CN110004105A

CN110004105A - 一种蛋白在细胞培养中的应用

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Publication number: CN110004105A
Application number: CN201810011486.7A
Authority: CN
Inventors: 张英豪; 陈博; 陈锐; 付晶鹏
Original assignee: Shanghai Qingliu Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Puyou Biomedical Co ltd
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2038-01-05
Also published as: WO2019134498A1; CN111770988A; CN110004105B

Abstract

本发明公开了一种蛋白在细胞培养中的应用，其是把sDSS1蛋白应用于细胞培养，从而提高细胞培养效率的方法。在培养液中添加sDSS1蛋白能够有效地降低细胞ROS水平，减少细胞死亡，提高细胞数量并维持干细胞的分化能力。sDSS1蛋白在科学研究、医疗、工业生产中所涉及的细胞培养中有重要的应用价值。

Description

一种蛋白在细胞培养中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白在细胞培养中的应用。

背景技术

细胞培养是在体外模拟在体细胞的生理环境，对细胞进行孵育或培养，以维持其生存和生长的过程。细胞培养广泛应用于科学研究、医疗医药和工业化生产，但是，体外培养的细胞与在体细胞状态仍然有区别。细胞培养液往往含有较高的糖分、蛋白质等营养物质，细胞培养普遍使用的二氧化碳培养箱中氧分压远远高于体内，细胞传代过程中使用的消化酶会造成细胞一定程度的损伤，这些因素使细胞始终处于高氧化应激状态，除了造成细胞氧化应激水平升高，也会恶化培养环境，引起培养液中氧化蛋白、氧化脂质和氧化糖类水平增加，最终影响细胞活力和细胞功能[1-3]。此外，在细胞培养过程中经常用到肽牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，血清质量是影响细胞活力和细胞增殖活性的关键因素。无血清培养的细胞因为失去血清的保护，对培养环境更加敏感，易受培养液中毒性物质的影响[4]。因此，改善细胞的生存环境，减少培养液中毒性成分含量，提高培养细胞的活力，成为提高细胞培养效率的有效途径。

在细胞移植中，从组织分离的供体细胞经过细胞分选、细胞纯化、细胞扩增、细胞注射等过程，存活的细胞数量有限，细胞活力也会受处理过程的延长而下降。细胞治疗往往需要大量的供体细胞，例如，神经干细胞治疗过程中单次注射的细胞量是10⁹-10¹⁰[5]。而且，供体细胞活力影响细胞生存和功能的发挥，是保证细胞治疗效果的决定性因素。在细胞治疗过程中，细胞经过基因修饰和细胞分选等过程，活力受到一定程度的影响，保护供体细胞活力是决定治疗效果的关键因素之一[6]。工业生产中，利用哺乳动物细胞或昆虫细胞进行大规模发酵生产抗体蛋白或多肽/蛋白药物，细胞数量和细胞活力是影响蛋白生产效率的决定性因素[7]。因此，如何在细胞培养过程中尽力提高细胞数量并且维持细胞活力是决定细胞在医药或工业化应用的重要课题。

前期的研究表明，当细胞内发生氧化应激时，DSS1(Deleted split hand/splitfoot 1)蛋白作为一种在真核生物中高度保守的小蛋白，能够在酶促反应并消耗ATP的条件下被共价修饰到氧化蛋白上，这种修饰将介导氧化蛋白在细胞内的降解[8]。DSS1基因敲除导致细胞死亡；高表达DSS1蛋白的细胞对氧化应激或抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡表现显著的抗性[9]。这些结果显示DSS1蛋白在细胞清除氧化蛋白过程中的重要作用，对细胞的生存非常关键。

以上内容引文如下：

1.B.Halliwell(2003)Oxidative stress in cell culture:An under-appreciated problem？FEBS Lett 540(1–3):3–6.

2.Oze H,Hirao M,Ebina K,Shi K,Kawato Y,Kaneshiro S, Yoshikawa H,Hashimoto J(2012)Impact of medium volume and oxygen concentration in theincubator on pericellular oxygen concentration and differentiation of murinechondrogenic cell culture.In Vitro Cell Dev BiolAnim 48(2):123-30.

3.J.J.Reiners,P.Mathieu,C.Okafor,D.A.Putt,and L.H. Lash(2000)Depletion of cellular glutathione by conditions used for the passaging ofadherent cultured cells.Toxicol.Lett 115(2):153–163.

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6.Pettitt D,Arshad Z,Smith J,Stanic T,G,Brindley D(2017)CAR-T Cells:A Systematic Review and Mixed Methods Analysis of the ClinicalTrial Landscape.Mol Ther S1525-0016(17):30556-7.

7.Omasa T,Onitsuka M,Kim WD(2010)Cell engineering and cultivation ofchinese hamster ovary(CHO)cells.Curr Pharm Biotechno 11(3):233-40.

8.Zhang Y,Chang FM,Huang J,Junco JJ,Maffi SK,Pridgen HI,Catano G,DangH,Ding X,Yang F,Kim DJ,Slaga TJ,He R, Wei SJ(2014)DSSylation,a novel proteinmodification targets proteins induced by oxidative stress,and facilitatestheir degradation in cells.Protein Cell 5(2):124-40.

