CN106755242A - 一种魔芋蛋白ace抑制肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，将魔芋蛋白溶液的pH值调节为6‑9，加入胶原蛋白酶进行酶解，在30℃‑45℃下进行酶解，得到酶解液；将酶解液进行灭酶，然后调节pH值至魔芋蛋白等电点，然后进行离心，收集上清液；将离心后收集的上清液进行冷冻干燥，得到ACE抑制肽粗品；将ACE抑制肽粗品经过凝胶层析分离，得到魔芋蛋白ACE抑制肽。本发明采用胶原蛋白酶解制备ACE抑制肽，本发明不仅拓宽了魔芋研究的范围，而且也开辟了ACE抑制肽的新蛋白来源，缩减了成本，工艺简单，可进行产业化生产。

Description

一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法
技术领域
本发明属于生物活性肽制备技术领域，尤其涉及一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法。
背景技术
随着社会的进步与发展，人们生活水平逐渐提高，饮食中脂肪与热量的比重逐渐加大，再加上人们的生活习惯等因素，我国心血管疾病的发病率快速上升，其中高血压占主要地位，我国的高血压人群数量呈现逐年增加趋势，高血压人群需要长期服用降血压药物，这可能会导致出现咳嗽、肾功能减退、蛋白尿、肝功能异常、血管神经性水肿等不良反应。因此天然、有效、无副作用、可长期服用的ACE抑制肽成为高血压药物方面研究的热点。
ACE抑制肽(Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition简称ACEI)是指血管紧张素转化酶抑制剂，也称为降血压肽。ACEI对ACE活性区域结合能力较强，共同特点是与ACE活性部位的锌离子结合的能力比Ang I或缓激肽更强，而且结合上之后不易从ACE结合区释放，从而阻碍ACE催化Ang I水解成AngⅡ以及催化舒缓激肽水解成为失活片段两个过程，起到降血压的作用。ACE抑制肽的制备方法主要有4种：酶解法、微生物发酵法、化学合成法和基因工程法，现在最常用的是酶解法。
目前来说，ACE抑制肽对降血压具有较好作用。化学降血压药物副作用大，所以，因此天然、有效、无副作用、可长期服用的ACE抑制肽成为高血压药物方面研究的热点，所以急需开拓ACE抑制肽的原料和制备方法。
发明内容
为实现上述目的，本发明的目的在于提供一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，在制备过程中不加其他蛋白酶，开辟了ACE抑制肽的新蛋白来源。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤A:将魔芋蛋白溶液的pH值调节为6-9，加入胶原蛋白酶进行酶解，在30℃-45℃下进行酶解，得到酶解液；
步骤B:将酶解液进行灭酶，然后调节pH值至魔芋蛋白等电点，然后进行离心，收集上清液；
步骤C:将离心后收集的上清液进行冷冻干燥，得到ACE抑制肽粗品；
步骤D:将ACE抑制肽粗品经过凝胶层析分离，得到魔芋蛋白ACE抑制肽。
本发明进一步的改进在于，魔芋蛋白溶液通过以下过程制备：将魔芋蛋白加入纯净水中，配成质量浓度1-5％的魔芋蛋白溶液。
本发明进一步的改进在于，酶解的时间为3-6h。
本发明进一步的改进在于，每克魔芋蛋白溶液中加入胶原蛋白酶的量为3000-10000U。
本发明进一步的改进在于，灭酶的温度是60-100℃，时间为10-30min。
本发明进一步的改进在于，离心是在8000-10000rpm下进行的，离心的时间为10-20min。
本发明进一步的改进在于，冷冻干燥的温度为-50～-110℃，冷冻干燥的时间为10-24h。
本发明进一步的改进在于，采用Sephadex G-15凝胶层析分离。与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
本发明ACE抑制肽主要是以魔芋蛋白质为原料，通过加入胶原蛋白酶进行酶解后灭酶，纯化，得到ACE抑制肽，由于ACE抑制肽一般以无活性的形式存在于蛋白质序列中，所以本发明通过对蛋白质加热、酸碱的降解、酶制剂水解或微生物的发酵等，使无活性的蛋白质中可以释放出具有降压作用的ACE抑制肽，且本发明的ACE抑制肽的抑制活性为10％-40％。本发明采用胶原蛋白酶解制备ACE抑制肽，本发明不仅拓宽了魔芋研究的范围，而且也开辟了ACE抑制肽的新蛋白来源，缩减了成本，工艺简单，可进行产业化生产，该魔芋ACE抑制肽来源于天然植物蛋白，分子量小，稳定、安全、人体易吸收。
具体实施方式
一种魔芋ACE抑制肽的制备方法，包括以下几个步骤：
步骤A:将魔芋蛋白加入纯净水中，配成一定浓度魔芋蛋白溶液，调节pH值，加入胶原蛋白酶，恒温磁力搅拌器上进行酶解，酶解期间保持温度和pH值恒定；
步骤B:灭酶，待酶解液温度降至室温，调节酶解液pH值至魔芋蛋白等电点；然后进行离心；
步骤C:将离心后收集的上清液进行冷冻干燥，得到冻干粉，配成一定浓度溶液，测其ACE抑制率。
优选出，步骤A中酶解条件为魔芋蛋白质浓度为1-5％，胶原蛋白酶进行酶解解反应3-6h，酶与魔芋蛋白的比为3000-10000U：1g，调整魔芋蛋白溶的温度30℃-45℃和pH值6-9；
优选出，步骤B中灭酶条件为60-100℃水浴中保持10-30min，离心速度为8000-10000rpm，离心10-20min；
优选出，步骤C中冷冻干燥温度为-50～-110℃以下，冷冻干燥10-24h，得到冻干粉。
测定ACE的抑制率：
利用Cushman检测法进行检测:取75uL、HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)与25uL、ACE抑制剂(多肽液)充分混匀。在37℃水浴锅中温育5min,加入25uL、25mu/mL ACE硼酸盐溶液，在37℃水浴锅中反应40min。结束后加入200uL、1.0moL/L盐酸溶液破坏反应环境，终止反应进程。然后于各试管中加入乙酸乙酯1.7mL，混合后离心4000r/min离心10min；吸取1.2mL乙酸乙酯层于另一试管中，放入100℃烘箱中，挥发溶剂40min。拿出冷却后加入去离子水3mL，混匀后在波长228nm下测定其吸光度，计算公式为：
式中：A1—ACE抑制肽和ACE都存在溶液的吸光度值
A2—不加ACE抑制肽存在溶液的吸光度值
A3—ACE与HHL存在空白溶液的吸光度值
魔芋蛋白ACE抑制肽活性检测：采用紫外分光光度法进行检测。
配制反应液与空白液，两者其他条件均相同，给反应液中加入魔芋ACE抑制肽。以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制马尿酸标准品曲线方程。得出空白液及反应液中马尿酸含量，计算得出魔芋蛋白ACE抑制肽的抑制活性。
实施例1
(1)将魔芋蛋白冻干粉溶解于纯净水中，配制质量浓度1％的蛋白溶液；
(2)将蛋白液置于恒温磁力搅拌器上加热；调节pH值至6，加入胶原蛋白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器上进行酶解反应，酶解反应时间为3h，酶解反应温度为30℃，得到酶解液；其中，每克魔芋蛋白溶液中加入胶原蛋白酶的量为3000U。
(3)将酶解液置于90℃恒温水浴锅中灭酶10min，待酶解液温度降至室温，调节pH值至魔芋蛋白等电点；
(4)8000r/min离心20min，收集上清液。
(5)将离心后收集的上清液在-50℃以下，冷冻干燥24h，得到魔芋蛋白ACE抑制肽粗品，将其配成溶液，测其ACE抑制率>20％。
(6)魔芋蛋白ACE抑制肽粗品经过SephadexG-15凝胶层析分离后，得到ACE抑制肽，测得ACE抑制肽的抑制活性为15.7％。
实施例2
(1)将魔芋蛋白冻干粉溶解于纯净水中，配制质量浓度2％的蛋白溶液；
(2)将蛋白液置于恒温磁力搅拌器上加热；调节pH值至7.5，加入胶原蛋白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器上进行酶解反应，酶解反应时间为3h，酶解反应温度为37℃，得到酶解液；其中，每克魔芋蛋白溶液中加入胶原蛋白酶的量为5000U。
(3)将酶解液置于97℃恒温水浴锅中灭酶10min，待酶解液温度降至室温，调节pH值至魔芋蛋白等电点；
(4)10000r/min离心10min，收集上清液。
(5)将离心后收集的上清液在-80℃以下，冷冻干燥12h，得到魔芋蛋白ACE抑制肽粗品，将其配成溶液，测其ACE抑制率>30％。
(6)魔芋蛋白ACE抑制肽粗品经过SephadexG-15凝胶层析分离后，得到ACE抑制肽，测得ACE抑制肽的抑制活性为19.5％。
实施例3
(1)将魔芋蛋白冻干粉溶解于纯净水中，配制质量浓度3％的蛋白溶液；
(2)将蛋白液置于恒温磁力搅拌器上加热；调节pH值至8.0，加入胶原蛋白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器上进行酶解反应，酶解反应时间为5h，酶解反应温度为35℃，得到酶解液；其中，每克魔芋蛋白溶液中加入胶原蛋白酶的量为8000U。
(3)将酶解液置于60℃恒温水浴锅中灭酶30min，待酶解液温度降至室温，调节pH值至魔芋蛋白等电点；
(4)8500r/min离心20min，收集上清液。
(5)将离心后收集的上清液在-110℃以下，冷冻干燥10h，得到魔芋蛋白ACE抑制肽粗品，将其配成溶液，测其ACE抑制率>40％。
(6)魔芋蛋白ACE抑制肽粗品经过SephadexG-15凝胶层析分离后，得到ACE抑制肽，测得ACE抑制肽的抑制活性为24.5％。
实施例4
(1)将魔芋蛋白干粉溶解于纯净水中，配制质量浓度4％的蛋白溶液；
(2)将蛋白液置于恒温磁力搅拌器上加热；调节pH值至7.0，加入胶原蛋白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器上进行酶解反应，酶解反应时间为4h，酶解反应温度为40℃，得到酶解液；其中，每克魔芋蛋白溶液中加入胶原蛋白酶的量为10000U。
(3)将酶解液置于80℃恒温水浴锅中灭酶15min，待酶解液温度降至室温，调节pH值至魔芋蛋白等电点；
(4)9000r/min离心20min，收集上清液。
(5)将离心后收集的上清液在-80℃以下，冷冻干燥12h，得到魔芋蛋白ACE抑制肽粗品，将其配成溶液，测其ACE抑制率>20％。
(6)魔芋蛋白ACE抑制肽粗品经过SephadexG-15凝胶层析分离后，得到ACE抑制肽，测得ACE抑制肽的抑制活性为16.2％。
实施例5
(1)将魔芋蛋白干粉溶解于纯净水中，配制质量浓度5％的蛋白溶液；
(2)将蛋白液置于恒温磁力搅拌器上加热；调节pH值至9.0，加入胶原蛋白酶混合均匀，在恒温磁力搅拌器上进行酶解反应，酶解反应时间为6h，酶解反应温度为45℃，得到酶解液；其中，每克魔芋蛋白溶液中加入胶原蛋白酶的量为10000U。
(3)将酶解液置于70℃恒温水浴锅中灭酶20min，待酶解液温度降至室温，调节pH值至魔芋蛋白等电点；
(4)9500r/min离心20min，收集上清液。
(5)将离心后收集的上清液在-50℃以下，冷冻干燥24h，得到魔芋蛋白ACE抑制肽粗品，将其配成溶液，测其ACE抑制率>40％。
(6)魔芋蛋白ACE抑制肽粗品经过SephadexG-15凝胶层析分离后，得到ACE抑制肽测得ACE抑制肽的抑制活性为25.0％。

Claims (8)

1.一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A:将魔芋蛋白溶液的pH值调节为6-9，加入胶原蛋白酶进行酶解，在30℃-45℃下进行酶解，得到酶解液；
步骤B:将酶解液进行灭酶，然后调节pH值至魔芋蛋白等电点，然后进行离心，收集上清液；
步骤C:将离心后收集的上清液进行冷冻干燥，得到冻干粉，得到ACE抑制肽粗品；
步骤D:将ACE抑制肽粗品经过凝胶层析分离，得到魔芋蛋白ACE抑制肽。
2.根据权利要求1所述的一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，魔芋蛋白溶液通过以下过程制备：将魔芋蛋白加入纯净水中，配成质量浓度1-5％的魔芋蛋白溶液。
3.根据权利要求1所述的一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，酶解的时间为3-6h。
4.根据权利要求1所述的一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，每克魔芋蛋白溶液中加入胶原蛋白酶的量为3000-10000U。
5.根据权利要求1所述的一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，灭酶的温度是60-100℃，时间为10-30min。
6.根据权利要求1所述的一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，离心是在8000-10000rpm下进行的，离心的时间为10-20min。
7.根据权利要求1所述的一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，冷冻干燥的温度为-50～-110℃，冷冻干燥的时间为10-24h。
8.根据权利要求1所述的一种魔芋蛋白ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，采用Sephadex G-15凝胶层析分离。
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车云波: "《功能食品加工技术》", 31 January 2013, 中国质检出版社 *

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