输血装置和材料。
本公开内容的肽、药物组合物、用途和方法的实施方案旨在说明性的而非限制性的。本领域技术人员鉴于上述教导可做出修饰和变化,特别是可涉及保持关于抗HCV病毒作用上接近天然功能的肽中的变化的那些。因此,应该理解的是,可在所描述的范围内中公开的具体实施方案中进行变化。
本发明进一步由下列实施例阐述。这些实施例仅旨在说明本发明,而不是限制本发明的范围。对于下列实施例中的实验方法,它们在常规条件,例如由Sambrook等于Molecule Clone:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989中所述或由制造商所指示的那些下进行,除非另有规定。
实施例1
肽制备
用于合成的通用信息:用于合成的氨基酸:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。HPLC分析在Agilent 1100系列系统上使用C18柱(BIOSIL,4.6mm x150mm,5μm)进行。在220nm通过UV进行检测。流速为0.3mL/min。对于肽-3和5,使用下列梯度洗脱(溶剂A:0.1%TFA/H2O,溶剂B:0.1%TFA/MeOH):在0min时100%A,在10min时80%A,20%B,在15min时50%A,50%B,在20min时100%B,和100%B持续额外10min。在HPLC(NUCLEODUR C18Pyramid,4.6mm x 250mm,5μm)中用于QET的流动相为0.1%TFA/CH3OH。MALDI-TOF质谱仪(Autoflex III系统,BrukerDaltonics)和核磁共振波谱学(VarianUnity Plus 400MHz)用于肽鉴定。
肽的通用合成和纯化:使用标准Fmoc策略和固相肽合成仪(PS3)合成了肽。一般而言,将D或Q残基预装载的Wang树脂(0.79mmol/g载荷)称入反应容器并在合成前用新鲜DMF(5mL)溶胀1小时。将第一和相续的Fmoc基团用含20%哌啶的5mL DMF(作为“DEP”溶液)去除2次各5min,以游离N端的胺。其后,将含0.4M N-甲基吗啉的3mL DMF加入用于C端活化(作为“ACT”),并将所需的氨基酸(作为FmoC-AA(保护的侧链)-OH)和PyBOP以4倍过量用于偶联(称为AA)。在“AA”进行恰当时间(参见表2)后,将N端氨基酸引入Ac2O(100μL)以在ACT溶液中加冒其余的未反应游离胺(称为CAP)达25min(作为CAP)。然后,保持重复DEP-ACT-AA--CAP循环以自C端至N端构建肽。所有反应物通过Kaisar测试监测。最后,通过用95%TFA/H2O在冰浴中处理并返回室温达1.5小时而将肽从固相支持体中移除。通过过滤收集粗产物。将粗产物通过中压液相色谱使用C18柱(MERCK Lobar 310-25Lichrprep)进行纯化。通过HPLC系统鉴定纯度。所合成的肽通过MALDI-TOF质谱仪和核磁共振波谱学表征。
结果
肽-3(DEA-Q):DEAQETAVSSHEQ,收率:29%。保留时间:17.7min(纯度>95%).MS(MALDI-TOF):理论值:1430Da(M+H+),实测值:1430Da(M+H+)(观察的)。1H-NMR(400MHz,D2O):8.54(s,1H),7.22(s,1H),4.65(m,1H),4.51(q,J=7Hz,1H),4.30(m,8H),4.09(m,3H),3.77(m,3H),3.58(m,2H),3.23(dd,J=6和6Hz,1H),3.09(dd,J=8和9Hz,1H),2.97(dd,J=5和5Hz,1H),2.87(dd,J=8和8Hz,1H),2.42(m,6H),2.04(m,15H),1.30(t,J=7Hz,6H),1.16(m,3H),0.87(dd,J=4和4Hz,6H)。
肽-5(DEA):DEAQETAVSSHEQD,收率:28%。保留时间:16.5min(纯度>95%)。MS(MALDI-TOF):理论值:1545Da.(M+H+),实测值:1545Da((M+H+)。1H-NMR(400MHz,D2O):8.53(s,1H),7.20(s,1H),4.64(m,2H),4.50(t,J=7Hz,1H),4.30(m,8H),4.08(m,3H),3.69(m,5H),3.20(dd,J=6和6Hz,1H),3.07(dd,J=8和8Hz,1H),2.85(m,3H),2.42(m,6H),2.07(m,15H),1.28(m,6H),1.15(m,3H),0.86(dd,J=3和3Hz,6H)。
QET:QETAVSSHEQD;保留时间:3.9;MS(MALDI-TOF):理论值:1230Da([M+H]),实测值:1230.Da([M+H])。
表2用于各氨基酸偶联(AA)的反应时间
#AA运行两次记录为“*2”.
