CN115363167B - 一种利用內源酶催化和高温热处理转化槲皮素制备槐米粉的方法 - Google Patents
一种利用內源酶催化和高温热处理转化槲皮素制备槐米粉的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用內源酶催化和高温热处理转化槲皮素制备槐米粉的方法，属于医药、保健品和食品加工领域。本发明的利用內源酶催化和高温热处理转化槲皮素制备槐米粉的方法，所述方法是将槐米与水混合进行匀浆处理，之后立即在40～50℃保温处理40‑60min；然后再在150～200℃条件下进行高温热处理；干热处理后将其研磨成粉末，过筛，即得。该方法制备的槐米粉槲皮素得率高，工艺简单，具有良好的降血糖性能，可广泛应用于功能性食品、药品和保健品领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用內源酶催化和高温热处理转化槲皮素制备槐米粉的方法，属于医药、保健品和食品加工领域。
背景技术
槐米是豆科植物槐干燥的花蕾，是一种常见的药食同源原料。槐米含有芦丁、槲皮素、槐二醇等多种化学成分成分，具有抗自由基及抗氧化、降血糖等多种活性。槐米中芦丁含量可达20％以上，是我国医药工业提取芦丁的主要原料。槐米的来源丰富，槐米芦丁的提取纯化工艺成熟，且未见不良反应，有广阔的开发前景。芦丁是一种天然抗氧化剂，具有降低毛细血管通透性、抗氧化、抗炎、抗病毒及抑制α-葡萄糖苷酶的作用。而槐米的另一主要成分而槲皮素的生理活性远高于芦丁，具有抗氧化、降血糖等性质，因此它们在药物制剂中，常被用作食品添加剂或辅助药物给药。从化学结构上看，芦丁(Rutin)的苷元是槲皮素(Quercetin)，槲皮素第3碳上连接一个芸香糖，就是芦丁。
II型糖尿病近年来已成为威胁人类生命健康的第三大疾病，往往伴随着多种并发症，如糖尿病肾病、糖尿病心脏病等，给患者带来身心痛苦与经济负担。因此，研究降血糖的药物及功能性食品具有巨大意义。大量研究显示，槲皮素具有抗氧化、降血糖等多种生物活性，并可能在预防和治疗糖尿病中发挥作用。有实验表明，补充槲皮素有利于降低糖尿病大鼠的血糖浓度，促进胰岛β细胞的恢复并增加胰岛素的释放。进一步的研究显示，槲皮素具有胰岛素增敏作用，长期低剂量的膳食补充能够减轻糖尿病小鼠的胰岛素抵抗。研究显示，槲皮素可以通过抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶来增强db/db小鼠的胰岛素敏感性和胰岛素信号传导，从而改善空腹高血糖。
槲皮素在自然界植物中的分布也很广泛，但是含量却很低。槲皮素在植物中的含量也只有千分之几到万分之几，很难提取。以往槲皮素都是从天然植物中分离提取，如“从生物类黄酮中回收异槲皮素”(CN1355797A)等方法，这些方法大多采用大量的有机溶剂，并且产率低，成本高，很难实现产业化生产，因此限制了槲皮素的生产和应用。
中国发明专利CN104592186A公开了槐米一锅煮法制备槲皮素新技术，其将槐米粉碎至0.5-1mm，多功能提取罐中利用90％乙醇和70-95的甲醇回流提取槲皮素。该发明专利的回流提取法，时间长，并且其工艺非常繁琐，最终得到单一的槲皮素产物纯度不高。
中国发明专利CN1483825A公开了一种酶法水解芦丁制备异槲皮素和榔皮素的方法，其利用能水解芦丁的鼠李糖或葡萄糖基的酶，水解芦丁糖基，制备异槲皮素和槲皮素，用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。所用的微生物为细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌。所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。首先加碱沉淀酶蛋白并过滤除去酶蛋白，在滤液中加入酸沉淀析出沉淀物，并用蒸馏水将沉淀物充分洗至中性，减压干燥，得槲皮素单体，但槲皮素的微生物发酵法，时间长，并且其工艺非常繁琐。
中国发明专利CN102952108A公开了一种利用槐米制备槲皮素和鼠李糖的方法，其利用饱和澄清的石灰水提取芦丁，水解芦丁制备槲皮素和鼠李糖，将芦丁水解液发酵制取鼠李糖粗品，利用甲醇分离粗品中的葡萄糖制取鼠李糖精品；该方法制备槲皮素采用的酸水解法，时间长，有污染，并且其产率不高。
中国发明专利CN105534897A公开了一种高水溶性槲素微乳液的制备方法，以槐米为原料，制得槐米颗粒，与石灰乳等混合加热煮沸后过滤得滤液，调节pH静置处理收集沉淀物，干燥后与盐酸混合制得槲皮素浆液，加入氯化钠溶液混合静置沉淀，过滤得滤饼，对其进行改性，然后与制得的空白微乳液混合超声振荡制得高水溶性槲皮素微乳液。上述制备槲皮素的酸水解法，时间长，并且其产率不高。
中国发明专利CN108003126A公开了一种蒸汽爆破处理槐米制备槲皮素的方法，其将槐米进行蒸汽爆破处理，在蒸汽爆破过程中控制压力在0.2-3.0MPa并维持此过程0.5-4.0min，然后瞬间爆破得到经过爆破处理的槐米碎粒，在此高温高压条件下槐米中的芦丁被转化成其苷元槲皮素。将蒸汽爆破处理后的槐米为原料经过有机溶剂提取，重结晶，可以得到纯度很高的槲皮素。本发明所涉及的槲皮素的制备工艺得率高、纯度好、能耗低、无酸碱、废水排放少、环境友好，适合工业化生产。但蒸汽爆破需要能耗高，并且其产率不高。
针对现有技术槐米中槲皮素提取过程的复杂性以及容易造成的环境污染等问题，急需开发一种槲皮素转化效率高、工艺简单、无污染的槐米处理方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足与缺陷，本发明建立一种高效转化槐米中的芦丁为槲皮素的方法，将槐米经过匀浆处理使得槐米细胞的内源芦丁降解酶与芦丁充分接触，再经过水热最适温度处理，使酶活反应最大限度的完成，再经过干热处理使剩下的芦丁继续转化为槲皮素，获得高槲皮素得率的槐米粉；槐米粉中槲皮素的得率明显高于超声法、浸渍法；与普通槐米相比，槲皮素的含量提高了10倍左右；并且该槐米粉产品具有良好的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性效果良好，可广泛应用于降糖药物和功能性食品的制备。本发明的方法制备的槐米功能产品槲皮素得率高，工艺简单，具有良好的降血糖能力的特点。
本发明的第一个目的是提供一种利用內源酶转化槲皮素制备槐米粉的方法，所述方法包括如下：
将槐米与水混合进行匀浆处理，之后立即在40～60℃水浴条件下处理40-60min；取出沥干，然后在150～200℃条件下进行干热处理；干热处理后将其研磨成粉末，过筛，即得。
在一种实施方式中，所述匀浆处理的条件为：转速10000～20000r/min，时间30～180s。
在一种实施方式中，所述槐米和水混合是按照1:1～3g/ml的比例混合。
在一种实施方式中，所述水热处理是在50℃水浴条件下，处理40min。
在一种实施方式中，所述匀浆处理的条件为：转速15000r/min，时间180s。
在一种实施方式中，所述干热处理的时间为40～80min。
在一种实施方式中，所述匀浆处理的条件为：转速15000r/min，时间180s；水热处理是在50℃水浴条件下，处理40min；干热处理是在180℃条件下处理60min。
在一种实施方式中，所述研磨条件为：转速5000～8000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃。
本发明的第二个目的是提供一种由上述所述的方法制备得到的槐米粉。
本发明的第三个目的是提供一种由上述所述槐米粉在制备功能性食品、药品和保健品中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用自然界槐米植物中广泛且大量存在的芦丁，通过匀浆-水热处理使得槐米细胞的内源芦丁降解酶与芦丁充分接触，促使芦丁的降解转化，同时在结合高温干热处理，最终获得高槲皮素得率的槐米粉；槐米粉中槲皮素产物得率高达99％，可以满足食品和临床的应用；该方法操作简单安全，整个过程经济实用，产出量大，相比现有的爆破法、闪提、酸水解、微生物发酵等方式，工艺简单，能耗低，产量大，适合工业化生产，实现了槐米的高效绿色利用。
(2)本发明槐米的制备方法可以根据实际生产的需要选择不同匀浆时间得到不同得率的槲皮素：高槲皮素得率的槐米粉可制备降血糖药物，应用于医药等领域；低槲皮素得率的槐米粉可制备功能性食品，应用于食品、保健品领域。
(3)本发明制备的槐米粉产品具有良好的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性效果良好，能够有效起到降血糖的作用。
附图说明
图1为本发明匀浆辅助热处理过程中槐米中槲皮素得率变化图(A：不同匀浆时间30s、90s、180s；B：不同匀浆转速10000、15000、20000r/min)；
图2为本发明匀浆辅助热处理过程中槐米中內源酶酶活变化图(A：不同匀浆时间30s、90s、180s；B：不同匀浆转速10000、15000、20000r/min)；
图3为本发明匀浆辅助热处理过程中槐米中α-葡萄糖苷酶抑制率变化图(A：不同匀浆时间30s、90s、180s；B：不同匀浆转速10000、15000、20000r/min)；
图4为本发明匀浆辅助热处理过程中槐米中α-淀粉酶抑制率变化图(A：不同匀浆时间30s、90s、180s；B：不同匀浆转速10000、15000、20000r/min)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不限于这些实例。
1、槐米粉末中槲皮素的提取方法
准确称取0.25g槐米粉末，置于50mL烧杯中，用15mL 70％乙醇(v/v)边搅拌边提取40min，然后将提取液转移到50mL的容量瓶中，用上述方法将残渣重复提取三次，最后用70％乙醇(v/v)将提取液定容至50mL，得到槐米槲皮素提取液。
槐米粉末中槲皮素含量的测定方法
精密称取5mg槲皮素，定容至10mL，即得槲皮素浓度0.5mg/mL的混合标准品溶液。取0.2、0.4、0.6、0.8、1mL的母液，并定容至10mL，过0.45μm有机滤膜后，得到5个不同浓度的混合标准品。以质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，建立标准曲线。同时，将槲皮素提取液，稀释10倍后，过0.22μm有机滤膜后进行测定。HPLC条件：采用C18反相柱，流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液，流速为0.6mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL，在波长360nm处进行检测。
2、槲皮素得率计算公式
槲皮素得率(％)＝m4-m3/m1-m2×100，m1是新鲜的槐米中芦丁含量；m2是处理后的槐米中芦丁含量；m3新鲜的槐米中槲皮素含量；m4是处理后的槐米中槲皮素含量。
3、内源酶活性测定方法
精确称取1.6g槐米，置于20mL 0.2mol/L乙酸缓冲液(pH 5.0)中，于4℃下静提过夜，以10 000r/min的速度冷冻离心15min，上清液即为待测酶液。
取10mL具塞试管，加入1.5mL酶反应底物(1mol/L芦丁的甲醇溶液：0.2mol/L乙酸缓冲液＝1：4，现配现用)与0.5mL待测酶液，分别在30，50，70及90℃下保温3min，立即加入8mL甲醇终止酶反应，用HPLC测定芦丁和槲皮素的含量。同时，阴性对照用0.2mol/L乙酸缓冲液代替待测酶液，阳性对照则在添加酶反应底物前用甲醇灭活待测酶液，然后加入酶反应底物保温。一个酶活力单位(U)为，在特定反应条件下，每分钟转化1μmol芦丁所需的酶量。
4、α-葡萄糖苷酶抑制率、α-淀粉酶抑制率测定方法
α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法：将0.2mL的10倍稀释后的槐米提取液与1mL的0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液于37℃水浴中混合反应10min，α-葡萄糖苷酶于25mmol/L的pH6.8的磷酸缓冲液中溶解备用；再加入5mmol/L的PNPG溶液(0.5mL)于37℃水浴中混合反应10min，后加入0.1mol/L的Na2CO3(1mL)溶液终止反应。紫外可见分光光度计测定在405nm处的吸光度。实验同时设空白组，对照组和样品空白组。
按下面公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率。
抑制率＝[(A样品-A样品空白)-(A对照-A空白)]/[A对照-A空白]
α-淀粉酶抑制率测定方法：将0.1mL的10倍稀释后的槐米提取液与2mL的1U/mL的α-淀粉酶溶液于37℃水浴中混合反应10min，α-淀粉酶于25mmol/L的pH 6.8的磷酸缓冲液中溶解制备。再加入质量浓度为1％的可溶性淀粉溶液(1mL)于37℃水浴中混合反应10min，后加入1mL的二硝基水杨酸溶液放入沸水中终止反应，持续5min，定容至10mL。当反应液冷却至室温后在540nm下测定其吸光度。
实验同时设空白组，对照组和样品空白组。
按下面公式计算α-淀粉酶抑制率。
抑制率＝[(A样品-A样品空白)-(A对照-A空白)]/[A对照-A空白]
实施例1
一种槐米粉的制备，具体制备方法包括如下：
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1进行匀浆处理，匀浆转速15000r/min，时间180s，匀浆处理后立即在50℃水热处理40min；取出沥干，然后在180℃进行干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在水热40min时，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为1.05U，见附图2；槐米槲皮素得率为63％；最终槐米粉中槲皮素得率99％，见附图1。
实施例2
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1进行匀浆处理，匀浆转速15000r/min，时间180s，匀浆处理后立即在50℃水热处理60min；取出沥干，然后在180℃进行干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在水热结束时，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为0.81U，见附图2；槐米槲皮素得率为79％；最终槐米粉中槲皮素得率91％，见附图1。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为83％、α-淀粉酶抑制率为85％，见附图3和附图4。
实施例3
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1进行匀浆处理，匀浆转速15000r/min，时间180s，匀浆处理后立即在50℃水热处理60min；取出沥干，然后在150℃进行干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在水热结束时，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为0.81U，见附图2；槐米槲皮素得率为79％，见附图1；最终槐米粉中槲皮素得率88％。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为81％、α-淀粉酶抑制率为83％，见附图3和附图4。
实施例4
不同匀浆时间处理制备槐米粉，具体包括如下步骤：
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1进行匀浆处理，匀浆转速15000r/min、时间分别设置为30、90s，之后立即放入50℃水热处理40min，取出沥干，然后在180℃干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
经测定，结果如附图1和2所示；在水热40min时，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性分别为0.85、0.91U，槐米中槲皮素得率分别为52％，55％；最终槐米粉中槲皮素得率分别为89％，91％。
实施例5
不同匀浆转速处理制备槐米粉，具体包括如下步骤：
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1进行匀浆处理，匀浆时间180s，转速分别10000r/min、20000r/min，立即50℃水热处理40min，取出沥干，然后在180℃干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
经测定，结果如附图1和2所示；在水热40min时，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性分别为0.83、0.95U，槐米中槲皮素得率分别为58％、60％；最终槐米粉中槲皮素得率分别为87％、90％。
不同匀浆条件下的槐米粉中槲皮素得率和降血糖活性性能测定，结果如表1所示：
表1不同匀浆条件处理下槐米粉中槲皮素得率和降血糖活性
对比例1
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1进行匀浆处理，匀浆转速15000r/min，时间180s，匀浆处理后立即在50℃水热处理20min；然后再在180℃进行干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在水热40min时，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为0.71U；见附图2；槐米槲皮素得率为35％；最终槐米粉中槲皮素得率65％。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为69％、α-淀粉酶抑制率为66％，见附图3和附图4。
对比例2
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1混合，并在50℃水热处理40min，然后进行180℃干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在水浴浸渍处理后，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为0.45U；槐米槲皮素得率为51％；最终槐米粉中槲皮素得率65％。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为66％、α-淀粉酶抑制率为77％。
对比例3
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1进行匀浆处理，匀浆转速15000r/min，时间180s，匀浆处理后在50℃水热处理40min，然后进行120℃干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在水浴浸渍处理后，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为1.05U，见附图2；槐米槲皮素得率为63％；最终槐米粉中槲皮素得率85％。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为77％、α-淀粉酶抑制率为81％。
对比例4
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1进行匀浆处理，匀浆转速15000r/min，时间180s，匀浆处理后在50℃水热处理40min，然后进行210℃干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在水浴浸渍处理后，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为1.05U，见附图2；槐米槲皮素得率为63％；最终槐米粉中槲皮素得率77％。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为73％、α-淀粉酶抑制率为77％。
对比例5
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1混合，并在超声功率200W条件下，超声10min，然后进行180℃干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在超声处理后，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为0.55U；槐米槲皮素得率为33％；最终槐米粉中槲皮素得率61％。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为75％、α-淀粉酶抑制率为85％。
对比例6
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1混合，并在超声功率300W条件下，超声10min，然后进行180℃干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在超声处理后，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为0.61U；槐米槲皮素得率为36％；最终槐米粉中槲皮素得率66％。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为66％、α-淀粉酶抑制率为78％。
对比例7
将新鲜的槐米与饮用水按照料液比1：1混合，并在超声功率300W条件下，超声10min，立即在50℃水热处理40min，然后进行180℃干热处理60min，之后再在转速5000rpm，工作10s，间隔时间为10s，温度控制在25℃条件下，研磨成粉末，过80目筛即得。
在超声处理后，称取部分槐米测定其内源芦丁降解酶的活性为0.77U；槐米槲皮素得率为36％；最终槐米粉中槲皮素得率77％。
对槐米粉末功能固体进行降血糖活性测试：α-葡萄糖苷酶抑制率为71％、α-淀粉酶抑制率为83％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种利用內源酶催化和高温热处理转化槲皮素制备槐米粉的方法，其特征在于，所述方法包括以下：
将槐米与水混合进行匀浆处理，之后立即在40~50℃保温处理40-60min；取出沥干，然后在150~200℃条件下进行高温热处理；处理后将其研磨成粉末，过筛，即得；所述匀浆处理的条件为：转速15000~20000r/min，时间30~180s；所述高温热处理的时间为40~80min。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述槐米和水混合是按照1:1~3 g/ml的比例混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保温处理是在50℃水浴条件下，处理40min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述匀浆处理的条件为：转速15000r/min，时间180s。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述匀浆处理的条件为：转速15000r/min，时间180s；保温处理是在50℃水浴条件下，处理40min；高温热处理是在180℃条件下处理60min。
6.由权利要求1~5任一项所述的方法制备得到的槐米粉。
7.由权利要求6所述的槐米粉在制备食品、药品和保健品中的应用。
8.包含权利要求6所述槐米粉的食品、药品和保健品。
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