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发明内容

sDSS1蛋白添加到细胞培养基中可以减少细胞毒性反应，并降低在细胞培养过程中细胞的死亡和胞内的氧化自由基水平，从而提高细胞培养的效率。把sDSS1蛋白应用于细胞培养将有助于提高细胞移植、细胞治疗和细胞发酵等医药或工业的效率，具有重要的应用价值。

具体的技术方案如下：

一种蛋白在细胞培养中的应用，所述的应用是把sDSS1蛋白用于细胞培养。

优选地，所述的sDSS1蛋白包括人、黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、白颊长臂猿、川金丝猴、恒河猴、滇金丝猴、东非狒狒、安哥拉疣猴、白顶白眉猴、鬼狒、豚尾猴的任一sDSS1蛋白序列形成的基础蛋白，其中人sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO： 1，黑猩猩sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2，倭黑猩猩sDSS1 的氨基酸序列如SEQ ID NO：3，大猩猩sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4，红毛猩猩sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5，白颊长臂猿sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6，川金丝猴sDSS1 的氨基酸序列如SEQ ID NO：7,恒河猴sDSS1的氨基酸序列如 SEQ ID NO：8，滇金丝猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：9，东非狒狒sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：10，安哥拉疣猴 sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：11，白顶白眉猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12，鬼狒sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13，豚尾猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：14。

优选地，所述的sDSS1蛋白是任一与以上方案所述的基础蛋白相似度达到70％以上的第一种蛋白。

优选地，所述的sDSS1蛋白是任一以以上方案所述的基础蛋白氮端58个氨基酸为基础，在氮端或碳端融合其他多肽片段，用于融合的多肽片段的结构特征或氨基酸序列特征与以上方案所述的基础蛋白碳端31个序列相同或相似的第二种蛋白。

优选地，所述的sDSS1蛋白是任一以以上方案所述的基础蛋白氮端58个氨基酸为基础，在氮端或碳端融合其他氨基酸片段，融合后的蛋白能实现跨膜转运功能的第三种蛋白。

优选地，所述的sDSS1蛋白是利用以上方案任一所述基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白或第三种蛋白与该蛋白自身、载体蛋白、抗体或其他任意长度氨基酸片段连接形成的融合蛋白。

优选地，所述的sDSS1蛋白是基于所述基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白或第三种蛋白进行的修饰产生的多肽/蛋白修饰物。

优选地，所述多肽/蛋白修饰物的修饰是针对sDSS1蛋白氨基酸侧链上的氨基、氨基酸侧链上的羰基、氮端末端氨基、碳端末端羰基、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸或色氨酸进行的特异性或非特异性的1-20 个位点的化学修饰。

优选地，所述多肽/蛋白修饰物的修饰方法包括糖基化修饰、脂肪酸修饰、酰基化修饰、Fc片段融合、白蛋白融合、聚乙二醇修饰、右旋糖苷修饰、肝素修饰、聚乙烯吡咯烷酮修饰、聚氨基酸修饰、多聚唾液酸修饰、壳聚糖及其衍生物修饰、凝集素修饰、海藻酸钠修饰、卡波姆修饰、聚乙烯吡咯烷酮修饰、羟丙基甲基纤维素修饰、羟丙基纤维素修饰、乙酰化修饰、甲酰化修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、磺酸化修饰或其他医药上可用的多肽/蛋白药物修饰方法的一种或一种以上。

优选地，所述的sDSS1蛋白是利用所述基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白或第三种蛋白的氨基酸序列为基础进行的20种基本氨基酸以外的氨基酸进行的1-31个任意氨基酸位点替换的非天然氨基酸替代蛋白。

优选地，所述非天然氨基酸替代蛋白的氨基酸替换包括羟脯氨酸、羟赖氨酸、硒代半胱氨酸、D-型氨基酸或者人工合成的非天然氨基酸及其衍生物。

优选地，所述的sDSS1蛋白是把所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白、融合蛋白、多肽/蛋白修饰物或非天然氨基酸替代蛋白与医药上可应用的药物载体形成的部分或全部复合体。

优选地，所述药物载体包含肠溶衣制剂、胶囊、微球/囊、脂质体、微乳液、复乳液、纳米颗粒、磁颗粒、明胶和凝胶中的一种或一种以上。

优选地，所述的sDSS1蛋白是细胞培养过程中把所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白的DNA或RNA序列导入细胞从而在培养液中获得的第四种蛋白。

优选地，所述的sDSS1蛋白在细胞培养中的应用是把所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白、第四种蛋白、融合蛋白、多肽/蛋白修饰物、非天然氨基酸替代蛋白或复合体用做基础培养基组分、血清组分、血清替代物组分、增殖添加物组分，或其他细胞培养过程中需要添加的任意成分的组分。

优选地，所述的应用是把所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白、融合蛋白、多肽/蛋白修饰物、非天然氨基酸替代蛋白或复合体用做细胞移植、细胞治疗、组织移植、组织修复或器官移植过程中的细胞/组织保护液、细胞悬液、细胞/组织维持液、细胞/组织清洗液或这些过程中使用的任意溶液的组分。

优选地，所述的细胞培养是利用培养基在体外进行的细胞制备、细胞分选、细胞克隆培养、细胞扩增培养、细胞富集、细胞纯化、细胞工程、细胞三维培养、细胞发酵、组织培养、器官培养的任一形式。

优选地，所述的细胞培养是对来源于人、猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟或昆虫的任意细胞进行的细胞培养。

优选地，所述的细胞培养是对原代细胞、组织来源干细胞、组织来源前体细胞、诱导多能干细胞、分化来源细胞、转分化来源细胞、细胞工程获得的细胞、肿瘤干细胞、肿瘤组织分离的肿瘤细胞、细胞株、细胞系、昆虫细胞、细胞团块、组织团块、体外培养器官中的一种或一种以上进行的细胞培养。

优选地，所述的原代细胞其类型是心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、毛囊真皮乳头细胞、肝细胞、肾细胞、角质化细胞、黑色素细胞、成骨细胞、前成脂肪细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、前体细胞、周细胞或树突细胞中的一种或一种以上。

优选地，所述的细胞培养过程中任意时期添加所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白、融合蛋白、多肽/蛋白修饰物、非天然氨基酸替代蛋白或复合体的浓度为不小于10nM。

