KR101653012B1

KR101653012B1 - 안지오텐신 변환 효소 저해 펩티드

Info

Publication number: KR101653012B1
Application number: KR1020117006723A
Authority: KR
Inventors: 다케하루 나카하라; 리이치로 우치다; 히토미 아오타; 가츠토시 스기모토; 다쿠야 사토
Original assignee: 기꼬만 가부시키가이샤
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2009-02-06
Publication date: 2016-08-31
Also published as: US20130345396A1; WO2010082367A1; KR20110105761A; EP2380901B1; US9006171B2; CN102164946B; US20110171690A1; EP2380901A4; EP2380901A1; JP2010163400A; CN102164946A

Abstract

본 발명은 소량의 섭취로 ACE를 유효하게 저해하며, 부작용의 걱정이 없고, 고혈압자가 일상 생활 중에서 용이하게 경구 섭취할 수 있는 ACE 저해 펩티드 및 상기 펩티드를 함유하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 하기 구조식 (1)∼(9)로 나타내는 펩티드, 및 그의 염을 제공한다: (1) Asp-Arg-Pro, (2) Asn-Trp, (3) Val-Gly-Leu, (4) Ile-Gly-Val, (5) Gly-Val-Pro, (6) Ile-Pro-Tyr, (7) pyroGlu-Pro, (8) Tyr-Thr, (9) Pro-Trp

Description

안지오텐신 변환 효소 저해 펩티드{ANGIOTENSIN CONVERTING ENZYME INHIBITORY PEPTIDE}

본 발명은 안지오텐신 변환 효소를 저해함으로써 혈압 강하의 기능을 발휘하는 펩티드 및 이들 펩티드를 함유하는 조성물, 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

안지오텐신 변환 효소(Angiotensin Converting Enzyme, 이하 ACE로 약칭함)는, 동물 체내에 존재하는 카르복시펩티다아제의 일종이며, 안지오텐신 I의 펩티드 결합의 하나를 절단하여 안지오텐신 II를 생산한다. 안지오텐신 II는 강력한 승압 작용을 갖는 펩티드 호르몬이고, 혈관 수축이나 알도스테론 분비 촉진 등을 통해 혈압 상승을 야기한다. 따라서, ACE 활성을 저해하면 안지오텐신 II의 생산을 억제할 수 있어, 고혈압증의 치료가 가능하다. 지금까지 ACE 저해 물질로서 캡토프릴 등의 의약품이 실용화되어, 널리 사용되고 있다. 그러나, 이들 의약품은 작용이 강력하기 때문에 부작용의 염려가 있어, 많은 ACE 저해약에서는 헛기침 등의 부작용에 대한 주의가 요구되고 있다.

한편, ACE의 기질인 안지오텐신 I가 펩티드이기 때문에, 천연물 유래의 펩티드에 의해 ACE를 경합적으로 저해하고, 부작용이 없는 고혈압 치료제를 제공하는 연구가 행해져 왔다(예컨대 특허문헌 1∼5 참조). 이들 펩티드는 그 작용이 온화하기 때문에, 안전성이 높은 것으로 기대되는 한편, 유효량을 섭취하기 위해서는 펩티드 또는 펩티드를 함유하는 조성물을 비교적 대량으로 섭취해야 하는 문제가 있다. 더 나아가서는, 이들 펩티드의 대부분은 전체의 소수성이 높고, 이러한 펩티드는 일반적으로 쓴맛이 강하여(예컨대 특허문헌 6, 비특허문헌 1∼2 참조), 대량으로 경구 섭취하는 것이 어려운 문제도 있다.

[특허문헌]

특허문헌 1: 일본 특허 공개 평4-091097호 공보

특허문헌 2: 일본 특허 공개 평5-262790호 공보

특허문헌 3: 일본 특허 공개 평6-040944호 공보

특허문헌 4: 일본 특허 공개 평7-188282호 공보

특허문헌 5: 일본 특허 공개 평10-175997호 공보

특허문헌 6: 일본 특허 공개 제2006-75064호 공보

비특허문헌 1: Wenyi Wang et al. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2005,(4), p.63-78.

