CN114480139A - 一种芦丁降解酶高产菌的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于芦丁降解酶菌的筛选技术领域，具体公开一种芦丁降解酶高产菌的筛选方法，通过对槐米进行富集堆肥一个月，然后使用含有芦丁的PDA平板进行初筛，因为芦丁是黄色，因此含有芦丁的PDA平板是黄色的，如果菌株能分泌芦丁降解酶，菌株周边会形成无色透明圈，且透明圈直径越大，酶活力越高，该方法筛选工作量小，成功率高，且产酶活力高。
Description
技术领域
本发明属于芦丁降解酶菌的筛选技术领域，尤其涉及一种芦丁降解酶高产菌的筛选方法。
背景技术
槐米是我国典型的药食同源品种，为豆科植物槐的干燥花蕾（槐米）及花（槐花），主产于河南、山东、山西、陕西等地，随着现代科技的发展，已经证实槐米主要药效成分是黄酮类物质，其中芦丁含量最高。芦丁，其化学名称为：5，7，3'，4'-四羟基-3-芸香糖苷，分子式 C27H30O16，常以3个结合水形式存在。1842年由Weiss首次从芸香中分离得到的。
芦丁的生理活性已经被大家所熟知，随着大量研究的进行，发现芦丁的一些代谢产物如槲皮素表现出了比芦丁更优秀的生理活型。槲皮素和芦丁对比能更好的抑制脂质过氧化、活性氧（ROS）生成、维持体内红细胞吞噬功能和胆固醇含量正常。目前制备槲皮素的方法主要有芦丁酸水解法和利用芦丁降解酶进行生物酶解，目前芦丁降解菌的筛选一般是从发霉的种子中进行分离，纯化和鉴定。将发霉的种子用无菌水浸泡后，然后将浸泡后的无菌水梯度稀释后，涂布PDA平板，分离出的单菌落再进行固体发酵，检测芦丁降解酶酶活力，该方法具有一定的盲目性，且工作量大，难于筛选出高产菌株，制约了芦丁产业的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种芦丁降解酶高产菌的筛选方法，具有快速高效筛选产芦丁降解酶的菌株，该方法筛选工作量小，成功率高，且产酶活力高。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种芦丁降解酶高产菌的筛选方法，包括以下步骤：
（1）微生物富集培养：取刺槐树下的泥土，将粉碎后的干槐米、刺槐树下泥土：水以1:5:12的比例搅拌均匀，用圆盆堆积成直径80cm，高度40cm的圆锥型，上面覆盖一层棉布，放置在25℃的房间中30 d，期间不定期补灭菌后的蒸馏水，保持棉布湿润，参照根际土壤采样方法，设10个取样点，每个取样点取5g槐米泥，加入45 mL无菌水浸泡30min后离心取上清1 mL加入灭菌后的富集固体培养中放入30℃培养箱中培养10 d；具体取样点选取如下：1号取样点为圆锥顶部，11号为圆锥底圆圆心，2,3,4,5位圆锥1/2 高度圆周长上的的4个等分点，6位圆心，7，8,9,10取样点为2,3,4,5号点与11号点组成的圆锥的1/2高度圆周长的4个等分点；
（2）Rutin-PDA平板初筛：于无菌环境下取5 g富集固体培养基加入45 mL无菌水浸泡30min后用灭菌滤纸过滤，然后用无菌水梯度稀释，分别选取10-6、10-7和10-8梯度进行Rutin-PDA平板涂板，于30℃培养箱中培养5 d，以平板上形成的无菌透明圈以及圈内的黄色菌落为目标筛选出菌株即可。
进一步的，所述干槐米在使用时均需过20目筛。
进一步的，所述富集固体培养基配置方法：于三角瓶中加入20g粉碎后的干槐米，加入20 mL无机盐溶液即可，每升无机盐溶液含有4g（NH4）2SO4、0.5gNaCl、0.5gMgSO4 、CuSO40.0002g、FeSO4·7H2O 0.00002g、MnCl2·4H2O 0.00002g、Co（NO3）2·6H2O 0.00002g、NiSO4·6H2O 0.00002g、ZnSO4·7H2O 0.00002g，余量为水。
进一步的，所述步骤（2）中Rutin-PDA的配制：使用无机盐溶液配置含8 g/L的芦丁固体Rutin-PDA平板，8 g/L的芦丁固体Rutin-PDA的配置方法如下：可溶性淀粉6 g，葡萄糖糖20 g，酵母浸出物 2 g，蛋白胨 5 g、 KH2PO2g、 MgSO4 0.3 g、琼脂 20g 、芦丁8 g，用水稀释到1000 mL, 121℃ 30min灭菌后倒平板即可，芦丁和无机盐溶液中的组分需分开灭菌后再混合。
本发明具有的优点是：本发明提供的筛选方法，首先对槐米进行富集堆肥一个月，然后使用含有芦丁的PDA平板进行初筛，因为芦丁是黄色，因此含有芦丁的PDA平板是黄色的，如果菌株能分泌芦丁降解酶，菌株周边会形成无色透明圈，且透明圈直径越大，酶活力越高，利用这一特点对芦丁降解酶菌进行快速筛选，不仅快速，且筛选高效，筛选工作量小，成功率高，且产酶活力高。
附图说明
图1是本发明实施例的流程图。
图2是本发明中实施例的分析趋势图。
图3是本发明中取样点的位置图。
具体实施方式
实施例
如图所示，一种芦丁降解酶高产菌的筛选方法，包括以下步骤：
1.微生物富集培养
微生物富集培养：取刺槐树下的泥土，将粉碎后的干槐米、刺槐树下泥土：水以1:5:12的比例搅拌均匀，用圆盆堆积成直径80cm，高度40cm的圆锥型，上面覆盖一层棉布，放置在25℃的房间中30 d，期间不定期补灭菌后的蒸馏水，保持棉布湿润，参照根际土壤采样方法，设10个取样点，每个取样点取5g槐米泥，加入45 mL无菌水浸泡30min后离心取上清1mL加入灭菌后的富集固体培养中放入30℃培养箱中培养10 d；具体取样点选取如下：1号取样点为圆锥顶部，11号为圆锥底圆圆心，2,3,4,5位圆锥1/2 高度圆周长上的的4个等分点，6位圆心，7，8,9,10取样点为2,3,4,5号点与11号点组成的圆锥的1/2高度圆周长的4个等分点（见图3）。
其中，富集固体培养基配制如下：250 mL三角瓶中加入20g粉碎后的干槐米（过20目筛网），然后加入20 mL无机盐溶液，每升无机盐溶液含有4g（NH4）2SO4、0.5gNaCl、0.5gMgSO4 、CuSO4 0.0002g、FeSO4·7H2O 0.00002g、MnCl2·4H2O 0.00002g、Co（NO3）2·6H2O 0.00002g、NiSO4·6H2O 0.00002g、ZnSO4·7H2O 0.00002g，余量为水。
2. Rutin-PDA平板初筛
在无菌工作台中，取5 g富集固体培养基加入45 mL无菌水浸泡30min后用灭菌后的滤纸过滤，然后用无菌水进行梯度稀释，分别选取10-6、10-7和10-8梯度进行Rutin-PDA平板涂板，并在30℃培养箱中培养5 d。
Rutin-PDA的配置：使用上述无机盐溶液配置含8 g/L的芦丁固体Rutin-PDA平板，8 g/L的芦丁固体Rutin-PDA的配置方法如下：可溶性淀粉6 g，葡萄糖糖20 g，酵母浸出物2 g，蛋白胨 5 g、 KH2PO2g、 MgSO4 0.3 g、琼脂 20g 、芦丁8 g，用水稀释到1000 mL, 121℃ 30min灭菌后倒平板即可，为了防止离子之间反应，芦丁、CuSO4和其它离子(Fe, Ni,Zn, Co 和 Mn)分开灭菌后再混合。
培养5 d后，观察平板背面是否有无菌透明圈，并量取无菌透明圈的直径，共筛选出5株菌株，见表1。
3. 固体发酵复筛
固体复筛培养基：250 mL的三角瓶中加入18g干槐米（粉碎过20目），并加入粉碎过60目的玉米和豆粕各1g，加入20 mL无机盐溶液高压灭菌后分别接入初筛后的5株真菌，分别在培养的第1d、 3d和5 d测定样品中芦丁降解酶的酶活。芦丁降解酶酶活定义为在37℃下1 min芦丁降解酶分解芦丁生产1μg槲皮素定义为1 u，试验结果见表2。
4. 相关性分析
使用发酵5d的酶活分别与菌落直径、透明圈直径和r/R进行相关性分析，结果表明透明圈直径和发酵酶活力正相关，见表3。因此可使用透明圈直径作为筛选指标。
图2分析如下：将菌种固体发酵复筛测出的降解酶活力变化趋势分别与菌落直径R、透明圈直径r和r/R进行趋势对比分析，见图2。结果发现菌种的酶活变化趋势和透明圈直径r 变化一致。这也表示高产芦丁降解酶菌株的筛选可以使用透明圈的直径直接反映该菌株的产酶活力，不需要再进行复筛对比验证，提高了筛选效率。
Claims (4)
1.一种芦丁降解酶高产菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)微生物富集培养：取刺槐树下的泥土，将粉碎后的干槐米、刺槐树下泥土：水以1:5:12的比例搅拌均匀，用圆盆堆积成直径80cm，高度40cm的圆锥型，上面覆盖一层棉布，放置在25℃的房间中30 d，期间不定期补灭菌后的蒸馏水，保持棉布湿润，参照根际土壤采样方法，设10个取样点，每个取样点取5g槐米泥，加入45 mL无菌水浸泡30min后离心取上清1 mL加入灭菌后的富集固体培养中放入30℃培养箱中培养10 d；
（2）Rutin-PDA平板初筛：取5 g富集固体培养基加入45 mL无菌水浸泡30min后用灭菌滤纸过滤，然后用无菌水梯度稀释，分别选取10-6、10-7和10-8梯度进行Rutin-PDA平板涂板，于30℃培养箱中培养5 d，以平板上形成的无菌透明圈以及圈内的黄色菌落为目标筛选出菌株即可。
2.如权利要求1所述的芦丁降解酶高产菌的筛选方法，其特征在于：所述干槐米在使用时均需过20目筛。
3.如权利要求2所述的芦丁降解酶高产菌的筛选方法，其特征在于：所述富集固体培养基配置方法：于三角瓶中加入20g粉碎后的干槐米，加入20 mL无机盐溶液即可，每升无机盐溶液含有4g（NH4）2SO4、0.5gNaCl、0.5gMgSO4 、CuSO4 0.0002g、FeSO4·7H2O 0.00002g、MnCl2·4H2O 0.00002g、Co（NO3）2·6H2O 0.00002g、NiSO4·6H2O 0.00002g、ZnSO4·7H2O0.00002g，余量为水。
4.如权利要求3所述的芦丁降解酶高产菌的筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）中Rutin-PDA的配制为使用无机盐溶液配置含8 g/L的芦丁固体Rutin-PDA平板，8 g/L的芦丁固体Rutin-PDA的配置方法如下：可溶性淀粉6 g，葡萄糖糖20 g，酵母浸出物 2 g，蛋白胨5 g、 KH2PO2g、 MgSO4 0.3 g、琼脂 20g 、芦丁8 g，用水稀释到1000 mL, 121℃ 30min灭菌后倒平板即可，芦丁和无机盐溶液中的组分需分开灭菌后再混合。
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