CN117587090B - 一种玉米蛋白水解物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种玉米蛋白水解物及其制备方法与应用，属于生物活性肽产品制备技术领域。本发明提供的抗幽门螺旋杆菌粘附和高蛋白回收率的玉米蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：将玉米蛋白粉进行预处理后，用蛋白酶N进行水解1，取上清液为水解物1；取沉淀用碱性蛋白酶进行水解2，取上清液为水解物2，将水解物1和水解物2合并，干燥得玉米蛋白水解物。本发明提供的玉米蛋白水解物的制备方法，能够制备获得具有高抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物，且本发明制备方法具有高蛋白回收率的优势，提高了原料利用率，显著降低了产品成本。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽产品制备技术领域，尤其涉及一种玉米蛋白水解物及其制备方法与应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌（Helibactor pylori）是一种革兰氏阴性杆菌，是一种特殊的病原体，机体感染H. pylori后，一般难以自行清除，若不采取根除治疗，将终生携带。H. pylori特异性地与胃粘膜上皮细胞粘附，是公认的慢性胃炎与溃疡性疾病的重要致病因子之一，也可能与胃癌、胃粘膜相关性淋巴瘤的发病密切相关，世界卫生组织将其列为I类致癌因子。H. pylori表面的粘附素可以特异性识别宿主细胞表面的受体，从而实现H. pylori对胃粘膜上皮细胞的粘附。H. pylori一旦粘附在胃上皮表面，便可以抵抗胃蠕动和排空所施加的力，进而获得生长所需的养分，输送毒素破坏宿主细胞并引起感染。
现阶段，最常采用的根除H.pylori的方法是抗生素治疗，常用质子泵抑制剂和两种抗生素的三联疗法以及铋剂、质子泵抑制剂和两种抗生素联合使用的四联疗法。但随着H.pylori对抗生素的耐药性逐年上升，其根除率也在下降，并且服用抗生素具有很多副作用，如肠道不适、过敏等。因此，开发抗生素的替代疗法对于防治H.pylori感染、保持人类胃肠道菌群健康具有重要意义。
生物活性肽因其具有多种生物活性而被关注，但生物活性肽的生产中存在蛋白回收率低、原料利用率低等问题，导致产品生产成本高。因此研究兼具高抗H. pylori粘附生物活性和高蛋白回收率的生物活性肽产品具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种玉米蛋白水解物的制备方法，本发明提供的玉米蛋白水解物制备方法能够制备获得具有高抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物，且本发明制备方法具有高蛋白回收率的优势，提高了原料利用率，显著降低了产品成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种抗幽门螺旋杆菌粘附和高蛋白回收率的玉米蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：将预处理后的玉米蛋白粉用蛋白酶N进行水解1，取上清液为水解物1；取沉淀用碱性蛋白酶进行水解2，取上清液为水解物2，将水解物1和水解物2合并，干燥得玉米蛋白水解物。
在本发明中，所述预处理优选的包括如下步骤：将玉米蛋白粉膨化、去淀粉得预处理后的玉米蛋白粉。所述膨化优选的采用三段式升温膨化，第一段膨化温度优选为60℃、第二段膨化温度优选为110℃，第三段膨化温度优选为160℃。膨化结束后，进行去淀粉步骤，所述去淀粉优选的为加入α-淀粉酶进行水解，所述α-淀粉酶的添加量优选为玉米蛋白粉质量的0.8%~1.2%，更优选为玉米蛋白粉质量的1.0%。进行α-淀粉酶水解时，水解的温度优选为60℃~70℃，更优选为65℃~68℃，水解的时间优选为1.5 h~2.5 h，更优选为1.8 h~2.0h。
在本发明中，获得预处理后的玉米蛋白粉后，用蛋白酶N进行水解1。所述蛋白酶N的添加量以预处理后的玉米蛋白粉的重量计，优选为每g预处理后的玉米蛋白粉添加400U-600 U蛋白酶N，更优选为每g预处理后的玉米蛋白粉添加450 U-550 U蛋白酶N。所述水解1的温度优选为45℃~55℃，更优选为48℃~52℃，所述水解1的时间优选为1.5 h~2 h，更优选为1.6 h~1.9 h，所述水解1的pH值优选为6.5~7.5，更优选为6.7~7.2。
在本发明中，水解1结束后，取沉淀用碱性蛋白酶进行水解2，所述碱性蛋白酶的添加量以预处理后的玉米蛋白粉的重量计，优选为每g预处理后的玉米蛋白粉添加800 U-1200 U碱性蛋白酶，更优选为每g预处理后的玉米蛋白粉添加900 U-1100 U碱性蛋白酶。所述水解2的温度优选为50℃~60℃，更优选为52℃~56℃，所述水解2的时间优选为2 h~3 h，更优选为2.2 h~2.8 h，所述水解2的pH值优选为8.0~9.0，更优选为8.2~8.6。
本发明还提供了上述制备方法制备所得的玉米蛋白水解物。
本发明还提供了上述制备方法或上述玉米蛋白水解物在制备抑制幽门螺旋杆菌感染产品或在制备防治胃部炎症产品中的应用。
在本发明中，所述产品优选的包括药物。
本发明的有益效果：
本发明提供的玉米蛋白水解物的制备方法，能够制备获得具有高抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物，且本发明制备方法具有高蛋白回收率的优势，提高了原料利用率，显著降低了产品成本。
采用本发明制备方法制备所得的玉米蛋白水解物，一方面可以抑制幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞活性，减少幽门螺旋杆菌在人胃部的定植量。另一方面具有产品成本低的优势，适用于工业生产。
附图说明
图1为菌落浓度与菌悬液光密度值（OD600）标准曲线；
图2为异硫氰酸荧光素（FITC）荧光强度值与OD600标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
（1）将玉米蛋白粉（购自黑龙江龙凤玉米开发有限公司）进行三段式膨化处理，第一段膨化温度为60℃、第二段膨化温度为110℃，第三段膨化温度为160℃，膨化结束后，用去离子水配置成浓度为10%（w/v）的悬液，加入玉米蛋白粉质量1%的α-淀粉酶（购自北京奥博星公司），65℃反应2 h去除淀粉。在100℃的条件下灭酶10 min，10000 rpm离心15 min，取沉淀蒸煮后烘干得预处理后的玉米蛋白粉。
（2）按照500 U/g预处理后的玉米蛋白粉（即每g预处理后的玉米蛋白粉添加500 U蛋白酶N）的添加量加入蛋白酶N（购自Amano酶制剂公司，Protin NY50C, Lot:CPRNS0552502），与预处理后的玉米蛋白粉混合，50℃、pH7.0条件下水解1.8 h，将酶解物加热至100℃灭酶10 min，冷却，3000 r/min离心 5min，取上清液为水解物1，水解物1中蛋白的回收率为总蛋白的30.51%（蛋白的回收率=（水解物中蛋白含量/原玉米蛋白粉中蛋白含量）×100%，下述蛋白的回收率均采用此公式计算）。取沉淀进行后续碱性蛋白酶水解。
（3）按照1000 U/g预处理后的玉米蛋白粉（即每g预处理后的玉米蛋白粉添加1000U碱性蛋白酶）的添加量加入碱性蛋白酶（购自丹麦诺维信公司的Alcalase 2.4 L），与第一步水解所得沉淀混合，55℃、pH8.5条件下水解2.5 h，将酶解物加热至100℃灭酶10 min，冷却，3000 r/min离心5 min，取上清液为水解物2，所得水解物2中蛋白的回收率为总蛋白的46.63%；
将水解物1和水解物2混合合并，冷冻干燥，得到玉米蛋白水解物，总蛋白回收率为77.14%。
对比例1
与实施例1的区别在于先进行碱性蛋白酶水解，再进行蛋白酶N水解，其余步骤均同实施例1，具体过程如下：
（1）同实施例1步骤（1）。
（2）按照1000 U/g预处理后的玉米蛋白粉的添加量加入碱性蛋白酶，55℃、pH8.5条件下水解2.5 h，将酶解物加热至100℃灭酶10 min，冷却，3000 r/min离心5 min，取上清液为水解物1，所得水解物1的蛋白回收率为总蛋白的50.71%。取沉淀进行后续蛋白酶N水解。
（3）按照500 U/g预处理后的玉米蛋白粉的添加量加入蛋白酶N，与步骤（2）所得沉淀混合，50℃、pH7.0条件下水解1.8 h，将酶解物加热至100℃灭酶10 min，冷却，3000 r/min离心5 min，取上清液得到水解物2，所得水解物2的蛋白回收率为总蛋白的13.94%。
将水解物1和水解物2混合合并，冷冻干燥，得到玉米蛋白水解物，总蛋白回收率为64.65%。
对比例2
与实施例1的区别在于采用蛋白酶N和碱性蛋白酶进行连续酶解，其余步骤均同实施例1，具体操作如下：
（1）同实施例1步骤（1）。
（2）按照500 U/g预处理后的玉米蛋白粉的添加量加入蛋白酶N（购自Amano酶制剂公司），与预处理后的玉米蛋白粉混合，50℃、pH7.0条件下水解1.8 h，调节溶液pH至8.5，温度55 ℃。然后按照1000 U/g预处理后的玉米蛋白粉的添加量加入碱性蛋白酶（购自丹麦诺维信），继续在55℃、pH8.5条件下水解2.5 h，将酶解物加热至100℃灭酶10 min，冷却，3000r/min离心5 min，离心，得到两步连续水解的水解物，冷冻干燥，得到两步连续水解的玉米蛋白水解物，所得两步连续水解的玉米蛋白水解物的蛋白回收率为总蛋白的69.37%。
实施例2
实施例1所得玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验
利用H.pylori ATCC43504菌株（购自于美国模式培养物集存库）作为抗粘附活性试验测定菌株。在37℃条件下将经过冻存的幽门螺旋杆菌菌株解冻，先与液体培养基（3 g大豆蛋白胨、2.5 g K2HPO4、17 g胰蛋白胨和5 g NaCl，加入1 L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1 Mpa灭菌1 h）混合，随后将其接种于斜面培养基（15 g胰蛋白胨、5 g大豆蛋白胨、15 g琼脂、5 g NaCl和950 mL去离子水，搅拌溶解调节pH至7.2，121℃、0.1 Mpa灭菌1 h，在培养基冷却至45℃左右，加入50 mL无菌的脱纤维羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基）上，在37℃微需氧（5% O2，85% N2，10% CO2）条件下，培养48~72 h，得到的菌液可进行菌种传代和抗粘附活性检测。
将传代的幽门螺旋杆菌的菌液，进行四次10倍梯度稀释获得五种不同浓度的菌液，在600 nm条件下测定幽门螺旋杆菌菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD600的标准曲线，如图1所示。
冻存人胃粘膜上皮细胞（GES-1）解冻后移入细胞培养瓶中，细胞培养基组成包括1%青链霉素混合液、10%胎牛血清和90% DMEM培养基。在37℃，5% CO2条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代，离心，用不含抗生素的细胞培养基重悬，调整细胞浓度为3×105 cells/mL。将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100 μL，在37℃，5% CO2培养箱中培养孵育24 h，用于拮抗H. pylori粘附活性的测定实验。
异硫氰酸荧光素（FITC）标记幽门螺旋杆菌
制备FITC浓度为2 mg/mL的DMSO溶液，无菌滤膜过滤处理。按照1:1的比例将幽门螺旋杆菌菌液与其混匀，在避免光照的条件下，生化摇摆台上混合30 min后，在4500 r/min的转速下离心处理3 min，除去上清液，经过1×PBS缓冲液洗涤3次，除去多余的FITC，最后将菌液在液体培养基（3 g大豆蛋白胨、2.5 g K2HPO4、17 g胰蛋白胨和5 g NaCl，加入1 L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1 Mpa灭菌1 h）上稀释至OD600值在0.1左右（108 cfu/mL），备用。
FITC荧光强度值与OD600标准曲线的构建
将上步经过FITC标记处理的幽门螺旋杆菌菌液，按照梯度稀释成六个浓度，在激发波长485 nm和发射波长530 nm条件下，测量其荧光强度值，与此同时在600 nm条件下测OD值，建立FITC荧光强度值和OD600的标准曲线，如图2所示。
玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验
使用无抗生素的细胞培养基，配制一定蛋白浓度的玉米蛋白水解物（实施例1所得）溶液，按照1:1(v/v)的比例与经过FITC标记过的菌液在室温避光条件下进行混合30min，使玉米蛋白水解物的终浓度分别为4 mg/mL，测定不同浓度的玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性。向带有胃粘膜上皮细胞（GES-1）的96孔板中加入100 μL混合后的菌液，在培养箱中放置90 min。然后将溶液去除，用PBS缓冲液清洗3次，随即，将PBS缓冲液按照每孔100 μL量加入，在发射波长530 nm、激发波长485 nm条件下进行荧光强度值的测定。依据荧光强度和图1、图2计算粘附抑制率。阴性对照组即为未添加玉米蛋白水解物的组别。粘附抑制率采用以下公式计算：
结果实施例1所述两步混合后得到的玉米蛋白水解物，其在蛋白浓度4 mg/mL下，其抗粘附活性为52.43±0.65%（进行了6个平行试验）。
对比例3
对比例1所得玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验
具体测定方法同实施例2。结果显示对比例1所述两步分步水解物混合后得到的玉米蛋白水解物，其在蛋白浓度4 mg/mL下，其抗粘附活性为47.69±0.62%（进行了6个平行试验）。
对比例4
对比例2所得玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验
具体测定方法同实施例2。结果显示对比例2所述两步连续水解得到的玉米蛋白水解物在蛋白浓度4 mg/mL下，其抗粘附活性为32.39±0.93%（进行了6个平行试验）。
实施例3
实施例1所得水解物1和水解物2各自的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验
具体测定方法同实施例2，进行了6个平行试验。结果显示，实施例1所得水解物1在蛋白浓度4mg/mL下，其抗粘附活性为37.07±1.12%，实施例1所得水解物2在蛋白浓度4mg/mL下，其抗粘附活性为45.37±1.23%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种抗幽门螺旋杆菌粘附和高蛋白回收率的玉米蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将预处理后的玉米蛋白粉用蛋白酶N进行水解1，取上清液为水解物1；取沉淀用碱性蛋白酶进行水解2，取上清液为水解物2，将水解物1和水解物2合并，干燥得玉米蛋白水解物；
所述水解1的温度为45℃~55℃，所述水解1的时间为1.5h~2h，所述水解1的pH值为6.5~7.5；
所述蛋白酶N的添加量以预处理后的玉米蛋白粉的重量计，为每g预处理后的玉米蛋白粉添加400U-600U蛋白酶N；
所述水解2的温度为50℃~60℃，所述水解2的时间为2h~3h，所述水解2的pH值为8.0~9.0；
所述碱性蛋白酶的添加量以预处理后的玉米蛋白粉的重量计，为每g预处理后的玉米蛋白粉添加800U-1200U碱性蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预处理包括如下步骤：将玉米蛋白粉膨化、去淀粉得预处理后的玉米蛋白粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述去淀粉为加入α-淀粉酶进行水解，所述α-淀粉酶的添加量为玉米蛋白粉质量的0.8%~1.2%。
4.权利要求1-3任意一项所述制备方法制备所得的玉米蛋白水解物。
5.权利要求4所述玉米蛋白水解物在制备抑制幽门螺旋杆菌感染产品中的应用。
6.权利要求4所述玉米蛋白水解物在制备防治胃部炎症产品中的应用。
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