CN116063378A - 具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用 - Google Patents

具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116063378A
CN116063378A CN202210989940.2A CN202210989940A CN116063378A CN 116063378 A CN116063378 A CN 116063378A CN 202210989940 A CN202210989940 A CN 202210989940A CN 116063378 A CN116063378 A CN 116063378A
Authority
CN
China
Prior art keywords
helicobacter pylori
bifunctional
activity
corn
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210989940.2A
Other languages
English (en)
Inventor
郑喜群
刘晓兰
李冠龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiqihar University
Original Assignee
Qiqihar University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiqihar University filed Critical Qiqihar University
Priority to CN202210989940.2A priority Critical patent/CN116063378A/zh
Publication of CN116063378A publication Critical patent/CN116063378A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于蛋白肽制备技术领域，具体涉及具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用。本发明提供了具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽，包括多肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；所述多肽Ⅰ包括如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；所述多肽Ⅱ包括如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本发明所述双功能玉米肽分离自玉米蛋白粉，具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双重活性，尤其对幽门螺旋杆菌的粘附具有较强的抑制作用，可用于制备具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品。

Description

具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白肽制备技术领域，具体涉及具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)是一种革兰氏阴性菌，长2～4μm，宽0.5～1μm，通常呈螺旋形。该细菌有2～6个鞭毛，鞭毛赋予细菌运动能力，使其在胃上皮细胞的粘液层快速运动。幽门螺旋杆菌的生长具有微需氧的特性，5％的O2、10％的CO2、85％的N2、37℃和高湿度的条件是其最佳生长环境。尽管幽门螺旋杆菌可以定植在胃粘膜上，但仅在pH5.5～8.0的范围内才能生长。
幽门螺旋杆菌是一种特殊的病原体，机体感染幽门螺旋杆菌后，一般难以自行清除，若不采取根除治疗，将终生携带。幽门螺旋杆菌可以特异性地与胃粘膜上皮细胞粘附，引发胃部氧化应激和炎症反应，是公认的慢性胃炎与溃疡性疾病的重要致病因子之一，也可能与胃癌、胃粘膜相关性淋巴瘤的发病密切相关。现阶段，世界卫生组织将幽门螺旋杆菌列为I类致癌因子。现阶段，最常见的根除幽门螺旋杆菌的方法是抗生素治疗，常用质子泵抑制剂和两种抗生素的三联疗法以及铋剂、质子泵抑制剂和两种抗生素联合使用的四联疗法。但随着幽门螺旋杆菌对抗生素的耐药性逐年上升，其根除率也在下降，并且服用抗生素具有很多副作用，如肠道不适、过敏等。因此，开发抗生素的替代疗法对于防治幽门螺旋杆菌感染、保持人类胃肠道菌群健康具有重要意义。
近年来，已经报道了一些关于天然来源的食源性组分抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，如蔓越莓中的黄酮类物质、多糖、卵黏蛋白肽和小麦胚芽蛋白肽等，但总体种类较少。因此，进一步研发天然、安全、价格低廉且更高效的具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的食源性组分仍然十分必要。
玉米蛋白粉(corn gluten meal，CGM)是玉米湿法生产淀粉中产量最大、蛋白质含量最高的副产物(约占60％)，但是存在很多限制其在食品行业应用的不利因素，如溶解性差、疏水性强等，因而，玉米蛋白粉作为饲料直接使用，造成了其粮食资源的极大浪费。因此，如果能够对玉米蛋白进行改性，开发具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的功能食品，提高其附加值，对玉米蛋白的精深加工具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用，所述玉米肽为新发现的双功能肽，具备拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化的双重活性。
本发明提供了具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽，包括多肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；
所述多肽Ⅰ包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述多肽Ⅱ包括如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述双功能玉米肽的制备方法，包括如下步骤：
以中性蛋白酶酶解玉米蛋白粉，酶解液中包括所述双功能玉米肽。
