CN117903248A - 一种双功能玉米肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双功能玉米肽及其应用，属于生物活性肽技术领域。本发明提供的双功能玉米肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1(QQPTPCPY)所示。本发明从玉米蛋白粉中分离得到了所述新的双功能玉米肽，其同时具有抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双重功能，可以用于制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品，尤其具有强抗氧化功能。采用本发明所述双功能玉米肽在预防幽门螺旋杆菌感染的同时，还能缓解机体被幽门螺旋杆菌感染后产生的氧化应激反应和炎症反应。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，尤其涉及一种双功能玉米肽及其应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌是一种可以生活在人胃部的细菌，其进入胃部后，会释放各种毒力因子，造成胃粘膜损伤，进而造成胃炎、胃溃疡，甚至会发展成胃癌。因此，幽门螺旋杆菌被世界卫生组织列为I类致癌因子。
目前，对于幽门螺旋杆菌感染的治疗主要采用抗生素治疗方式，在治疗的初期，抗生素疗法效果显著。但随着菌株耐药性的产生，抗生素治疗根除率逐年降低。因此，开发安全、高效抗生素替代疗法对于防治幽门螺旋杆菌感染具有重大意义。
幽门螺旋杆菌表面存在多种粘附素，其可以通过粘附素特异性粘附定植在人胃粘膜上皮细胞表面，进而释放各种毒力因子，通过抑制幽门螺旋杆菌的粘附作用是一种有效防治其感染的方式。此外，通过食用具有抗氧化活性的物质可以有效缓解由幽门螺旋杆菌感染诱导的胃损伤。因此，开发具有抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性的双功能玉米肽对防治幽门螺旋杆菌感染具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化功能的新的玉米肽。
本发明的另一目的在于提供上述新的玉米肽的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种双功能玉米肽，所述玉米肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1(QQPTPCPY)所示，所述双功能为抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化。
本发明所述双功能玉米肽分离自玉米蛋白粉，具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化双重活性，尤其具有强抗氧化作用。
本发明还提供了上述双功能玉米肽在制备拮抗幽门螺旋杆菌粘附产品中的应用。所述产品优选的包括药品。
本发明还提供了上述双功能玉米肽在制备抗氧化产品中的应用。所述产品优选的包括药品、食品或化妆品。
本发明还提供了一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品，所述产品的活性成分包括上述的双功能玉米肽。本发明对所述产品中双功能玉米肽的用量没有特殊限定，根据制备的产品常规添加即可。在本发明所述产品中，优选的还包括辅料和/或其他活性成分。当所述产品中还包括其他活性成分时，本发明对所述其他活性成分的类型、功效和用量均没有特殊限定，依据制备的产品合理添加即可。
本发明的有益效果：
本发明从玉米蛋白粉中分离得到了所述新的双功能玉米肽，其同时具有抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双重功能，可以用于制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品，尤其具有强抗氧化功能。采用本发明所述双功能玉米肽在预防幽门螺旋杆菌感染的同时，还能缓解机体被幽门螺旋杆菌感染后产生的氧化应激反应和炎症反应。
附图说明
图1为菌落浓度与菌悬液光密度值(OD600)标准曲线；
图2为异硫氰酸荧光素(FITC)荧光强度值与OD600标准曲线；
图3为本发明试验的技术路线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、玉米蛋白酶解液的制备
取经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉(购自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司)，加水配制成底物浓度为15％(w/v)的悬浊液，然后用中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加酶量400U/g蛋白，酶解温度45℃，酶解时间150min，酶解pH 7.0，酶解结束后100℃加热灭酶10min，酶解物在4000r/min离心10min并弃去沉淀，所得上清液为玉米蛋白酶解液。
2、玉米蛋白酶解液的凝胶色谱分离
所使用的凝胶色谱柱为Superdex Peptide 10/300GL预装柱，将步骤1中所得玉米蛋白酶解液采用凝胶色谱分离得到不同分子量组分的多肽混合物，上样浓度50mg/mL，上样量1mL，洗脱液为pH 7.0含0.15mol/LNaCl的20mM PBS缓冲溶液，流速为0.25mL/min，检测波长为214nm；测定各分子量组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性，抑制幽门螺旋杆菌粘附活性测定方法为：
1)利用H.pylori ATCC43504菌株(购自于美国模式培养物集存库)作为抗粘附活性试验测定菌株。在37℃条件下将经过冻存的幽门螺旋杆菌菌株解冻，先与液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K2HPO4、17g胰蛋白胨和5g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h)混合，随后将其接种于斜面培养基(15g胰蛋白胨、5g大豆蛋白胨、15g琼脂、5g NaCl和950mL去离子水，搅拌溶解调节pH至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h，在培养基冷却至45℃左右，加入50mL无菌的脱纤维羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基)上，在37℃微需氧(5％O2，85％N2，10％CO2)条件下，培养48～72h，得到的菌液可进行菌种传代和抗粘附活性检测。
将传代的幽门螺旋杆菌的菌液，进行四次10倍梯度稀释获得五种不同浓度的菌液，在600nm条件下测定幽门螺旋杆菌菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD600的标准曲线，如图1所示。
2)冻存人胃粘膜上皮细胞(GES-1)解冻后移入细胞培养瓶中，细胞培养基组成包括1％青链霉素混合液、10％胎牛血清和90％DMEM培养基。在37℃，5％CO2条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代，离心，用不含抗生素的细胞培养基重悬，调整细胞浓度为3×105cells/mL。将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，在37℃，5％CO2培养箱中培养孵育24h，用于拮抗H.pylori粘附活性的测定实验。
3)异硫氰酸荧光素(FITC)标记幽门螺旋杆菌
制备FITC浓度为2mg/mL的DMSO溶液，无菌滤膜过滤处理。按照1:1的比例将幽门螺旋杆菌菌液与其混匀，在避免光照的条件下，生化摇摆台上混合30min后，在4500r/min的转速下离心处理3min，除去上清液，经过1×PBS缓冲液洗涤3次，除去多余的FITC，最后将菌液在液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K2HPO4、17g胰蛋白胨和5g NaCl，加入1L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1Mpa灭菌1h)上稀释至OD600值在0.1左右(108cfu/mL)，备用。
4)FITC荧光强度值与OD600标准曲线的构建
将上步经过FITC标记处理的幽门螺旋杆菌菌液，按照梯度稀释成六个浓度，在激发波长485nm和发射波长530nm条件下，测量其荧光强度值，与此同时在600nm条件下测OD值，建立FITC荧光强度值和OD600的标准曲线，如图2所示。
5)待测样品拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验
使用无抗生素的细胞培养基，配制一定蛋白浓度的待测样品溶液，按照1:1(v/v)的比例与经过FITC标记过的菌液在室温避光条件下进行混合30min，使待测样品的终浓度分别为4mg/mL，测定不同浓度的待测样品拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性。向带有胃粘膜上皮细胞(GES-1)的96孔板中加入100μL混合后的菌液，在培养箱中放置90min。然后将溶液去除，用PBS缓冲液清洗3次，随即，将PBS缓冲液按照每孔100μL量加入，在发射波长530nm、激发波长485nm条件下进行荧光强度值的测定。依据荧光强度和图1、图2计算粘附抑制率。阴性对照组即为未添加待测样品的组别。粘附抑制率采用以下公式计算：
抗氧化活性的测定方法为：
(1)清除DPPH自由基能力的测定：取2mL不同浓度的待测样品溶液(以水溶解待测样品制备待测样品溶液)，加入2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，避光反应30min，在517nm处测其吸光值(Ai)；取2mL待测样品溶液于试管中，加入2mL无水乙醇，在517nm处测其吸光值(Aj)；取2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液(0.1mmol/L)和2mL无水乙醇反应作为参比，在517nm处测其吸光值(A0)。样品对DPPH自由基的清除率K按式(1)计算：
式中：
K-对DPPH自由基的清除率，％；
A0-2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL无水乙醇在517nm下的吸光值；
Ai-2mL 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液与2mL样品溶液反应在517nm下的吸光值；
Aj-2mL无水乙醇与2mL样品溶液在517nm下的吸光值。
(2)清除ABTS自由基能力的测定：准确配制7.0mmol/LABTS溶液及2.45mmol/L过硫酸钾水溶液，混匀，室温避光条件下静置12～16h后，即得ABTS+母液。将ABTS+母液用去离子水稀释，使其在734nm处的吸光值为0.70±0.023，并在30℃下平衡30min，即得ABTS+工作液。分别取2.0mL不同浓度的待测样品溶液和2.0mLABTS+工作液加入试管中，混匀，室温下避光放置20min，于734nm处测定吸光值。以去离子水替代待测样品溶液同体积的反应混合液为对照，设3个重复，求平均值。根据下列公式计算多肽溶液对ABTS自由基的清除率。
清除率(％)＝(1-A样品/A空白)×100，其中，A样品为添加样品后溶液的吸光值；A空白为未添加样品溶液的吸光值。
(3)清除羟基自由基能力的测定：
按表1在10mL离心管中加入2mL待测样品溶液、2mL 6mmol/LFeSO4溶液和2mL2mmol/L H2O2溶液，震荡摇匀后室温下静置10min，加入2mL6mmol/L水杨酸，震荡混匀后室温静置30min，立即倒入石英比色皿中，在510nm波长下用紫外可见分光光度计测得吸光值，重复测定三次。
表1加样表
按下公式计算：
式中Ai是待测样品组的吸光度值；
Aj是用蒸馏水代替水杨酸后吸光度值；
A0是用蒸馏水代替待测样品后的吸光度值。
收集分子量小于1000Da且拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分用于离子交换色谱分离。
3、离子交换色谱分离
3.1Q-Sepharose HighPerformance强阴离子交换色谱分离
将凝胶色谱所得分子量小于1000Da且抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为4mg/mL，使用强阴离子交换剂为Q-Sepharose HighPerformance分离。上样量为50mL，所述强阴离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.5的20mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：pH7.5含1mol/LNaCl的的20mM Tris-HCl缓冲液，流速为2mL/min，检测波长214nm，梯洗体积为60mL，峰组分每管收集6mL；测定各管收集液的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性(具体测定方法同步骤2)，收集抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均相对较高的组分(第8管)用于Mono Q离子交换色谱分离。
3.2Mono Q离子交换色谱
步骤3.1中分离得到的高活性组分使用Mono Q离子交换色谱进一步分离。将上一步离子交换色谱所得高活性组分过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为2mg/mL，上样量10mL，所述Mono Q离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.0的20mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：pH 7.0含1mol/LNaCl的的20mM Tris-HCl缓冲液，流速为1mL/min，检测波长214nm，梯洗体积为20mL，峰组分每管收集1mL；测定各管收集液的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性(具体测定方法同步骤2)，收集抑制幽门螺旋杆菌粘附活性和抗氧化活性均较高的组分(第12管)备用。
4、LC-MS/MS质谱测序
将步骤3.2中得到的组分脱盐冻干后进行质谱测序(委托北京百泰派克生物科技有限公司进行)，经数据库序列比对，得到氨基酸序列为QQPTPCPY(SEQ ID NO.1)的双功能玉米肽。
实施例2
委托上海强耀生物科技有限公司合成实施例1所得双功能玉米肽QQPTPCPY(SEQID NO.1)，测定其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，具体测定方法同实施例1步骤2。
结果显示，当多肽QQPTPCPY的浓度为4mg/mL时，其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性为25.76％。
实施例3
委托上海强耀生物科技有限公司合成实施例1所得双功能玉米肽QQPTPCPY(SEQID NO.1)，测定其抗氧化活性，其中清除DPPH自由基能力的测定、清除ABTS自由基能力的测定和清除羟基自由基能力的测定方法同实施例1步骤2。
结果显示，多肽QQPTPCPY对DPPH自由基清除能力的IC50值为1.529mg/mL，多肽QQPTPCPY对ABTS自由基清除能力的IC50值为0.014mg/mL，QQPTPCPY对羟基自由基清除能力的IC50值为0.932mg/mL。
多肽QQPTPCPY还原力能力的测定：
按表2在10mL离心管中加入2mL多肽溶液(0.5mg/mL)、2mLpH 6.60.2mol/L PBS缓冲溶液和2mL 1％(w/v)K3Fe(CN)6溶液，震荡摇匀后50℃水浴20min，加入2mL 10％(w/v)三氯乙酸(TCA)溶液，震荡混匀后4000r/min离心10min，取上清2mL、蒸馏水2mL和0.4mL 0.1％(w/v)FeCl3溶液，震荡摇匀后50℃水浴10min，立即倒入石英比色皿中，在700nm波长下用紫外可见分光光度计测得吸光值，重复测定三次(还原力测定即比较相同蛋白浓度下的吸光度值)，表2中的Ai代表加样管，A0代表调零管。
表2加样表
结果显示，在多肽浓度0.5mg/mL下，QQPTPCPY还原力能力值为0.749。
由以上实施例可以得出，本发明提供的双功能玉米肽具备同时抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化的双活性。
本发明上述实施例的技术路线如图3所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种双功能玉米肽，其特征在于，所述玉米肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述双功能为抑制幽门螺旋杆菌粘附和抗氧化。
2.权利要求1所述双功能玉米肽在制备拮抗幽门螺旋杆菌粘附产品中的应用。
3.权利要求1所述双功能玉米肽在制备抗氧化产品中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述产品包括药品。
5.一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附和/或抗氧化功能的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包括权利要求1所述的双功能玉米肽。
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