비특허문헌 2: 후지마키 마사오 등 저, 「개정신판 식품화학」, 아사쿠라 서점, 1976년 3월, p.117-118

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 소량의 섭취로 ACE를 유효하게 저해하며, 부작용의 걱정이 없고, 쓴맛이 적기 때문에, 고혈압자가 일상생활중에서 용이하게 경구 섭취할 수 있는 ACE 저해 펩티드 및 이들 펩티드를 함유하는 조성물, 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자 등은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 지금까지 ACE 저해 작용이 있는 것이 알려져 있지 않는 화학 구조(아미노산 배열)를 가지며, 그 작용이 매우 강한 펩티드를 발견하여, 본 발명에 이르렀다.

즉 본 발명은,

1) 하기 구조식 (1)∼(9)로 나타내는 안지오텐신 변환 효소 저해 펩티드, 및 그의 염:

(1) Asp-Arg-Pro, (2) Asn-Trp, (3) Val-Gly-Leu, (4) Ile-Gly-Val, (5) Gly-Val-Pro, (6) Ile-Pro-Tyr, (7) pyroGlu-Pro, (8) Tyr-Thr, (9) Pro-Trp

2) 상기 1) 기재의 펩티드 중 1종 이상을 함유하는 안지오텐신 변환 효소 저해제.

3) 상기 1) 기재의 펩티드 중 1종 이상을 함유하고, 고혈압의 증상을 완화하는 것을 특징으로 하는 조성물.

4) 대두를 25℃ 이상에서 누룩균 배양물과 함께 혼합 교반하는 것을 특징으로 하는 상기 1) 기재의 펩티드의 제조 방법.

을 제공하는 것이다.

본 발명에 의해, 소량의 섭취로 ACE를 유효하게 저해하며, 부작용의 걱정이 없고, 쓴맛이 적기 때문에, 고혈압자가 일상생활 중에서 용이하게 경구 섭취할 수 있는 ACE 저해 펩티드 및 이들 펩티드를 함유하는 조성물, 및 그 제조 방법이 제공되었다.

도 1은 조성물 1로부터 Asp-Arg-Pro를 단리했을 때의 UV 피크를 도시하는 도면이다.
도 2는 조성물 1을 고혈압 래트에 장기간 투여했을 때의 혈압치의 변화를 도시하는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 펩티드 (1) Asp-Arg-Pro, (2) Asn-Trp, (3) Val-Gly-Leu, (4) Ile-Gly-Val, (5) Gly-Val-Pro, (6) Ile-Pro-Tyr, (7) pyroGlu-Pro, (8) Tyr-Thr, (9) Pro-Trp는, 각 아미노산 잔기를 일반적으로 사용되는 3문자 표기로 나타낸 디펩티드 또는 트리펩티드이며, pyroGlu는 피로글루타민산 잔기를 가리킨다. 이들 펩티드는, 예컨대 화학적으로 합성하는 방법으로 제조할 수 있다. 주지의 방법으로서, 예컨대 아미노말단측의 아미노산의 아미노기를 벤질옥시카르보닐기로 보호하고, 카르복실기를 p-니트로페닐에스테르기로 활성화하며, 카르복실말단측의 아미노산과 트리에틸아민 존재하에서 축합시킨 후, 접촉 환원이나 트리플루오로초산에 의해 보호기를 제거하는 액상법과, 폴리머성의 고상 지지체에 카르복실말단측의 아미노산을 결합하고, 아미노기의 보호와 카르복실기의 활성화를 실시한 아미노산을 순차 펩티드 결합에 의해 결합한 후, 트리플루오로초산이나 불화수소 등을 이용하여 고상 지지체로부터 절단하여, 아미노산 측쇄의 보호기를 제거하는 고상법이 있지만, 어떤 방법으로도 제조할 수 있다. 또한 펩티드 단체뿐만 아니라, 생리학적으로 허용되는 이온과의 염이어도, 같은 효과를 기대할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드는, 상기 아미노산 배열을 포함하는 단백질을 적당한 프로테아제제에 의해 가수 분해한 조성물로부터 칼럼 크로마토그래피 등을 이용하여 분리 정제함으로써 제조할 수도 있다. 이 경우, 상기 펩티드를 함유하는 조성물의 형태로 섭취하여도 원하는 효과를 얻을 수 있다. 전술한 화학 합성법과 비교하여, 대량 제조가 용이하고, 제조비용도 적기 때문에, 보다 바람직하다.