优选的，所述玉米蛋白粉为经挤压膨化后去淀粉的玉米蛋白粉；所述酶解前还包括将所述玉米蛋白粉制备成悬浊液，所述悬浊液中玉米蛋白粉的质量浓度为15％(w/v)。
优选的，所述中性蛋白酶的用量为400U/g蛋白；所述酶解的温度为45℃，时间为150min，pH为7.0。
优选的，所述酶解后还包括：对所述酶解液进行分离纯化，收集分子量＜1000Da的组分，得到所述双功能玉米肽。
优选的，所述分离纯化包括凝胶色谱分离和离子交换色谱分离。
优选的，所述凝胶色谱分离的预装柱为Superdex Peptide 10/300GL；所述离子交换色谱分离包括两步离子交换色谱分离，第一步离子交换色谱分离使用的离子交换剂为Q-Sepharose High Performance，第二步离子交换色谱分离使用的离子交换剂为Mone Q。
本发明还提供了上述技术方案所述的双功能玉米肽或所述的制备方法制备得到的双功能玉米肽在制备拮抗幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的药物和/或食品中的应用。
本发明还提供了一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和/或抗氧化活性的产品，所述产品的活性成分包括上述技术方案所述的双功能玉米肽或所述的制备方法制备得到的双功能玉米肽。
优选的，所述产品包括药物和/或食品。
有益效果：
本发明提供了具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽，包括多肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；所述多肽Ⅰ包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述多肽Ⅱ包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明所述双功能玉米肽分离自玉米蛋白粉，具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化的双重活性，尤其对幽门螺旋杆菌的粘附具有较强的抑制作用，可用于制备具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和/或抗氧化活性的产品。尤其兼具拮抗幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化功能的产品可以在预防幽门螺旋杆菌感染的同时，还能缓解机体被幽门螺旋杆菌感染后产生的氧化应激反应和炎症反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为为实施例1中双功能玉米肽制备的技术路线图；
图2为多肽Ⅰ(IIPQCS)的质谱检测图；
图3为多肽Ⅱ(VCENPIL)的质谱检测图；
图4为菌落浓度与OD600的标准曲线；
图5为FITC荧光强度值和OD600的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽，包括多肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；所述多肽Ⅰ包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述多肽Ⅱ包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为IIPQCS，所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列为VCENPIL。本发明所述双功能玉米肽分离自玉米蛋白粉，具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化双重活性，尤其对幽门螺旋杆菌的粘附具有较强的抑制作用。
本发明还提供了上述技术方案所述双功能玉米肽的制备方法，包括如下步骤：以中性蛋白酶酶解玉米蛋白粉，酶解液中包括所述双功能玉米肽。
本发明进行所述酶解之前优选还包括将所述玉米蛋白粉与水混合配制成悬浊液，所述悬浊液的质量浓度优选为15％(w/v)。本发明所述所述玉米蛋白粉优选为经挤压膨化后去淀粉的玉米蛋白粉。本发明对所述经挤压膨化后去淀粉的玉米蛋白粉的来源没有特殊限定，采用本领域中常规购买的经挤压膨化后去淀粉的玉米蛋白粉即可。
得到所述悬浊液后，本发明以中性蛋白酶酶解所述悬浊液，得到酶解混合物。以所述玉米蛋白粉中的蛋白含量计，本发明所述中性蛋白酶的用量优选为400U/g蛋白。本发明所述酶解的温度优选为45℃，时间优选为150min，pH值优选为7.0。完成所述酶解后，本发明优选还包括对所述酶解混合物进行灭酶处理，所述灭酶处理的温度优选为100℃；所述灭酶处理的时间优选为10min。完成所述灭酶处理后，本发明优选对灭酶处理后的混合物进行离心，取上清液，得到酶解液。本发明所述离心的转速优选为4000r/min，所述离心的时间优选为10min。本发明所述酶解液中包括所述双功能玉米肽。
得到所述酶解液后，本发明优选还包括对所述酶解液进行分离纯化，收集分子量＜1000Da的组分，得到所述双功能玉米肽。
本发明所述分离纯化优选包括如下步骤：采用凝胶色谱对所述酶解液进行分离，收集拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量＜1000Da的组分；得到所述组分后，采用离子交换色谱对所述组分进行分离，收集拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强的组分，得到所述双功能玉米肽。
本发明优选采用凝胶色谱对所述酶解液进行分离，收集拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量＜1000Da的组分。本发明所述凝胶色谱的分离预装柱优选为Superdex Peptide 10/300GL。本发明进行凝胶色谱分离的条件优选包括：上样浓度为50mg/L，上样量为1mL；洗脱液为pH 7.0的含0.15mol/L NaCl的20mM PBS缓冲液；洗脱液的流速为0.25mL/min；检测波长为214nm。本发明优选还包括测定收集得到的各组分的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，得到拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量＜1000Da的组分。本发明优选采用实施例1中的方法测定所述拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，下同，不再赘述。本发明所述拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量＜1000Da的组分中的蛋白浓度优选为4mg/mL。