一种商业开发或临床应用，所述的应用是利用上述任一技术方案所述的蛋白在细胞培养中的应用，然后把sDSS1蛋白在细胞培养中的应用进行商业开发或临床应用。

本发明的特点和/或有益效果有：

1.本发明证明sDSS1蛋白添加到细胞培养基中可以降低细胞培养基中的LDH水平以及胞内自由基水平，从而维持细胞增殖，提高细胞数量。

2.本发明证明sDSS1蛋白添加到细胞培养基可以在一定浓度范围内提高细胞数量，从而对细胞培养与连续传代有积极效果。

3.本发明证明sDSS1蛋白添加到干细胞培养基中可以提高干细胞数量，并且维持干细胞的细胞干性水平。

综上，本发明提供了一种新型sDSS1蛋白，通过在细胞系、原代成体细胞、原代干细胞上实验验证，sDSS1蛋白添加到培养基中可以降低细胞毒性反应和细胞死亡水平，从而提高培养过程中细胞的数量。保护细胞活力，维持干细胞的分化能力。因此，sDSS1蛋白在细胞移植、细胞治疗、细胞发酵等医疗医药或工业化发酵生产等领域具有重要的潜在应用价值。

附图说明

下面结合附图，对本发明做进一步详细的阐述，以使本发明能够清楚、完整，但不是为了限制本发明的保护范围。

图1A-图1C，sDSS1蛋白促进N2a细胞增殖并降低细胞毒性反应水平。

图1A，与对照组相比，培养液中加入sDSS1蛋白后，细胞数量显著增加，在100nM、200nM和高浓度组(2-50μM)检测到明显的细胞数量提高。图1B，用LDH试剂盒检测细胞毒性反应水平，结果发现加入sDSS1蛋白后，细胞毒性反应水平明显下降，在2-50μM 蛋白浓度之间，细胞毒性反应水平呈现明显的浓度梯度依赖性，随着蛋白浓度增加，细胞毒性反应水平逐渐下降。图1C，检测细胞胞内 ROS水平，结果显示sDSS1蛋白可以显著降低细胞ROS水平。每组n＝5。数据经ANOVA分析，*，p-value<0.05；**，p-value<0.01。

图2A-图2B，sDSS1蛋白促进PC-12细胞增殖并降低细胞毒性反应水平。

图2A，在PC-12细胞培养液中加入不同浓度的sDSS1蛋白，检测细胞数量发现，低浓度sDSS1蛋白(100nM、200nM)显著促进细胞增殖，而高浓度sDSS1蛋白能显著抑制细胞增殖，降低细胞数量(2-25μM)。图2B，检测细胞毒性反应水平发现，除了部分中间浓度，加入低浓度或高浓度sDSS1蛋白都可以显著减少细胞毒性反应水平。每组n＝5。数据经ANOVA分析，*，p-value<0.05；**， p-value<0.01。

图3A-图3C，sDSS1蛋白促进HUVECs细胞增殖并降低细胞毒性反应水平。

图3A，检测HUVECs细胞增殖发现，低浓度sDSS1蛋白有促进细胞增殖效应，但是仅在100nM和800nM条件下检测到显著促进效应，其他各组并不明显。图3B，HUVECs细胞在培养液中毒性反应比较小，加入sDSS1蛋白后，与对照组相比，细胞毒性反应有降低的趋势，但是差异不明显。图3C，加入sDSS1蛋白后，HUVECs 细胞的ROS水平在高浓度蛋白组(2-32μM)有显著增加的效应，低蛋白浓度组的没有检测到显著差异。每组n＝5。数据经ANOVA分析， *，p-value<0.05；**，p-value<0.01。

图4A-图4C，sDSS1蛋白促进BMSCs细胞增殖并降低细胞毒性反应水平。

图4A，在培养液中加入低浓度sDSS1蛋白可以促进BMSCs细胞增殖，提高细胞数量，该效应在10nM-125nM之间呈现明显的浓度依赖效应，随着蛋白浓度增加，效应增加。在125nM-750nM之间效应基本保持不变，1000nM蛋白组效应有下降但是仍旧保持促进增殖效应。在高浓度组(30μM)，sDSS1蛋白将抑制细胞增殖，减少细胞数量。图4B，培养液中加入sDSS1蛋白将对细胞产生保护效应，细胞毒性反应水平明显下降。图4C，BMSCs细胞培养液中加入低浓度sDSS1蛋白可以降低细胞ROS水平，该效应在250nM和 750nM组有显著差异，其他组有下降趋势。但是，高浓度sDSS1蛋白(30μM)明显刺激细胞ROS水平增加。每组n＝6。数据经ANOVA 分析，*，p-value<0.05；**，p-value<0.01。

图5A-图5C，sDSS1蛋白可以维持BMSCs细胞的干性水平。

图5A，BMSCs细胞在添加125nM sDSS1蛋白的培养液中处理 4天后，与对照细胞相比，处理组的细胞形态上没有检测到明显的差异。图5B-图5C，检测BMSCs细胞表面的标记物CD90、CD29和造血系细胞的分子标记物CD45的阳性细胞数量，结果显示，sDSS1 蛋白处理后，BMSCs细胞的CD90、CD29保持在极高的水平，与对照细胞相比没有明显的差异；CD45阳性细胞数量极低，与对照细胞没有明显改变。

图6A-图6D，sDSS1蛋白提高连续培养N2a细胞数量并降低细胞毒性反应水平。

图6A-图6B，加入低浓度sDSS1蛋白后进行细胞培养，在连续培养的第一代，sDSS1蛋白能显著促进N2a细胞数量，在8μM和 50μM蛋白组检测到显著差异。相应的，在8μM和50μM蛋白组检测到细胞毒性反应水平明显下降。图6C-图6D，在连续培养的第二代，sDSS1蛋白促进N2a细胞增殖效应出现明显的浓度依赖，在1μM 和8μM蛋白组，随着蛋白浓度增加，促增殖效应在增加。而高浓度组(50μM)，细胞增殖受到明显的抑制。检测细胞毒性反应水平，50μMsDSS1蛋白诱导细胞明显地毒性反应。每组n＝4。数据经ANOVA 分析，*，p-value<0.05；**，p-value<0.01。

图7，sDSS1蛋白促进连续培养的N2a细胞数量。在经过连续两次传代后，累计N2a细胞数量，结果显示，对照组细胞仅仅扩增了15倍，而1μM和8μM蛋白组的促进增殖效应十分显著，细胞分别扩增了26倍和21倍，高于对照组，高浓度sDSS1蛋白组(50μM) 的细胞也扩增了18倍，同样高于对照组。

