JP2005531485A - Rankリガンドの結晶形態および変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許出願第60/311,163号(2001年8月9日出願)および米国特許出願第10/105,057号(2002年3月22日出願)(これらの記載内容は、参考として本明細書中に援用される)に関連する。
本発明は、一部は、国立衛生研究所助成金AR32788、AR46523、AR46852、AR07033およびDE05413の下で米国政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
適用されない。
本発明は概して、NFκB(RANK)リガンドの受容体賦活物質およびその類似体または模倣体を用いた骨粗鬆症およびその他の骨欠乏または骨欠損の治療方法に関する。より詳細には、本発明は、結晶形態のRANKリガンド(RANKL)タンパク質、高分解能X線回析構造、原子構造座標、突然変異誘発データならびにそこから得られる三次元構造に関する。本発明のRANKL結晶および本本出願人らにより得られた構造情報は、RANKと相互作用し、RANKシグナル伝達を活性化し、特に骨細胞(例えば骨芽細胞および破骨細胞)、免疫細胞(例えばT細胞およびB細胞ならびに樹状細胞)、哺乳動物上皮の分化および機能の生物学、ならびにリンパ節器官形成を調節するRANKLの能力を模倣するかまたは阻害する化合物をスクリーニング、同定および/または設計し、それにより上記組織に関連する疾患または症状を治療、予防、阻害または逆転(治癒)するために有用である。
サイトカインの腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーは、多くの生物学的機能、(炎症、器官形成、宿主防御、自己免疫およびアポトーシスを含む)において不可欠な役割を果たす。これらの強力な生物学的媒介物質の作用は、受容体−リガンド相互作用により達成され、細胞内シグナル伝達および細胞表現型の変化をもたらす。リガンドは、トリマーを生成し、それらの対応する受容体に結合することによりそれらの機能を発揮する。その後の受容体オリゴマー化は、受容体の細胞内ドメインの立体配座変化を生じ、これが次に、アダプタータンパク質のTNF受容体関連因子(TRAF)ファミリーのメンバーが結合し、シグナル伝達カスケードを開始するのを可能にする。TNF−R2、TNF−R1、TrkA、NGFR、CD40、CD30、OX−40、DR5、DR3、DR4およびRANKとしては、種々のTRAF分子(1〜6を含めて)と相互作用するTNF受容体スーパーファミリーのメンバーのいくつかが挙げられる(Lewit−Bentley,A.ら、J.Mol.Biol.199:389−392(1988),Banner,D.W.ら、Cel.73:431−445(1993),Karpusas,M.ら、Structure.3:1031−1039(1995),Hymowitz,S.G.ら、Mol.Cell.4:563−571(1999),Mongkilsapaya,J.ら、Nat.Struc.Biol.6:1048−1053(1999),Cha,S.S.ら、J.Biol.Chem.275:31171−31177(2000))。
したがって、本発明は、RANKLの生物学的に活性な細胞外ドメイン(ectodomain)を構成する多数の結晶形態のポリペプチドを提供する。したがって、本発明の更なる目的は、結晶から得られる原子構造座標の提供と、RANKLの独特の溶媒接触可能表面ループの位置、受容体三量体化に必要とされるRANKLのサブユニット間水素結合の特定位置およびRANKLのホモトリマーサブユニット間溝の位置の決定と、骨形成活性を強化または抑制する化合物を設計または同定するために本出願人らにより得られた三次元構造情報の利用方法と、を包含する。別の関連目的は、骨形成化合物または骨形成および吸収抑制化合物を同定または設計するために用いられ得る、本出願人らにより得られた三次元構造情報あるいはその部分またはサブセットが埋め込まれる、機械またはコンピューター読取可能媒体を提供することである。さらなる目的は、本発明の結晶の製造方法を提供することである。
本発明の理解を促すために、多数の用語を以下に定義する。
「親水性アミノ酸」とは、Eisenberg,ら、J.Mol.Biol.179:125−142(1984)の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロより低い疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝子コード化親水性アミノ酸としては、Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)およびArg(R)が挙げられる。