본 발명의 펩티드를 단백질의 가수 분해에 의해 얻는 경우의 단백질원으로서는, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 어떠한 것을 이용하여도 좋지만, 바람직하게는 콩과 식물을 이용하는 것이 좋다. 더 바람직하게는, 재배량이 많고, 가격이 저렴하며, 단백질 함량이 많고, 식경험이 풍부하며, 분해 후의 조성물의 정미(정미)가 양호한 점에서, 대두를 이용하는 것이 좋다. 대두의 종류로서는, 황색 대두, 적색 대두, 흑색 대두 등을 들 수 있지만, 특히 황색 대두가 바람직하다. 대두의 모양으로서는, 환대두(전지 대두), 탈지 대두, 정제 대두 단백질 등을, 그대로 또는 해쇄, 분쇄한 후, 적절하게 단백질 변성 처리를 실시하여, 이용할 수 있다. 단백질 변성 처리로서는, 공업적으로 널리 행해지고 있는 가압증자가 바람직하다.

본 발명의 펩티드를 단백질의 가수 분해에 의해 얻는 경우의 프로테아제제로서는, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 어떠한 것을 이용하여도 좋지만, 프로테아제 활성이 높고, 가격이 저렴하며, 식경험이 풍부하고, 안전성이 보증되어 있으며, 분해 후의 조성물의 정미가 양호한 점에서, 누룩균 배양물을 이용하는 것이 좋다. 누룩균으로서는, 특히 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 및/또는 아스페르길루스 소야(Aspergillus sojae)가 적합하다. 이들 미생물은 간장이나 된장의 양조에 있어서 예전부터 단백질 분해에 이용되어 온 것뿐만 아니라, 미국 식품의약품국(FDA)에 의해, GRAS(Generally Recognized As Safe)의 리스트에 게재되어, 안전성을 인정받고 있다. 누룩균 배양물이란, 대두나 밀, 쌀 등을 배지로 하고, 누룩균을 섭취하여 배양함으로써 얻어지는 것이다. 그 배양 방법의 차이에 의해, 액체 누룩 배양물과 고체 누룩 배양물로 분류되지만, 본 발명에서는 모두 이용 가능하다. 예컨대 액체 누룩 배양물은 대두나 밀, 밀기울 등을 1%∼5% 포함하는 액체 배지에 누룩균을 접종하여, 25℃∼40℃에서 24∼120 시간 배양하여 얻을 수 있다. 또한 고체 누룩 배양물은, 대두나 밀 등을 포함하는 고체 배지에 누룩균을 접종하여, 25℃∼40℃에서 24∼120 시간 배양하여 얻을 수 있다.

상기한 가수 분해 반응의 조건으로서는, 누룩균 배양물을 종농도 10%∼70%, 바람직하게는 30%∼50%, 대두를 종농도 5%∼40%, 바람직하게는 15%∼30%, 식염을 종농도 0%∼25%, 바람직하게는 6%∼18%, 또한 물을 종농도 0%∼85% 혼합하고, 대두와 식염의 종농도가 상기 범위가 되도록 조제한 후, 25℃∼60℃, 바람직하게는 30℃∼55℃에서, 교반 속도 10 rpm∼150 rpm으로, 12∼240 시간, 바람직하게는 24∼168 시간 반응시킨다. 적절하게 향미 향상을 위해, 자이고사카로마이세스속 등의 효모를 첨가하여, 동시에 발효시키는 것도 가능하다.