图8，在含sDSS1蛋白的培养基中连续培养的BMSCs细胞数量更高。在BMSCs细胞的培养基中添加125nM sDSS1蛋白， BMSCs细胞在该环境中连续传代4次，结果显示sDSS1蛋白组累积获得的BMSCs细胞数量超过3ⅹ10⁶，高于对照组一倍以上。每组n＝6。数据经ANOVE分析，*，p-value<0.05；**，p-value<0.01。

图9-图11，sDSS1蛋白可以改善一般品质血清中生长的细胞增殖活力并降低细胞毒性反应水平。

图9(包括A、B、C、D四个部分，形成一个比较图)，在高品质血清中，N2a细胞生长良好，细胞形态完整，加入sDSS1蛋白后，细胞数量略有增加。在一般品质血清中，N2a细胞生长缓慢，部分细胞裂解，培养液中出现细胞碎片，加入50μM sDSS1蛋白可以有效减少细胞裂解，并且增加细胞数量。图10，用CCK-8试剂盒检测细胞数量，结果显示，优质血清培养条件下，加入50μM sDSS1蛋白可以提高约20％的细胞增殖。但是，在一般品质血清培养中，加入sDSS1蛋白可以明显改善细胞增殖活力，细胞数量增加一倍以上。图11，检测细胞毒性反应水平可以发现，一般品质血清中，N2a细胞毒性反应明显，加入sDSS1蛋白后，细胞毒性反应降低至对照组的一半以下。在高品质血清中，细胞毒性反应较低，sDSS1蛋白加入并没有造成明显的差异。每组n＝6。数据经ANOVA分析，*， p-value<0.05；**，p-value<0.01。

具体实施方式

以下内容将结合实例对本发明中的优选方案进行说明和验证，不是对本发明的范围进行限定。本发明的所有范围限定以权利要求书中的限定为准。

下述实施案例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。

下述实施案例中所用的sDSS1蛋白为本公司自行生产的人源 sDSS1蛋白，蛋白序列见SEQ ID NO：1。本公司对蛋白品质进行质量控制，经检测蛋白纯度大于95％，内毒素(小于3EU/mg蛋白) 和其他杂质残留符合标准，可用于细胞实验而不引起明显的细胞毒性反应。

下述实施案例中材料和试剂，除了sDSS1蛋白其他均可以通过商业途径获取。

实施例1、sDSS1蛋白提高培养的细胞系细胞数量降低细胞毒性反应

实验方法：

1.细胞培养小鼠来源神经瘤母细胞(N2a)和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(低分化)(PC12)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(N2a细胞目录号：TCM29；PC12细胞目录号：TCR8)。 N2a细胞培养在含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS) Gibco,C#10091148)、100U/mL青霉素及100ug/mL链霉素(Gibco 公司，C#15140-122)的Dulbecco'sModified Eagle Medium (DMEM，ThermoFisher Scientific,C#11995065)完全培养液中，每两天传代一次。PC12细胞培养在含10％(Horse Serum)(Gibco 公司，C#16050-122)、5％FBS和100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的RP1640完全培养液中，每两天传代一次。

2、细胞接种和处理N2a细胞或PC12细胞用磷酸盐缓冲液 (PBS)清洗一遍，然后经胰酶消化成单细胞，细胞悬液经过细胞计数并按照6000细胞每孔接种到96孔板中，200μL完全培养基。培养板在细胞培养箱(温度37℃，湿度95％，CO₂浓度5％)处理48 小时或72小时后，收集处理细胞培养液上清，100g离心5分钟后吸取上清液用于细胞毒性水平检测，处理好的细胞用于细胞增殖检测或细胞活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平检测。

3.细胞毒性水平检测乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司(C#C0016)。检测酶活性时，首先根据试剂盒说明书配置好足量检测工作液。在96孔板中每孔加入120μL细胞毒性实验中收集的上清液，然后加入30μL检测工作液，稍混匀，在37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测490nm吸光度值，吸光度高低与细胞毒性水平成正比。

4.细胞增殖检测细胞增殖/细胞毒性检测试剂盒(CCK-8) 购自东仁化学科技(上海)有限公司(C#CK04)。用无血清DMEM按照1：10(体积比，v/v)稀释CCK-8溶液制成工作液。96孔中的细胞处理完成后，弃去旧培养基，每孔加入150μL CCK-8工作液。培养板放在培养箱中孵育2小时，然后在多功能酶标仪上检测450nm 吸光度值，反映细胞增殖水平。

5、细胞ROS水平检测氧化自由基的检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司(C#S0033)。检测时，弃去旧的培养液，荧光探针DCFH-DA按照1：1000比例稀释到无血清DMEM溶液中制成工作液，每孔加入200μL工作液，混匀后放回细胞培养箱中孵育细胞 30分钟。孵育结束后，细胞首先使用无血清DMEM清洗一次，然后每孔加入200μL PBS溶液。检测时将96孔板底部用不透光黑色胶纸封住，并使用多功能酶标仪检测荧光强度，反映细胞ROS水平，激发光488nm，荧光525nm。

结果分析：

为了检测sDSS1蛋白对细胞系细胞培养的效应，分别采用两种细胞系作为细胞模型，包括小鼠来源神经瘤母细胞(N2a)和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(低分化)(PC12)。与常规培养基相比，N2a细胞在含有低浓度sDSS1蛋白的完全培养基中生长更好，表现为培养基中添加100nM、200nM sDSS1蛋白后，细胞数量显著增加；在更高浓度条件下，2μM-50μM同样表现出显著增加的细胞数量(图1A)。当检测细胞毒性反应水平时，所有添加sDSS1蛋白组的细胞的毒性水平都显著低于对照组，而且，1μM-50μM浓度之间呈现显著的剂量依赖效应，随着蛋白浓度增加而细胞毒性反应水平逐渐下降(图 1B)。当检测细胞ROS水平时，同样发现sDSS1蛋白添加细胞ROS 水平显著低于对照组(图1C)。在PC12细胞上，同样发现低浓度的sDSS1蛋白可以促进细胞增殖，提高细胞数量(图2A)，同时显著减少细胞毒性反应水平(图2B)。这些数据说明，sDSS1蛋白能屏蔽培养液中含有的毒性物质对细胞的影响，减少细胞氧化应激水平，最终促进细胞增殖，提高培养的细胞系细胞数量。

