CN113072616B - 一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鱼骨提取肽技术领域，针对现有技术的预防和治疗骨质疏松的药物成本较高且不能被有效吸收的问题，公开了一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊及其制备方法，所述功能肽的肽段氨基酸序列为Arg‑Ser‑Pro‑Met‑Gly‑Pro‑Phe‑Gly，ESI‑MS检测分子量为848.72 Da。本发明通过对金枪鱼骨进行简单有效的处理，从中提取出能够促进成骨前体细胞增殖的功能肽，该功能肽易于吸收，制备方法简单，最终功能肽得率高；制备出来的肽通过双层包覆制得功能肽微胶囊，功能肽微胶囊能够精准控制功能肽的释放位置及释放速度，促进人体肠道的吸收，来提升功能肽的稳定性及其营养价值，减少功能肽的浪费。

Description

一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊及其制备方法
技术领域
本发明涉及鱼骨提取肽技术领域，尤其是涉及一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊及其制备方法。
背景技术
骨质疏松症是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。随着社会老龄化加剧，骨质疏松症的发病率已跃居世界各种常见疾病的第7位，被公认为严重的社会公共健康问题。骨质疏松的发病与生活习惯、激素调控及遗传多种因素有关，是多因素共同作用的结果。目前研究学者大都从引起骨吸收和骨形成平衡被打破的因素找起。成骨细胞主要参与骨形成，破骨细胞参与骨吸收，从细胞生物学角度讲，骨平衡就是成骨细胞和破骨细胞在骨成熟过程中的相互制约关系。成骨细胞作为骨形成过程中的最关键的功能细胞，其所分泌的骨基质，在骨重建的过程中是必不可少的，并且成骨细胞的增殖也可以生成丰富的胶原，通过基质钙化的方式生成更多的新的骨组织。此外若成骨细胞的数目减少，生物功能降低，将会导致骨形成的减少，骨密度的降低，骨小梁逐渐变窄，又因为成骨细胞聚集至骨陷窝处的能力减弱，被破骨细胞吸收的骨陷窝无法得到修补，最终导致骨的减少。所以骨质疏松发生的一个很重要的原因是成骨细胞的数量与功能相对不足。
目前，传统骨质疏松症治疗药物主要包括骨吸收抑制剂和骨形成促进剂。骨吸收抑制剂主要是通过抑制破骨细胞的形成和活性，从而抑制骨的吸收来减缓骨钙的丢失，但由于骨质疏松症患者通常都会钙吸收不足，若单独应用此类药物则可能造成低钙血症。而骨形成促进剂目前研究较少，主要包括甲状旁腺激素、细胞因子、氟化物和锶制剂等，但其来源有限，靶向性差也限制了其应用。随着现代患者在饮食与健康方面的意识提高，食源性生物活性肽因其具有安全、无毒副作用、价格竞争力强和易于吸收等优点在预防和治疗治骨质疏松领域受到了越来越广泛的关注。骨胶原蛋白占到骨组织有机质的90％以上，对于维持骨结构的完整性非常重要，并能够螯合钙质，防止骨组织钙质流失。骨胶原蛋白肽是骨胶原蛋白降解产生的多肽，研究表明，摄入胶原蛋白肽可以有效补充人体流失的胶原蛋白，这可能是因为部分低于10个氨基酸的短肽可以被肠道上皮细胞直接吸收，在体内合成蛋白质。因此，摄入骨胶原蛋白肽可以在人体内转化为骨胶原蛋白，从而达到防治骨组织钙质流失和骨质疏松症的效果，然而现有骨胶原蛋白肽种类有限，且不能在有限的时间内被肠道消化吸收，或者在消化道中过早的分解，造成骨胶原蛋白肽营养价值降低，进而增加骨胶原蛋白肽的制备成本，相同效果的情况下，增加了食用者的服用次数与食用成本，因此，开发一种能够有效食用、充分吸收及降低成本的促进成骨前体细胞增殖的功能肽具有重要的意义。
专利号CN201910225417.0，专利名称“一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法”，本发明公开了一种金枪鱼骨胶原多肽的制备方法，包括如下步骤：将金枪鱼骨蛋白与蒸馏水混匀，并进行加热加压处理，得到金枪鱼骨蛋白浆液；调节金枪鱼骨蛋白浆液pH，并加入木瓜蛋白酶进行酶解，得到酶解液；将酶解液灭酶，得到灭酶酶解液；将灭酶酶解液静置冷却，离心取上清液后再进行超滤处理，得胶原多肽粗液；将胶原多肽粗液依次加入到阴离子交换树脂层析柱中洗脱，葡聚糖凝胶柱层析中洗脱，采用高效液相色谱进行纯化处理，即得金枪鱼骨胶原多肽。
其不足之处在于，骨胶原多肽后续服用过程中的容易被过早分解，骨胶原多肽稳定性难以保证，营养价值较低。
发明内容
本发明是为了克服现有技术预防和治疗骨质疏松的药物成本较高且不能被有效吸收的问题，提供一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊及其制备方法，通过对金枪鱼骨进行简单有效的处理，从中提取出能够促进成骨前体细胞增殖的功能肽，该功能肽易于吸收，制备方法简单，最终功能肽得率高；制备出来的肽通过双层包覆制得功能肽微胶囊，功能肽微胶囊能够精准控制功能肽的释放位置及释放速度，实现功能肽在肠道的释放和吸收，来提升功能肽的稳定性及其营养价值，减少功能肽的浪费。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽，所述功能肽的肽段氨基酸序列为Arg-Ser-Pro-Met-Gly-Pro-Phe-Gly，ESI-MS检测分子量为848.72Da。
提取得到新肽段氨基酸序列的促进成骨前体细胞增殖的功能肽，丰富了骨胶原多肽的种类，为治疗骨质疏松的药物提供更多的选择，降低了骨质疏松症的治疗成本。
一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)将金枪鱼骨清洗、破碎，蒸煮，去除鱼骨上的碎肉，粉碎鱼骨，得到鱼骨粉；
(2)往鱼骨粉中加入水，搅拌均匀，得到鱼骨溶浆；
(3)采用柠檬酸调节鱼骨溶浆的pH，加入酸性蛋白酶搅拌均匀，酶解，得到鱼骨酶解液；
(4)往鱼骨酶解液中接种乳酸菌菌粉，加入葡萄糖，发酵；
(5)发酵结束后灭酶，冷却至室温后，离心取上清液，采用分子筛超滤膜分离，收集滤液，得到功能肽溶液，对功能肽溶液进行真空冷冻干燥得到功能肽粉；
(6)将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊。
按照上述提取制备步骤对金枪鱼骨中的促进成骨前体细胞增殖的功能肽进行有效的提取，采用酶解结合发酵的方法来制备得到高质量高收率的促进成骨前体细胞增殖的功能肽；另外，本发明还通过在金枪鱼骨中提取的功能肽表面包覆保护层，通过控制功能肽的释放位置及释放速度，来提升功能肽的稳定性及其营养价值，促进人体肠道的吸收，制备出易于消化并能够充分吸收的功能肽制品，避免了功能肽的浪费，降低功能肽制备成本。
作为优选，步骤(1)中，金枪鱼骨蒸煮30-40min，用破碎机将鱼骨粉碎至80目以下。
作为优选，步骤(2)中，加入水的重量为鱼骨粉重量的3-4倍。
作为优选，步骤(3)中，采用5～5.5M的柠檬酸将鱼骨溶浆的pH调节至3.0～3.5，加入鱼骨粉重量0.25～0.75％的酸性蛋白酶，采用38～42℃水浴酶解3～3.2h。
作为优选，步骤(4)中，接种鱼骨粉重量0.1～0.3％乳酸菌菌粉，加入鱼骨粉重量4-6％的葡萄糖，发酵时间为10～12h。
作为优选，步骤(5)中，发酵结束后在92-98℃水浴中灭酶10～15min，冷却至室温后，4000～4200rpm离心10～15min取上清液，得到功能肽溶液，采用截留分子量为1000Da的超滤膜分离，收集滤液。
作为优选，步骤(5)中，真空冷冻干燥的条件：将功能肽溶液分装于冷冻盘中，高度16～20mm，置于-80～-75℃的冰柜中，预冻8～10h，转移至真空干燥机中，温度设定为-66～-62℃，冻干时间24～36h，冻干得到功能肽粉。
作为优选，步骤(6)中，所述功能肽微胶囊的具体制备过程为：(1)将醋酸纤维素溶于乙醇中，加入淀粉混合均匀，滴加二聚丙三醇，继续加入蚕丝蛋白纤维和二月桂酸二丁基锡，升温至50-55℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌20-25min，2000-2300r/min条件下均质5-10min；所得溶液在进风温度45-50℃、出风温度30-35℃、进料速度70-90mL/h下进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；醋酸纤维素、乙醇、淀粉、二聚丙三醇、蚕丝蛋白纤维、二月桂酸二丁基锡及功能肽粉的比例为20-22g：450-480mL：15-18g：40-45mL：12-16g：0.5-0.8g：15-20g；所述蚕丝蛋白纤维的长度为1-1.5mm；将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用均质机进行乳化均质处理，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊；单层包覆微胶囊与壁材的质量比为5：1～10：1；乳化均质条件：温度50～60℃，转速1500～1800rpm；喷雾干燥的条件：进风温度40～50℃，出风温度30～35℃，进料速度35～40mL/min。
本发明的功能肽微胶囊通过内部单层与壁材共同包覆来实现其在肠道中才会分解，且其内部的功能肽缓慢释放，有利于功能肽在肠道的充分吸收，不会一次释放过多功能肽导致肠道来不及吸收而造成浪费。壁材成分保证功能肽的口感及其在口腔、食管及胃中的稳定性，防止功能肽过早的释放，被胃蛋白酶等分解破环其活性结构，影响其营养成分及其吸收后的功能作用。
步骤(1)中单层包覆微胶囊中单层壳层的作用主要是对包覆的功能肽粉起到缓释且均匀释放的作用，因为单层包覆微胶囊壳层中含有淀粉及蚕丝蛋白纤维，而肠道中含有淀粉酶与胰蛋白酶，当功能肽微胶囊到达肠道中后，在碱性环境中壁材降解，将单层包覆微胶囊裸露出来。单层包覆微胶囊在肠液的作用下，由于淀粉具有较强的亲水性，蚕丝蛋白纤维的亲水性要差，所以淀粉会更快受到淀粉酶的酶解作用，促进淀粉酶的水解，当淀粉被水解后，单层壳层产生小孔，内部的功能肽会开始释放；当功能肽微胶囊中的部分功能肽释放之后，肠液会通过小孔进入到功能肽微胶囊内部，单层包覆微胶囊的单层壳层会受到胰蛋白酶的内外渗透并酶解，蚕丝蛋白纤维被酶解消化之后会形成不连续的残段纤维，由于蚕丝蛋白纤维占单层壳层的比重较大，当其被部分酶解消化之后，单层壳层结构会逐步具有更多的孔隙甚至包覆结构坍塌，对内部剩余的功能肽起到释放或者挤压作用，促进剩余功能肽的释放。该结构变化避免了随着功能肽逐步释放所带来的功能肽微胶囊内部后续剩余肽无法快速释放或者充分释放的问题，使得功能肽微胶囊中功能肽充分释放并且是均匀释放，促进了肠道均匀吸收，避免了功能肽的浪费。
单层壳层具体反应机理为：本发明采用含有多羧基与羟基的醋酸纤维素作为包覆层主体，再加入二聚丙三醇，二者在二月桂酸二丁基锡催化作用下发生酯化反应，进一步发生聚合反应，形成单层包覆微胶囊的壳层，二者在酯化反应与聚合反应的过程中，所形成酯化产物与聚合产物同时与蚕丝蛋白纤维表面的氨基及淀粉表面的羟基进行反应，使各成分之间产生连接的化学键，最终醋酸纤维素聚合产物与蚕丝蛋白纤维、淀粉形成一个整体性好且包覆性能好、流动性高，均匀性好的包覆壳层。
作为优选，壁材组分及质量比：瓜尔豆胶、黄原胶、白糊精、桔子油香精、胡萝卜素、柠檬酸钠、苯甲酸、白砂糖及水＝160～165g：182～185g：300～310g：182～185g：57～60g：380～390g：36～40g：30～35g：50～60g。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过各处理步骤与添加成分如乳酸菌菌粉及葡萄糖等的有效配合来提取出一种新的肽段氨基酸序列的功能肽，该功能肽能够有效促进成骨前体细胞增殖，并且该功能肽的制备高效优质；
(2)通过制备功能肽微胶囊，采用双层材料的包覆，来保证功能肽在肠道中释放，保护功能肽结构不被破坏，同时保证功能肽的释放速度达到匀速，最大限度的保证功能肽能够被充分吸收；
(3)提升功能肽后续的稳定性及其营养价值，促进人体肠道的吸收，制备出易于消化并能够充分吸收的功能肽制品，避免了功能肽的浪费。
附图说明
图1为促进成骨前体细胞增殖功能肽的HPLC分析图。
图2为促进成骨前体细胞增殖功能肽的MS分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
总实施例
一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽，所述功能肽的肽段氨基酸序列为Arg-Ser-Pro-Met-Gly-Pro-Phe-Gly，ESI-MS检测分子量为848.72Da。
1、制备功能肽的具体过程：
(1)将金枪鱼骨清洗、破碎，蒸煮30-40min，去除鱼骨上的碎肉，粉碎鱼骨至80目以下，得到鱼骨粉；
(2)往鱼骨粉中加入其重量3-4倍的水，搅拌均匀，得到鱼骨溶浆；
(3)采用5～5.5M的柠檬酸调节鱼骨溶浆的pH至3.0～3.5，加入鱼骨粉重量0.25～0.75％的酸性蛋白酶搅拌均匀，酶解，采用38～42℃水浴酶解3～3.2h得到鱼骨酶解液；
(4)往鱼骨酶解液中接种鱼骨粉重量0.1～0.3％的乳酸菌菌粉，加入鱼骨粉重量4-6％的葡萄糖，发酵10～12h；
(5)发酵结束后在92-98℃水浴中灭酶10～15min，冷却至室温后，4000～4200rpm离心10～15min取上清液，得到功能肽溶液，采用截留分子量为1000Da的超滤膜分离，收集滤液，进行真空冷冻干燥，；将功能肽溶液分装于冷冻盘中，高度16～20mm，置于-80～-75℃的冰柜中，预冻8～10h，转移至真空干燥机中，温度设定为-66～-62℃，冻干时间24～36h，冻干得到功能肽粉；超微粉碎，过100目筛，得到促进成骨前体细胞增殖功能肽粉；
(6)将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊；
所述功能肽微胶囊的制备过程为：
(1)将醋酸纤维素溶于乙醇中，加入淀粉混合均匀，滴加二聚丙三醇，继续加入蚕丝蛋白纤维和二月桂酸二丁基锡，升温至50-55℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌20-25min，2000-2300r/min条件下均质5-10min；所得溶液在进风温度45-50℃、出风温度30-35℃、进料速度70-90mL/h下进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；醋酸纤维素、乙醇、淀粉、二聚丙三醇、蚕丝蛋白纤维、二月桂酸二丁基锡及功能肽粉的比例为20-22g：450-480mL：15-18g：40-45mL：12-16g：0.5-0.8g：15-20g；所述蚕丝蛋白纤维的长度为1-1.5mm
(2)将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用均质机进行乳化均质处理，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊；壁材组分及质量比：瓜尔豆胶、黄原胶、白糊精、桔子油香精、胡萝卜素、柠檬酸钠、苯甲酸、白砂糖及水＝160～165g：182～185g：300～310g：182～185g：57～60g：380～390g：36～40g：30～35g：50～60g；单层包覆微胶囊与壁材的质量比为5：1～10：1；乳化均质条件：温度50～60℃，转速1500～1800rpm；喷雾干燥的条件：进风温度40～50℃，出风温度30～35℃，进料速度35～40mL/min。
实施例1
一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽，所述功能肽的肽段氨基酸序列为Arg-Ser-Pro-Met-Gly-Pro-Phe-Gly，ESI-MS检测分子量为848.72Da。
1、制备功能肽的具体过程：
(1)将金枪鱼骨清洗、破碎，蒸煮35min，去除鱼骨上的碎肉，粉碎鱼骨至80目以下，得到鱼骨粉；
(2)往鱼骨粉中加入鱼骨粉重量3.5倍的水，搅拌均匀，得到鱼骨溶浆；
(3)采用5～5.5M的柠檬酸调节鱼骨溶浆的pH至3.3，加入鱼骨粉重量0.5％的酸性蛋白酶搅拌均匀，酶解，采用40℃水浴酶解3.1h得到鱼骨酶解液；
(4)往鱼骨酶解液中接种鱼骨粉重量0.2％的乳酸菌菌粉，加入鱼骨粉重量5％的葡萄糖，发酵11h；
(5)发酵结束后在95℃水浴中灭酶12.5min，冷却至室温后，4100rpm离心13min取上清液，得到功能肽溶液，采用截留分子量为1000Da的超滤膜分离，收集滤液，进行真空冷冻干燥，；将功能肽溶液分装于冷冻盘中，高度18mm，置于-78℃的冰柜中，预冻9h，转移至真空干燥机中，温度设定为-64℃，冻干时间30h，冻干得到功能肽粉；超微粉碎，过100目筛，得到促进成骨前体细胞增殖功能肽粉；
(6)将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊；
所述功能肽微胶囊的制备过程为：
(1)将醋酸纤维素溶于乙醇中，加入淀粉混合均匀，滴加二聚丙三醇，继续加入蚕丝蛋白纤维和二月桂酸二丁基锡，升温至53℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌22min，2150r/min条件下均质8min；所得溶液在进风温度48℃、出风温度33℃、进料速度80mL/h下进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；醋酸纤维素、乙醇、淀粉、二聚丙三醇、蚕丝蛋白纤维、二月桂酸二丁基锡及功能肽粉的比例为21g：465mL：16.5g：42mL：14g：0.65g：18g；所述蚕丝蛋白纤维的长度为1.2mm
(2)将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用均质机进行乳化均质处理，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊；壁材组分及质量比：瓜尔豆胶、黄原胶、白糊精、桔子油香精、胡萝卜素、柠檬酸钠、苯甲酸、白砂糖及水＝162g：183.5g：305g：182～185g：58g：385g：38g：33g：55g；单层包覆微胶囊与壁材的质量比为7：1；乳化均质条件：温度55℃，转速1650rpm；喷雾干燥的条件：进风温度45℃，出风温度32℃，进料速度38mL/min。
实施例2
一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽，所述功能肽的肽段氨基酸序列为Arg-Ser-Pro-Met-Gly-Pro-Phe-Gly，ESI-MS检测分子量为848.72Da。
1、制备功能肽的具体过程：
(1)将金枪鱼骨清洗、破碎，蒸煮36min，去除鱼骨上的碎肉，粉碎鱼骨至80目以下，得到鱼骨粉；
(2)往鱼骨粉中加入鱼骨粉重量3倍的水，搅拌均匀，得到鱼骨溶浆；
(3)采用5.5M的柠檬酸调节鱼骨溶浆的pH至3.5，加入鱼骨粉重量0.25％的酸性蛋白酶搅拌均匀，酶解，采用38℃水浴酶解3.2h得到鱼骨酶解液；
(4)往鱼骨酶解液中接种鱼骨粉重量0.1％的乳酸菌菌粉，加入鱼骨粉重量6％的葡萄糖，发酵10h；
(5)发酵结束后在98℃水浴中灭酶10min，冷却至室温后，4200rpm离心10min取上清液，得到功能肽溶液，采用截留分子量为1000Da的超滤膜分离，收集滤液，进行真空冷冻干燥，；将功能肽溶液分装于冷冻盘中，高度16mm，置于-75℃的冰柜中，预冻8h，转移至真空干燥机中，温度设定为-62℃，冻干时间24h，冻干得到功能肽粉；超微粉碎，过100目筛，得到促进成骨前体细胞增殖功能肽粉；
(6)将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊；
所述功能肽微胶囊的制备过程为：
(1)将醋酸纤维素溶于乙醇中，加入淀粉混合均匀，滴加二聚丙三醇，继续加入蚕丝蛋白纤维和二月桂酸二丁基锡，升温至50℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌25min，2000r/min条件下均质10min；所得溶液在进风温度45℃、出风温度35℃、进料速度70mL/h下进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；醋酸纤维素、乙醇、淀粉、二聚丙三醇、蚕丝蛋白纤维、二月桂酸二丁基锡及功能肽粉的比例为20g：450mL：15g：45mL：12g：0.8g：15g；所述蚕丝蛋白纤维的长度为1.5mm
(2)将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用均质机进行乳化均质处理，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊；壁材组分及质量比：瓜尔豆胶、黄原胶、白糊精、桔子油香精、胡萝卜素、柠檬酸钠、苯甲酸、白砂糖及水＝160g：185g：300g：182g：60g：380g：40g：30g：60g；单层包覆微胶囊与壁材的质量比为8：1；乳化均质条件：温度50℃，转速1500rpm；喷雾干燥的条件：进风温度50℃，出风温度30℃，进料速度40mL/min。
实施例3
一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽，所述功能肽的肽段氨基酸序列为Arg-Ser-Pro-Met-Gly-Pro-Phe-Gly，ESI-MS检测分子量为848.72Da。
1、制备功能肽的具体过程：
(1)将金枪鱼骨清洗、破碎，蒸煮40min，去除鱼骨上的碎肉，粉碎鱼骨至80目以下，得到鱼骨粉；
(2)往鱼骨粉中加入鱼骨粉重量3倍的水，搅拌均匀，得到鱼骨溶浆；
(3)采用5M的柠檬酸调节鱼骨溶浆的pH至3.5，加入鱼骨粉重量0.75％的酸性蛋白酶搅拌均匀，酶解，采用38℃水浴酶解3.2h得到鱼骨酶解液；
(4)往鱼骨酶解液中接种鱼骨粉重量0.1％的乳酸菌菌粉，加入鱼骨粉重量4-6％的葡萄糖，发酵12h；
(5)发酵结束后在92℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，4000rpm离心15min取上清液，得到功能肽溶液，采用截留分子量为1000Da的超滤膜分离，收集滤液，进行真空冷冻干燥，；将功能肽溶液分装于冷冻盘中，高度16mm，置于-75℃的冰柜中，预冻8h，转移至真空干燥机中，温度设定为-62℃，冻干时间24h，冻干得到功能肽粉；超微粉碎，过100目筛，得到促进成骨前体细胞增殖功能肽粉；
(6)将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊；
所述功能肽微胶囊的制备过程为：
(1)将醋酸纤维素溶于乙醇中，加入淀粉混合均匀，滴加二聚丙三醇，继续加入蚕丝蛋白纤维和二月桂酸二丁基锡，升温至50℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌25min，2000r/min条件下均质5min；所得溶液在进风温度50℃、出风温度30℃、进料速度70mL/h下进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；醋酸纤维素、乙醇、淀粉、二聚丙三醇、蚕丝蛋白纤维、二月桂酸二丁基锡及功能肽粉的比例为20g：480mL：15g：45mL：12g：0.8g：15g；所述蚕丝蛋白纤维的长度为1mm
(2)将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用均质机进行乳化均质处理，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊；壁材组分及质量比：瓜尔豆胶、黄原胶、白糊精、桔子油香精、胡萝卜素、柠檬酸钠、苯甲酸、白砂糖及水＝160g：182g：310g：182g：60g：380g：40g：30g：60g；单层包覆微胶囊与壁材的质量比为5：1；乳化均质条件：温度50℃，转速1800rpm；喷雾干燥的条件：进风温度40℃，出风温度35℃，进料速度35mL/min。
实施例4
一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽，所述功能肽的肽段氨基酸序列为Arg-Ser-Pro-Met-Gly-Pro-Phe-Gly，ESI-MS检测分子量为848.72Da。
1、制备功能肽的具体过程：
(1)将金枪鱼骨清洗、破碎，蒸煮32min，去除鱼骨上的碎肉，粉碎鱼骨至80目以下，得到鱼骨粉；
(2)往鱼骨粉中加入鱼骨粉重量3.2倍的水，搅拌均匀，得到鱼骨溶浆；
(3)采用5.3M的柠檬酸调节鱼骨溶浆的pH至3.1，加入鱼骨粉重量0.35％的酸性蛋白酶搅拌均匀，酶解，采用39℃水浴酶解3.15h得到鱼骨酶解液；
(4)往鱼骨酶解液中接种鱼骨粉重量0.18％的乳酸菌菌粉，加入鱼骨粉重量4.5％的葡萄糖，发酵10.5h；
(5)发酵结束后在94℃水浴中灭酶12min，冷却至室温后，4050rpm离心14min取上清液，得到功能肽溶液，采用截留分子量为1000Da的超滤膜分离，收集滤液，进行真空冷冻干燥，；将功能肽溶液分装于冷冻盘中，高度18mm，置于-79℃的冰柜中，预冻9h，转移至真空干燥机中，温度设定为-65℃，冻干时间28h，冻干得到功能肽粉；超微粉碎，过100目筛，得到促进成骨前体细胞增殖功能肽粉；
(6)将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊；
所述功能肽微胶囊的制备过程为：
(1)将醋酸纤维素溶于乙醇中，加入淀粉混合均匀，滴加二聚丙三醇，继续加入蚕丝蛋白纤维和二月桂酸二丁基锡，升温至51℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌21min，2100r/min条件下均质6min；所得溶液在进风温度46℃、出风温度31℃、进料速度75mL/h下进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；醋酸纤维素、乙醇、淀粉、二聚丙三醇、蚕丝蛋白纤维、二月桂酸二丁基锡及功能肽粉的比例为21.5g：470mL：17g：44mL：15g：0.7g：19g；所述蚕丝蛋白纤维的长度为1.4mm
(2)将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用均质机进行乳化均质处理，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊；壁材组分及质量比：瓜尔豆胶、黄原胶、白糊精、桔子油香精、胡萝卜素、柠檬酸钠、苯甲酸、白砂糖及水＝161g：183g：302g：184g：59g：382g：37g：32g：52g；单层包覆微胶囊与壁材的质量比为6：1；乳化均质条件：温度52℃，转速1600rpm；喷雾干燥的条件：进风温度42℃，出风温度31℃，进料速度39mL/min。
实施例5
一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽，所述功能肽的肽段氨基酸序列为Arg-Ser-Pro-Met-Gly-Pro-Phe-Gly，ESI-MS检测分子量为848.72Da。
1、制备功能肽的具体过程：
(1)将金枪鱼骨清洗、破碎，蒸煮38min，去除鱼骨上的碎肉，粉碎鱼骨至80目以下，得到鱼骨粉；
(2)往鱼骨粉中加入鱼骨粉重量3.2倍的水，搅拌均匀，得到鱼骨溶浆；
(3)采用5.3M的柠檬酸调节鱼骨溶浆的pH至3.4，加入鱼骨粉重量0.55％的酸性蛋白酶搅拌均匀，酶解，采用41℃水浴酶解3.1h得到鱼骨酶解液；
(4)往鱼骨酶解液中接种鱼骨粉重量0.28％的乳酸菌菌粉，加入鱼骨粉重量5.5％的葡萄糖，发酵11.5h；
(5)发酵结束后在97℃水浴中灭酶11min，冷却至室温后，4150rpm离心14min取上清液，得到功能肽溶液，采用截留分子量为1000Da的超滤膜分离，收集滤液，进行真空冷冻干燥，；将功能肽溶液分装于冷冻盘中，高度19mm，置于-78℃的冰柜中，预冻9.5h，转移至真空干燥机中，温度设定为-63℃，冻干时间35h，冻干得到功能肽粉；超微粉碎，过100目筛，得到促进成骨前体细胞增殖功能肽粉；
(6)将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊；
所述功能肽微胶囊的制备过程为：
(1)将醋酸纤维素溶于乙醇中，加入淀粉混合均匀，滴加二聚丙三醇，继续加入蚕丝蛋白纤维和二月桂酸二丁基锡，升温至54℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌24min，2250r/min条件下均质8min；所得溶液在进风温度49℃、出风温度34℃、进料速度85mL/h下进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；醋酸纤维素、乙醇、淀粉、二聚丙三醇、蚕丝蛋白纤维、二月桂酸二丁基锡及功能肽粉的比例为21.5g：455mL：16g：42mL：13g：0.6g：17g；所述蚕丝蛋白纤维的长度为1.1mm
(2)将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用均质机进行乳化均质处理，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊；壁材组分及质量比：瓜尔豆胶、黄原胶、白糊精、桔子油香精、胡萝卜素、柠檬酸钠、苯甲酸、白砂糖及水＝164g：184g：308g：184g：58g：388g：37g：33g：58g；单层包覆微胶囊与壁材的质量比为9：1；乳化均质条件：温度58℃，转速1750rpm；喷雾干燥的条件：进风温度48℃，出风温度34℃，进料速度39mL/min。
对比例1与实施例1的区别在于，采用中性蛋白酶对鱼骨溶浆进行酶解，其余步骤均与实施例1相同。
对比例2与实施例1的区别在于，鱼骨溶浆酶解后未添加乳酸菌进行发酵，其余步骤均与实施例1相同。
对比例3与实施例1的区别在于，对功能肽溶液采用喷雾干燥得到功能肽粉，其余步骤均与实施例1相同。
对比例4与实施例1的区别在于，功能肽未进行包覆，其余步骤均与实施例1相同。
对比例5与实施例1的区别在于，功能肽微胶囊未包覆壁材，其余步骤均与实施例1相同。
对比例6与实施例1的区别在于，功能肽微胶囊未进行内层包覆，即未包覆单层壳层，其余步骤均与实施例1相同。
对比例7与实施例1的区别在于，单层包覆微胶囊之比过程中未加入蚕丝蛋白纤维，其余步骤均与实施例1相同。
对比例8与实施例1的区别在于，功能肽微胶囊中蚕丝蛋白纤维的加入量过量，添加量由14g增加到了25g，其余步骤均与实施例1相同。
对比例9与实施例1的区别在于，单层包覆微胶囊与壁材的质量比过大为15：1，其余步骤均与实施例1相同。
对以上实施例及对比例，通过检测成骨功能肽微胶囊在模拟胃液环境和模拟小肠液环境中的释放速度，评估微胶囊对成骨功能肽在胃液环境下的保护效果以及在肠道环境的缓释效果。
(1)在模拟胃液环境中的释放精确称取已干燥的微囊100mg装入100mL锥形瓶，加入新鲜配制的人工胃液50mL，恒温水浴振荡器中(37±1)℃、60r/min条件下反应，每隔1h取出3mL模拟胃液，在280nm波长处测定吸光度,同时补充同体积模拟胃液。根据标准曲线计算模拟胃液中肽含量，计算肽的释放率。
释放率(％)＝胃液模拟液中释放的总肽量/(加入的微囊质量×载药质量)×100(2)在模拟小肠液环境中的释放将100mg微囊加入50mL模拟肠液中，测定方法与在模拟胃液中相同。
表1成骨功能肽微胶囊在胃蛋白酶和淀粉酶作用下的保持率结果
Figure BDA0002996887480000121
对以上实施例及对比例，通过检测成骨功能肽对成骨前体细胞增殖率和分化的影响，进行评估其应用效果。
(1)成骨前体细胞增殖率检测
从液氮中取出冻存架，取成骨前体细胞MC3T3-E进行复苏培养传代1-2次后，取正常生长的成骨前体细胞MC3T3-E1，以每孔5×103/100μL/孔接种到96孔板，培养1天后，换液含加酶解多肽终浓度至200mg/L的培养液培养，设不含酶解多肽的培养液为对照组，每组设5个重复孔，培养2天后加5mg/mL的MTT20μL/孔，培养4h后去除上清，每孔加100μL DMSO震荡10min，570nm酶标仪检测吸光度OD值。
增殖率＝(OD样品-OD对照)×100％/OD对照
(2)成骨前体细胞的分化检测
碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分泌的一种功能性酶，组织与细胞表达的特异性强，ALP通过分解磷酸酯使局部的无机磷浓度增加，以促进基质的矿化，ALP的活力与骨的形成密切相关，因此是检测成骨细胞的存在和成骨细胞分化成熟的特异性标志。
按照上述方案进行培养，以每孔5×103/100μL/孔接种到96孔板，培养1天后，换液含加酶解多肽终浓度至200mg/L培养液培养，设不含酶解多肽培养液为对照组，每组设5个重复孔，隔天换液，培养5天后弃培养液，用PBS洗两次，加入0.2％的TritonX-100 50μL 4℃过夜裂解细胞，取裂解液上清根据碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒说明书操作，检测碱性磷酸酶(ALP)的活力。
表2各项目制备得到促进成骨前体细胞增殖功能肽对成骨前体细胞增殖率影响
项目 MC3T3-E1成骨细胞增殖率 MC3T3-E1成骨细胞ALP活性
实施例1 23.6％ 0.89U/mg prot
实施例2 24.2％ 0.90U/mg prot
实施例3 23.3％ 0.90U/mg prot
实施例4 22.8％ 0.90U/mg prot
实施例5 23.5％ 0.88U/mg prot
对比例1 19.4％ 0.79U/mg prot
对比例2 18.5％ 0.77U/mg prot
对比例3 17.6％ 0.74U/mg prot
对比例4 18.3％ 0.75U/mg prot
对比例5 18.8％ 0.76U/mg prot
对比例6 19.6％ 0.79U/mg prot
对比例7 18.7％ 0.73U/mg prot
对比例8 18.9％ 0.75U/mg prot
对比例9 18.3％ 0.78U/mg prot
结论：经过评估后的结果可以看出，由实施例1-5可以看出，在本发明制备步骤及制备工艺范围内制备出来的功能肽具有较高的获得率，制备效率高，功能肽质量优越，功能肽微胶囊具有较强的稳定性与促吸性，保质期限更长，保证功能肽在肠道中释放，保护功能肽结构不被破坏，同时保证功能肽的释放速度达到匀速，最大限度的保证功能肽能够被及时吸收，大大提升功能肽后续的营养价值；在本发明制备步骤及制备工艺范围内制备出来的功能肽具有较高的促MC3T3-E1成骨细胞增殖率，并且促进MC3T3-E1成骨细胞的分化。
对比例1与实施例1的区别在于，采用中性蛋白酶对鱼骨粉进行酶解，与酸性蛋白酶相比，其酶解的效率有所降低；且采用柠檬酸进行酸化，有助于鱼骨粉的脱腥，改善产品的风味；
对比例2与实施例1的区别在于，鱼骨溶浆酶解后未添加乳酸菌进行发酵；采用乳酸菌对鱼骨粉进行发酵可以产生有机酸(主要是乳酸)、游离氨基酸、脂肪酸等，可促进鱼骨粉中钙离子的溶出，使得到的功能肽中含有钙离子，具有补钙效果。另外，鱼骨粉发酵产生牛磺酸，摄入后可以提高人体免疫力。
对比例3与实施例1的区别在于，对功能肽溶液采用喷雾干燥得到功能肽粉；喷雾干燥由于干燥过程样品的温度较高，会造成功能肽活性成分的破坏，降低产品的功效，而采用冷冻干燥可以有效保护功能肽的活性成分。
对比例4与实施例1的区别在于，功能肽未进行包覆；未进行包覆的功能肽稳定性较差，当其从口腔经食管到达胃部的时候，均会发生水解，当其到达肠道吸收部位的时候，功能肽的结构大部分以遭到破坏，所以其性能评估较差。
对比例5与实施例1的区别在于，功能肽微胶囊未包覆壁材；本发明的壁材是能够起到防止功能肽微胶囊在到达肠道之前发生水解的作用，若未包覆壁材，则单层微胶囊在胃部便会发生酶解释放，功能肽会遭到破坏，致使其最终的功能性下降。
对比例6与实施例1的区别在于，功能肽微胶囊未进行内层包覆，即未包覆单层壳层；当功能肽微胶囊到达肠道之后，在碱性肠液的作用下功能肽微胶囊内部的功能肽会瞬间释放，使得肠道来不及充分吸收，多余的功能肽便提早释放遭到破坏或者前往下一站，造成功能肽浪费，同时也缩短了肠道吸收周期。
对比例7与实施例1的区别在于，单层包覆微胶囊之比过程中未加入蚕丝蛋白纤维；未加入蚕丝蛋白纤维，当淀粉被水解后内部的功能肽被释放出来，但是随着功能肽的逐步释放，功能肽微胶囊内的功能肽便会减少，在相同孔径释放通路的条件下，会使得其释放浓度降低，后续功能肽释放过慢甚至来不及完全释放便随着微胶囊壳体一起排出体外，降低功能肽混合粉的营养价值。
对比例8与实施例1的区别在于，功能肽微胶囊中蚕丝蛋白纤维的加入量过量，由14g增加到了25g；由于内层单层壳层中蚕丝蛋白纤维的加入量过多，就使得内层单层壳层在胰蛋白酶的酶解作用下过多的破坏并过早的坍塌，使得最终功能肽过多过早的释放，造成与对比例3类似的影响。
对比例9与实施例1的区别在于，单层包覆微胶囊与壁材的质量比过大为15：1；壁材成分过少，会使得其对功能肽微胶囊整体的保护性能较差，最终对功能肽微胶囊的包覆结构造成过早的破坏，进而破坏功能肽分子结构，降低其营养价值。
由上述实施例1～5及对比例1～9相关的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的功能肽及功能肽微胶囊。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将金枪鱼骨清洗、破碎，蒸煮，去除鱼骨上的碎肉，粉碎鱼骨，得到鱼骨粉；
（2）往鱼骨粉中加入水，搅拌均匀，得到鱼骨溶浆；
（3）采用柠檬酸调节鱼骨溶浆的pH，加入酸性蛋白酶搅拌均匀，酶解，得到鱼骨酶解液；
（4）往鱼骨酶解液中接种乳酸菌菌粉，加入葡萄糖，发酵；
（5）发酵结束后灭酶，冷却至室温后，离心取上清液，采用分子筛超滤膜分离，收集滤液，得到功能肽溶液，对功能肽溶液进行真空冷冻干燥得到功能肽粉；
（6）将制得的功能肽粉进行双层包覆，得到功能肽微胶囊；所述功能肽微胶囊的制备过程为：将醋酸纤维素溶于乙醇中，加入淀粉混合均匀，滴加二聚丙三醇，继续加入蚕丝蛋白纤维和二月桂酸二丁基锡，升温至50-55℃反应，反应完毕后加入功能肽粉，并继续搅拌至全部溶解，均质，所得溶液进行喷雾干燥，制得单层包覆微胶囊；将壁材各组分按照比例混匀，加入上述单层包覆微胶囊混匀采用均质机进行乳化均质处理，单层包覆微胶囊与壁材的质量比为5：1 ~10：1，再进行喷雾干燥，得到功能肽微胶囊；醋酸纤维素、乙醇、淀粉、二聚丙三醇、蚕丝蛋白纤维、二月桂酸二丁基锡及功能肽粉的比例为20-22g:450-480mL:15-18g:40-45 mL:12-16g:0.5-0.8g:15-20g。
2.根据权利要求1所述的一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，金枪鱼骨蒸煮30-40min，用破碎机将鱼骨粉碎至80目以下。
3.根据权利要求1所述的一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，加入水的重量为鱼骨粉重量的3-4倍。
4.根据权利要求1所述的一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，采用5~5.5M的柠檬酸将鱼骨溶浆的pH调节至3.0~3.5，加入鱼骨粉重量0.25~0.75%的酸性蛋白酶，采用38~42℃水浴酶解3~3.2h。
5.根据权利要求1所述的一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，接种鱼骨粉重量0.1~0.3%的乳酸菌菌粉，加入鱼骨粉重量4-6%的葡萄糖，发酵时间为10~12h。
6.根据权利要求1所述的一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，发酵结束后在92-98℃水浴中灭酶10~15min，冷却至室温后，4000~4200rpm离心10~15min取上清液，得到功能肽溶液，采用截留分子量为1000 Da的超滤膜分离，收集滤液。
7.根据权利要求1所述的一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，真空冷冻干燥的条件：将功能肽溶液分装于冷冻盘中，高度16~20mm，置于-80~-75℃的冰柜中，预冻8~10h，转移至真空干燥机中，温度设定为-66~-62℃，冻干时间24~36h，冻干得到功能肽粉。
8.根据权利要求1所述的一种促进成骨前体细胞增殖的功能肽微胶囊的制备方法，其特征在于，壁材组分及质量比：瓜尔豆胶、黄原胶、白糊精、桔子油香精、胡萝卜素、柠檬酸钠、苯甲酸、白砂糖及水＝160~165g：182~185g：300~310g：182~185g：57~60g：380~390g：36~40g：30~35g：50~60g。
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