상기 제조 방법에 의해 조제한 조성물은, 본 발명의 펩티드를 함유함에도 불구하고, 종래 알려져 있는 ACE 저해 펩티드 함유 조성물과는 현저하게 상이하여, 쓴맛이 거의 느껴지지 않고, 순하고 풍부한 우마미·깊은맛과, 은은하고 우수한 방향(芳香)을 가지며, 식품으로서 맛있게 섭취할 수 있는 것이다.

상기 조성물로부터, 본 발명의 펩티드를 분리 정제하기 위한 방법으로서는, 한외여과, 투석, 각종 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 이들은, 일반적으로 널리 이용되고 있는 방법이다. 특히, 샘플의 처리량과 정제 효율의 점에서, 양이온 교환 크로마토그래피와 역상 크로마토그래피가 유효하다.

이와 같이 하여 얻어진 본 발명의 펩티드는, ACE 저해제, 즉 혈압 상승 억제/강하제로서, 경구 또는 비경구 투여에 의해 이용할 수 있다. 상법에 따라, 경구 투여의 경우에는 정제, 과립제, 분말제, 캡슐제 등의 형태로 할 수 있고, 비경구 투여의 경우에는 주사약 제제, 경피제, 좌제 등으로 할 수 있다.

또한, 고혈압 예방 및/또는 치료를 목적으로 한 음식품(예컨대 건강 식품, 건강 지향 식품, 기능성 식품, 특정 보건용 식품 등)에 이용할 수 있다. 본 발명의 펩티드를 각종 음식품에 첨가하여 제조할 수도 있지만, 전술한 바와 같이 펩티드를 함유하는 조성물의 형태라도, 그 풍미가 양호하기 때문에, 각종 음식품에 첨가하는 것은 용이하다. 더 나아가서는, 조성물 그 자체를 섭취하는 것도 용이하다. 이와 같이 하여 얻어지는 음식품으로서는, 예컨대 간장, 간장 가공품, 분말 간장, 된장, 쯔유·스프류, 조미국물류, 두유, 발효유, 청량 음료, 음료 농축 원액 및 조정용 분말, 주류, 유지 함유 식품, 면류, 수산 가공 식품, 축육 가공 식품, 반고형 식품, 페이스트상 식품, 고형 식품 등을 들 수 있다.

이들 펩티드의 투여량은, 예방 또는 치료 목적·수단에 따라 상이하지만, 펩티드로서 1일당 0.01 ㎎∼100 ㎎의 범위가 바람직하다. 또한, 각종 음식품으로서 섭취하는 경우에는, IC₅₀으로 나타내는 ACE 저해 활성이 전체적으로 1 ㎎/㎖ 이하가 되는 것이 바람직하다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 기재에 의해 전혀 제한되는 것이 아니다.

실시예 1

<화학 합성법에 의한 펩티드의 제조>

이하에 Asn-Trp의 제조를 예시한다. 또한 특기 이외의 시약은 와코준야쿠제를 사용하였다. 우선 120 ㎎의 L-트립토판 염산염을 2 ㎖의 디메틸포름아미드에 용해하고, 150 ㎕의 트리에틸아민과 300 ㎎의 Z-Asn-Onp(고쿠산카가쿠 제조)를 첨가하여, 실온에서 24시간 교반하였다. 이어서, 20 ㎖의 1% 암모니아수를 첨가하고, -10℃에서 1시간 방치하여 생긴 석출물을 여과하여 취하여, 석출물을 냉수로 세정하였다. 이 석출물을 20 ㎖의 메탄올에 용해하고, 20 ㎎의 팔라듐 활성 탄소를 첨가하며, 질소 가스 봉입 후, 접촉 환원 반응을 행하였다. 반응은 실온, 대기압하에서 진탕하면서 수소가스를 접촉시켜, 3일간 행하였다. 반응 후, 불용물을 여과 제거하고, 메탄올을 증류 제거한 후, 증류수에 용해하였다. 이어서, HPLC(시마즈 제작소 제조 LC-8A)에 접속한 ODS 칼럼(나카라이테스크 제조 Cosmosil 5C18-ARII 20 ㎜×250 ㎜)에 의해 분취 정제를 하였다. 용리액 A는 초순수 + 0.1% 트리플루오로초산(TFA)으로, 용리액 B는 아세토니트릴+0.1% TFA로 하고, 상법에 따라 구배 용출하였다. 각 분획을 박층 크로마토그래피(TLC)로 전개하고, 닌히드린 시약으로 스폿이 나타나는 분획으로부터 87 ㎎의 Asn-Trp를 얻었다. 이 화학 구조는 프로테인 시퀀서(어플라이드 바이오시스템스 제조 Procise 492), 및 NMR(브루커 제조 AVANCE 500), 및 LC-MS(애질런트 테크놀러지스 제조 1100, 어플라이드 바이오 시스템스 제조 QSTAR Elite, 칼럼은 노무라 카가쿠 제조 Develosil RPAQUEOUS-AR)를 이용하여 상법에 따라 확인하였다.

상기 합성법에 의해 얻어진 펩티드의 ACE 저해 활성을 측정하였다. 측정법으로서는, Yamamoto 등의 방법(야마모토 세쯔코 등, 일본 흉부 질병 학회지, 1980,18, p.297-302)을 일부 개변된 방법으로 행하였다. 즉 100 ㎕의 기질 용액[12.5 mM Hippuryl-His-Leu(시그마 제조), 100 mM 붕산 버퍼 pH 8.3, 1M NaCl]에 140 ㎕의 샘플 용액과 10 ㎕의 효소 용액[0.3 U/㎖ ACE(토끼의 폐 유래, 시그마 제조), 50 mM 붕산버퍼 pH 8.3]을 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응하였다. 이어서, 250 ㎕의 1N 염산을 첨가하여 반응을 정지하고, 1.5 ㎖의 초산에틸을 첨가하여 교반하며, 원심 분리 후, 1 ㎖의 초산에틸층을 원심 농축 건고하고, 1 ㎖의 초순수에 용해하여, 228 nm의 흡광도를 측정하였다. ACE 저해율은, 다음식으로 나타낸다.

ACE 저해율(%) = {1-(ODs-ODsb)/(ODc-ODcb)}×100

또한, ODs는 상기한 바와 같이 샘플에 효소 용액을 첨가하여 반응시켰을 때의 흡광도이고, ODsb는 효소 용액 대신에 초순수를 첨가했을 때의 흡광도이며, ODc는 샘플 용액 대신에 초순수를 첨가했을 때의 흡광도이고, ODcb는 효소 용액과 샘플 용액 대신에 초순수를 첨가했을 때의 흡광도이다. 또한, 이 반응계에 대하여 50%의 효소 활성 저해율을 부여하는 샘플 농도를 IC₅₀값으로 한다.

본 발명의 펩티드의 ACE 저해 활성을 표 1에 나타낸다. 또한 지금까지 보고된 주된 ACE 저해 펩티드, 약 400종류의 IC₅₀값은 약 1 μM∼1000 μM였다(야마다 코지 편저, 「식의 과학 라이브러리 3 식품 성분의 작용」, 아사쿠라 서점, 2004년 3월, p.63-67). 본 발명의 펩티드는, 기지의 펩티드와 비교하여 충분히 강한 활성을 갖고 있기 때문에, 산업상 유용하다고 생각된다.

아미노산 배열	ACE 저해 활성(IC₅₀, μM)
Asp-Arg-Pro	79
Asn-Trp	25
Val-Gly-Leu	257
Ile-Gly-Val	212
Gly-Val-Pro	100
Ile-Pro-Tyr	79
pyroGlu-Pro	106
Tyr-Thr	35
Pro-Trp	186

실시예 2

<대두를 누룩균 배양물로 분해하는 방법에 의한 펩티드의 제조>

가열 변성한 환대두와 밀을 등량 포함하는 고체 배지에, 누룩균 아스페르길루스 소야의 포자를 첨가하여, 25℃∼40℃에서 72시간 배양함으로써 누룩균 배양물을 얻었다. 다음에 가열 변성한 환대두 14 ㎏, 누룩균 배양물 2 ㎏, 물 16 L, 식염 3 ㎏을 혼합하고, 45℃, 100 rpm으로 5일간 교반하여 모로미를 얻었다. 이어서, 효모 자이고사카로마이세스 룩시이를 1.5×10⁶개/㎖의 비율로 혼합하고, 25℃에서 7일간 정치하였다. 이어서, 유압식 압착기를 이용하여 모로미로부터 불용성 고형분을 제거하고, 청징액을 얻었다. 또한 HS 살균기(히사카 제작소 제조)를 이용하여 117℃로 5초간 가열함으로써 효소 실활과 살균을 행하고, 50℃에서 3일간 정치한 후, 찌꺼기 성분을 포함하지 않는 상청만을 20 L 채취하였다(조성물 1).

5 L의 조성물 1을 전기 투석에 의해 식염 약 0%까지 탈염하고, 칼럼 용적 18 L의 ODS 칼럼(다이소 제조 SP-120-40/60-ODS-B)에 로딩하였다. 용리액 A는 0.1% TFA를 함유하는 증류수로, 용리액 B는 0.1% TFA를 함유하는 30% 아세토니트릴로, 용리액 C는 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴로 하고, A에서 B까지 20시간, 이어서 B에서 C까지 5시간의 선형 구배 용출을 하였다. 유속은 45 ㎖/min으로 하고, 1600 ㎖씩 분획을 얻었다. 6개씩의 분획을 합쳐서 증발기로 농축하여, 동결 건조 분말을 얻었다. 이들 ACE 저해 활성(IC₅₀값)을 측정하였다.

상기한 동결 건조 분말을 초순수에 용해 후, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC, 시마즈 세이카쿠쇼)에 접속한 ODS 칼럼(Cosmosil-5C18-ARII 20 ㎜×250 ㎜, 나카라이테스크)에 로딩하였다. 용리액 A는 0.1% TFA를 함유하는 초순수로, 용리액 B는 0.1% TFA를 함유하는 70% 아세토니트릴로 하고, B: 0%로 10분 유지 후, B: 0%부터 B: 30%까지 70분간, 이어서 B: 100%까지 20분간의 선형 구배 용출을 행하였다. 유속은 5 ㎖/min으로 하고, 7.5 ㎖씩 분획을 얻었다. 각 분획으로부터 100 ㎕씩 샘플링하고, 원심 농축 건고 후, 500 ㎕의 초순수에 재용해하여, ACE 저해 활성을 측정하였다.

또한, ACE 저해 활성을 갖는 분획을 C30 칼럼(노무라카가쿠 제조 Develosil RPAQUEOUS-AR 20 ㎜×250 ㎜)에 로딩하였다. 용리액 A는 초순수 + 0.1% TFA로, 용리액 B는 40% 아세토니트릴 + 0.1% TFA로 하고, 구배 조건은 (A100%: 10분간)→(B30%까지 구배: 60분간)→(B100%까지 구배: 30분간)으로 하며, 유속 5 ㎖/분, 분획 사이즈 6 ㎖로 분획하였다. 그 크로마토그램을 도 1에 도시한다. ACE 저해 활성을 측정한 바, 화살표로 도시한 피크에만 활성이 보였다. 이 분획을 증발기로 농축하고, 프로테인 시퀀서, NMR, LC-MS로 구조 해석한 바, Asp-Arg-Pro였다. 마찬가지로 하여, 다른 분획으로부터, Asn-Trp, Val-Gly-Leu, Ile-Gly-Val, Gly-Val-Pro, Ile-Pro-Tyr, pyroGlu-Pro를 단리하였다.

상기한 LC-MS를 이용하여 조성물 1에 함유되는 본 발명의 펩티드를 정량하였다. 우선 화학 합성에 의해 얻어진 펩티드를 표품으로서 검량선을 작성하였다. 이어서, 조성물 1을 전기 투석에 의해 탈염하고, 적절하게 희석하며 분석하여, 각 펩티드에 유래하는 검출된 이온량으로부터 함유량을 계산하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

아미노산 배열	조성물 1 중의 함유량(μg/ml)
Asp-Arg-Pro	154
Asn-Trp	2
Val-Gly-Leu	1
Ile-Gly-Val	2
Gly-Val-Pro	56
pyroGlu-Pro	60
Tyr-Thr	10
Pro-Trp	127

실시예 2

마찬가지로, 조건이 상이한 제조 방법으로 얻어진 조성물에 함유되는, 본 발명의 펩티드의 함유량을 표 3에 나타낸다. 비교예로서, 대두 대신에 밀, 누룩균 배양물 대신에 식품용 프로테아제제(노보자임즈 제조 알카라아 제조 2.4 L-FG)를 사용하였다. 표 3의 결과로부터, 원료로서는 대두가 우수하고, 효소제로서는 누룩균 배양물이 우수하며, 반응 온도는 25℃ 이상이 우수한 것을 알 수 있다. 즉 대두를 누룩균 배양물과 함께 25℃ 이상에서 혼합 교반함으로써, 본 발명의 펩티드를 특히 효율적으로 제조할 수 있다.

원료	효소제	반응 온도	Asp-Arg-Pro (μg/ml)	Gly-Val-Pro (μg/ml)	Tyr-Thr (μg/ml)	Pro-Trp (μg/ml)	비고
대두	누룩균 배양물	20℃	33	21	1	90	본 발명 1
대두	누룩균 배양물	25℃	47	26	3	181	본 발명 2
대두	누룩균 배양물	30℃	80	37	4	185	본 발명 3
대두	누룩균 배양물	35℃	95	42	4	161	본 발명 4
대두	누룩균 배양물	50℃	154	56	10	127	본 발명 5
대두	알카타아제	35℃	3	n.d.	1	79	비교예 1
밀	누룩균 배양물	35℃	3	n.d.	1	7	비교예 2

실시예 3

<래트 사료 혼합 장기 투여에 의한 강압 작용의 검증>

5주령의 수컷 식염 감수성 고혈압 래트(Dahl-S) 35마리를 7마리씩, 이하의 5군으로 나눠 30일간 사료 혼합 장기 투여 시험을 행하였다. 샘플의 식염 농도는 염광분석법에 의해 분석하고, 사료중 식염 농도가 각 군 사이에서 동일해지도록 식염을 첨가하여 조정하였다. 시험 기간중, 사료는 자유 섭취로 했지만, 섭이량은 각 군 사이에서 대략 동일했다.

제1군(대조)(도면 중 ▲): 저염 간장(식염 농도 7% w/v)을 사료에 대하여 25% v/w 혼합한 사료(사료중 식염 농도 3% w/w).

제2군(조성물 1)(도면 중 ●): 저염 간장에 상기 조성물 1을 20%v/v 혼합하고, 사료에 대하여 25%v/w 혼합한 사료(사료중 식염 농도 3%w/w, 조성물 1 농도 1.5%w/w).

제3군(조성물 1로부터 펩티드를 제외한 분획)(도면 중 ○): 저염 간장에 상기 ODS-A 분획(조성물 1을 ODS 칼럼으로 분획한, 펩티드를 거의 함유하지 않는 분획)을 혼합하고, 사료에 대하여 25%v/w 혼합한 사료(사료중 식염 농도 3%w/w, ODS-A 분획 농도 1.3% w/w).

제4군(조성물 1의 펩티드 분획)(도면 중 □): 저염 간장에 상기 ODS-B 분획과 ODS-C 분획(조성물 1을 ODS 칼럼으로 분획한, 펩티드를 많이 함유하는 분획)을 중량비에 따라 혼합하고, 사료에 대하여 25% v/w 혼합한 사료(사료중 식염 농도 3% w/w, ODS-B·ODS-C 분획 합계 농도 0.2% w/w).

제5군(염산 분해한 펩티드 분획)(도면 중 ■): ODS-B 분획과 ODS-C 분획을 통상법에 따라 염산 분해함으로써 펩티드를 완전히 분해하고, 제4군과 마찬가지로 혼합한 사료(사료중 식염 농도 3%w/w, ODS-B·ODS-C 분획 합계 농도 0.2% w/w).

시험 시작시부터 일주일마다, 비관혈식 혈압계 MK-2000을 이용하여 수축기 혈압을 측정하였다. 이들의 결과를 도 2에 도시한다. 또한 투여 30일째의 수축기 혈압치를 이용하여, Tukey의 다중 비교 검정에 의해 통계 처리를 행하였다.

도 2의 결과로부터, 본 발명의 펩티드를 함유하는 조성물 1은 혈압 상승을 유의하게 억제하였다. 또한 펩티드를 함유하는 분획에 강압 작용이 확인된 한편, 펩티드를 분해한 것에 의해 강압 작용을 잃었기 때문에, 조성물 1의 강압 작용은 펩티드에 유래하는 것이 시사되었다.

실시예 4

<관능 평가>

실시예 2에 기재된 조성물 1과 비교예 1을 사용하여, 관능 평가를 하였다. 패널은 8명으로 하고, 「쓴맛의 강도」와 「맛의 바람직함」을 1대 비교법으로 평가하였다. 표 4의 결과로부터, 본 발명의 발효 조미료는 펩티드를 많이 함유함에 불구하고, 쓴맛이 적고, 바람직한 맛을 갖고 있는 것을 알 수 있다. 프로테아제제에 의한 펩티드 제조 방법은 지금까지 많이 개시되어 있지만, 본 발명은 정미의 점에서 종래 기술보다 우수하다고 생각된다.

	쓴맛이 강한 샘플	맛이 바람직한 샘플
조성물 1	1	8
비교예 1	7	0

본 발명을 상세하고 특정한 실시양태를 참조하여 설명했지만, 본 발명의 정신과 범위를 일탈하지 않고 여러 가지 변경이나 수정을 가할 수 있는 것은 당업자에 있어서 명백하다.

본 출원은, 2009년 1월 19일 출원한 일본 특허 출원(일본 특허 출원 2009-008503)에 기초하는 것이며, 그 내용은 여기에 참조로서 포함된다. 또한 여기에 인용되는 모든 참조는 전체로서 포함된다.

본 발명으로 얻어지는 안지오텐신 변환 효소 저해 펩티드는, 소량의 섭취로 ACE를 유효하게 저해하며, 부작용의 걱정이 없고, 고혈압자가 일상생활 중에서 용이하게 경구 섭취할 수 있다. 또한 상기 펩티드를 함유하고, 풍미에 우수하며, 안전성이 높고, 식품으로서의 섭취가 용이한 조성물의 제조 방법을 제기한 것에 의해, 고혈압자의 생활의 질의 향상에 크게 공헌하는 것이 가능해진다.

Claims

하기 구조식으로 나타내는 안지오텐신 변환 효소 저해 펩티드, 및 그의 염:
Asp-Arg-Pro.
삭제
제1항에 기재된 펩티드를 함유하고, 고혈압의 증상을 완화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
대두를 25℃ 이상에서 누룩균 배양물과 함께 혼합 교반하는 것을 특징으로 하는 제1항에 기재된 펩티드의 제조 방법.