##顺序:从C端至N端
实施例2
抗HCV活性
我们接下来检查了在实施例1中制备的由14个氨基酸DEAQETAVSSHEQD组成的肽(命名为DEA)及其衍生物QETAVSSHEQD(命名为QET)和DEAQETAVSSHEQ(命名为DEA-Q)在hADSC和人原代肝细胞中对血清携带的HCV的复制的作用。将1、10和100μg/ml剂量的各种肽加入了p5hADSC的培养物中1h,然后暴露于HCV(+)血清(基因型1b)。也用100μg/ml的对照肽处理hADSC,所述对照肽为HLA-A11限制的埃-巴病毒特异性肽表位CSSCSSCPLSK10。在感染后第21天,通过qRT-PCR定量上清液和细胞裂解物中的5’-UTR拷贝数。结果显示在HCVser-1b感染hADSC的d21上清液(图1A)和细胞裂解物(图1B)中,通过用DEA、DEA-Q或QET肽预处理显著减少病毒拷贝数,并且各种肽的抑制作用在1μg/ml下就已经值得注意了。相比之下,用对照肽进行的预处理没有作用。
我们也检测了这些肽是否还抑制人肝细胞中的HCVser复制。如所述11,人肝细胞分离自远离损伤的非肿瘤部分。肝细胞静置3天以允许贴附于朔料孔上,并随后在有或无对照肽、DEA、DEA-Q或QET肽的预处理下暴露于HCVser-1b。感染5天后,将细胞RNA提取出用于5’-UTR的RT-PCR。结果证实与hADSC的情形一样,在低至1μg/ml的浓度下(图1C),用肽DEA、DEA-Q和QET进行的预处理显著抑制人肝细胞中的HCVser复制。
总之,我们提供了下列证据:具有DEAQETAVSSHEQD、DEAQETAVSSHEQ和QETAVSSHEQD序列的肽具有在hADSC和原代人肝细胞两者中对HCVser复制的抑制作用。具有DEAQETAVSSHEQD序列的肽为兔α1-抗蛋白酶F的片段,这种天然来源的产物会令人信服地导致更安全的特征,并且具有较低的生产成本。
参考文献
1 Lindenbach,B.D&Rice,C.M.Unravelling hepatitis C virus replicationfrom genome to function.Nature 436,933-938,doi:10.1038/nature04077(2005).
2 Sheets,W.F.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/.(2012年7月).
3 Scheel,T.K.&Rice,C.M.Understanding the hepatitis C virus lifecycle paves the way for highly effective therapies.Nature medicine 19,837-849,doi:10.1038/nm.3248(2013).
4 Bartenschlager,R.&Lohmann,V.Novel cell culture systems for thehepatitis C virus.Antiviral research52,1-17(2001).
5 Wilson,G.K.&Stamataki,Z.In vitro systems for the study ofhepatitis C virus infection.International journal of hepatology 2012,292591,doi:10.1155/2012/292591(2012).
6 Sheehy,P.et alIn vitro replication models for the hepatitis Cvirus.Journal of viral hepatitis 14,2-10,doi:101111/j.1365-2893.2006.00807.x(2007).
7 Fletcher,N.F.et alHepatitis C virus infection of neuroepitheliomacell lines.Gastroenterology 139,1365-1374,doi:10.1053/j.gastro.2010.06.008(2010).
8 Mercer,D.F.et al.Hepatitis C virus replication in mice withchimeric human livers.Nature medicine 7,927-933,doi:10.1038/90968(2001).
9 Dorner,M.et al.A genetically humanized mouse model for hepatitis Cvirus infection.Nature 474,208-211,doi:10.1038/nature10168(2011).
10 Lin,C.L.et alImmunization with Epstein-Barr Virus(EBV)peptide-pulsed dendritic cells induces functional CD8+ T-cell immunity and may leadto tumor rearession in patients with EBV-positive nasopharyngealcarcinoma.Cancer research 62,6952-6958(2002).
11 Bhogal,R.H.et alIsolation of primary human hepatocytes from normaland diseased liver tissue:a one hundred liver experience.PloS one 6,e18222,doi:10.1371/journal.pone.0018222(2011).