本発明に従って、本出願人らは、RANKLの生物学的に不可欠な領域を模倣し、それによりRANKを活性化するよう機能する化合物を設計し、作製するのに不可欠な三次元構造データを提供した。特に本出願人らは、RANKLタンパク質の外部ドメインの結晶形態を作製し、高分解能X線回析分析、原子構造座標、突然変異誘発データ、ならびにそれらから得られる三次元構造を調製し、これを用いて、RANKLの活性を模倣するかまたは阻害する化合物および方法を発明し得る。
E. coli中で組換え的に発現されるマウスRANKLの生物学的活性細胞外ドメイン(残基158〜316、QPFA...QDID)は、2形態で結晶化する。すなわち、対称の結晶学的3回軸上に置かれる第七モノマーと共に2つのトリマーとして整列されたASU中に7つのモノマーを含有する菱面体結晶;ならびにASU中に単一RANKLトリマーを含有する斜方晶系結晶。ひとまとめにして、これらの回析性結晶は、RANKLモノマーの8つの個々の図を提供する。RANKLの構造は分子置換により段階的に動かされ、2.6Åの分解能まで精密化された。いくつかの可動性ループ領域を除いて、全RANKL細胞外ドメイン、アミノ末端のマイナス残基158〜161は、最終結晶構造中に十分に整列される(結晶学的R因子23.5%およびRfree28.0%、図1)。
RANKLのコアβ鎖は、TNFファミリーサイトカインの特徴であるフォールドを採用する。各RANKLモノマーは、2つの平坦な逆平行βプリーツ化シートで構成されるa−サンドイッチからなる。第一シートはβ鎖(A、H、CおよびF)により形成され、一方、第二シートはβ鎖(B、G、DおよびE)により形成される(図2A〜2D、図3)。内部AHCFβシートはサブユニット間会合に関与し、一方、BGDEβシートは外表面に大きく寄与する。RANKLモノマーは、3回対称軸に沿って自己会合する。トリマー複合体は、遠位尖端より幅広の膜近位基部を有する切頭ピラミッドとして最もよく説明されている。RANKLトリマーは高さ55Åであって、およその直径は、基部で55Å、尖端で35Åである。ホモトリマーは、各RANKLモノマー、鎖EおよびFにおけるβサンドイッチの一縁が隣接モノマーのAHCFβシートの内部疎水性面に寄るよう、アセンブルされる(図2A、2C)。このようなものとして、RANKLホモトリマーのトリマー界面は、縁−面相互作用のプラットホームからなる。側面から見て、各モノマーは、回転軸の周囲でのわずかに左寄りのねじれを取り入れる(図2A、2B)。各RANKLモノマーのアミノ酸組成は同一であるが、このトリマーは、結晶学的対称により位相幾何学的に等しくない。
したがって、本発明は、RANK分子を結合し、それによりこの受容体を活性化するRANKLの能力を模倣する化合物を対象とする。本出願人らは具体的に、RANKLおよびRANKの結合を可能にするRANKLの独特の構造を示した。
本発明は、X線結晶学により決定した場合のRANKLの細胞外ドメインの結晶複合体の高分解能三次元構造および原子構造座標を提供する。2.6Å分解能まで得られた結晶RANKL複合体の原子構造座標を、図1に列挙する。
典型的には原子構造座標の形態での構造情報は、例えば結晶化ポリペプチドあるいはその部分または断片を結合する化合物を設計し、スクリーニングおよび/または同定するために、あるいは生物学的特性変更を示す変異体をインテリジェントに設計するために、種々のコンピューター的またはコンピューターベースの方法に用いられ得る。
1.GRID(Goodford,J.Med.Chem.28:849−857(1985))。GRIDは、Oxford University,Oxford,UKから入手可能である。
1.CAVEAT(Bartlettら、「CAVEAT:A Program to Facilitate the Structure−Derived Design of Biologically Active Molecules」(1989)。「Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems」,Special Pub.,Royal Chem.Soc.78:182−196)。CAVEATは、University of California,Berkeley,CAから入手可能である。
1.LUDI(Bohm,J.Comp.Aid.Molec.Design 6:61−78(1992))。LUDIは、Molecular Simulations,Inc.,San Diego,CAから入手可能である。
本発明の構造座標およびそのサブセットは、RANKLを模倣する化合物に関して設計またはスクリーニングするために有用である。本発明のRANKL複合体の高分解能X線構造は、特に本出願人らの構造ベースの突然変異誘発分析から誘導される機能情報と組合せた場合、その独特の界面残基の詳細を示す。この情報は、RANK相互作用の部位と結合する化合物に関して設計および/またはスクリーニングするために用いられ得る。