实施例2、sDSS1蛋白提高培养的原代细胞细胞数量降低细胞毒性反应

实验方法

1.细胞培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)原代细胞从Promo Cell购得(Promo Cell,C#22011)，并在添加内皮细胞生长添加剂(Endothelial Cell Growth Medium Supplement Mix，C#39215)与100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素(Gibco公司，C#15140-122))的内皮细胞基础培养基(Endothelial CellBasal Medium，Promo Cell,C#22210) 中培养,放置于在细胞培养箱(温度37℃，湿度95％，CO2浓度5％) 中培养。细胞每3-5天传代一次。

2、细胞接种和处理HUVECs细胞用磷酸盐缓冲液(PBS) 清洗一遍，然后经胰酶消化成单细胞，细胞悬液经过细胞计数并按照 3000细胞每孔接种到96孔板中，200μL完全培养基。培养板在细胞培养箱(温度37℃，湿度95％，CO2浓度5％)处理48小时后，收集处理细胞培养液上清，100g离心5分钟后吸取上清液用于细胞毒性水平检测，处理好的细胞用于细胞增殖检测或细胞活性氧 (Reactive oxygen species，ROS)水平检测。

实验结果

为了检测sDSS1蛋白对原代细胞的效应，采用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行细胞增殖和细胞毒性实验。结果显示，添加100nM 和800nM sDSS1蛋白后，细胞数量显著高于对照组(图3A)。相应的，利用LDH试剂盒检测细胞毒性反应发现，添加sDSS1蛋白后，细胞毒性反应水平呈现下降的趋势，但是，由于HUVECs细胞的毒性反应水平降低，这些效应并不明显(图3B)。加入低浓度sDSS1 蛋白后，HUVECs细胞的ROS水平没有出现明显差异，但是高浓度 sDSS1蛋白可以明显刺激细胞ROS水平增加(图3C)。这些结果说明，sDSS1蛋白能保护原代细胞不受培养液毒性物质的影响，提高细胞数量，但是高浓度sDSS1蛋白对HUVECs细胞呈现一定的毒性。

实施例3、sDSS1蛋白提高培养的干细胞数量不影响细胞干性水平

1.细胞培养选取4周龄雄性SD大鼠(100-120g，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限公司)，断颈处死后用75％无水乙醇中浸泡10分钟，随后在无菌条件下取出股骨，剪去骨垢端。使用5mL 含有10％胎牛血清(Gibco公司，C#10100-147)的α-MEM培养基(Hyclone公司，C#SH30265.01)反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液并小心转移至25cm2细胞培养瓶，置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱中进行培养。在原代骨髓间充质干细胞(P0-BMSC)贴壁 48小时后，更换含有10％FBS的新鲜α-MEM培养基，弃去未贴壁的细胞。之后每2天更换新鲜培基，待P0-BMSCs融合度达到 80-90％，进行传代培养。使用0.25％胰蛋白酶于37℃消化，细胞在完全培养基中消化成单细胞悬液，细胞按照1：5比例稀释后继续传代培养或冻存。

2.细胞接种和处理稳定传代的BMSCs细胞用磷酸盐缓冲液 (PBS)清洗一遍，然后经胰酶消化成单细胞，细胞悬液经过细胞计数并按照3000细胞每孔接种到96孔板中，200μL完全培养基。培养板在细胞培养箱(温度37℃，湿度95％，CO2浓度5％)处理72 小时后，收集处理细胞培养液上清，100g离心5分钟后吸取上清液用于细胞毒性水平检测，处理好的细胞用于细胞增殖检测或细胞活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平检测。

3.细胞毒性水平检测乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司(C0016)。检测酶活性时，首先按照试剂盒说明书配制足量检测工作液。在96孔板中每孔加入120μL细胞毒性实验中收集的上清液，然后加入30μL检测工作液，稍混匀，于室温避光孵育30分钟。在酶标仪上检测490nm处的吸光度值，吸光度值的高低与细胞毒性水平成正比。

4.细胞增殖检测细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)购自东仁化学科技(上海)有限公司(CK04)。使用完全培养基以1：10(体积比，v/v)稀释CCK-8溶液制成工作液。96孔中的细胞处理完成后，弃去旧培养基，每孔加入110μL CCK-8工作液。将培养板置于培养箱中37℃避光孵育2小时，然后在多功能酶标仪上检测450nm处吸光度值，吸光度值的高低与细胞数量成正比。

5.细胞ROS水平检测氧化自由基的检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司(C#S0033)。检测时，弃去旧的培养液，使用无血清α-MEM培基按照1：1000比例稀释荧光探针DCFH-DA母液制成工作液，每孔加入200μL工作液，混匀后放回细胞培养箱中37℃避光孵育30分钟。孵育结束后，细胞首先使用无血清DMEM清洗一次，然后每孔加入200μL PBS溶液。检测时将96孔板底部用不透光黑色胶纸封住，并使用多功能酶标仪检测荧光强度，设置荧光激发波长为488nm，荧光发射波长为525nm。最终，荧光强度与细胞 ROS水平成正比。

6.干细胞表面标志物检测取生长状态良好的第3代干细胞 (P3-BMSCs)，分别使用完全培养基(对照组)和含有125nM sDSS1 蛋白(实验组)的培基进行培养，连续培养2代至第5代(P5-BMSCs)，用胰酶消化并制成单细胞悬液。计数后每组取5ⅹ10⁵个细胞作为分析样本，首先使用含0.5％BSA的PBS冲洗细胞，然后加入0.5mL 抗体工作液，混匀细胞并于4℃避光孵育30分钟。孵育完成的细胞用含0.5％BSA PBS洗涤2次后，在流式细胞仪上检测细胞表面标志物的表达水平。其中，本实验选择三种抗体：FITC-anti-CD90 (Biolegend，C#206105/50μg)、PE-anti-CD29(Biolegend， 102207/50μg)、PerCP/Cy5.5-anti-CD45(Biolegend， 202220/100μg)，使用0.5％BSA的PBS分别按照1:1000、1:800 和1:200稀释抗体母液制成抗体工作液。

实验结果

干细胞培养液对环境中毒性物质的反应更加敏感。为了检查 sDSS1蛋白对干细胞增殖和干性水平的影响，采用原代培养的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行增殖、毒性反应水平和表面标志物检测实验。结果显示，在干细胞的培养液中添加sDSS1蛋白可以促进BMSCs细胞增殖，10nM-125nM之间，细胞增殖水平呈现明显的剂量依赖效应，随着蛋白浓度提高，细胞数量逐渐增加。在125nM sDSS1蛋白组，细胞数量最高。细胞数量在125nM-1000nM之间保持效应不变，更高浓度sDSS1蛋白对细胞增殖有一定的抑制效应(图 4A)。检测细胞毒性反应水平发现，加入sDSS1蛋白后，细胞毒性反应水平显著低于对照组细胞(图4B)。检测干细胞ROS水平，结果显示，加入sDSS1蛋白的处理组中细胞ROS水平都有下降的趋势，但是仅在250nM、750nM组有显著降低的效应，在高浓度组 (30μM sDSS1蛋白)有明显的提高(图4C)。总结这些结果，说明sDSS1蛋白可以保护干细胞免受培养环境中毒性成分的影响，减少细胞毒性反应水平，提高细胞培养获得的细胞数量。为了检测 sDSS1蛋白处理是否影响干细胞质量，用流式细胞仪方法检测 sDSS1蛋白处理后的干细胞表面标志物，包括CD90、CD29和 CD45，其中BMSCs细胞表达CD90和CD29抗原，但不表达CD45。结果显示，正常培养的BMSCs细胞和在添加sDSS1蛋白的培养基中培养的BMSCs细胞在形态上没有出现明显的差异(图5A)。检测标志物水平，正常培养BMSCs细胞的CD90和CD29阳性细胞比例分别为98.9％和97.8％，而作为造血系细胞标记物的CD45阳性细胞的比例极低，为1.47％(图5B)。经过sDSS1蛋白处理后，干细胞的标记物阳性的比例并没有受到显著影响，其中CD90和CD29 阳性细胞比例分别为98.8％和98.1％，CD45阳性细胞比例为0.69％ (图5C)。这些结果说明，sDSS1蛋白提高干细胞培养获得的细胞数量，但是并没有显著改变细胞干性水平。

实施例4、sDSS1蛋白提高连续培养细胞数量并降低细胞毒性反应

1.N2a细胞连续培养和处理 N2a细胞用胰酶消化后，用完全培养基制成单细胞悬液。细胞按照2.5ⅹ10⁴每孔接种到24孔板中，每孔添加1ml培养基。细胞贴壁6小时后，换成不含sDSS1蛋白的对照培养基，或者含1μM sDSS1蛋白、8μM sDSS1蛋白、50μM sDSS1蛋白的完全培养基。把培养板放在细胞培养箱中处理48小时后，收集培养液，100g离心后吸取上清用于细胞毒性水平检测，细胞用于细胞增殖水平检测。对照组和每个处理组设置6次重复。48 小时后作为复孔的细胞经过胰酶消化，用对照培养基或含不同浓度 sDSS1蛋白的培养基制成细胞悬液，按照1：4比例继续接种到新的 24孔板中，按照相同的处理方式加入不同培养基处理。连续进行2 次传代并检测细胞增殖和细胞毒性水平。

2.BMSCs细胞连续培养和处理第2代BMSCs细胞消化成单细胞后，按照8000细胞每孔接种到24孔板中，添加1mL培养基，对照组培养基中添加125nM sDSS1蛋白。细胞放在培养箱中培养，根据细胞生长情况，每3-4天传代一次，传代时用血球计数板进行细胞计数。另外，复孔中的其他细胞按照1：3比例接种到新的24孔板中，按照相同的处理方式加入对照培养基或添加sDSS1蛋白的培养基。连续进行4次传代并统计累计细胞数量。

实验结果

为了检测sDSS1蛋白对细胞系细胞的促进效应是否能在细胞传代后继续保持，把N2a细胞在含有sDSS1蛋白的培养基中进行传代并检测细胞毒性反应水平。结果显示，第一次传代时，在8μM和50μM 组的细胞数量显著高于对照组(图6A)，这两组的细胞毒性反应水平也显著降低(图6B)。在第二次传代时，细胞数量在1μM和8μM组显示出明显的促进效应(图6C)，毒性反应水平在50μM组显著下降 (图6D)。把连续检测细胞数量进行汇总处理，结果显示经过4天连续培养，使用不含sDSS1蛋白的培养基培养细胞扩增了15倍，而含1μM、8μM、50μM sDSS1蛋白的培养基培养的细胞分别扩增了 26倍，21倍及18倍(图7)。综合这些数据，说明低浓度sDSS1 蛋白可以有效促进细胞增殖，并且在连续培养中获得更多细胞。为了验证该效应在原代干细胞上的效应，把BMSCs细胞在含有125nM sDSS1蛋白的培养液中进行连续传代，结果同样显示sDSS1蛋白可以有效促进细胞生长，经过15天培养，sDSS1蛋白组每孔获得的细胞超过3ⅹ10⁶，而不添加蛋白的对照组数量仅仅是其一半(图8)。这些结果验证，sDSS1蛋白同样促进连续培养的干细胞增殖，提高培养获得的细胞数量。

实施例5、sDSS1蛋白提高低品质血清中细胞培养效率

1.细胞接种和处理分别购买市场上不同品质的血清用于本次实验。根据细胞培养的实践和网络相关资料的描述，购买高品质胎牛血清(Gibco公司，C#10100-147，产自澳洲地区)和一般品质胎牛血清(浙江天杭生物科技公司，C#10111-8611，产自中国内蒙古地区)。将这两种血清按照正常的细胞培养方法配制成包含10％高品质血清完全培养基(培养基A)和一般品质血清完全培养基(培养基B)。 N2细胞经过胰酶消化后，分别用培养基A和培养基B中重悬并制成单细胞悬液。处理细胞时，细胞按照2.5ⅹ10⁴每孔接种到24孔板中，添加1mL培养液，处理组分别在A、B培养基中添加50μM sDSS1 蛋白。将培养板放置于在细胞培养箱中培养，48小时后收集培养基， 100g离心收集上清液用于细胞毒性水平检测，细胞用于细胞增殖检测。

2.细胞毒性水平检测乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司(C#C0016)。检测酶活性时，首先根据试剂盒说明书配置好足量检测工作液。在96孔板中每孔加入120μL细胞毒性实验中收集的上清液，然后加入30μL检测工作液，稍混匀，在37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测490nm吸光度值，吸光度高低与细胞毒性水平成正比。

3.细胞增殖检测细胞增殖/细胞毒性检测试剂盒(CCK-8) 购自东仁化学科技(上海)有限公司(C#CK04)。用无血清DMEM按照1：10(体积比，v/v)稀释CCK-8溶液制成工作液。96孔中的细胞处理完成后，弃去旧培养基，每孔加入150μL CCK-8工作液。培养板放在培养箱中孵育2小时，然后在多功能酶标仪上检测450nm 吸光度值，反映细胞增殖水平。

实验结果

血清是培养液中维持细胞增殖的主要因素。为了检测sDSS1蛋白添加后能否改善血清品质，保证细胞增殖效应。采用商业上能得到的优质血清和一般品质血清检测细胞增殖效应和细胞毒性反应水平。结果显示，在优质血清条件下，N2a细胞生长良好，添加50μMsDSS1 蛋白后细胞略有增加，但是不能明显区分(图9的A部分，图9的B 部分)；在一般品质血清中，细胞生长明显受到抑制，细胞数量较少，而且部分细胞变圆，破碎形成肉眼可见的细胞碎片，说明细胞有一定毒性反应。加入sDSS1蛋白后，细胞数量有明显提高，变圆细胞数量较少(图9的C部分，图9的D部分)。用CCK-8检测细胞数量发现无论在优质血清或一般品质血清中，sDSS1蛋白加入都可以促进细胞数量，但是在一般品质血清组，sDSS1蛋白的促进效应更明显，效应超过1倍(图10)。检测细胞毒性反应水平结果显示一般品质血清中细胞毒性反应水平较高，sDSS1蛋白明显抑制毒性反应， LDH检测结果降低一半以上；优质血清组细胞毒性反应较弱，sDSS1 蛋白加入没有明显影响(图11)。总结这些数据，sDSS1蛋白能明显改善一般品质血清的品质，维持细胞增殖并屏蔽血清中含有的毒性物质对细胞的影响。

序列表

<110> 上海清流生物医药科技有限公司

<120> 一种蛋白在细胞培养中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 89

<212> PRT

<213> 人类(Homosapiens)

<400> 1

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Leu Val Cys Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Val Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 2

<211> 89

<212> PRT

<213> 黑猩猩(Pantroglodytes)

<400> 2

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Leu Val Cys Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Val Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 3

<211> 89

<212> PRT

<213> 倭黑猩猩(Panpaniscus)

<400> 3

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Leu Val Cys Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Val Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 4

<211> 89

<212> PRT

<213> 大猩猩(Nomascusleucogenys)

<400> 4

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Val

50 55 60

Leu Val Cys Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Val Leu His Gln Lys Glu

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 5

<211> 89

<212> PRT

<213> 红毛猩猩(Gorillagorilla)

<400> 5

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Val Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Leu Val Cys Glu Thr Leu Tyr Gly Cys Tyr Val Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 6

<211> 89

<212> PRT

<213> 白颊长臂猿(Pongoabelii)

<400> 6

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Ile Leu Leu Met Ile

50 55 60

Leu Val Cys Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Val Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 7

<211> 89

<212> PRT

<213> 川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)

<400> 7

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 8

<211> 89

<212> PRT

<213> 恒河猴(Macacamulatta)

<400> 8

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 9

<211> 89

<212> PRT

<213> 滇金丝猴(Rhinopithecusbieti)

<400> 9

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ile Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 10

<211> 89

<212> PRT

<213> 东非狒狒(Colobusangolensis)

<400> 10

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Lys

50 55 60

Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 11

<211> 89

<212> PRT

<213> 安哥拉疣猴(Cercocebusatys)

<400> 11

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 12

<211> 89

<212> PRT

<213> 白顶白眉猴(M.leucophaeus)

<400> 12

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 13

<211> 89

<212> PRT

<213> 鬼狒(Macacanemestrina)

<400> 13

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

<210> 14

<211> 89

<212> PRT

<213> 豚尾猴(Papioanubis)

<400> 14

Met Ser Glu Lys Lys Gln Pro Val Asp Leu Gly Leu Leu Glu Glu Asp

1 5 10 15

Asp Glu Phe Glu Glu Phe Pro Ala Glu Asp Trp Ala Gly Leu Asp Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Ala His Val Trp Glu Asp Asn Trp Asp Asp Asp Asn Val

35 40 45

Glu Asp Asp Phe Ser Asn Gln Leu Arg Ala Thr Val Leu Leu Met Ile

50 55 60

Lys Val Tyr Glu Thr Pro Tyr Gly Cys Tyr Ile Leu His Gln Lys Gly

65 70 75 80

Arg Met Cys Ser Ala Phe Leu Cys Cys

85

Claims

1.一种蛋白在细胞培养中的应用，其特征在于，所述的应用是把sDSS1蛋白用于细胞培养。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白包括人、黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩、红毛猩猩、白颊长臂猿、川金丝猴、恒河猴、滇金丝猴、东非狒狒、安哥拉疣猴、白顶白眉猴、鬼狒、豚尾猴的任一sDSS1蛋白序列形成的基础蛋白，其中人sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1，黑猩猩sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2，倭黑猩猩sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3，大猩猩sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4，红毛猩猩sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5，白颊长臂猿sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6，川金丝猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7,恒河猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8，滇金丝猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：9，东非狒狒sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：10，安哥拉疣猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：11，白顶白眉猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12，鬼狒sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13，豚尾猴sDSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO：14。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白是任一与权利要求2所述的基础蛋白相似度达到70％以上的第一种蛋白。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白是任一以权利要求2所述的基础蛋白氮端58个氨基酸为基础，在氮端或碳端融合其他多肽片段，用于融合的多肽片段的结构特征或氨基酸序列特征与权利要求2所述的基础蛋白碳端31个序列相同或相似的第二种蛋白。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白是任一以权利要求2所述的基础蛋白氮端58个氨基酸为基础，在氮端或碳端融合其他氨基酸片段，融合后的蛋白能实现跨膜转运功能的第三种蛋白。

6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白是利用权利要求2-5任一所述基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白或第三种蛋白与该蛋白自身、载体蛋白、抗体或其他任意长度氨基酸片段连接形成的融合蛋白。

7.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白是基于权利要求2-5任一所述基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白或第三种蛋白进行的修饰产生的多肽/蛋白修饰物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的多肽/蛋白修饰物的修饰是针对sDSS1蛋白氨基酸侧链上的氨基、氨基酸侧链上的羰基、氮端末端氨基、碳端末端羰基、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸或色氨酸进行的特异性或非特异性的1-20个位点的化学修饰。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多肽/蛋白修饰物的修饰方法包括糖基化修饰、脂肪酸修饰、酰基化修饰、Fc片段融合、白蛋白融合、聚乙二醇修饰、右旋糖苷修饰、肝素修饰、聚乙烯吡咯烷酮修饰、聚氨基酸修饰、多聚唾液酸修饰、壳聚糖及其衍生物修饰、凝集素修饰、海藻酸钠修饰、卡波姆修饰、聚乙烯吡咯烷酮修饰、羟丙基甲基纤维素修饰、羟丙基纤维素修饰、乙酰化修饰、甲酰化修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、磺酸化修饰或其他医药上可用的多肽/蛋白药物修饰方法的一种或一种以上。

10.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白是利用权利要求2-5任一所述基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白或第三种蛋白的氨基酸序列为基础进行的20种基本氨基酸以外的氨基酸进行的1-31个任意氨基酸位点替换的非天然氨基酸替代蛋白。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述非天然氨基酸替代蛋白的氨基酸替换包括羟脯氨酸、羟赖氨酸、硒代半胱氨酸、D-型氨基酸或者人工合成的非天然氨基酸及其衍生物。

12.根据权利要求2-11任一所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白是把所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白、融合蛋白、多肽/蛋白修饰物或非天然氨基酸替代蛋白与医药上可应用的药物载体形成的部分或全部复合体。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述药物载体包含肠溶衣制剂、胶囊、微球/囊、脂质体、微乳液、复乳液、纳米颗粒、磁颗粒、明胶和凝胶中的一种或一种以上。

14.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白是细胞培养过程中把权利要求2-5所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白的DNA或RNA序列导入细胞从而在培养液中获得的第四种蛋白。

15.据权利要求1-14任一所述的应用，其特征在于，所述的sDSS1蛋白在细胞培养中的应用是把权利要求1-14所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白、第四种蛋白、融合蛋白、多肽/蛋白修饰物、非天然氨基酸替代蛋白或复合体用做基础培养基组分、血清组分、血清替代物组分、增殖添加物组分，或其他细胞培养过程中需要添加的任意成分的组分。

16.据权利要求1-14任一所述的应用，其特征在于，所述的应用是把权利要求1-14所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白、融合蛋白、多肽/蛋白修饰物、非天然氨基酸替代蛋白或复合体用做细胞移植、细胞治疗、组织移植、组织修复或器官移植过程中的细胞/组织保护液、细胞悬液、细胞/组织维持液、细胞/组织清洗液或这些过程中使用的任意溶液的组分。

17.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的细胞培养是利用培养基在体外进行的细胞制备、细胞分选、细胞克隆培养、细胞扩增培养、细胞富集、细胞纯化、细胞工程、细胞三维培养、细胞发酵、组织培养、器官培养中的任一形式。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的细胞培养是对来源于人、猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟或昆虫的任意细胞进行的细胞培养。

19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的细胞培养是对原代细胞、组织来源干细胞、组织来源前体细胞、诱导多能干细胞、分化来源细胞、转分化来源细胞、细胞工程获得的细胞、肿瘤干细胞、肿瘤组织分离的肿瘤细胞、细胞株、细胞系、昆虫细胞、细胞团块、组织团块、体外培养器官中的一种或一种以上进行的细胞培养。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述的原代细胞其类型是心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、毛囊真皮乳头细胞、肝细胞、肾细胞、角质化细胞、黑色素细胞、成骨细胞、前成脂肪细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、前体细胞、周细胞或树突细胞中的一种或一种以上。

21.上述权利要求1-20任一所述的应用，其特征在于，所述的细胞培养过程中任意时期添加权利要求1-18所述的基础蛋白、第一种蛋白、第二种蛋白、第三种蛋白、融合蛋白、多肽/蛋白修饰物、非天然氨基酸替代蛋白或复合体的浓度为不小于10nM。

22.一种商业开发或临床应用，其特征在于，所述的应用是利用权利要求1-21任一所述的蛋白在细胞培养中的应用，然后把sDSS1蛋白在细胞培养中的应用进行商业开发或临床应用。