CN117247430A - 一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用 - Google Patents

一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用，属于活性肽技术领域。本发明提供的玉米抗氧化肽，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑5所示的玉米抗氧化肽中的至少一种。本发明首次从玉米蛋白粉中分离得到了具有较高抗氧化活性且抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑5所示的新的玉米抗氧化肽，可作为天然抗氧化剂应用于食品、药品和化妆品中。

Description

一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于活性肽技术领域，尤其涉及一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用。
背景技术
人体的衰老和许多疾病的发生与机体内物质氧化产生的自由基密切相关。正常情况下，机体内的抗氧化酶和内源性抗氧化剂组成的防御系统可以有效的清除代谢过程中产生的各种自由基，从而维持体内自由基的动态平衡。但当机体受到外界刺激时，动态平衡被打破，就会导致氧化应激，造成氧化损伤。研究表明，通过外源性补充膳食抗氧化剂可以明显降低机体自由基水平，增强机体自身抗氧化能力，起到预防疾病，保持机体健康的作用。
天然抗氧化剂与合成抗氧化剂相比，具有来源广、易吸收、安全性高等优点，近些年来广受关注。抗氧化肽是一种由多个氨基酸残基组成的多肽分子，已从多种动植物蛋白中分离得到，但分离方法较为繁琐复杂且成本较高。因此，研发高效、安全且价格低廉的天然抗氧化肽具有十分重要的意义。
玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM），是玉米籽粒经湿法生产玉米淀粉后的主要副产物，具有产量大、蛋白含量高等优点。但玉米蛋白粉因其氨基酸组成不平衡、成品口感粗糙、水溶性差、有独特的苦味和色泽等缺点，严重限制其在食品工业中的应用，常常被用作生产蛋白粗饲料，造成了粮食资源的严重浪费。因此，如果对玉米蛋白粉进行酶法改性，开发具有抗氧化活性的功能食品，对拓宽玉米蛋白粉的应用领域，实现高值化利用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有较高抗氧化活性，抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当的玉米抗氧化肽及其制备方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种玉米抗氧化肽，所述玉米抗氧化肽包括氨基酸序列如SEQ IDNO.1（CSQAPIA）、SEQ ID NO.2（QCSQAPIA）、SEQ ID NO.3（QQPHPSPC）、SEQ ID NO.4（CCHQIR）和SEQ ID NO.5（QPQPW）所示的玉米抗氧化肽中的至少一种。
本发明还提供了一种玉米蛋白水解物，所述玉米蛋白水解物含有上述的玉米抗氧化肽。在本发明所述玉米蛋白水解物中，优选的含有上述玉米抗氧化肽中的两种以上。
本发明还提供了上述玉米蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：先用碱性蛋白酶对玉米蛋白粉进行酶解，得酶解物，然后用复合蛋白酶对酶解物进行酶解，得到所述玉米蛋白水解物。
优选的，所述碱性蛋白酶的用量为1300U/g蛋白（此处用量是根据玉米蛋白粉中蛋白含量来计算酶的添加量的）；所述碱性蛋白酶的酶解温度为64℃，时间为150min，pH为8.0。
优选的，所述复合蛋白酶的用量为200U/g蛋白（此处用量是根据玉米蛋白粉中蛋白含量来计算酶的添加量的）；所述复合蛋白酶的酶解温度为55℃，时间为150min，pH为7.0。
本发明还提供了一种玉米抗氧化肽的制备方法，在上述制备方法的基础上，还包括如下步骤：将玉米蛋白水解物进行Caco-2细胞单层转运，收集细胞转运液，进行质谱测序，化学合成即得所述玉米抗氧化肽。
在本发明中，进行Caco-2细胞单层转运时，优选的需先构建Caco-2细胞单层模型，本发明对于Caco-2细胞单层模型的构建方法没有特殊限定，采用本领域常规构建方法即可。
本发明还提供了上述玉米抗氧化肽、上述玉米蛋白水解物、上述玉米蛋白水解物制备方法或上述玉米抗氧化肽制备方法在制备抗氧化产品中的应用。
优选的，所述抗氧化产品包括抗氧化药品、食品抗氧化剂或化妆品。
本发明还提供了一种抗氧化产品，所述抗氧化产品的活性成分包括上述玉米抗氧化肽或上述玉米蛋白水解物。
本发明的有益效果：
本发明从玉米蛋白粉中分离得到了具有较高抗氧化活性且抗氧化效果与同浓度还原型谷胱甘肽相当的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-5所示的新的玉米抗氧化肽，可作为天然抗氧化剂应用于食品、药品和化妆品中。
附图说明
图1为本发明玉米抗氧化肽制备的技术路线图；
图2为本发明多肽Ⅰ（CSQAPIA）的质谱检测图；
图3为本发明多肽Ⅱ（QCSQAPIA）的质谱检测图；
图4为本发明多肽Ⅲ（QQPHPSPC）的质谱检测图；
图5为本发明多肽Ⅳ（CCHQIR）的质谱检测图；
图6为本发明多肽Ⅴ（QPQPW）的质谱检测图。
具体实施方式
本发明提供了一种玉米抗氧化肽，所述玉米抗氧化肽包括氨基酸序列为CSQAPIA（SEQ ID NO.1）、QCSQAPIA（SEQ ID NO.2）、QQPHPSPC（SEQ ID NO.3）、CCHQIR（SEQ ID NO.4）和QPQPW（SEQ ID NO.5）中的至少一种。
本发明还提供了一种玉米蛋白水解物，所述玉米蛋白水解物含有上述的玉米抗氧化肽。
本发明还提供了上述玉米蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：先用碱性蛋白酶对玉米蛋白粉进行酶解，得酶解物，然后用复合蛋白酶对酶解物进行酶解，得到所述玉米蛋白水解物。
在本发明中，所述玉米蛋白粉优选的为经预处理后的玉米蛋白粉，所述预处理优选的为经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉，本发明对于玉米蛋白粉的具体来源没有特殊限定。进行碱性蛋白酶酶解前，优选的还包括将所述玉米蛋白粉与水混合配制成悬浊液的步骤，所述悬浊液的质量浓度优选为10％(m/v)。本发明对于碱性蛋白酶和复合蛋白酶的具体来源没有特殊限定，所述碱性蛋白酶的用量优选为1300U/g蛋白，所述碱性蛋白酶的酶解温度优选为64℃，时间优选为150min，pH优选为8.0；所述复合蛋白酶的用量优选为200U/g蛋白，所述复合蛋白酶的酶解温度优选为55℃，时间优选为150min，pH优选为7.0。两种酶进行顺次酶解结束后，优选的需进行灭酶处理，所述灭酶的条件优选为100℃加热灭酶20min，灭酶结束后，取上清即为玉米蛋白水解物，更优选的取上清进行真空冷冻干燥，得到玉米蛋白水解物，本发明对于真空冷冻干燥的方法没有特殊限定，采用本领域中常规真空冷冻干燥方法即可。
本发明还提供了一种玉米抗氧化肽的制备方法，在上述制备方法的基础上，还包括如下步骤：将玉米蛋白水解物进行Caco-2细胞单层转运，收集细胞转运液，进行质谱测序，化学合成即得所述玉米抗氧化肽。
本发明将玉米蛋白水解物进行Caco-2细胞单层转运，有助于获得既能经肠道吸收，又能在机体内真正发挥抗氧化作用的抗氧化肽。本领域获得多肽的常规方法为利用层析技术进行分离纯化，但较为繁琐复杂且成本较高。本发明首次利用Caco-2细胞单层模型进行玉米蛋白水解物的转运吸收，并对转运后的转运液进行质谱测序，获得玉米抗氧化肽。本发明提供的该方法一方面相对较为简单便捷，另一方面也能确保得到的多肽是能够经肠道转运吸收后的多肽，能真正在机体内发挥抗氧化功效。本发明对于质谱测序的具体方法没有特殊限定。本发明所述玉米抗氧化肽的制备方法的流程图如图1所示。
本发明还提供了上述玉米抗氧化肽、上述玉米蛋白水解物、上述玉米蛋白水解物制备方法或上述玉米抗氧化肽制备方法在制备抗氧化产品中的应用。
在本发明中，所述抗氧化产品优选的包括抗氧化药品、食品抗氧化剂或化妆品。
本发明还提供了一种抗氧化产品，所述抗氧化产品的活性成分包括上述玉米抗氧化肽或上述玉米蛋白水解物。
在本发明中，所述抗氧化产品优选的还包括辅料和/或其他活性成分，本发明对于所述辅料和/或其他活性成分的种类没有特殊限定，采用所要制备的产品常规辅料或其他活性成分即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
（1）玉米蛋白水解物的制备
取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉（购买于齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司），加水配制成底物浓度为10％(w/v)的悬浊液，然后先用碱性蛋白酶（诺维信碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，购买自丹麦诺维信公司）进行酶解，碱性蛋白酶酶解条件为：加酶量1300U/g玉米蛋白粉，酶解温度64℃，酶解时间150min，酶解pH 8.0，获得碱性蛋白酶酶解液后，添加复合蛋白酶（诺维信复合蛋白酶Protamex，购买自丹麦诺维信公司）进行酶解，复合蛋白酶酶解条件为：加酶量200U/g玉米蛋白粉，酶解温度55℃，酶解时间150min，酶解pH7.0。酶解结束后100℃加热灭酶20min，酶解物在4000r/min离心20min并弃去沉淀，所得上清液为玉米蛋白酶解液，真空冷冻干燥，得到玉米蛋白水解物。
（2）Caco-2细胞单层模型建立
Caco-2细胞用含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的DMEM完全培养基在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养和传代。选用20代的细胞，以密度1×105个/mL接种于12孔Transwell板中，其中肠腔侧（apical，AP）加入0.5 mL细胞悬液，基底侧（basolateral，BL）加入1.5 mLDMEM完全培养基，接种后置于37℃，5% CO2培养箱中进行培养。前7天每隔2天更换一次培养基，之后每天更换，连续培养21 d，建立Caco-2细胞单层模型。
（3）Caco-2细胞单层转运
将步骤（1）中玉米蛋白水解物用PBS缓冲液配制成浓度为20 mg/mL的溶液，然后在Caco-2细胞单层模型的AP侧加入0.5 mL，在BL侧加入PBS缓冲液1.5 mL，置于37℃，5% CO2培养箱中转运2 h，然后收集BL侧的细胞转运液。
（4）LC-MS/MS质谱测序
将步骤（3）中得到的细胞转运液进行质谱测序（委托北京百泰派克生物科技有限公司进行），得到氨基酸序列为CSQAPIA的多肽Ⅰ，氨基酸序列为QCSQAPIA的多肽Ⅱ，氨基酸序列为QQPHPSPC的多肽Ⅲ，氨基酸序列为CCHQIR的多肽Ⅳ和氨基酸序列为QPQPW的多肽Ⅴ。结果如图2-图6所示。
实施例2
委托上海强耀生物科技有限公司合成实施例1中得到的玉米多肽，测定其对DPPH的清除能力，同时以同浓度的还原型谷胱甘肽作为对照组进行试验，具体方法如下：
取2mL不同浓度的多肽Ⅰ溶液(以水溶解多肽Ⅰ制备多肽Ⅰ溶液)，加入2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，避光反应30min，在517nm处测其吸光值(Ai)；取2mL多肽Ⅰ溶液于试管中，加入2mL无水乙醇，在517nm处测其吸光值(Aj)；取2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液(0.1mmol/L)和2mL无水乙醇反应作为参比，在517nm处测其吸光值(A0)。样品对DPPH自由基的清除率按下述公式计算：
式中：A0为2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL无水乙醇在517nm下的吸光值；
Ai为2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL样品溶液反应在517nm下的吸光值；
Aj为2mL无水乙醇与2mL样品溶液在517nm下的吸光值。
结果显示，多肽Ⅰ(CSQAPIA)对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.039mg/mL，还原性谷胱甘肽对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.047mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅱ(QCSQAPIA)对DPPH自由基清除能力，结果显示多肽Ⅱ(QCSQAPIA)对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.025mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅲ(QQPHPSPC)对DPPH自由基清除能力，结果显示多肽Ⅲ(QQPHPSPC)对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.040mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅳ(CCHQIR)对DPPH自由基清除能力，结果显示多肽Ⅳ(CCHQIR)对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.018mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅴ(QPQPW)对DPPH自由基清除能力，结果显示多肽Ⅴ(QPQPW)对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.173mg/mL。
实施例3
委托上海强耀生物科技有限公司合成实施例1中得到的玉米多肽，测定其对ABTS自由基的清除能力，同时以同浓度的还原型谷胱甘肽作为对照组进行试验，具体方法如下：
准确配制7.0mmol/LABTS溶液及2.45mmol/L过硫酸钾水溶液，混匀，室温避光条件下静置12h后，即得ABTS+母液。将ABTS+母液用去离子水稀释，使其在734nm处的吸光值为0.70±0.02，并在30℃下平衡30min，即得ABTS+工作液。分别取2.0mL不同浓度的多肽I溶液和2.0mLABTS+工作液加入试管中，混匀，室温下避光放置20min，于734nm处测定吸光值。以去离子水替代多肽I溶液同体积的反应混合液为对照，设3个重复，求平均值。根据下述公式计算多肽I溶液对ABTS自由基的清除率。
式中：A（样）为添加样品后溶液的吸光值；
A（空）为未添加样品溶液的吸光值。
结果显示，多肽Ⅰ(CSQAPIA)对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.042mg/mL，还原性谷胱甘肽对对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.006mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅱ(QCSQAPIA)对ABTS自由基清除能力，结果显示，多肽Ⅱ(QCSQAPIA)对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.024mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅲ(QQPHPSPC)对ABTS自由基清除能力，结果显示，多肽Ⅲ(QQPHPSPC)对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.009mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅳ(CCHQIR)对ABTS自由基清除能力，结果显示，多肽Ⅳ(CCHQIR)对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.013mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅴ(QPQPW)对ABTS自由基清除能力，结果显示，多肽Ⅴ(QPQPW)对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.005mg/mL。
由以上结果可以得出：本发明所述单个玉米活性肽均具备较高的抗氧化活性，其抗氧化效果与同浓度的还原型谷胱甘肽相当。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种玉米抗氧化肽，其特征在于，所述玉米抗氧化肽为氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的玉米抗氧化肽。
2.一种玉米蛋白水解物，其特征在于，所述玉米蛋白水解物含有权利要求1所述的玉米抗氧化肽。
3.权利要求2所述玉米蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：先用碱性蛋白酶对玉米蛋白粉进行酶解，得酶解物，然后用复合蛋白酶对酶解物进行酶解，得到所述玉米蛋白水解物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的用量为1300U/g蛋白；所述碱性蛋白酶的酶解温度为64℃，时间为150min，pH为8.0。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶的用量为200U/g蛋白；所述复合蛋白酶的酶解温度为55℃，时间为150min，pH为7.0。
6.一种玉米抗氧化肽的制备方法，其特征在于，在权利要求3-5任意一项所述制备方法的基础上，还包括如下步骤：将玉米蛋白水解物进行Caco-2细胞单层转运，收集细胞转运液，进行质谱测序，化学合成即得权利要求1所述玉米抗氧化肽。
7.权利要求1所述玉米抗氧化肽、权利要求2所述玉米蛋白水解物、权利要求3-5任意一项所述制备方法或权利要求6所述制备方法在制备抗氧化产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗氧化产品包括抗氧化药品、食品抗氧化剂或化妆品。
9.一种抗氧化产品，其特征在于，所述抗氧化产品的活性成分包括权利要求1所述玉米抗氧化肽或权利要求2所述玉米蛋白水解物。
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