RANKLの生物学的に活性な細胞外ドメインを、GST融合タンパク質として大腸菌(Escherichia coli)中で発現させた。要するに、マウスRANKL残基158〜316のコア細胞外ドメインをコードするcDNAを、SaIIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼを用いて、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)の下流でpGEX−6P−I(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)にクローニングした。プロテアーゼ欠損BL21(DE3)E.coli(大腸菌)中でのタンパク質発現のIPTG(イソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド)−媒介性誘導後、細胞を、150mMのNaCl、20mMのトリス−HCl、pH8.0および1mMのEDTAを含む非変性溶解緩衝液中で粉砕した。溶解物を融合タンパク質のアフィニティー精製のためにグルタチオンセファロース(Amersham Pharmacia Biotech)とともにインキュベートし、その後、150mMのNaClおよび20mMのトリス−HCl、pH8.0を含む緩衝液で過度に洗浄した。グルタチオンとの競合的溶離により、GST融合タンパク質をアフィニティーマトリックスから放出させた。次に、単離タンパク質を陰イオン交換に付して、その後、150mMのNaCl、20mMのトリス−HCl、pH7.2に対して透析した。そのGST融合相手からのRANKLの分離を、50mMのトリス−HCl、pH7.0、150mMのNaCl、10mMのEDTAおよび1mMのDTT中で4℃で4時間実施した14型ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)を用いたタンパク質分解性切断により成し遂げた。グルタチオンアフィニティーマトリクス上を通過させることにより、非切断融合タンパク質、ならびにGST−タグ化プロテアーゼを除去した。スーパーデックス(Superdex)200(Amersham Pharmacia Biotech)上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより最終生成物をさらに精製したが、この際、最終生成物は、ホモトリマーのサイズと一致する分子量55kDで移動した。質量分光測定法により同定を継続し、19,034Daという質量は、予測値±1Daと合致した。精製RANKLを、20mMのNaCl、20mMのトリス−HCl、pH8.0中で20mg/mlに濃縮した。
20℃での懸滴での蒸気拡散により、RANKLの結晶を成長させた。80mMのHEPES、pH7.5、16mMのCaCl2および11〜14%のPEG4000を含む沈殿剤を用いて、回析品質の結晶を得た。2つの結晶形態が優勢であった:典型的サイズ0.4mm×0.4mm×0.2mmに成長し、単位セル寸法a=b=150.6Å×c=139.5Åで、非対称単位(ASU)中に7個のRANKLモノマーを含有する単純菱面体結晶(空間群3);ならびに典型的サイズ0.3mm×0.3mm×0.4mmに成長し、単位セル寸法a=65.3Å×b=82.0Å×およびc=99.5Åで、ASU中に3RANKLモノマーを含有する単純斜方結晶(空間群P212121)。結晶を20%グリセロール中で凍結保護し、液体N2中でフラッシュ冷却した。菱面体結晶に関して3.0Å分解能に対する完全データを、また斜方結晶に関しては2.6Å分解能データを、YaleミラーおよびR−AxisIV検出器を装備し、CuKα線を用いるRigaku回転アノード発生器を用いて、振動法(1.5°)により、収集した。データセットを、DENZOおよびSCALEPACKを用いて処理した。
最初に、TNFβ(PDBコード1TNR)およびTRAIL(PDBコード1D4V)座標から構築されたモデルを用いて分子置換により、RANKL構造を決定した。インサイトIIプログラムモジュールHomology(Molecular Simulations Inc.、San Diego、CA)を用いる分岐領域の欠失およびRANKL配列の組み入れにより、これらの構造をキメラ探索モデル中に併合した。AMORE(Navaza,J.ら、Methods Enzymol.276:581−591(1997))を用いた翻訳機能探索により、菱面体結晶のASU中に7個のRANKLモノマーが生じ、結晶学的な3回対称軸上に存在する第7モノマーを有する2つのトリマーとして整列された。データセットに対するキメラモデルの剛体精密化により、20〜4Åの分解能のすべてのデータに関して46%のR因子が得られた。初期RANKLモデルを、3Å分解能で算定した7倍平均電子密度マップに作り上げた。プログラムO(Jones,T.A.