Claims (18)
1.一种用于在受试者中治疗或预防HCV感染或抑制HCV复制的方法,其中所述方法包括给予所述受试者有效量的肽或其变体、衍生物、突变体或片段,所述肽包含具有与氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少70%同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的方法,其中所述肽的氨基酸序列具有与氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的方法,其中所述肽包含氨基酸序列 EAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述肽的序列基本上由或由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ组成。
5.权利要求1-4中任一项的方法,其中所述肽包含至少一个氨基酸添加、缺失和/或取代。
6.权利要求5的方法,其中所述氨基酸添加、缺失和/或取代在C端和/或N端进行。
7.权利要求5或6的方法,其中所述肽具有1-5、优选1-3个氨基酸添加、缺失和/或取代。
8.权利要求1-7中任一项的方法,其中所述方法进一步包含给予另一种抗HCV剂。
9.权利要求1-8中任一项的方法,其中HCV具有基因型1a、1b、2a或2b或基因型3或基因型4。
10.一种包含与氨基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变体、衍生物、突变体或片段。
11.权利要求10的肽,其中所述肽的序列基本上由或由QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ组成。
12.一种多核苷酸,其包含与选自以下的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列:
(a)编码包含QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ的氨基酸序列的肽、其变体、衍生物、突变体或片段的核苷酸序列,和
(b)与(a)的核苷酸序列互补的多核苷酸;
其中所述肽、其变体、衍生物、突变体或片段具有对HCV复制的抑制作用。
13.一种包含权利要求12的多核苷酸的载体。
14.一种包含权利要求12的多核苷酸或权利要求13的载体的宿主细胞。
15.一种包含有效量的权利要求10-11中任一项的肽、权利要求12的多核苷酸、权利要求13的载体或权利要求14的宿主细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。
16.包含具有与氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽、权利要求12的多核苷酸、权利要求13的载体、权利要求14的宿主细胞或权利要求15的药物组合物在制备用于在受试者中治疗或预防HCV感染或抑制HCV复制的药物中的用途。
17.权利要求16的用途,其中所述药物进一步包含另一种抗HCV剂。
18.权利要求16的用途,其中HCV具有基因型1a、1b、2a或2b或基因型3或基因型4。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2015/076744 WO2016165101A1 (en) | 2015-04-16 | 2015-04-16 | Peptide and its derivatives capable of inhibiting replication of hepatitis c virus in human adipose-derived stem cells and hepatocytes |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107849091A true CN107849091A (zh) | 2018-03-27 |
CN107849091B CN107849091B (zh) | 2021-09-10 |
Family
ID=57125559
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580078911.9A Active CN107849091B (zh) | 2015-04-16 | 2015-04-16 | 能够在人脂肪衍生的干细胞和肝细胞中抑制丙肝病毒复制的肽及其衍生物 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11254706B2 (zh) |
EP (1) | EP3283503B1 (zh) |
JP (1) | JP2018516272A (zh) |
KR (1) | KR20170137184A (zh) |
CN (1) | CN107849091B (zh) |
AU (1) | AU2015391060A1 (zh) |
CA (1) | CA2982391A1 (zh) |
HK (1) | HK1249914A1 (zh) |
WO (1) | WO2016165101A1 (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112543765A (zh) * | 2018-08-01 | 2021-03-23 | 宏福生物发展有限公司 | 能够刺激细胞因子释放的新型肽及其衍生物 |
WO2021072724A1 (zh) * | 2019-10-18 | 2021-04-22 | 沛尔生技医药股份有限公司 | 肽及其作为制备治疗发炎性疾病及疼痛的药物的用途 |
CN112759625A (zh) * | 2019-10-18 | 2021-05-07 | 沛尔生技医药股份有限公司 | 肽及其作为制备治疗发炎性疾病及疼痛的药物的用途 |
WO2023186062A1 (zh) * | 2022-04-01 | 2023-10-05 | 首创生物技术有限公司 | 肽用于治疗神经退行性疾病或改善认知功能的用途 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI705818B (zh) * | 2019-10-18 | 2020-10-01 | 沛爾生技醫藥股份有限公司 | 肽及其作為製備治療發炎性疾病及疼痛的藥物的用途 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006130553A2 (en) * | 2005-06-02 | 2006-12-07 | Schering Corporation | Hcv protease inhibitors |
CN102574909A (zh) * | 2009-05-05 | 2012-07-11 | 自然环境研究会 | 修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法 |
CN104321337A (zh) * | 2012-05-25 | 2015-01-28 | 永林有限公司 | 肽及其用途 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100794362B1 (ko) | 2006-02-27 | 2008-01-15 | 주식회사 임젠 | Nanog를 이용한 아스트로사이트의 신경줄기세포로의역분화 |
-
2015
- 2015-04-16 KR KR1020177032845A patent/KR20170137184A/ko unknown
- 2015-04-16 AU AU2015391060A patent/AU2015391060A1/en not_active Abandoned
- 2015-04-16 JP JP2018505509A patent/JP2018516272A/ja active Pending
- 2015-04-16 EP EP15888806.5A patent/EP3283503B1/en active Active
- 2015-04-16 US US15/566,910 patent/US11254706B2/en active Active
- 2015-04-16 CA CA2982391A patent/CA2982391A1/en not_active Abandoned
- 2015-04-16 CN CN201580078911.9A patent/CN107849091B/zh active Active
- 2015-04-16 WO PCT/CN2015/076744 patent/WO2016165101A1/en active Application Filing
-
2018
- 2018-07-20 HK HK18109405.0A patent/HK1249914A1/zh unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006130553A2 (en) * | 2005-06-02 | 2006-12-07 | Schering Corporation | Hcv protease inhibitors |
CN102574909A (zh) * | 2009-05-05 | 2012-07-11 | 自然环境研究会 | 修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法 |
CN104321337A (zh) * | 2012-05-25 | 2015-01-28 | 永林有限公司 | 肽及其用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
陆志檬等: "HCV基因型和病毒量与干扰素疗效的关系", 《中华传染病杂志》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112543765A (zh) * | 2018-08-01 | 2021-03-23 | 宏福生物发展有限公司 | 能够刺激细胞因子释放的新型肽及其衍生物 |
WO2021072724A1 (zh) * | 2019-10-18 | 2021-04-22 | 沛尔生技医药股份有限公司 | 肽及其作为制备治疗发炎性疾病及疼痛的药物的用途 |
CN112759625A (zh) * | 2019-10-18 | 2021-05-07 | 沛尔生技医药股份有限公司 | 肽及其作为制备治疗发炎性疾病及疼痛的药物的用途 |
CN112759625B (zh) * | 2019-10-18 | 2023-05-05 | 沛尔生技医药股份有限公司 | 肽作为制备治疗发炎性疾病及疼痛的药物的用途 |
WO2023186062A1 (zh) * | 2022-04-01 | 2023-10-05 | 首创生物技术有限公司 | 肽用于治疗神经退行性疾病或改善认知功能的用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3283503A4 (en) | 2018-11-14 |
EP3283503B1 (en) | 2020-08-19 |
US11254706B2 (en) | 2022-02-22 |
JP2018516272A (ja) | 2018-06-21 |
US20180134751A1 (en) | 2018-05-17 |
CA2982391A1 (en) | 2016-10-20 |
WO2016165101A1 (en) | 2016-10-20 |
EP3283503A1 (en) | 2018-02-21 |
HK1249914A1 (zh) | 2018-11-16 |
CN107849091B (zh) | 2021-09-10 |
KR20170137184A (ko) | 2017-12-12 |
AU2015391060A1 (en) | 2017-10-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN100509846C (zh) | 有效治疗肿瘤和其它需要除去或破坏细胞的疾病的肽 | |
CN107849091A (zh) | 能够在人脂肪衍生的干细胞和肝细胞中抑制丙肝病毒复制的肽及其衍生物 | |
CN104662038B (zh) | 胰高血糖素类似物 | |
KR101626153B1 (ko) | 조직 보호 펩티드 및 이의 용도 | |
CN103087172A (zh) | 包含fyn激酶的修饰的sh3结构域的特异性的且高亲和力的结合蛋白 | |
CN102066413A (zh) | 用于预防和治疗组织损伤相关疾病和病症的组织保护肽和肽类似物 | |
Basile et al. | Characterization of a designed vascular endothelial growth factor receptor antagonist helical peptide with antiangiogenic activity in vivo | |
RU2398776C2 (ru) | Тимус-специфический белок | |
CN110078813A (zh) | 免疫原性wt-1肽和其使用方法 | |
CN106573072A (zh) | 降低血清胆固醇的方法 | |
TWI588153B (zh) | 多胜肽、編碼該多胜肽之核酸分子、以及該多胜肽之應用 | |
CN106573960A (zh) | 用于针对乙型肝炎病毒感染的治疗性接种的合成长肽(slp) | |
CN101330928A (zh) | 用于预防和治疗丙型肝炎的免疫刺激剂组合 | |
CN102449172A (zh) | 施用针对登革病毒的疫苗的组合物和方法 | |
CN108138150A (zh) | 细胞透性改善的(iCP)帕金重组蛋白及其用途 | |
CN109422816A (zh) | 一种靶向次级淋巴组织的肝癌疫苗 | |
CN101921314A (zh) | 脑靶向防治老年性痴呆的神经营养因子融合多肽 | |
AU2003288434B2 (en) | Peptides, antibodies thereto, and their use in the treatment of central nervous system damage | |
CN105504070B (zh) | 一种四分支多肽及其应用 | |
CN101092452A (zh) | 肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽、融合蛋白及两者制备方法 | |
CN109096368B (zh) | 一种同时具有抗氧化和护肝活性的多肽及编码该多肽的基因与其制备方法和应用 | |
CN108299556B (zh) | 一种治疗血液肿瘤的多肽 | |
TWI648062B (zh) | 能夠抑制c型肝炎病毒於人類脂肪幹細胞及肝細胞複製的肽及其衍生物 | |
CN101255190B (zh) | 一种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN100586476C (zh) | 一种Myostatin特异性抗体的治疗性疫苗及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1249914 Country of ref document: HK |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |