CN105326861A - 一种鹿骨胶原肽和活性钙复剂的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹿骨胶原肽和鹿骨活性钙复剂的加工方法，步骤为，1鹿骨前处理：取梅花鹿骨或马鹿骨，除去骨髓，烘干，粉碎，备用；2鹿骨胶原多肽的提取：取鹿骨粉，加入磷酸盐缓冲液，加入胃蛋白酶酶解，离心，上清液备用，残渣加入木瓜蛋白酶酶解，离心，合并两次上清，过滤膜，收集被截留的多肽，冷冻干燥，即为鹿骨多肽；3鹿骨活性钙的提取：取酶解后的残渣,接入乳酸菌、碳源及天然西红柿培养基发酵，加入蒸馏水，组织破碎，离心，取上清，减压浓缩干燥，即得鹿骨活性钙；4将步骤2、3中获得的产品混合均匀即得本发明产品。实验证明，产品的活性明显高于市售鹿骨提取物及其他先进工艺获得鹿骨提取物，可作为医药、保健食品的原料。

Description

一种鹿骨胶原肽和活性钙复剂的提取方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种利用联合酶解级微生物发酵的方法从鹿骨中提取胶原多肽及活性钙复合物的方法。

背景技术

鹿骨是鹿的骨骼，含有大量胶原蛋白、磷脂质、磷蛋白、维生素，还含有多种矿物质元素如钙、镁、铁、锌、钾、铜等，具有重要的生理功能和多种药理活性。有文献记载，鹿骨胶具有补肾壮阳、益气补血、祛风除湿功能，对久病体弱、精髓不足、贫血、风湿、四肢疼痛等症有较好的临床疗效。

胶原(collagen)是一种由动物细胞合成的生物高分子，是动物结缔组织中的主要成分，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，在动物体内起支持、保护、连接等多种作用。胶原与人体的生长、衰老以及健康、疾病有着密切的关系，因此可广泛应用于食品、保健品、药品、化品等领域。

从目前的研究状况来看,制备胶原多肽的原料主要有畜禽的皮和鱼类的皮、骨、鳞等，采用鹿骨制备胶原多肽的研究很少，作为养鹿业较为发达的国家,我国对鹿骨这样的产业副产物的研究利用较少，如何科学有效开展鹿骨综合利用就成为了一个重要的问题，采用一定的科学方法将鹿骨制备成胶原多肽成为一条很好的鹿骨利用途径；与此同时，提取胶原多肽后的鹿骨残渣中含有丰富的钙质，采用相应技术手段将其转化提取，制备成易于人体吸收的钙质，将大大提高鹿骨的综合利用水平。

目前，现有的加工技术多是对鹿骨进行单一酶解或联合酶解得到得到鹿骨多肽，极少数采用单一酶解后再对鹿骨进行超微粉碎得到鹿骨肽钙复合物，上述方法对鹿骨的综合利用率低，且得到的样品生物活性不高。本发明首先应用的是联合酶解的方法，提高了酶解的效率，增加了鹿骨多肽的收率，同时酶解后的残渣再通过乳酸菌发酵游离并富集鹿骨中的钙质，使鹿骨中的无机钙转化成高活性有机钙，该专利方法得到的鹿骨胶原肽钙复合物的预防骨质疏松效果明显强于其他方法得到的鹿骨胶原肽及鹿骨胶原肽钙复合物，具有，工艺过程简单，生产成本低，适合于产业化生产等优点。

发明内容

发明内容：本发明是一种利用复合酶酶解与乳酸菌发酵联用技术从鹿骨中提取鹿骨多肽和活性钙复合物的。该方法提取效率高，生产成本低，工艺流程简单，无环境污染，适合于工业生产，得到的产品具有显著的预防预防骨质疏松效果。

本发明的技术方案如下： 鹿骨前处理：取梅花鹿骨或马鹿骨，除去骨髓，50-80℃烘干,粉碎过60-100目筛，备用；鹿骨胶原多肽的提取：取步骤中的鹿骨粉，加入8-10倍量0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，加入1%-5%胃蛋白酶，在PH2-5的条件下37-45℃酶解5-10小时，4000-6000转/分钟离心，上清液备用，残渣加入1%-5%木瓜蛋白酶，在PH6-8的条件下45-60℃继续酶解5-10小时，4000-6000转/分钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500-1000KD），收集被截留的多肽，冷冻干燥，即为鹿骨多肽；活性钙的提取：取酶解后的残渣,接入3%-6%乳酸菌、3-10%碳源及5%-20%天然西红柿培养基发酵20-40小时，加入8-12倍量蒸馏水，组织破碎，4000-6000转/分钟离心，取上清，减压浓缩干燥，即得活性钙；将步骤中得到的鹿骨多肽与步骤中得到的活性钙混合均匀，即为鹿骨胶原、肽活性钙钙复合物。与现有方法比较，有以下优点： 本发明采用的是胃蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解，提高了酶解效率；本发明采用的是纳米滤膜富集后冷冻干燥的方法，避免了加热过程，保持了蛋白和多肽的活性；本发明将酶解后的残渣进行二次利用，利用乳酸菌发酵富集钙质及有益离子，将鹿骨中的无机钙转化为高活性的有机钙，易于人体吸收；本发明得到的鹿骨肽钙复合物在预防骨质疏松方面的活性远高于其他方法得到的鹿骨肽及鹿骨肽钙复合物的活性。

具体实施例：实施例1： 鹿骨前处理：取梅花鹿骨，除去骨髓，60℃烘干,粉碎过60目筛，取1.0kg备用；鹿骨胶原多肽的提取：取步骤中的鹿骨粉，加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲液10L,加入胃蛋白酶20g，在PH3.0的条件下40℃酶解5小时，5000转/分钟离心，上清液备用，残渣加入木瓜蛋白酶30g,在PH7.0的条件下50℃继续酶解5小时，5000转/分钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500KD），收集，被截留的大分子多肽，冷冻干燥，得鹿骨多肽190g；活性钙的提取：取酶解后的残渣,加入碳源（葡萄糖:蔗糖=3:7）50g，超微粉碎西红柿泥150g，灭菌后，接种乳酸乳杆菌与干酪乳杆菌干酪亚种（1:1）双菌株发酵,接种量为4%,在37℃振荡培养24h后,45℃下再静止发酵18h,加入10L蒸馏水，组织破碎，5000转/分钟离心，取上清，60℃减压浓缩干燥，即得活性钙370g；将步骤中得到的鹿骨多肽与步骤中得到的活性钙混合均匀，得鹿骨肽钙复合物553g。

实施例2： 鹿骨前处理：取梅花鹿骨，除去骨髓，50℃烘干,粉碎过80目筛，取2.0kg备用；鹿骨胶原多肽的提取：取步骤中的鹿骨粉，加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液12L,加入胃蛋白酶30g，在PH4.0的条件下37℃酶解6小时，6000转/分钟离心，上清液备用，残渣加入木瓜蛋白酶35g,在PH8.0的条件下55℃继续酶解6小时，6000转/分钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500KD），收集被截留的大分子多肽，冷冻干燥，得鹿骨多肽370g；活性钙的提取：取酶解后的残渣,加入碳源（葡萄糖:蔗糖=3:7）120g，超微粉碎西红柿泥310g，灭菌后，接种嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌（1:1）双菌株发酵,接种量为5%,在37℃振荡培养20h后,42℃下再静止发酵20h,加入20L蒸馏水，组织破碎，6000转/分钟离心，取上清，55℃减压浓缩干燥，即得活性钙730g；将步骤中得到的鹿骨多肽与步骤中得到的活性钙混合均匀，得鹿骨肽钙复合物1083g。

实施例3： 鹿骨前处理：取马鹿骨，除去骨髓，65℃烘干,粉碎过100目筛，取5.0kg备用；鹿骨胶原多肽的提取：取步骤中的鹿骨粉，加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲液50L,加入胃蛋白酶140g，在PH5.0的条件下40℃酶解8小时，5000转/分钟离心，上清液备用，残渣加入木瓜蛋白酶190g,在PH6.5的条件下50℃继续酶解8小时，5000转/分钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500KD），收集被截留的大分子多肽，冷冻干燥，得鹿骨多肽940g；活性钙的提取：取酶解后的残渣,加入碳源（葡萄糖:蔗糖=3:7）60g，超微粉碎西红柿泥160g，灭菌后，接种嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌（1:1）双菌株发酵,接种量为5%,在37℃振荡培养20h后,42℃下再静止发酵20h,加入12L蒸馏水，组织破碎，6000转/分钟离心，取上清，55℃减压浓缩干燥，即得活性钙1820g；将步骤中得到的鹿骨多肽与步骤中得到的活性钙混合均匀，得鹿骨肽钙复合物2695g。

实施例4： 鹿骨前处理：取马鹿骨，除去骨髓，70℃烘干,粉碎过80目筛，取10kg备用；鹿骨胶原多肽的提取：取步骤中的鹿骨粉，加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲液100L,加入胃蛋白酶200g，在PH3.5的条件下38℃酶解6小时，5000转/分钟离心，上清液备用，残渣加入木瓜蛋白酶300g,在PH7.5的条件下53℃继续酶解6小时，5000转/分钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500KD），收集，被截留的大分子多肽，冷冻干燥，得鹿骨多肽1650g；活性钙的提取：取酶解后的残渣,加入碳源（葡萄糖:蔗糖=3:7）50g，超微粉碎西红柿泥150g，灭菌后，接种保加利亚乳杆菌与嗜酸乳杆菌（1:1）双菌株发酵,接种量为6%,在37℃振荡培养25h后,45℃下再静止发酵20h,加入100L蒸馏水，组织破碎，7000转/分钟离心，取上清，70℃减压浓缩干燥，即得活性钙3500g；将步骤中得到的鹿骨多肽与步骤中得到的活性钙混合均匀，得鹿骨肽钙复合物5110g。

鹿骨胶原肽与活性钙复合剂对去卵巢大鼠骨质疏松的预防作用研究

1材料和仪器：1.1材料：实验用药品：鹿骨胶原肽与活性钙复合剂（本发明产品）：为实施例4所得到的产品；鹿骨提取物（市售）：西安天瑞生物技术有限公司；规格10:1；批号20150301；鹿骨提取物（目前较先进提取方法）：鹿骨前处理：取马鹿骨，除去骨髓，65℃烘干,粉碎过100目筛，取5.0kg备用。鹿骨胶原多肽的提取：取步骤中的鹿骨粉，加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲液50L,加入胰蛋白酶160g，在PH8.0的条件下37℃酶解8小时，5000转/分钟离心，上清液冷冻干燥，得鹿骨多肽510g。鹿骨钙的提取：取酶解后的残渣80℃烘干，超微粉碎得鹿骨钙4000g。鹿骨提取物获得：将步骤中得到的鹿骨胶原多肽与步骤中得到的鹿骨钙混合均匀，得鹿骨提取物4510g；阳性对照药：雷洛昔芬（江苏恒瑞医药股份有限公司）。实验动物：健康Wistar雌性未交配三月龄大鼠(SPF级),体重220±20g,购自吉林大学基础医学院实验动物中心。

1.2仪器：BR4i型冷冻离心机，法国Jouan公司；680型酶标仪,美国BIORAD公司；TGL-16G型台式离心机，上海安亭科学仪器有限公司；梅特勒-托利电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；BH-2型显微镜，OLYMPUS公司；GK99-UNIGAMMAX-RAYPLUS双能X射线骨密度仪，意大利l¹acn公司；722S型分光光度计,上海精密仪器有限公司。

1.3试剂：TNF-α(Tumornecrosisfactor-α)ELISA检测试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)、血清钙、血清磷、血清总胆固醇等测定试剂盒均购于北京鼎国生物技术有限责任公司

2方法：2.1动物模型制备及处理：2.1.1动物饲养：大鼠在清洁级环境中喂养,室温保持22±2℃,对室内定期进行紫外线消毒,每日中午明暗交替。大鼠自由饮水及摄食。2.1.2动物模型制备：全部动物适应性喂养14d后,将动物随机分为假手术组(SHAM,n=9)和去卵巢手术组(n=72)。经腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(30mg/kgbw)麻醉后,将大鼠仰卧固定,于腹中线两侧1~2cm、距阴道口3~4cm处去毛。使用75%酒精进行消毒,待稍干后做纵形切口,长约1~2cm,切开皮肤和腹肌。打开腹腔,拨开白色脂肪层找到子宫角。沿子宫角方向向上将其尽头处的组织轻轻拉出。分离脂肪,可找到被脂肪包裹的呈粉红色带有桑葚状花纹的卵巢组织。用止血钳夹在卵巢与子宫角末端位置,使用手术线结扎后,将卵巢组织及其连带的脂肪全部切除。松开止血钳,然后将剩余子宫角送回腹腔。将腹肌和皮肤分层进行缝合后,伤口处洒适量青霉素钠溶液进行消毒。同法剪除另一侧卵巢。SHAM组大鼠仅打开腹腔后摘除少量脂肪组织。术后大鼠腹腔注射青霉素2万单位,连续2天以预防感染。2.1.3动物分组及饲料配制：手术后第2周,将接受去卵巢手术的大鼠随机分为8组,并开始灌服样品,持续灌胃12周。其中,阳性对照组(RAL,n=9)灌胃3mg/kg的雷洛昔芬；提取方法Ⅰ低、高剂量组分别灌胃不同剂量提取物(剂量分别为1和2g/kg)。提取方法Ⅱ低、高剂量组分别灌胃(剂量分别为1和2mg/kg)。鹿骨胶原肽与活性钙复合低、高剂量组分别灌胃(剂量分别为0.6和1.2g/kg)。阴性对照组(OVX,n=9)和假手术组(SHAM,n=9)按照1ml/200g体重灌服生理盐水。实验期间动物自由饮用蒸馏水,动物基础饲料避免大豆异黄酮类植物性雌激素对结果的干扰。观察大鼠活动、饮食等一般状况,每周称量体重一次。

2.2标本采集及处理：2.2.1血清样本的收集与处理：大鼠饲喂12周,末次喂养后,各组禁食不禁水12h。将大鼠用乙醚麻醉后进行腹主动脉取血。血液室温静置30min后4℃离心15min,分离血清后贮存于-35℃,避免反复冻融。2.2.2股骨与胫骨的分离处理：顺着大鼠关节的走向小心将双侧股骨与胫骨取下,用剪刀及纱布剔净附着于骨上的肌肉与结缔组织。将右侧股骨样本用生理盐水浸泡过的纱布包裹使其保持湿润,置于4℃冰箱保存备用；左侧股骨样本置于-20℃冰箱保存；将右侧胫骨样本置于10%中性甲醛中固定48h备用；左侧胫骨样本快速清理后用锡纸包裹置于液氮中,然后保存于-80℃冰箱中备用。

2.3测定方法：2.3.1血液生化指标测定：血清样本解冻后涡旋震荡混匀。按照各试剂盒说明书检测血清样本中各基本指标含量,包括:Ca、P、ALP、ALT、AST、Cr、BUN、CHO、OC和TNF-α等。2.3.2大鼠股骨BMD的测定：将大鼠股骨样本取出,去除包裹样本所用纱布,将保持湿润的股骨样本放于测试台水膜之上,使用GK99-UNIGAMMAX-RAYPLUS双能X射线骨密度仪对样品进行扫描,扫描时切换到小动物模式。扫描结束后使用l’acn公司的配套软件对股骨样本的骨矿物质密度(Bonemineraldensity,BMD)进行分析。2.3.3股骨长度、直径、干重、灰重的测定：以游标卡尺测量股骨长度、股骨中段直径。将样品置于105℃烘箱干燥6h。记录股骨样品的干重。将干燥的样品进行灰化6h后,测定股骨灰重含量。2.3.4骨钙含量的测定：股骨钙含量的测定按照国标方法(GB/T5009.92-2003),采用高温灰化-原子吸收法,对股骨样品进行高温灰化后,使用火焰原子吸收法测定骨钙含量(曲剑英等,2002)。操作参数:混合消化液(硝酸:高氯酸混合比例为4:1)消化样品至无色透明;波长设定为422.7nm,光源为可见光,火焰为空气-乙炔;标准溶液系列浓度范围为0.25μg/ml～2μg/ml,稀释溶液20g/L氧化镧溶液。

2.4数据统计处理：所有数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS11.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA),同时进行LSD检验。以P<0.05为有显著性差异。

3结果与讨论：3.1对大鼠肝肾功能的影响：对各组大鼠肝肾功能指标进行检测(表1),OVX组CHO水平有显著上升(P<0.05),阳性对照组及受试物各剂量组均未能明显降低血清CHO含量。这可能是由于雌激素能够调节体内脂肪代谢,卵巢去除后雌激素分泌的减少导致其对脂肪代谢保护作用的减弱。ALT、AST、BUN、Cr等其余各项指标未见异常。大鼠连续灌胃12周后,各组的肝脏、肾脏系数并无显著性差异,在解剖过程中观察大鼠各个脏器未出现异常情况。这表明受试样品各剂量组均不会显著影响大鼠的肝肾功能,证明鹿骨提取物作为天然产物无明显的副作用,能够作为安全的天然营养添加剂长期服用。与骨转换(Boneturnover)有关的生化检测项目能够反映骨代谢的改变,因此对骨质疏松症以及其它代谢性骨病的诊断具有重要意义。与骨矿化有关的生化指标主要为血钙和血磷。钙是生物体内含量最多的阳离子,骨骼是生物体内最大的钙贮备库。磷在生物体内的含量仅次于钙,其中约70%～80%沉积于骨骼。如表2所示,对于血清磷,各测试组间无显著性差异(P>0.05)。对于血清钙,与SHAM组相比,各受试样品组均有提高血钙浓度的趋势,其中胶原肽与活性钙复合剂高剂量组作用显著(P<0.05),这可能是由于摄入高剂量钙会提高机体局部钙离子水平。血清中碱性磷酸酶(ALP)与肿瘤坏死因子(TNF)均是生化指标中的特异性标志物。ALP是一种磷酸单酯酶,在骨骼中由成骨细胞所分泌,能够反映成骨细胞的功能和活性。肿瘤坏死因子(TNF)具有刺激破骨细胞形成和促进骨吸收的作用,能够反映骨的吸收。如表2所示,与SHAM组相比,阴性对照组大鼠ALP(P<0.05)与TNF-α(P<0.01)指标均显著性提升,说明去卵巢后骨形成与骨吸收功能均增强,骨代谢处于高转换的状态,这表明去卵巢手术能够诱导高骨转换型骨质疏松症的形成。阳性对照组能够显著抑制去卵巢所诱导的骨转化指标的增高(P<0.05forALP;P<0.01forTNF-α)。对于ALP,各给药组有降低ALP活性的趋势,其中胶原肽与活性钙复合剂高具有明显的抑制作用(P<0.05)。TNF-α促进破骨细胞的增殖与活性,骨吸收的加快增速了骨组织钙质的流失,可见钙的流失在骨质疏松症发病过程中有重要的作用。对于TNF-α，除提取物低低剂量组外,其余受试样品各剂量组都表现出了明显的降低作用(P<0.01orP<0.05)。绝经后骨质疏松症属于高转换型骨质疏松症,从细胞学水平上来说是骨重建的过程中骨形成与骨吸收存在了一定的时间差,骨吸收速率大于骨形成速率,导致骨重建过程越快,骨量丢失越多。根据受试样品对TNF-α的抑制作用,可以推测上述受试样品有助于降低去卵巢所导致的高骨转换状态,相应减缓骨吸收的速度,使大鼠的骨重建水平向正平衡状态恢复,从而降低骨量的丢失。OC是骨中含量最高的非胶原蛋白,血清中OC的半衰期约为5min。OC主要是由骨和牙齿中的成熟成骨细胞合成,大部分沉积在骨基质中,小部分进入血液循环。血液中的OC是由成骨细胞合成后分泌入血的,而非骨基质吸收时释放入血中,因此血液中OC的浓度可以反映成骨细胞的活性。检测血清中OC的含量不仅能够反映骨形成的情况与成骨细胞的活性,而且对观察药物治疗前后的动态变化具有一定的参考价值。如表2所示,OC结果检测表明各组之间无显著性差异(P>0.05)。可能是由于本次实验是在连续灌胃12周后取血检测,此时OC值可能已经回落,因此对OC的检测可能需在去卵巢手术结束后短期内进行。

目前骨质疏松非损伤性诊断的主要定量指标是骨矿物质含量(bonemineralcontent,BMC)和骨密度(bonemineraldensity,BMD)。BMC主要是指在一特定骨骼部位中所含有的矿物质量,但由于骨骼大小差异波动大。为减少因骨骼大小所引起的个体差异,BMD被用于骨质疏松的诊断标准。BMD即平均每平方厘米的骨矿物质含量。由于骨质疏松症在发病早期无明显症状不易被发现,因此对BMD的测定是一种有效的筛选手段。如表3所示,相较于阴性对照组,阳性对照组及肽钙复剂高剂量组大鼠的股骨BMD得到明显的恢复(P<0.05),其余各组股骨BMD值虽然没有达到假手术组的水平,但均有提高的趋势。在骨干部位,只有复剂高剂量组显著高于阴性对照组(P<0.05),其余各给药组同阴性对照组相比，均无统计学差异。在骨骺端,活性钙复合剂低、高剂量组的骨骺BMD值均明显高于阴性对照组(P<0.05),其余样品组的骨骺端BMD值亦有提高的趋势。这显示受试样品对骨BMD的改善主要作用于松质骨部位。联合骨代谢生化指标的检测结果,说明胶原肽与活性钙复合剂能够有效的削弱卵巢摘除所引起的松质骨的骨转换加快以及相应导致的骨量减少，效果明显优于其他两种受试样品。

大鼠股骨物理指标及骨钙含量如表4所示,结果表明与假手术组相比，所有去卵巢组大鼠股骨横径都不具有明显差别(P>0.05)；与阴性对照组相比,提取物高剂量组与复剂的高剂量组则对股骨长度有显著的促进作用(P<0.05)。与假手术组相比,阴性对照组大鼠股骨干重并无显著性差别(P>0.05),但其灰重与骨钙含量较假手术组明显降低(P<0.05forAsh;P<0.01forCa),显示去卵巢引起大鼠骨骼无机矿物质含量降低。与阴性对照组相比,阳性对照组骨钙含量得到明显增加；提取物各剂量组具有提高骨钙含量的趋势,但是作用的效果并不显著(P>0.05),与提取物的检测结果变化相似。CCM高剂量组与复剂低剂量组可以显著提升股骨灰重含量(P<0.05)，复剂高剂量组可以极显著提升股骨灰重含量(P<0.01)；CCM高剂量组与复剂低剂量组可以显著增加股骨钙含量(P<0.05)，复剂高剂量组可以极显著增加股骨钙含量(P<0.01)，与BMD变化趋势一致,这说明BMD是反映骨矿物质含量的有效指标。

本实验采用去卵巢大鼠模型,通过对比研究鹿骨不同提取方式得到产物对绝经后骨质疏松症的预防作用。发现，各组大鼠的肝脏、肾脏指数与普通生化指标检测未见异常；说上述鹿骨提取加工方式具有较好的安全性。复剂高剂量组能够明显的降低血清ALP含量(P<0.05)；提取物高剂量组、提取物低、高剂量与复剂低、高剂量均显著下调了TNF-α水平(P<0.05)。与阴性对照组相比,复剂低、高剂量组的骨骺端BMD值均显著高于阴性对照组(分别为P<0.05和P<0.01)。结合骨代谢生化指标的检测结果,说明肽钙复剂能够显著削弱卵巢摘除所引起的松质骨的骨转换加快以及相应导致的骨量减少。复剂高剂量组可以显著提升股骨灰重含量,提取物高剂量组(P<0.05)与复剂的低剂量(P<0.05)和高剂量(P<0.01)都能显著增加股骨的钙含量，表明，该发明所得肽钙复剂预防骨质疏松效果明显优于现阶段其他工艺所得鹿骨提取物。

附图说明图1是该项专利的技术流程图。

Claims (4)

1.从鹿骨中提取鹿骨胶原肽鹿骨活性钙复剂，其特征在于本发明中产品方法是通过一种复合酶酶解与乳酸菌发酵联用的技术获得的。

2.根据权利要求1所述的一种从鹿骨中提取鹿骨胶原肽鹿骨活性钙复剂技术，其特征在于通过以下制备方法：包括鹿骨去骨髓、烘干，粉碎，胃蛋白酶酶解，木瓜蛋白酶酶解，除盐及杂蛋白，冻干，乳酸菌发酵，浓缩，减压干燥等一系列步骤。

3.根据权利要求2所述的制备方法，具体实施过程为鹿骨前处理：取梅花鹿骨或马鹿骨，除去骨髓，50-80℃烘干,粉碎过60-100目筛，备用；鹿骨胶原多肽的提取：取步骤中的鹿骨粉，加入8-10倍量0.1-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，加入1%-5%胃蛋白酶，在PH2-5的条件下37-45℃酶解5-10小时，4000-6000转/分钟离心，上清液备用，残渣加入1%-5%木瓜蛋白酶，在PH6-8的条件下45-60℃继续酶解5-10小时，4000-6000转/分钟离心，将两次酶解上清液合并，通过纳米滤膜（500-1000KD），收集被截留的多肽，冷冻干燥，即为鹿骨多肽；鹿骨活性钙的提取：取酶解后的残渣,接入3%-6%乳酸菌、3-10%碳源及5%-20%天然西红柿培养基发酵20-40小时，加入8-12倍量蒸馏水，组织破碎，4000-6000转/分钟离心，取上清，减压浓缩干燥，即得鹿骨活性钙；将步骤、中获得的产品混合均匀即得本发明产品。

4.根据权利要求3所述的制备方法，鹿骨前处理过程中，涉及到的烘干设备有烘箱或与之功能相同或相似的设备，粉碎设备有粉碎机及与之功能相同或相似的设备；鹿骨胶原多肽的提取过程中，涉及到的设备主要有离心装置，酶解反应装置，超滤装置，冷冻干燥装置，上述设备可以是定制设备也可以是购买的成套设备；鹿骨活性钙的提取过程中，涉及到的设备主要有发酵装置，组织破碎装置，离心装置，减压浓缩干燥装置，上述设备可以是定制设备也可以是成套购买设备。