ら、Acta Crystallogr.A.47:110−119(1991))を用いて、複合体2FoFc省略マップへのモデル構築を実行した。CNS(33)を用いて、厳密且つ制限されたNCSオペレーターを用いたモデルの構築および精密化を何度も繰り返して実行した。菱面体結晶座標での分子置換により、斜方晶系RANKLに関する位相を得た。翻訳機能をすべての可能な単純斜方晶系鏡像体で実行し、最高シグナルは空間群P212121で明瞭に認められた。ASU中に存在する3つのモノマーの剛体精密化は、20〜4Åの分解能データに関して37%のR因子を生じた。モデル構築は、非結晶学的3回平均化(three−fold averaging)を用いて算定したマップ上で開始し、原子精密化は、各モノマーの構造的分岐ループ領域を除いて、制限NCSオペレーターを用いて実行した。
NACCESSv2.1.1を用いて、原子的接触可能領域を算定した(Hubbard,S.J.& Thornton,J.M.、University College、London)。要するに、溶媒接触可能表面積を算定するために、半径1.4Åプローブを、RANKLおよびその他のTNFファミリーサイトカイン構造のファンデルワールス表面に転がした。HBPLUSv3.0(McDonald,I.K.ら、J.Mol.Biol.238:777−793(1994))を用いて、隣接物相互作用および水素結合の幾何学的配置を評価した。
ポリメラーゼ連鎖反応により、ネズミRANKLの部位特異的突然変異誘発を実施した。上記のように大腸菌中で突然変異化RANKL構築物を発現させて、核酸配列決定および質量分光測定により同一性を確証した。ホモ三量体化は、サイズ排除クロマトグラフィーでの移動により示されるように、適正タンパク質のフォールディングおよびアセンブリーに関する証拠とみなした。カブトガニ・アメボサイト・ライセート(LAL)アッセイ(BioWhittaker、Walkersville、MD)により、内毒素夾雑の欠如を確証した。
ネズミ破骨細胞前駆体の純粋集団を、Lam,J.ら、J.Clin.Invest.106:1481−1488(2000)に記載された骨髄から単離した。10%ウシ胎仔血清を含有するα−MEM中で、細胞を培養し、10ng/mlのマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)および種々の濃度のRANKLを添加して、破骨細胞分化を誘導した。6%CO2を含有する湿潤大気中で37℃で細胞をインキュベートし、新しい培地およびサイトカインを毎日補充した。培養5日目〜9日目の間に、典型的な成熟破骨細胞形成を観察した。
破骨細胞形成を、Burstone(Burstone,M.S.、J.Natl.Cancer Inst.20:601−606(1958))の方法により、組織化学的に同定した。要するに、細胞性酸性ホスファターゼ活性を用いて、0.05Mの酒石酸ナトリウムの存在下で、色素生成基質としてナフトールAS−Blホスフェートを切断した。10mMの酒石酸ナトリウム、pH4.5の存在下で、比色基質として5.5mMのp−ニトロフェニルホスフェートの添加により、酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)活性の定量を行った。反応生成物を、405nmの吸光度の分光分析的測定により定量した。
大腸菌中で組換え的に発現されるネズミRANKLの生物学的活性細胞外ドメイン(残基158〜316、QPFA...QDID)は、2形態で結晶化する:結晶学的な3回対称軸上に置かれる第7モノマーを有する2つのトリマーとして整列されたASU中に7個のモノマーを含有する菱面体結晶;およびASU中に単一のRANKLトリマーを含有する斜方結晶。これらの回析性結晶は、まとめて、RANKLモノマーの8個の個々の図を提供する。RANKLの構造は、分子置換により段階的に変化され、2.6Åの分解能に精密化された。いくつかの可動性ループ領域を除いて、全RANKL細胞外ドメイン、アミノ末端のマイナス残基158〜161は、最終結晶構造中に整列される(結晶学的R因子23.5%およびRfree28.0%、図1)。
RANKLのコアβ鎖は、TNFファミリーサイトカインの特徴である襞を採用する。各RANKLモノマーは、2つの平坦な逆平行β襞状シートで構成されるβ−サンドイッチからなる。第1のシートはβ鎖A、H、CおよびFにより形成され、第2のシートはβ鎖B、G、DおよびEにより形成される(図2A〜図2D、図3)。内部AHCFβシートはサブユニット間会合に関与し、BGDEβシートは外表面に主に寄与する。RANKLモノマーは、3回対称軸に沿って自己会合する。トリマー複合体は、遠位尖端より幅広の膜近位基部を有する切頭ピラミッドとして最もよく説明されている。RANKLトリマーは高さ55Åであって、およその直径は、基部で55Å、尖端で35Åである。ホモトリマーは、各RANKLモノマー、鎖EおよびFにおけるβサンドイッチの一縁が近隣モノマーのAHCFβシートの内部疎水性面に寄るよう、アセンブルされる(図2A、図2C)。従って、RANKLホモトリマーのトリマー界面は縁−面相互作用のプラットホームからなる。側面から見て、各モノマーは回転軸を中心としてわずかに左寄りにねじれる(図2A、図2B)。各RANKLモノマーのアミノ酸組成は同一であるが、トリマーは結晶学的対称により位相幾何学的に等しくない。
RANKLに対する2つの受容体、すなわちRANKおよびOPGは、TNFRファミリーに属する。TNFファミリー受容体−リガンド複合体に関する2つの既知の結晶構造に基づいて、TNFファミリーサイトカインは、ホモトリマーの隣接モノマーにより形成される3つの溝のそれぞれに沿って、1つの延長受容体分子を結合する、ということが認められる。これらのサブユニット間溝は、3回対称軸に沿って下方に見えると理解され得る(図2C、図2D)。この斜視図から、溝は、RANKLホモトリマーの2つの隣接モノマーにより形成され、従って受容体結合のためにはリガンドホモ三量体化が必要とされる、ということが明らかである。このように、RANKLトリマーは3つの空間的に異なってはいるが等価の受容体結合領域を示す。RANKLの構造的に独特なAA”、CD、DEおよびEFループの部分は、受容体結合溝の側面を裏打ちする(図2C)。多数の天然に存在する、および合成のTNFファミリーサイトカイン改変体は、これらのループの突然変異に起因する受容結合に際しての親和性変更を示す(図3)が、これは、TRAIL−DR5複合体(Hymowitz,S.G.ら、5.Mol.Cell.4:563−571(1999)、Mongkolsapaya,J.ら、Nat.Struct.Biol.6:1048−1053(1999)、Cha,S.S.ら、J.Biol.Chem.275:31171−31177(2000))、およびTNFβ−TNFR複合体(Banner,D.W.ら、Cell.73:431−445(1993))の結晶構造中で受容体分子と直接接触することが実証されている。
既知のTNF−TNFR構造との比較は、RANKLがその独特の溶媒接触可能ループを介してその受容体を結合し得る、ということを示唆する。本発明者らは、構造ベースの突然変異誘発実験を実施することにより、これらの予測の生物学的関連性を調べた。RANKLの生物学的機能に影響を及ぼす3つの突然変異:AspでIle248を置換する、DEループにおける単一アミノ酸置換(I248D);Gly177からLeu183のAA”ループの欠失(AA”ループ欠失);およびRANKL(177〜183)のAA”ループのTNFのA”ループでの置換(AA”ループ交換)を生成した(図5A)。AA”ループ欠失およびループ交換変異体を保有するRANKLは、破骨細胞前駆体がインビトロで分化するよう誘導できないが、I248D置換変異体は、ネイティブRANKLと比較して、効力が8分の1に低減することが示される(図5B)。さらに、I248D RANKLにより誘導された破骨細胞は、機能障害性形態、すなわち典型的にはネイティブRANKLにより誘導された多核化良好伝播性(well−spread)破骨細胞と比較して、単核性および小サイズを示す(図5C)。従って、RANKLのAA”ループ欠失およびAA”ループ交換変異体は、RANKを介した細胞分化を誘導することができない。これに対比して、構築物I248Dは、RANKを活性化するが、ネイティブRANKLの濃度の8倍で投与された場合にのみ匹敵するレベルの細胞分化を誘導する、新規の形態のRANKLを示す。
Claims (37)
- 結晶形態でタンパク質複合体を含む組成物であって、該複合体は、RANKL細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む、組成物。
- 前記アミノ酸配列は、RANKLの細胞外ドメインを含む、請求項1に記載の組成物。
- 非対称単位中に7個のRANKLモノマーを含む単純(primitive)菱面体結晶を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記結晶は、a=b=150.6ű0.2Åおよびc=139.5ű0.2Åの単位セル寸法を有するR3の空間群を有する、請求項3に記載の組成物。
- 非対称単位中に3個のRANKモノマーを含む単純斜方結晶を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記結晶は、a=65.3ű0.2Å、b=82.0ű0.2Åおよびc=99.5ű0.2Åの単位セル寸法を有するP212121の空間群を有する、請求項5に記載の組成物。
- 前記結晶は、回析性を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記結晶は、未変性結晶である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記結晶は、重原子誘導体結晶である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、RANKL変異体である、請求項1に記載の組成物。
- 前記変異体は、セレノメチオニン変異体またはセレノシステイン変異体である、請求項10に記載の結晶。
- 前記変異体は、保存的変異体である、請求項10に記載の結晶。
- 前記変異体は、短縮型または伸長型の変異体である、請求項10に記載の結晶。
- 前記結晶は、以下:
(a)RANKL細胞外ドメインを含む一定容量の溶液を、沈殿剤を含む一定容量のリザーバ溶液と混合する工程と、
(b)該工程(a)で得られた混合物を、結晶が生成するまで結晶化に適した条件下で密閉容器中の該リザーバ溶液上でインキュベートする工程と、
を包含する方法により生成される、請求項1に記載の組成物。 - RANKLタンパク質複合体を結晶化する方法であって、以下:
(a)RANKLタンパク質複合体を含む一定容量の溶液を、沈殿剤を含む一定容量のリザーバ溶液と混合する工程と、
(b)該工程(a)で得られた混合物を、該結晶が生成するまで結晶化に適した条件下で密閉容器中の該リザーバ溶液上でインキュベートする工程と、
を包含する、方法。 - RANK調節活性を有する化合物を同定する方法であって、RANKL細胞外ドメイン結晶複合体または結合溝を含むそのフラグメントの三次元構造表示を用いて、RANK結合部位を結合する能力に関して候補化合物をコンピュータースクリーニングする工程、を包含する方法。
- 以下の工程:
(a)前記候補化合物を合成する工程と、
(b)骨形成活性に関して該候補化合物をスクリーニングする工程と、
をさらに包含する、請求項16に記載の方法。 - 三次元構造情報が、RANKL細胞外ドメインの原子構造座標を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記三次元構造情報は、RANKLの受容体結合溝を含む残基の原子構造座標をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 前記RANKLの受容体結合溝を含む残基の原子構造座標は、RANKL細胞外ドメイン複合体の原子構造座標から得られる、請求項19に記載の方法。
- RANKまたはOPG調節化合物を同定する方法であって、RANKL細胞外ドメイン複合体またはRANKLの結合溝を含むそのフラグメントの三次元構造表示を用いて、RANK OPGまたはRANKLを結合する合成可能な候補化合物をコンピューター設計する工程を包含する、方法。
- 前記コンピューター設計は、以下:
(a)RANKLの受容体結合溝を模倣可能な化学物質またはフラグメントを同定する工程と、
(b)前記化学物質または断片を単一分子に構築して、前記候補化合物の構造を提供する工程、
を包含する請求項21に記載の方法。 - 以下の工程:
(a)前記候補化合物を合成する工程と、
(b)RANK活性を調節するために前記候補化合物をスクリーニングする工程と、
をさらに包含する、請求項22に記載の方法。 - 前記構造情報は、RANKL細胞外ドメインの原子構造座標を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記構造情報は、RANKLの受容体結合溝を含む残基の原子構造座標をさらに包含する、請求項24に記載の方法。
- 結晶RANKL細胞外ドメイン複合体あるいはそのフラグメントまたは一部の三次元構造表示に対応する情報とともに埋め込まれる、機械読取可能媒体。
- 前記RANKL細胞外ドメイン複合体は、非対称単位中に7個のモノマーを含む菱面体結晶を含む、請求項26に記載の機械読取可能媒体。
- 前記複合体の少なくとも1つのモノマーが変異体である、請求項26に記載の機械読取可能媒体。
- 前記RANKL細胞外ドメイン複合体は、非対称単位中に3個のRANKLモノマーを含む斜方結晶を含む、請求項26に記載の機械読取可能媒体。
- 前記複合体の少なくとも1つのモノマーが変異体である請求項29に記載の機械読取可能媒体。
- 前記情報は、原子構造座標またはそのサブセットを含む、請求項26〜30のいずれか1項に記載の機械読取可能媒体。
- RANKLのDEループ中に非天然変異を含む化合物。
- 前記変異は、残基248に存在する、請求項32に記載の変異体。
- I248D置換を含む、請求項33に記載の変異体。
- RANKLのAA”ループ中に非天然変異を含む化合物。
- 前記AA”ループ変異は、Gly177からLeu183までのAA”ループの欠失を含む、請求項35に記載の変異体。
- 前記AA”ループ変異は、RANKL残基177〜183のTNFの残基による置換を含む請求項35に記載の変異体。
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