得到所述拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量＜1000Da的组分后，本发明优选对所述拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强且分子量＜1000Da的组分进行第一步离子交换色谱分离，得到组分Ⅰ。本发明所述第一步离子交换色谱分离使用的离子交换剂优选为Q-Sepharose High Performance。本发明进行所述第一步离子交换色谱分离的条件优选包括：上样量为50mL；洗脱液A优选为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为20mM，pH值优选为7.5；洗脱液B为pH 7.5的含1mol/L NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱液的流速为2mL/min，检测波长为214nm，梯洗体积60mL，峰组分收集的体积为6mL/管。本发明优选还包括测定收集得到的峰组分的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，得到拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强的组分，即为组分Ⅰ。本发明所述组分Ⅰ中的蛋白浓度优选为2mg/mL。
得到所述组分Ⅰ后，本发明优选对所述组分Ⅰ进行第二步离子交换色谱分离，得到组分Ⅱ。本发明所述第二步离子交换色谱分离使用的离子交换剂优选为Mone Q。本发明进行所述第二步离子交换色谱分离的条件优选包括：上样量为10mL；洗脱液A优选为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为20mM，pH值优选为7.0；洗脱液B为pH 7.0含1mol/L NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱液的流速为1mL/min，检测波长为214nm，梯洗体积20mL，峰组分收集的体积为1mL/管。本发明优选还包括测定收集得到的峰组分的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，得到拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性相对更强的组分，即为组分Ⅱ。
得到所述组分Ⅱ后，本发明优选对所述组分Ⅱ进行脱盐冻干和质谱测序，得到所述双功能玉米肽，所述双功能玉米肽为氨基酸序列为IIPQCS的多肽Ⅰ和氨基酸序列为VCENPIL多肽Ⅱ。本发明优选采用LC-MS/MS进行所述质谱测序。本发明对所述脱盐冻干和质谱测序的过程和步骤没有特殊限定，采用本领域中常规脱盐冻干和质谱测序的步骤即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的双功能玉米肽或所述的制备方法制备得到的双功能玉米肽在制备拮抗幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的药物和/或食品中的应用。
本发明还提供了一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和/或抗氧化活性的产品，所述产品的活性成分包括上述技术方案所述的双功能玉米肽或所述的制备方法制备得到的双功能玉米肽。本发明所述产品优选包括药物和/或食品。本发明所述产品中优选还包括辅料和/或其他活性成分。本发明对所述辅料和其他活性成分没有特殊限定，根据制备的产品合理添加即可。本发明对所述产品中所述双功能玉米肽的用量没有特殊限定，根据具体制备的产品合理添加即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
在下述实施例中所使用的方法，如无特殊说明，采用的均为本领域中的常规试验方法；所使用的生物材料和试验材料，如无特殊说明，均可通过本领域中常规购买渠道获得。
实施例1
具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽，由以下步骤组成，技术路线如图1所示：
1、玉米蛋白酶解液的制备
取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉(购自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司)，加水配制成底物浓度为15％(w/v)的悬浊液，然后用中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加酶量400U/g蛋白，酶解温度45℃，酶解时间150min，酶解pH 7.0，酶解结束后100℃加热灭酶10min，酶解物在4000r/min离心10min并弃去沉淀，所得上清液为玉米蛋白酶解液，通过测定其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，确认其为具有高拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的多肽混合物。拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性测定的方法均参照步骤5中进行，下同，不再赘述。
2、玉米蛋白酶解液的凝胶色谱分离
所使用的凝胶色谱柱为Superdex Peptide 10/300GL预装柱，将步骤1中具有高拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的多肽混合物采用凝胶色谱分离得到不同分子量组分的多肽混合物，上样浓度50mg/mL，上样量1mL，洗脱液为pH 7.0含0.15mol/L NaCl的20mM PBS缓冲溶液，流速为0.25mL/min，检测波长为214nm；测定各分子量组分的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，收集＜1000Da组分且拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分用于离子交换色谱分离。
3、离子交换色谱分离
3.1 Q-Sepharose High Performance强阴离子交换色谱分离
将凝胶色谱所得分子量＜1000Da且拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为4mg/mL，使用强阴离子交换剂为Q-Sepharose High Performance分离。上样量为50mL，所述强阴离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.5的20mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：pH7.5含1mol/L NaCl的的20mMTris-HCl缓冲液，流速为2mL/min，检测波长214nm，梯洗体积为60mL，峰组分每管收集6mL；测定各管收集液的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，收集拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分(第6管)用于Mono Q离子交换色谱分离。
3.2 Mono Q离子交换色谱
步骤3.1中分离得到的高活性组分使用Mono Q离子交换色谱进一步分离。将上一步离子交换色谱所得高活性组分过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为2mg/mL，上样量10mL，所述Mono Q离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.0的20mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：pH 7.0含1mol/L NaCl的的20mM Tris-HCl缓冲液，流速为1mL/min，检测波长214nm，梯洗体积为20mL，峰组分每管收集1mL；测定各管收集液的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，收集拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均较高的组分(第16管)备用。
4、LC-MS/MS质谱测序
将步骤3.2中得到的组分脱盐冻干后进行质谱测序，获得氨基酸序列为IIPQCS(多肽Ⅰ)和VCENPIL(多肽Ⅱ)的双功能玉米肽，结果如图2和3所示。
5、双功能玉米肽的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的测定
将步骤4中得到的双功能玉米肽化学合成后(委托上海强耀生物科技有限公司合成)，测定其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和对DPPH和ABTS自由基的清除能力。
5.1双功能玉米肽拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的测定：
1)利用H.pylori ATCC43504菌株作为抗粘附活性试验测定菌株。在37℃条件下将经过冻存的H.pylori ATCC43504菌株解冻，先与液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K2HPO4、17g胰蛋白胨和5g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h)混合，随后将其接种于斜面培养基(15g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、15g琼脂、5g NaCl和950mL去离子水，搅拌溶解调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h，在培养基冷却至45℃左右，加入50mL无菌的脱纤维羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基)上，在37℃微需氧(5％O2，85％N2，10％CO2)条件下，培养48～72h，得到的菌液可进行菌种传代和抗粘附活性检测。
将传代的H.pylori ATCC43504的菌液，进行四次10倍梯度稀释获得五种不同浓度的菌液，在600nm条件下测定幽门螺旋杆菌菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD600的标准曲线，如图4所示。
2)冻存人胃粘膜上皮细胞(GES-1)解冻后移入细胞培养瓶中，细胞培养基组成为1％青链霉素混合液、10％胎牛血清和89％DMEM培养基。在37℃，5％CO2条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代，离心，用不含抗生素的细胞培养基重悬，调整细胞浓度为3×105cells/mL。将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，在37℃，5％CO2培养箱中培养孵育24h，用于拮抗H.pylori粘附活性的测定实验。
3)异硫氰酸荧光素(FITC)标记幽门螺旋杆菌
制备FITC浓度为2mg/mL的DMSO溶液，无菌滤膜过滤处理。按照1：1的体积比将步骤1)中制备得到的传代的H.pylori ATCC43504的菌液与其混匀，在避免光照的条件下，生化摇摆台上混合30min后，在4500r/min的转速下离心处理3min，除去上清液，经过1×PBS缓冲液洗涤3次，除去多余的FITC，最后将菌液在液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K2HPO4、17g胰蛋白胨和5g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h)上稀释至OD600值在0.1左右(108cfu/mL)，备用。
4)FITC荧光强度值与OD600标准曲线的构建
将上步中经过FITC标记处理的幽门螺旋杆菌菌液，按照四次10倍梯度稀释，在激发波长485nm和发射波长530nm条件下，测量其荧光强度值，与此同时在600nm条件下测OD值，建立FITC荧光强度值和OD600的标准曲线，如图5所示。
5)双功能玉米蛋白肽拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验
将实施例1中制备得到的多肽Ⅰ使用100％DMEM培养基，配制一定蛋白浓度的多肽Ⅰ溶液，按照1：1(v/v)的比例与步骤3)中经过FITC标记过的菌液在室温避光条件下进行混合30min，使实施例1所得多肽Ⅰ的终浓度为4mg/mL，得到混合后的菌液。
向带有胃粘膜上皮细胞(GES-1)的96孔板中分别加入100μL混合后的菌液，以加入100μL100％DMEM培养基为阴性对照组，在培养箱中放置90min。然后将溶液去除，用PBS缓冲液清洗3次，随即，将PBS缓冲液按照每孔100μL量加入，在发射波长530nm、激发波长485nm条件下进行荧光强度值的测定，根据实施例1中5.1的步骤3)和4)，计算出阴性对照组和试验组的菌落浓度，采用以下公式计算粘附抑制率：
Figure BDA0003803462950000091
结果为：当多肽Ⅰ(IIPQCS)的浓度为4mg/mL时，其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性为21.96％。
采用相同的方法测定多肽Ⅱ(VCENPIL)的抗幽门螺旋杆菌粘附活性，当多肽Ⅱ(VCENPIL)的浓度为4mg/mL时，其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性为36.86％。
5.2双功能玉米肽抗氧化活性的测定：
(1)双功能玉米肽清除DPPH自由基能力的测定：取2mL不同浓度的多肽Ⅰ溶液(以水溶解多肽Ⅰ制备多肽Ⅰ溶液)，加入2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，避光反应30min，在517nm处测其吸光值(Ai)；取2mL多肽Ⅰ溶液于试管中，加入2mL无水乙醇，在517nm处测其吸光值(Aj)；取2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液(0.1mmol/L)和2mL无水乙醇反应作为参比，在517nm处测其吸光值(A0)。样品对DPPH自由基的清除率K按式(1)计算：
Figure BDA0003803462950000092
式中：
K-对DPPH自由基的清除率，％；
A0-2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL无水乙醇在517nm下的吸光值；
Ai-2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL样品溶液反应在517nm下的吸光值；
Aj-2mL无水乙醇与2mL样品溶液在517nm下的吸光值。
由以上DPPH自由基清除活性测定结果可以得出，多肽Ⅰ(IIPQCS)对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.090mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅱ(VCENPIL)对DPPH自由基清除能力，多肽Ⅱ(VCENPIL)对DPPH自由基清除能力的IC50值为0.082mg/mL。
(2)双功能玉米肽清除ABTS自由基能力的测定：准确配制7.0mmol/L ABTS溶液及2.45mmol/L过硫酸钾水溶液，混匀，室温避光条件下静置12～16h后，即得ABTS+母液。将ABTS+母液用去离子水稀释，使其在734nm处的吸光值为0.70±0.023，并在30℃下平衡30min，即得ABTS+工作液。分别取2.0mL不同浓度的多肽I溶液和2.0mL ABTS+工作液加入试管中，混匀，室温下避光放置20min，于734nm处测定吸光值。以去离子水替代多肽I溶液同体积的反应混合液为对照，设3个重复，求平均值。根据下列公式计算多肽I溶液对ABTS自由基的清除率。
清除率(％)＝(1-A样品/A空白)×100，其中，A样品为添加样品后溶液的吸光值；A空白为未添加样品溶液的吸光值。
由以上ABTS测定结果可以得出，多肽Ⅰ(IIPQCS)对ABTS自由基清除能力的IC50值分别为0.011mg/mL。
采用相同的方法测定多肽Ⅱ(VCENPIL)对ABTS自由基清除能力，多肽Ⅱ(VCENPIL)对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.019mg/mL。
由以上实施例可以得出，本发明提供的双功能玉米肽具备同时拮抗幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双活性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽，其特征在于，包括多肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ；
所述多肽Ⅰ包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述多肽Ⅱ包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述双功能玉米肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以中性蛋白酶酶解玉米蛋白粉，酶解液中包括所述双功能玉米肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述玉米蛋白粉为经挤压膨化后去淀粉的玉米蛋白粉；所述酶解前还包括将所述玉米蛋白粉制备成悬浊液，所述悬浊液中玉米蛋白粉的质量浓度为15％w/v。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的用量为400U/g蛋白；所述酶解的温度为45℃，时间为150min，pH为7.0。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解后还包括：对所述酶解液进行分离纯化，收集分子量＜1000Da的组分，得到所述双功能玉米肽。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化包括凝胶色谱分离和离子交换色谱分离。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶色谱分离的色谱预装柱为Superdex Peptide 10/300GL；所述离子交换色谱分离包括两步离子交换色谱分离，第一步离子交换色谱分离使用的离子交换剂为Q-Sepharose High Performance，第二步离子交换色谱分离使用的离子交换剂为Mone Q。
8.权利要求1所述的双功能玉米肽或权利要求2～7任一项所述的制备方法制备得到的双功能玉米肽在制备拮抗幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的药物和/或食品中的应用。
9.一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包括权利要求1所述的双功能玉米肽或权利要求2～7任一项所述的制备方法制备得到的双功能玉米肽。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品包括药物和/或食品。
CN202210989940.2A 2022-08-18 2022-08-18 具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用 Pending CN116063378A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210989940.2A CN116063378A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210989940.2A CN116063378A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116063378A true CN116063378A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86173769

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210989940.2A Pending CN116063378A (zh) 2022-08-18 2022-08-18 具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116063378A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117247430A (zh) * 2023-11-17 2023-12-19 齐齐哈尔大学 一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用
CN117603308A (zh) * 2024-01-19 2024-02-27 齐齐哈尔大学 一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用
CN118027147A (zh) * 2024-04-11 2024-05-14 齐齐哈尔大学 一种玉米蛋白肽及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117247430A (zh) * 2023-11-17 2023-12-19 齐齐哈尔大学 一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用
CN117247430B (zh) * 2023-11-17 2024-01-30 齐齐哈尔大学 一种玉米抗氧化肽及其制备方法与应用
CN117603308A (zh) * 2024-01-19 2024-02-27 齐齐哈尔大学 一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用
CN117603308B (zh) * 2024-01-19 2024-04-12 齐齐哈尔大学 一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用
CN118027147A (zh) * 2024-04-11 2024-05-14 齐齐哈尔大学 一种玉米蛋白肽及其应用
CN118027147B (zh) * 2024-04-11 2024-06-07 齐齐哈尔大学 一种玉米蛋白肽及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116063378A (zh) 具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽及其制备方法和应用
CN115960167B (zh) 一种玉米抗粘附肽及其制备方法和应用
CN116023433B (zh) 一种玉米活性肽及其制备方法和应用
CN116041425A (zh) 双功能玉米蛋白源活性肽及其制备方法和应用
CN115247197B (zh) 一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物及其制备方法和应用
CN109750054B (zh) 一种牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用
CN111961617B (zh) 一株高产免疫多糖和细菌素的多效枯草芽孢杆菌及应用
CN109627299B (zh) 一种具有广谱抗菌活性的细菌素Gr17及其应用
CN117603308B (zh) 一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用
CN116063386B (zh) 一种鹿角盘免疫活性肽及其制备方法和应用
CN116041426B (zh) 玉米蛋白源抗粘附肽及其制备方法和应用
CN104558115A (zh) 一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽及其制备方法和用途
EP1024147B1 (en) Process for preparing (1-3)-beta-d-glucan from fungi
AU2011362979B2 (en) Compositions and methods for separating, characterizing and administering soluble selenoglycoproteins
CN114213512B (zh) 增强藻胆蛋白光热稳定性的组合物及其制备方法与应用
JPH068322B2 (ja) ペクチンの製造法
CN114478742A (zh) 一种抗幽门螺杆菌活性多肽及其应用
CN117903248A (zh) 一种双功能玉米肽及其应用
KR100573631B1 (ko) 포피로모나스 진지발리스의 세포결합을 저해하는인삼뿌리에서 분리된 산성다당류 및 이를 함유하는 구강치주질환 예방 및 그 치료용 조성물
CN118108798B (zh) 一种米糠蛋白肽及其筛选方法与应用
Khayoon et al. Cleavage of Mucin by Partial Purified Protease Produced from Gastrointestinal Escherichia Coli A29 Isolated from Iraqi Patients
WO2018100035A1 (en) L. salivarius sgl03: probiotic activities and production of antimicrobial proteins
JP4422404B2 (ja) 感染予防・治療剤および食品
CN116355063A (zh) 一种具有免疫增强活性的姬松茸多肽提取物及其制备方法和应用
Meshram et al. Comparative Evaluation of Antioxidant Potential of In-Vitro Digested Cow Milk Derived A1 and A2 β Casein Variants Using Different Proteases

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination