WO2010082367A1 - アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド - Google Patents

アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド Download PDF

Info

Publication number
WO2010082367A1
WO2010082367A1 PCT/JP2009/052108 JP2009052108W WO2010082367A1 WO 2010082367 A1 WO2010082367 A1 WO 2010082367A1 JP 2009052108 W JP2009052108 W JP 2009052108W WO 2010082367 A1 WO2010082367 A1 WO 2010082367A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
pro
val
gly
composition
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/052108
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
仲原　丈晴
理一郎 内田
仁美 青田
勝俊 杉本
佐藤　拓也
Original Assignee
キッコーマン株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by キッコーマン株式会社 filed Critical キッコーマン株式会社
Priority to EP09838334.2A priority Critical patent/EP2380901B1/en
Priority to CN200980137462.5A priority patent/CN102164946B/zh
Priority to US13/120,531 priority patent/US9006171B2/en
Publication of WO2010082367A1 publication Critical patent/WO2010082367A1/ja
Priority to US14/014,559 priority patent/US20130345396A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06173—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Glp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to peptides that exhibit the function of lowering blood pressure by inhibiting angiotensin converting enzyme, compositions containing these peptides, and methods for producing the same.
  • Angiotensin-converting enzyme (Angiotensin Converting Enzyme, hereinafter abbreviated as ACE) is a kind of carboxypeptidase present in the body of an animal, and cleaves one of the peptide bonds of angiotensin I to produce angiotensin II.
  • Angiotensin II is a peptide hormone having a strong pressor action and causes an increase in blood pressure through vasoconstriction and aldosterone secretion promotion. Therefore, if ACE activity is inhibited, production of angiotensin II can be suppressed, and hypertension can be treated.
  • pharmaceuticals such as captopril have been put into practical use and widely used as ACE inhibitors. However, these pharmaceuticals have a strong action and thus have side effects, and many ACE inhibitors require attention to side effects such as dry cough.
  • angiotensin I which is a substrate for ACE
  • ACE angiotensin I
  • patent documents 1-5
  • These peptides are expected to be highly safe because of their mild action, but in order to ingest an effective amount, a relatively large amount of the peptide or a composition containing the peptide must be ingested. There's a problem.
  • many of these peptides are highly hydrophobic as a whole, and such peptides are generally said to have a strong bitter taste (see, for example, Patent Document 6 and Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 6 and Non-Patent Documents 1 and 2 There is also a problem that it is difficult to take orally.
  • the problem to be solved by the present invention is to effectively inhibit ACE with a small amount of intake, and there is no worry about side effects and less bitterness. It is to provide a composition containing these peptides, and a method for producing the same.
  • the present invention 1) Angiotensin converting enzyme inhibitory peptides represented by the following structural formulas (1) to (9) and salts thereof.
  • a composition comprising at least one peptide described in 1) above, which relieves symptoms of hypertension.
  • an ACE inhibitory peptide that effectively inhibits ACE with a small amount of intake, has no worries about side effects, and has little bitterness, and can be easily orally taken by a hypertensive person in daily life, and a composition containing these peptides And a method of manufacturing the same.
  • FIG. 3 is a diagram showing a UV peak when Asp-Arg-Pro is isolated from composition 1. It is a figure which shows the change of the blood-pressure value at the time of administering the composition 1 to a hypertensive rat for a long term.
  • Peptides of the present invention (1) Asp-Arg-Pro, (2) Asn-Trp, (3) Val-Gly-Leu, (4) Ile-Gly-Val, (5) Gly-Val-Pro, (6) Ile-Pro-Tyr, (7) pyroGlu-Pro, (8) Tyr-Thr, and (9) Pro-Trp are dipeptides or tripeptides in which each amino acid residue is generally expressed in three letters. Yes, pyroGlu refers to pyroglutamic acid residues. These peptides can be produced, for example, by a chemically synthesized method.
  • the amino group of the amino terminal amino acid is protected with a benzyloxycarbonyl group, the carboxyl group is activated with a p-nitrophenyl ester group, and condensed with the carboxyl terminal amino acid in the presence of triethylamine.
  • a liquid phase method in which the protective group is removed by catalytic reduction or trifluoroacetic acid, and an amino acid at the carboxyl terminal side is bound to a polymeric solid support to protect the amino group and activate the carboxyl group
  • the amino acid side chain protecting group is removed by sequentially cleaving from the solid phase support using trifluoroacetic acid, hydrogen fluoride, etc. be able to. The same effect can be expected not only with a peptide alone but also with a salt with a physiologically acceptable ion.
  • the peptide of the present invention can also be produced by separating and purifying a protein containing the amino acid sequence from a composition hydrolyzed with an appropriate protease agent using column chromatography or the like. In this case, the desired effect can be obtained even when ingested in the form of a composition containing the peptide. Compared with the above-mentioned chemical synthesis method, mass production is easy and production cost is low, which is more preferable.
  • any protein source may be used as long as the object of the present invention can be achieved, but a leguminous plant is preferably used. More preferably, soybean is preferably used because it has a large amount of cultivation, a low price, a high protein content, a rich dietary experience, and a good taste of the composition after decomposition. Examples of soybeans include yellow soybeans, red soybeans, and black soybeans, with yellow soybeans being particularly preferable.
  • whole soybean full fat soybean
  • defatted soybean, refined soybean protein and the like can be used after being subjected to protein denaturation treatment as appropriate or after being crushed and pulverized.
  • the protein denaturation treatment steaming under pressure which is widely performed in industry is preferable.
  • any one can be used as long as the object of the present invention can be achieved, but the protease activity is high, the price is low, the food experience is abundant, From the viewpoint that safety is guaranteed and the taste of the composition after decomposition is good, it is preferable to use a koji mold culture.
  • As the koji mold Aspergillus oryzae and / or Aspergillus soya are particularly suitable.
  • Aspergillus oryzae culture is obtained by using soybean, wheat, rice or the like as a culture medium and ingesting and culturing aspergillus. Depending on the culture method, it is classified into a liquid anther culture and a solid anther culture, and any of them can be used in the present invention.
  • a liquid koji culture can be obtained by inoculating koji mold in a liquid medium containing 1 to 5% of soybean, wheat, wheat bran, etc., and culturing at 25 to 40 ° C. for 24 to 120 hours.
  • the solid koji culture can be obtained by inoculating koji mold on a solid medium containing soybean, wheat, etc. and culturing at 25 to 40 ° C. for 24 to 120 hours.
  • the hydrolysis reaction conditions are as follows: Aspergillus oryzae culture at a final concentration of 10-70%, preferably 30-50%, soybean at a final concentration of 5-40%, preferably 15-30%, and sodium chloride at a final concentration of 0- 25%, preferably 6 to 18%, and further mixed with water to a final concentration of 0 to 85%, and adjusted so that the final concentration of soybean and salt is within the above range, then 25 to 60 ° C., preferably 30 to 55
  • the reaction is carried out at a stirring speed of 10 to 150 rpm at 12 ° C. for 12 to 240 hours, preferably 24 to 168 hours.
  • yeasts such as Tychosaccharomyces and ferment them at the same time.
  • composition prepared by the above-described production method contains the peptide of the present invention, it is remarkably different from the conventionally known ACE-inhibiting peptide-containing composition, and hardly has a bitter taste and is mellow and rich. It had deliciousness and richness, and had a mild and excellent fragrance, and was deliciously ingested as a food.
  • Examples of the method for separating and purifying the peptide of the present invention from the composition include ultrafiltration, dialysis, various chromatographies and the like. These are generally widely used methods. In particular, cation exchange chromatography and reverse phase chromatography are effective from the viewpoint of sample throughput and purification efficiency.
  • the peptide of the present invention thus obtained can be used as an ACE inhibitor, that is, an antihypertensive / lowering agent, by oral or parenteral administration.
  • an ACE inhibitor that is, an antihypertensive / lowering agent
  • oral administration it can be in the form of tablets, granules, powders, capsules, etc.
  • parenteral administration an injection preparation, a transdermal agent, a suppository, etc. can do.
  • the peptide of the present invention can be produced by adding it to various foods and drinks.
  • the composition containing the peptide is easy to add to various foods and drinks because of its good flavor. It is. Furthermore, it is easy to take the composition itself.
  • Examples of the food and drink obtained in this way include soy sauce, processed soy sauce, powdered soy sauce, miso, soup, soup, soup stock, soy milk, fermented milk, soft drink, beverage concentrate concentrate and powder for adjustment, alcoholic beverages, Examples include fat and oil-containing foods, noodles, processed fishery products, processed meat products, semi-solid foods, pasty foods, and solid foods.
  • the dosage of these peptides varies depending on the purpose or means of prevention or treatment, but is preferably in the range of 0.01 mg to 100 mg per day as a peptide.
  • a whole ACE inhibitory activity represented by the IC 50 of.
  • This precipitate was dissolved in 20 ml of methanol, 20 mg of palladium activated carbon was added, nitrogen gas was sealed, and a catalytic reduction reaction was performed. The reaction was carried out for 3 days by contacting with hydrogen gas while shaking at room temperature and atmospheric pressure. After the reaction, insoluble matter was removed by filtration, methanol was distilled off, and the residue was dissolved in distilled water. Subsequently, preparative purification was performed using an ODS column (Cosmosil 5C18-ARII 20 ⁇ 250 mm, manufactured by Nacalai Tesque) connected to HPLC (LC-8A, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the eluent A was ultrapure water + 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)
  • the eluent B was acetonitrile + 0.1% TFA
  • gradient elution was performed according to a conventional method.
  • Each fraction was developed by thin layer chromatography (TLC), and 87 mg of Asn-Trp was obtained from the fraction in which spots appeared with the ninhydrin reagent.
  • the chemical structure is protein sequencer (Procise 492 manufactured by Applied Biosystems), NMR (AVANCE 500 manufactured by Bruker), and LC-MS (1100 manufactured by Agilent Technologies, QSTAR Elite manufactured by Applied Biosystems, column is Develosil RPAQUEOUS- manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) AR) was used according to a conventional method.
  • the ACE inhibitory activity of the peptide obtained by the above synthesis method was measured.
  • the method of Yamamoto et al. (Setsuko Yamamoto et al., Journal of the Japan Breast Cancer Society, 1980, 18, p.297-302) was partially modified. Specifically, in a 100 ⁇ l substrate solution (12.5 mM Hippuryl-His-Leu (manufactured by Sigma), 100 mM borate buffer pH 8.3, 1 M NaCl), 140 ⁇ l sample solution and 10 ⁇ l enzyme solution (0.3 U / ml ACE (rabbit) Lung origin, Sigma) and 50 mM borate buffer pH 8.3) were added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • ACE inhibition rate is expressed by the following formula.
  • ACE inhibition rate (%) ⁇ 1 ⁇ (ODs ⁇ ODsb) / (ODc ⁇ ODcb) ⁇ ⁇ 100
  • ODs is the absorbance when the enzyme solution is added to the sample as described above
  • ODsb is the absorbance when ultrapure water is added instead of the enzyme solution
  • ODc is ultrapure water instead of the sample solution
  • ODcb is the absorbance when ultrapure water is added instead of the enzyme solution and the sample solution.
  • concentration of a sample that gives an enzyme activity inhibition rate of 50% to this reaction system is defined as an IC 50 value.
  • Table 1 shows the ACE inhibitory activity of the peptides of the present invention.
  • the IC 50 values of about 400 kinds of the main ACE-inhibiting peptides reported so far were about 1-1000 ⁇ M (edited by Koji Yamada, “Food Science Library 3, How Food Ingredients”, Asakura Shoten March 2004, p.63-67). Since the peptide of the present invention has sufficiently strong activity as compared with known peptides, it is considered industrially useful.
  • yeast Tigosaccharomyces rouxii was mixed at a rate of 1.5 ⁇ 10 6 pieces / ml and allowed to stand at 25 ° C. for 7 days.
  • an insoluble solid was removed from the moromi using a hydraulic press to obtain a clarified liquid.
  • enzyme inactivation and sterilization were performed by heating at 117 ° C. for 5 seconds using an HS sterilizer (manufactured by Nisaka Seisakusho), and after standing at 50 ° C. for 3 days, only the supernatant containing no sputum component was removed. 20 L was collected (Composition 1).
  • Composition 1 5 L of Composition 1 was desalted to about 0% of sodium chloride by electrodialysis and loaded onto an 18 L ODS column (SP-120-40 / 60-ODS-B manufactured by Daiso).
  • the eluent A is distilled water containing 0.1% TFA
  • the eluent B is 30% acetonitrile containing 0.1% TFA
  • the eluent C is acetonitrile containing 0.1% TFA.
  • linear gradient elution was performed from B to C for 5 hours. The flow rate was 45 ml / min, and 1600 ml fractions were obtained. Six fractions were combined and concentrated with an evaporator to obtain a lyophilized powder.
  • Their ACE inhibitory activity (IC 50 value) was measured.
  • the above lyophilized powder was dissolved in ultrapure water and then loaded onto an ODS column (Cosmosil-5C18-ARII 20 ⁇ 250 mm, Nacalai Tesque) connected to high performance liquid chromatography (HPLC, Shimadzu Corporation).
  • Eluent A is ultrapure water containing 0.1% TFA
  • Eluent B is 70% acetonitrile containing 0.1% TFA
  • B is held at 0% for 10 minutes
  • B is from 0% to B is 30%.
  • Linear gradient elution was performed for 70 minutes, and then B: 100% for 20 minutes.
  • the flow rate was 5 ml / min, and 7.5 ml fractions were obtained. 100 ⁇ l was sampled from each fraction, centrifuged and concentrated to dryness, redissolved in 500 ⁇ l of ultrapure water, and ACE inhibitory activity was measured.
  • a fraction having ACE inhibitory activity was loaded onto a C30 column (Dvelosil RPAQUEOUS-AR 20 ⁇ 250 mm manufactured by Nomura Chemical).
  • the eluent A is ultrapure water + 0.1% TFA
  • the eluent B is 40% acetonitrile + 0.1% TFA
  • the gradient conditions are (A 100%: 10 minutes) ⁇ (B 30% gradient: 60 minutes) ⁇ ( B: gradient to 100%: 30 minutes), fractionation at a flow rate of 5 ml / min and a fraction size of 6 ml.
  • the chromatogram is shown in FIG. When the ACE inhibitory activity was measured, the activity was found only at the peak indicated by the arrow.
  • This fraction was concentrated by an evaporator and analyzed by a protein sequencer, NMR, and LC-MS. As a result, it was Asp-Arg-Pro. Similarly, Asn-Trp, Val-Gly-Leu, Ile-Gly-Val, Gly-Val-Pro, Ile-Pro-Tyr, and pyroGlu-Pro were isolated from other fractions.
  • the peptide of the present invention contained in Composition 1 was quantified using the LC-MS. First, a calibration curve was prepared using a peptide obtained by chemical synthesis as a standard. Subsequently, the composition 1 was desalted by electrodialysis, analyzed by appropriate dilution, and the content was calculated from the amount of ions detected derived from each peptide. The results are shown in Table 2.
  • Table 3 shows the content of the peptide of the present invention contained in the composition obtained by the production method under different conditions.
  • wheat was used instead of soybean, and a food protease agent (alkalase 2.4L-FG manufactured by Novozymes) was used instead of the koji mold culture.
  • alkalase 2.4L-FG manufactured by Novozymes
  • Group 2 (Composition 1) ( ⁇ in the figure): Feed obtained by mixing 20% v / v of the composition 1 with low-salt soy sauce and mixing 25% v / w of the feed (salt concentration in feed: 3% w / W, composition 1 concentration 1.5% w / w).
  • Group 3 (fraction obtained by removing peptide from composition 1) ( ⁇ in the figure): ODS-A fraction (fraction obtained by fractionating composition 1 using an ODS column) in reduced salt soy sauce ) And 25% v / w of the feed (saline concentration in feed: 3% w / w, ODS-A fraction concentration: 1.3% w / w).
  • Group 4 (peptide fraction of composition 1) ( ⁇ in the figure): Reduced salt soy sauce with ODS-B and ODS-C fractions (composition 1 was fractionated on an ODS column, containing a large amount of peptide) Fraction) was mixed according to the weight ratio, and 25% v / w of feed was mixed (salt concentration in feed: 3% w / w, ODS-B / ODS-C fraction total concentration: 0.2% w) / W).
  • Group 5 hydrochloric acid-degraded peptide fraction
  • ODS-B and ODS-C fractions were hydrolyzed with hydrochloric acid according to a conventional method to completely decompose the peptide.
  • composition 1 containing the peptide of the present invention significantly suppressed an increase in blood pressure. Furthermore, while the antihypertensive action was observed in the fraction containing the peptide, the antihypertensive action of composition 1 was derived from the peptide because the antihypertensive action was lost by decomposing the peptide. It was.
  • the angiotensin converting enzyme-inhibiting peptide obtained in the present invention effectively inhibits ACE when ingested in a small amount and has no side effects, so that hypertension can be easily taken orally in daily life.
  • a method for producing a composition containing the peptide excellent in flavor, high in safety, and easy to ingest as a food, it can greatly contribute to the improvement of the quality of life of hypertensives. Become.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

　少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できるＡＣＥ阻害ペプチドおよび該ペプチドを含む組成物を提供すること。　下記の構造式（１）～（９）で表されるペプチド、およびその塩を提供する。（１）Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ、（２）Ａｓｎ－Ｔｒｐ、（３）Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、（４）Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ、（５）Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ、（６）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ、（７）ｐｙｒｏＧｌｕ－Ｐｒｏ、（８）Ｔｙｒ－Ｔｈｒ、（９）Ｐｒｏ－Ｔｒｐ

Description

アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド
　本発明は、アンジオテンシン変換酵素を阻害することにより血圧降下の機能を発揮するペプチドならびにこれらのペプチドを含有する組成物、およびその製造法に関する。
　アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ、以下ＡＣＥと略す）は、動物体内に存在するカルボキシペプチダーゼの一種であり、アンジオテンシンＩのペプチド結合の一つを切断してアンジオテンシンＩＩを産生する。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧作用を有するペプチドホルモンであり、血管収縮やアルドステロン分泌促進などを通じて血圧上昇を引き起こす。したがって、ＡＣＥ活性を阻害すればアンジオテンシンＩＩの産生を抑制することができ、高血圧症の治療が可能である。これまでにＡＣＥ阻害物質としてカプトプリルなどの医薬品が実用化され、広く使用されている。しかしながら、これら医薬品は作用が強力であるために副作用の懸念があり、多くのＡＣＥ阻害薬では空咳などの副作用に対する注意が必要とされている。
　一方、ＡＣＥの基質であるアンジオテンシンＩがペプチドであることから、天然物由来のペプチドによりＡＣＥを競合的に阻害し、副作用の無い高血圧治療剤を提供する研究が行われてきた（例えば、特許文献１～５参照）。これらのペプチドはその作用が穏やかであることから、安全性が高いと期待される一方、有効量を摂取するためにはペプチドもしくはペプチドを含有する組成物を比較的大量に摂取しなければならないという問題がある。さらには、これらのペプチドの多くは全体の疎水性が高く、このようなペプチドは一般的に苦味が強いと言われており（例えば、特許文献６、非特許文献１～２参照）、大量に経口摂取することが難しいという問題もある。
特開平４－０９１０９７号公報 特開平５－２６２７９０号公報 特開平６－０４０９４４号公報 特開平７－１８８２８２号公報 特開平１０－１７５９９７号公報 特開２００６－７５０６４号公報 Ｗｅｎｙｉ　Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｓａｆｅｔｙ、２００５、（４）、ｐ．６３－７８． 藤巻正生ら著、「改定新版食品化学」、朝倉書店、１９７６年３月、ｐ．１１７－１１８
　本発明が解決しようとする課題は、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、苦味が少ないため、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できるＡＣＥ阻害ペプチドならびにこれらのペプチドを含む組成物、およびその製造法を提供することである。
　本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、これまでにＡＣＥ阻害作用があることが知られていない化学構造（アミノ酸配列）を有し、その作用が極めて強いペプチドを見出し、本発明に至った。
　すなわち本発明は、
１）下記の構造式（１）～（９）で表されるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド、およびその塩。
（１）Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ、（２）Ａｓｎ－Ｔｒｐ、（３）Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、（４）Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ、（５）Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ、（６）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ、（７）ｐｙｒｏＧｌｕ－Ｐｒｏ、（８）Ｔｙｒ－Ｔｈｒ、（９）Ｐｒｏ－Ｔｒｐ
２）上記１）記載のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
３）上記１）記載のペプチドの少なくとも１種を含有し、高血圧の症状を緩和することを特徴とする組成物。
４）大豆を２５℃以上で麹菌培養物とともに混合攪拌することを特徴とする、上記１）記載のペプチドの製造法。
を提供するものである。
　本発明により、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、苦味が少ないため、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できるＡＣＥ阻害ペプチドならびにこれらのペプチドを含む組成物、およびその製造法が提供された。
組成物１からＡｓｐ－Ａｒｇ－Ｐｒｏを単離した際のＵＶピークを示す図である。 組成物１を高血圧ラットに長期投与した際の血圧値の変化を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のペプチド（１）Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ、（２）Ａｓｎ－Ｔｒｐ、（３）Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、（４）Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ、（５）Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ、（６）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ、（７）ｐｙｒｏＧｌｕ－Ｐｒｏ、（８）Ｔｙｒ－Ｔｈｒ、（９）Ｐｒｏ－Ｔｒｐは、各アミノ酸残基を一般的に使用される３文字表記で表したジペプチドまたはトリペプチドであり、ｐｙｒｏＧｌｕはピログルタミン酸残基を指す。これらのペプチドは、例えば、化学的に合成する方法で製造することができる。周知の方法として、例えば、アミノ末端側のアミノ酸のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護し、カルボキシル基をｐ－ニトロフェニルエステル基で活性化し、カルボキシル末端側のアミノ酸とトリエチルアミン存在下で縮合させた後、接触還元やトリフルオロ酢酸により保護基を除去する液相法と、ポリマー性の固相支持体にカルボキシル末端側のアミノ酸を結合し、アミノ基の保護とカルボキシル基の活性化を施したアミノ酸を順次ペプチド結合により結合した後、トリフルオロ酢酸やフッ化水素などを用いて固相支持体から切断し、アミノ酸側鎖の保護基を除去する固相法があるが、いずれの方法でも製造することができる。なお、ペプチド単体だけではなく、生理学的に許容されるイオンとの塩であっても、同様の効果が期待できる。
　また、本発明のペプチドは、該アミノ酸配列を含むタンパク質を適当なプロテアーゼ剤によって加水分解した組成物からカラムクロマトグラフィー等を用いて分離精製することにより製造することもできる。この場合、該ペプチドを含有する組成物の形態で摂取しても目的の効果が得られる。前述の化学合成法と比べ、大量製造が容易であり、製造コストも少ないことから、より好ましい。
　本発明のペプチドをタンパク質の加水分解により得る場合のタンパク質源としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良いが、好ましくはマメ科植物を用いるのが良い。さらに好ましくは、栽培量が多く、価格が安く、タンパク質含量が多く、食経験が豊富で、分解後の組成物の呈味が良好という点から、大豆を用いるのが良い。大豆の種類としては、黄大豆、赤大豆、黒大豆などが挙げられるが、特に黄大豆が好ましい。大豆の態様としては、丸大豆（全脂大豆）、脱脂大豆、精製大豆タンパク質などを、そのままあるいは割砕、粉砕してから、適宜タンパク質変性処理を施し、用いることができる。タンパク質変性処理としては、工業的に広く行われている加圧蒸煮が好ましい。
　本発明のペプチドをタンパク質の加水分解により得る場合のプロテアーゼ剤としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良いが、プロテアーゼ活性が高く、価格が安く、食経験が豊富で、安全性が保証されており、分解後の組成物の呈味が良好という点から、麹菌培養物を用いるのが良い。麹菌としては、特にアスペルギルス・オリゼー及び／又はアスペルギルス・ソーヤが好適である。これらの微生物は醤油や味噌の醸造において古来よりタンパク質分解に利用されてきたばかりでなく、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　Ａｓ　Ｓａｆｅ）のリストに掲載され、安全性が認められている。麹菌培養物とは、大豆や小麦、米等を培地とし、麹菌を摂取して培養することにより得られるものである。その培養方法の違いにより、液体麹培養物と固体麹培養物に分類されるが、本発明においてはいずれも利用可能である。例えば、液体麹培養物は、大豆や小麦、小麦フスマ等を１～５％含む液体培地に麹菌を接種し、２５～４０℃で、２４～１２０時間培養して得ることができる。また、固体麹培養物は、大豆や小麦等を含む固体培地に麹菌を接種し、２５～４０℃で、２４～１２０時間培養して得ることができる。
　前記の加水分解反応の条件としては、麹菌培養物を終濃度１０～７０％、好ましくは３０～５０％、大豆を終濃度５～４０％、好ましくは１５～３０％、食塩を終濃度０～２５％、好ましくは６～１８％、さらに水を終濃度０～８５％混合し、大豆と食塩の終濃度が前記の範囲になるように調製した後、２５～６０℃、好ましくは３０～５５℃で、攪拌速度１０～１５０ｒｐｍ　にて、１２～２４０時間、好ましくは２４～１６８時間反応させる。適宜香味向上のために、チゴサッカロマイセス属等の酵母を添加して、同時に発酵させることも可能である。
　前記の製造法により調製した組成物は、本発明のペプチドを含有するにもかかわらず、従来知られているＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物とは著しく異なり、苦味がほとんど感じられず、まろやかで豊富な旨味・コクと、穏やかで優れた芳香を有し、食品としておいしく摂取できるものであった。
　前記組成物から、本発明のペプチドを分離精製するための方法としては、限外濾過、透析、各種クロマトグラフィー等が挙げられる。これらは、一般に広く用いられている方法である。特に、サンプルの処理量と精製効率の点から、陽イオン交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーが有効である。
　このようにして得られた本発明のペプチドは、ＡＣＥ阻害剤すなわち血圧上昇抑制／降下剤として、経口又は非経口投与により用いることができる。常法に従い、経口投与の場合には、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤などの形態とすることができ、非経口投与の場合には、注射薬製剤、経皮剤、坐剤などとすることができる。
　また、高血圧予防及び／又は治療を目的とした飲食品（例えば、健康食品、健康志向食品、機能性食品、特定保健用食品等）に用いることができる。本発明のペプチドを各種飲食品に添加して製造することもできるが、前述の通りペプチドを含有する組成物の形態でも、その風味が良好であるがゆえに、各種飲食品に添加するのは容易である。さらには、組成物そのものを摂取することも容易である。このようにして得られる飲食品としては、例えば、しょうゆ、しょうゆ加工品、粉末しょうゆ、味噌、つゆ・スープ類、だし類、豆乳、発酵乳、清涼飲料、飲料濃縮原液および調整用粉末、酒類、油脂含有食品、麺類、水産加工食品、畜肉加工食品、半固形状食品、ペースト状食品、固形状食品等が挙げられる。
　これらのペプチドの投与量は、予防あるいは治療目的・手段により異なるが、ペプチドとして一日当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇの範囲が好ましい。また、各種飲食品として摂取する場合には、ＩＣ５０で表されるＡＣＥ阻害活性が全体として１ｍｇ／ｍｌ以下になるのが好ましい。
　以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によってなんら制限されるものではない。
＜化学合成法によるペプチドの製造＞
　以下にＡｓｎ－Ｔｒｐの製造を例示する。なお、特記以外の試薬は和光純薬製を使用した。まず、１２０ｍｇのＬ－トリプトファン塩酸塩を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１５０μｌのトリエチルアミンと３００ｍｇのＺ－Ａｓｎ－Ｏｎｐ（国産化学製）を加え、室温で２４時間攪拌した。次いで、２０ｍｌの１％アンモニア水を加え、－１０℃で１時間放置して生じた析出物を濾取し、析出物を冷水で洗浄した。この析出物を２０ｍｌのメタノールに溶解し、２０ｍｇのパラジウム活性炭素を加え、窒素ガス封入後、接触還元反応を行った。反応は室温、大気圧下で振盪しながら水素ガスを接触させ、３日間行った。反応後、不溶物を濾過除去し、メタノールを溜去した後、蒸留水に溶解した。次いで、ＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ－８Ａ）に接続したＯＤＳカラム（ナカライテスク製Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　５Ｃ１８－ＡＲＩＩ　２０×２５０ｍｍ）により分取精製を行った。溶離液Ａは超純水＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、溶離液Ｂはアセトニトリル＋０．１％　ＴＦＡとし、常法に従いグラジエント溶出した。各フラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で展開し、ニンヒドリン試薬でスポットが現れるフラクションから８７ｍｇのＡｓｎ－Ｔｒｐを得た。この化学構造は、プロテインシークエンサー（アプライドバイオシステムズ製Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９２）、及びＮＭＲ（ブルカー製ＡＶＡＮＣＥ　５００）、及びＬＣ－ＭＳ（アジレントテクノロジーズ製１１００、アプライドバイオシステムズ製ＱＳＴＡＲ　Ｅｌｉｔｅ、カラムは野村化学製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ－ＡＲ）を用いて常法に従い確認した。
　前記合成法により得られたペプチドのＡＣＥ阻害活性を測定した。測定法としては、Ｙａｍａｍｏｔｏらの方法（山本節子ら、日胸疾会誌、１９８０、１８、ｐ．２９７－３０２）を一部改変した方法で行った。すなわち、１００μｌの基質溶液（１２．５ｍＭ　Ｈｉｐｐｕｒｙｌ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ（シグマ製）、１００ｍＭホウ酸バッファーｐＨ８．３、１Ｍ　ＮａＣｌ）に１４０μｌのサンプル溶液と１０μｌの酵素溶液（０．３Ｕ／ｍｌ　ＡＣＥ（ウサギ肺由来、シグマ製）、５０ｍＭホウ酸バッファーｐＨ８．３）を加え、３７℃で３０分間反応した。次いで、２５０μｌの１Ｎ塩酸を加えて反応を停止し、１．５ｍｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、遠心分離後、１ｍｌの酢酸エチル層を遠心濃縮乾固し、１ｍｌの超純水に溶解して、２２８ｎｍの吸光度を測定した。ＡＣＥ阻害率は、次式で表される。
　ＡＣＥ阻害率（％）＝｛１－（ＯＤｓ－ＯＤｓｂ）／（ＯＤｃ－ＯＤｃｂ）｝×１００
なお、ＯＤｓは前記の通りサンプルに酵素溶液を加えて反応させたときの吸光度であり、ＯＤｓｂは酵素溶液の代わりに超純水を加えたときの吸光度、ＯＤｃはサンプル溶液の代わりに超純水を加えたときの吸光度、ＯＤｃｂは酵素溶液とサンプル溶液の代わりに超純水を加えたときの吸光度である。また、この反応系に対し５０％の酵素活性阻害率を与えるサンプルの濃度をＩＣ５０値とする。
　本発明のペプチドのＡＣＥ阻害活性を表１に示す。なお、これまでに報告された主なＡＣＥ阻害ペプチド、約４００種類のＩＣ５０値は約１～１０００μＭであった（山田耕路編著、「食の科学ライブラリー３　食品成分のはたらき」、朝倉書店、２００４年３月、ｐ．６３－６７）。本発明のペプチドは、既知のペプチドと比較して充分に強い活性を有しているため、産業上有用と考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜大豆を麹菌培養物で分解する方法によるペプチドの製造＞
　加熱変性した丸大豆と小麦を等量含む固体培地に、麹菌アスペルギルス・ソーヤの胞子を添加して、２５～４０℃で７２時間培養することにより麹菌培養物を得た。次に、加熱変性した丸大豆１４ｋｇ、麹菌培養物２ｋｇ、水１６Ｌ、食塩３ｋｇを混合し、４５℃、１００ｒｐｍで５日間攪拌して諸味を得た。次いで、酵母チゴサッカロマイセス・ルーキシーを１．５×１０６個／ｍｌの割合で混合し、２５℃で７日間静置した。次いで、油圧式圧搾機を用いて諸味から不溶性固形分を除去し、清澄液を得た。さらに、ＨＳ殺菌機（日阪製作所製）を用いて１１７℃で５秒間加熱することにより酵素失活と殺菌を行い、５０℃で３日間静置した後、滓成分を含まない上清のみを２０Ｌ採取した（組成物１）。
　５Ｌの組成物１を電気透析により食塩約０％まで脱塩し、カラム容積１８ＬのＯＤＳカラム（ダイソー製ＳＰ－１２０－４０／６０－ＯＤＳ－Ｂ）にロードした。溶離液Ａは０．１％　ＴＦＡを含む蒸留水、溶離液Ｂは０．１％　ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル、溶離液Ｃは０．１％　ＴＦＡを含むアセトニトリルとし、ＡからＢまで２０時間、次いでＢからＣまで５時間のリニアグラジエント溶出を行った。流速は４５ｍｌ／ｍｉｎとし、１６００ｍｌずつのフラクションを得た。６本ずつのフラクションを合わせてエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥粉末を得た。これらのＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０値）を測定した。
　上記の凍結乾燥粉末を超純水に溶解後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、島津製作所）に接続したＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ－５Ｃ１８－ＡＲＩＩ　２０×２５０ｍｍ、ナカライテスク）にロードした。溶離液Ａは０．１％　ＴＦＡを含む超純水、溶離液Ｂは０．１％　ＴＦＡを含む７０％　アセトニトリルとし、Ｂ：０％で１０分ホールド後、Ｂ：０％からＢ：３０％まで７０分間、次いでＢ：１００％まで２０分間のリニアグラジエント溶出を行った。流速は５ｍｌ／ｍｉｎとし、７．５ｍｌずつのフラクションを得た。各フラクションから１００μｌずつサンプリングし、遠心濃縮乾固後、５００μｌの超純水に再溶解し、ＡＣＥ阻害活性を測定した。
　さらに、ＡＣＥ阻害活性を有するフラクションをＣ３０カラム（野村化学製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ－ＡＲ　２０×２５０ｍｍ）にロードした。溶離液Ａは超純水＋０．１％　ＴＦＡ、溶離液Ｂは４０％アセトニトリル＋０．１％　ＴＦＡとし、グラジエント条件は、（Ａ１００％：１０分間）→（Ｂ３０％までグラジエント：６０分間）→（Ｂ１００％までグラジエント：３０分間）とし、流速５ｍｌ／分、フラクションサイズ６ｍｌで分画した。そのクロマトグラムを図１に示す。ＡＣＥ阻害活性を測定したところ、矢印で示したピークにのみ活性が見られた。このフラクションをエバポレーターで濃縮し、プロテインシークエンサー、ＮＭＲ、ＬＣ－ＭＳで構造解析したところ、Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｐｒｏであった。同様にして、他の画分から、Ａｓｎ－Ｔｒｐ、Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ、Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ、ｐｙｒｏＧｌｕ－Ｐｒｏを単離した。
　前記のＬＣ－ＭＳを用いて組成物１に含まれる本発明のペプチドを定量した。まず、化学合成により得られたペプチドを標品として検量線を作成した。次いで、組成物１を電気透析により脱塩し、適宜希釈して分析を行い、各ペプチドに由来する検出されたイオン量から含有量を計算した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　同様に、条件の異なる製造法で得られた組成物に含まれる、本発明のペプチドの含有量を表３に示す。比較例として、大豆の代わりに小麦、麹菌培養物の代わりに食品用プロテアーゼ剤（ノボザイムズ製アルカラーゼ２．４Ｌ－ＦＧ）を使用した。表３の結果から、原料としては大豆が優れ、酵素剤としては麹菌培養物が優れ、反応温度は２５℃以上が優れることが判る。すなわち、大豆を麹菌培養物とともに２５℃以上で混合攪拌することにより、本発明のペプチドを特に効率的に製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜ラット混餌長期投与による降圧作用の検証＞
　５週齢の雄性食塩感受性高血圧ラット（Ｄａｈｌ－Ｓ）３５匹を７匹づつ、以下の５群に分け３０日間の混餌長期投与試験を行った。サンプルの食塩濃度は炎光分析法により分析し、飼料中の食塩濃度が各群間で同一になるように食塩を加えて調整した。試験期間中、飼料は自由摂取としたが、摂餌量は各群間でほぼ同じであった。
第１群（対照）（図中▲）：減塩醤油（食塩濃度７％ｗ／ｖ）を飼料に対し２５％ｖ／ｗ混合した飼料（飼料中食塩濃度３％ｗ／ｗ）。
第２群（組成物１）（図中●）：減塩醤油に前記組成物１を２０％ｖ／ｖ混合し、飼料に対し２５％ｖ／ｗ混合した飼料（飼料中食塩濃度３％ｗ／ｗ、組成物１濃度１．５％ｗ／ｗ）。
第３群（組成物１からペプチドを除いた画分）（図中○）：減塩醤油に前記ＯＤＳ－Ａ画分（組成物１をＯＤＳカラムで分画した、ペプチドをほとんど含まない画分）を混合し、飼料に対し２５％ｖ／ｗ混合した飼料（飼料中食塩濃度３％ｗ／ｗ、ＯＤＳ－Ａ画分濃度１．３％ｗ／ｗ）。
第４群（組成物１のペプチド画分）（図中□）：減塩醤油に前記ＯＤＳ－Ｂ画分とＯＤＳ－Ｃ画分（組成物１をＯＤＳカラムで分画した、ペプチドを多く含む画分）を重量比に応じて混合し、飼料に対し２５％ｖ／ｗ混合した飼料（飼料中食塩濃度３％ｗ／ｗ、ＯＤＳ－Ｂ・ＯＤＳ－Ｃ画分合計濃度０．２％ｗ／ｗ）。
第５群（塩酸分解したペプチド画分）（図中■）：ＯＤＳ－Ｂ画分とＯＤＳ－Ｃ画分を常法に従い塩酸分解することによりペプチドを完全に分解し、第４群と同様に混合した飼料（飼料中食塩濃度３％ｗ／ｗ、ＯＤＳ－Ｂ・ＯＤＳ－Ｃ画分合計濃度０．２％ｗ／ｗ）。
　試験開始時から１週間毎に、非観血式血圧計ＭＫ－２０００を用い収縮期血圧の測定を行った。これらの結果を図２に示す。なお、投与３０日目の収縮期血圧値を用いて、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定により統計処理を行った。
　図２の結果から、本発明のペプチドを含む組成物１は血圧上昇を有意に抑制した。さらに、ペプチドを含む画分に降圧作用が認められた一方で、ペプチドを分解したことにより降圧作用が失われたことから、組成物１の降圧作用はペプチドに由来するものであることが示唆された。
＜官能評価＞
　実施例２に記載の組成物１と比較例１を使用して、官能評価を行った。パネルは８名とし、「苦味の強さ」と「味の好ましさ」を１対比較法で評価した。表４の結果から、本発明の発酵調味料は、ペプチドを多く含むにもかかわらず、苦味が少なく、好ましい味を有していることが分かる。プロテアーゼ剤によるペプチド製造法はこれまでに多くが開示されているが、本発明は呈味の点で従来技術より優れていると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　　本出願は、２００９年１月１９日出願の日本特許出願（特願２００９－００８５０３）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
　本発明で得られるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できる。また、該ペプチドを含み、風味に優れ、安全性が高く、食品としての摂取が容易な組成物の製造法を提起したことにより、高血圧者の生活の質の向上に大きく貢献することが可能となる。

Claims (4)

  1. 　下記の構造式（１）～（９）で表されるアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド、およびその塩。
    （１）Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ、（２）Ａｓｎ－Ｔｒｐ、（３）Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、（４）Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ、（５）Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ、（６）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ、（７）ｐｙｒｏＧｌｕ－Ｐｒｏ、（８）Ｔｙｒ－Ｔｈｒ、（９）Ｐｒｏ－Ｔｒｐ
  2. 　請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
  3. 　請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有し、高血圧の症状を緩和することを特徴とする組成物。
  4. 　大豆を２５℃以上で麹菌培養物とともに混合攪拌することを特徴とする、請求項１記載のペプチドの製造法。
PCT/JP2009/052108 2009-01-19 2009-02-06 アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド WO2010082367A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09838334.2A EP2380901B1 (en) 2009-01-19 2009-02-06 Angiotensin converting enzyme inhibitory peptide
CN200980137462.5A CN102164946B (zh) 2009-01-19 2009-02-06 血管紧张素转换酶抑制肽
US13/120,531 US9006171B2 (en) 2009-01-19 2009-02-06 Angiotensin converting enzyme inhibitory peptide
US14/014,559 US20130345396A1 (en) 2009-01-19 2013-08-30 Angiotensin converting enzyme inhibitory peptide

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-008503 2009-01-19
JP2009008503A JP2010163400A (ja) 2009-01-19 2009-01-19 新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/014,559 Division US20130345396A1 (en) 2009-01-19 2013-08-30 Angiotensin converting enzyme inhibitory peptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010082367A1 true WO2010082367A1 (ja) 2010-07-22

Family

ID=42339632

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/052108 WO2010082367A1 (ja) 2009-01-19 2009-02-06 アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド

Country Status (6)

Country Link
US (2) US9006171B2 (ja)
EP (1) EP2380901B1 (ja)
JP (1) JP2010163400A (ja)
KR (1) KR101653012B1 (ja)
CN (1) CN102164946B (ja)
WO (1) WO2010082367A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304169A (zh) * 2011-08-05 2012-01-04 成都中医药大学 降血压多肽及其用途
CN106755244A (zh) * 2016-12-29 2017-05-31 陕西科技大学 一种风味蛋白酶酶解制备ace抑制肽的方法
CN106755242A (zh) * 2016-12-29 2017-05-31 陕西科技大学 一种魔芋蛋白ace抑制肽的制备方法
CN110317824A (zh) * 2018-03-29 2019-10-11 中国科学院植物研究所 降血压水稻材料的制备方法及所用基因与蛋白质

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5729297B2 (ja) * 2009-07-13 2015-06-03 不二製油株式会社 経口性抗炎症剤及び経口性抗炎症ペプチド
JP5456144B1 (ja) * 2012-11-21 2014-03-26 ヤマキ株式会社 アンジオテンシン変換酵素阻害ジペプチド
US20150183822A1 (en) * 2012-06-26 2015-07-02 Yamaki Co., Ltd. Angiotensin-converting-enzyme inhibiting dipeptide
CN105002249B (zh) * 2015-08-14 2018-09-21 湖北工业大学 一种红曲霉液态发酵制备ace抑制肽的方法
US10676505B2 (en) 2016-06-16 2020-06-09 Sunstar Inc. Tripeptides having angiotensin converting enzyme inhibitory activity and uses thereof
WO2019006951A1 (zh) * 2017-07-07 2019-01-10 广州世优生物科技有限公司 非极性二肽在制备降血压药物或保健品中的应用
KR102209870B1 (ko) * 2019-03-13 2021-02-03 강원대학교산학협력단 항고혈압 활성 펩타이드, 그의 제조방법 및 그의 용도
CN110467649A (zh) * 2019-09-12 2019-11-19 浙江省农业科学院 一种抑制血管紧张素转换酶活性的多肽qeip及其应用

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0491097A (ja) 1990-08-03 1992-03-24 Nisshin Flour Milling Co Ltd 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤
JPH05262790A (ja) 1991-06-03 1993-10-12 Takara Shuzo Co Ltd 新規ペプチド
JPH05339166A (ja) * 1992-06-03 1993-12-21 Abo Sadakichi アンジオテンシン変換酵素阻害物質およびその製造法
JPH0640944A (ja) 1992-07-23 1994-02-15 Calpis Food Ind Co Ltd:The アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造法
JPH07188282A (ja) 1991-04-19 1995-07-25 Suetsuna Yoko 新規なトリペプチド、その製法およびそれを有効成分と する血圧降下剤
JPH08269087A (ja) * 1992-03-02 1996-10-15 Fumio Yamauchi 新規なテトラペプチド、ペンタペプチドその製法およびそれらを有効成分とする血圧降下剤
JPH10175997A (ja) 1996-12-12 1998-06-30 Shirako:Kk 海苔から得られるペプチド混合物
JP2002053595A (ja) * 2000-08-14 2002-02-19 Abo Kenji アンジオテンシン変換酵素阻害物質とその製造法
WO2002055546A1 (fr) * 2001-01-16 2002-07-18 Ajinomoto Co.,Inc. Inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine
JP2006075064A (ja) 2004-09-09 2006-03-23 Sanei Gen Ffi Inc ペプチド含有飲料
JP2007008846A (ja) * 2005-06-29 2007-01-18 Kikkoman Corp 血管内皮機能改善組成物
JP2008088151A (ja) * 2006-09-08 2008-04-17 Higashimaru Shoyu Co Ltd 醤油に含まれる高分子物質の用途
JP2009008503A (ja) 2007-06-27 2009-01-15 Sysmex Corp 血小板凝集測定方法および血小板凝集測定装置
JP2009040696A (ja) * 2007-08-07 2009-02-26 Kikkoman Corp 新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07188283A (ja) * 1991-04-19 1995-07-25 Suetsuna Yoko 新規なトリペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素 阻害剤
JP3083245B2 (ja) 1995-06-22 2000-09-04 喜弘 井上 積重容器の除塵装置
US9274101B2 (en) * 2001-04-20 2016-03-01 Biolog, Inc. Methods and kits for obtaining a metabolic profile of living animal cells
CN101139625B (zh) * 2002-12-24 2012-11-28 加拿大农业及农业食品部 源自植物材料的ace抑制肽
TWI344371B (en) * 2003-03-18 2011-07-01 Suntory Holdings Ltd Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides
JP2007008876A (ja) * 2005-06-30 2007-01-18 Avant Immunotherapeutics Inc 脊髄損傷を治療するための補体阻害タンパク質の使用

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0491097A (ja) 1990-08-03 1992-03-24 Nisshin Flour Milling Co Ltd 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤
JPH07188282A (ja) 1991-04-19 1995-07-25 Suetsuna Yoko 新規なトリペプチド、その製法およびそれを有効成分と する血圧降下剤
JPH05262790A (ja) 1991-06-03 1993-10-12 Takara Shuzo Co Ltd 新規ペプチド
JPH08269087A (ja) * 1992-03-02 1996-10-15 Fumio Yamauchi 新規なテトラペプチド、ペンタペプチドその製法およびそれらを有効成分とする血圧降下剤
JPH05339166A (ja) * 1992-06-03 1993-12-21 Abo Sadakichi アンジオテンシン変換酵素阻害物質およびその製造法
JPH0640944A (ja) 1992-07-23 1994-02-15 Calpis Food Ind Co Ltd:The アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造法
JPH10175997A (ja) 1996-12-12 1998-06-30 Shirako:Kk 海苔から得られるペプチド混合物
JP2002053595A (ja) * 2000-08-14 2002-02-19 Abo Kenji アンジオテンシン変換酵素阻害物質とその製造法
WO2002055546A1 (fr) * 2001-01-16 2002-07-18 Ajinomoto Co.,Inc. Inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine
JP2006075064A (ja) 2004-09-09 2006-03-23 Sanei Gen Ffi Inc ペプチド含有飲料
JP2007008846A (ja) * 2005-06-29 2007-01-18 Kikkoman Corp 血管内皮機能改善組成物
JP2008088151A (ja) * 2006-09-08 2008-04-17 Higashimaru Shoyu Co Ltd 醤油に含まれる高分子物質の用途
JP2009008503A (ja) 2007-06-27 2009-01-15 Sysmex Corp 血小板凝集測定方法および血小板凝集測定装置
JP2009040696A (ja) * 2007-08-07 2009-02-26 Kikkoman Corp 新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Kaitei Shinpan Shokuhin Kagaku", March 1976, ASAKURA SHOTEN, pages: 117 - 118
"Shoku no Kagaku Library 3 Shokuhin Seibun no Hataraki", March 2004, ASAKURA SHOTEN, pages: 63 - 67
See also references of EP2380901A4
SETSUKO YAMAMOTO ET AL., JOURNAL OF THE JAPAN SOCIETY OF CHEST DISEASES, vol. 18, 1980, pages 297 - 302
WENYI WANG ET AL., COMPREHENSIVE REVIEWS IN FOOD SCIENCE AND FOOD SAFETY, vol. 4, 2005, pages 63 - 78

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304169A (zh) * 2011-08-05 2012-01-04 成都中医药大学 降血压多肽及其用途
CN102304169B (zh) * 2011-08-05 2013-03-20 成都中医药大学 降血压多肽及其用途
CN106755244A (zh) * 2016-12-29 2017-05-31 陕西科技大学 一种风味蛋白酶酶解制备ace抑制肽的方法
CN106755242A (zh) * 2016-12-29 2017-05-31 陕西科技大学 一种魔芋蛋白ace抑制肽的制备方法
CN110317824A (zh) * 2018-03-29 2019-10-11 中国科学院植物研究所 降血压水稻材料的制备方法及所用基因与蛋白质
CN110317824B (zh) * 2018-03-29 2021-03-05 中国科学院植物研究所 降血压水稻材料的制备方法及所用基因与蛋白质

Also Published As

Publication number Publication date
EP2380901A4 (en) 2012-12-26
US20130345396A1 (en) 2013-12-26
EP2380901A1 (en) 2011-10-26
EP2380901B1 (en) 2019-07-17
KR101653012B1 (ko) 2016-08-31
US9006171B2 (en) 2015-04-14
CN102164946B (zh) 2016-02-17
JP2010163400A (ja) 2010-07-29
US20110171690A1 (en) 2011-07-14
CN102164946A (zh) 2011-08-24
KR20110105761A (ko) 2011-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2010082367A1 (ja) アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド
Zhu et al. A comprehensive review of corn protein‐derived bioactive peptides: Production, characterization, bioactivities, and transport pathways
Zhang et al. Identification of novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from wheat gluten hydrolysate by the protease of Pseudomonas aeruginosa
Mallikarjun Gouda et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide derived from glycinin, the 11S globulin of soybean (Glycine max)
JP5832049B2 (ja) ジペプチジルペプチダーゼ−ｉｖ阻害剤
AU2002366037B2 (en) Novel peptide having angiotensin convertase inhibitory effect
WO2013125622A1 (ja) ジペプチジルペプチダーゼ－ｉｖ阻害剤
JP3592593B2 (ja) アンギオテンシン変換酵素阻害剤
JP5416964B2 (ja) 新規トリペプチドおよびそれらトリペプチドの製造法、ならびにアンジオテンシン変換酵素阻害物質の製造方法
WO2014002571A1 (ja) アンジオテンシン変換酵素阻害ジペプチド
JP5626748B2 (ja) ペプチド含有調味料
JP5799842B2 (ja) アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド、該ペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、組成物及び食品、並びに、該ペプチドの製造方法
CA2681593A1 (en) Preventive or therapeutic composition for liver disease
WO2013133032A1 (ja) ジペプチジルペプチダーゼ－ｉｖ阻害剤
JP2009040696A (ja) 新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド
WO2003055901A1 (fr) Nouveau peptide sy
JP5877560B2 (ja) ジペプチジルペプチダーゼ−ｉｖ阻害剤
JP2013241470A (ja) ペプチド含有組成物
JP2014138617A (ja) アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド含有組成物
JP3122093B2 (ja) アンジオテンシン変換酵素阻害性ペプチド
JP4429031B2 (ja) アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド
JP6826726B2 (ja) 糖取り込み促進用経口組成物
WO2022186290A1 (ja) ジペプチジルペプチダーゼ－ｉｖ阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980137462.5

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09838334

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009838334

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20117006723

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13120531

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE