CN117264853B - 一种缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌h15的筛选方法与应用 - Google Patents
一种缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌h15的筛选方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物新应用技术领域，具体为一种预防和缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌H15的筛选方法与应用。该菌株名称为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）H15，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27654。该菌株具有良好的纳米硒转化能力及有机硒的富集能力，并对溃疡性结肠炎具有良好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于微生物新应用技术领域，具体为一种预防和缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌H15的筛选方法与应用。
背景技术
溃疡性结肠炎是一种病因尚不明确的非特异性肠道炎症性疾病，其病程缓慢，易反复发作，是困扰人类胃肠疾病的主要疾病之一。其中，溃疡性结肠炎可释放大量的自由基，消除有益菌的数量，导致肠屏障受损。目前国内外医学领域普遍采用药物治疗方式，但存在很多不良反应，不适于长期服用。
双歧杆菌是一种主要生长繁殖于人体和其他哺乳动物肠道内的革兰氏阳性专性厌氧菌，其作为益生菌被普遍添加在食品中。然而，在双歧杆菌的生产加工和人体吸收消化过程中，需要通过一系列的物理化学障碍，并达到一定的活菌数才能在宿主肠道内定殖，从而发挥益生作用效果。在双歧杆菌治疗溃疡性结肠炎的应用中，由于患者肠道内会释放大量自由基，这种强氧化环境严重抑制了双歧杆菌的数量与增殖，导致其应用受限。
硒是人类和动物健康所需要的基本微量元素，主要以硒蛋白的形式积极参与到动物生理学过程中，通过提高含硒酶活性增强机体抗氧化能力。据报道，在溃疡性结肠炎患者中，补充硒剂能够提高抗氧化能力，恢复肠道屏障，且硒状态与溃疡性结肠炎风险之间存在正相关关系。纳米硒和有机硒与无机硒相比，其毒性较低，生物活性较高，可以迅速被吸收和利用，成为近年来研究者所关注的焦点。
因此，分离筛选能够缓解溃疡性结肠炎且具有富硒能力的微生物至关重要，其已成为肠道疾病治疗的难点及重要环节，对于维持人体肠道健康、助力生物医疗具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种能够缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌，该菌株能从母乳喂养的顺产婴儿粪便中被分离筛选，对于溃疡性结肠炎具有一定治疗效果。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株，属于动物双歧杆菌，名称为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis） H15，分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNO.27654，保藏日期：2023-06-16。
作为本发明的一种优选方案，所述动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）H15的生物学特征为：
（1）革兰氏阳性菌，呈现弯曲、棒状的短杆菌状。
（2）16S rDNA基因测序
对动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）H15的16S rDNA基因序列进行PCR扩增、测序以及BLAST比对，结果显示，动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）H15的16S rDNA基因序列与动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）的相似度较高，具有高度一致性。
（3）对于亚硒酸钠和模拟胃液具有耐受性，且能够将无机硒转化为纳米硒形式。
另一方面，本发明提供了该新型可缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
采集五份来自北京地区的母乳喂养的健康婴儿新鲜粪便样本置于无菌采样袋中，厌氧4℃暂存，取样后及时分离。将称好的1 g婴儿粪便与9 mL的大便稀释液充分混匀，此溶液作为稀释1次的悬浮液，从中吸取1 mL悬浮液于另一支9 mL大便稀释液中，制成稀释2次的悬浮液，以此操作为标准制备梯度稀释液，最终稀释7次。将1 mL合适梯度的稀释液涂布于含有新物质溶液的MRSc培养基中，37℃厌氧培养48 h。培养结束后选取不同生长位置、菌落大小、菌落形态的单菌落进行革兰氏染色、16S rDNA基因测序及同源性分析，并将单一的菌株保存于-80℃冰箱中。
作为本发明的一种优选方案，所述培养基和大便稀释液按下述比例配制：
（1）大便稀释液：Na2HPO4·12H2O 6 g/L、K2HPO4·3H2O 4.5 g/L、吐温80 1 mL/L、琼脂0.5 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g/L、pH 6.8~7.0；
（2）新物质溶液（现用现配）：抗生素（硫酸巴龙霉素0.1 g、硫酸新霉素0.4 g）、丙酸钠15 g、氯化锂3 g、无菌水40 mL；
（3）MRSc培养基：K2HPO4·3H2O 2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、酵母浸粉5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、牛肉膏10 g/L、柠檬酸铵2 g/L、胰蛋白胨10 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L、葡萄糖20 g/L、一水合硫酸盐0.25 g/L、吐温80 1mL/L、pH 6.5。
本发明的第三方面，提供了该可缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌对无机硒转化为生物纳米硒过程的鉴定，所述鉴定过程及具体方案如下：
（1）富硒动物双歧杆菌H15所产生物纳米硒的分离
将培养好的二代动物双歧杆菌H15进行富硒培养24 h（亚硒酸钠添加量为100 μg/mL）后通过0.45 μm滤膜去除菌体，6500 rpm离心10 min，无菌PBS洗涤3次后重悬于PBS并调整浓度。
（2）生物纳米硒的形态、粒径与Zeta电位表征
滴加5 μL纯化的生物纳米硒于200目碳支持铜网上，干燥2 h后，利用透射电子显微镜测量样品的表观形貌，加速电压为15 KV。其次，用马尔文激光粒度仪在25℃测定生物纳米硒溶液的水合粒径、Zeta电位和聚合物分散性指数（PDI），每个样品测量3次，每次测量扫描10次。
（3）生物纳米硒的元素分析
利用X-射线光电子能谱探究生物纳米硒中Se的化合价。取样品用导电胶固定在样品台上，进样抽真空进行测试，结合能采用C1s=284.8 eV为基准校正。主要参数：500 μm束斑、功率150 W、单色Al Ka （其中hv =1486.6 eV）
（4）生物纳米硒的官能团分析
将生物纳米硒与KBr研磨并混合（比例约1：50）后压片，在红外灯下烘烤后，进样采集KBr背景；波数范围为800~4000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描32次。
另一方面，本发明提供了该可缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌在体外增强抗氧化能力的评估，并基于此提供该缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株在制备抗氧化产品方面的应用。
具体方案如下：
菌株无细胞提取物的制备：将培养好的二代富硒菌液6000 rpm离心10 min，除去上清液，保留菌体沉淀，利用无菌PBS缓冲液洗涤3次后重悬于1 mL的PBS缓冲液中。将菌液添加至装有0.3 g的100 μm玻璃珠的螺口管中，利用珠磨式研磨器高速破碎15 s，共2次。12000 rpm离心5 min后，取上清液即为无细胞提取物，冻于-80℃待用。
抗氧化水平的测定：使用试剂盒测量富硒菌株无细胞提取物的超氧化物歧化酶（SOD）、1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基（DPPH）和脂质氧化（MDA）水平。
本发明的第五方面，提供了该可缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌的应用，具体为上述富硒动物双歧杆菌在体内缓解小鼠溃疡性结肠炎的应用。并基于此所述缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株在制备治疗肠道炎症性疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种优选方案，上述富硒动物双歧杆菌在体内缓解小鼠溃疡性结肠炎的应用，具体方案如下：
（1）肠道定植实验
小动物荧光成像：异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记菌株：将动物双歧杆菌H15在4℃下4500 rpm离心10 min，收集菌体沉淀，利用PBS缓冲液洗3次。将109CFU/mL的菌液与0.2μL的FITC母液（10 mg/mL）厌氧避光涡旋30 min，利用PBS缓冲液洗3次，重悬于PBS缓冲液中。
实验动物：获得中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准后，采购24只6-8周龄的C57BL/6J雄性小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），经专业清洁级包装处理后送至中国农业大学西校区无特定病原体及SPF级动物房，饲养环境相对湿度为55 ± 10%，饲养环境温度为22 ± 2℃，严格遵循光照条件为12 h的昼夜交替间隔照明。
动物分组：将动物随机分成3组，每组8只，自由采食与饮水，进行为期一周的环境适应性饲养。适应期结束后，进行为期7天的灌胃处理。H15组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的FITC标记的H15菌液；空白组：每天灌胃200 μL的PBS缓冲液。实验结束后处死小鼠，避光解剖取完整肠段，小动物荧光成像在FITC滤光片下（488 nm/525 nm）观察荧光。
16S rDNA定量：上述实验结束后，解剖小鼠，收集小肠、结肠、直肠内容物，冻于-80℃备用。提取粪便DNA，通过16S rDNA基因通用引物对保守目的片段进行PCR扩增，定量每克粪便中的乳酸菌含量。
（2）富硒动物双歧杆菌H15在体内缓解溃疡性结肠炎的鉴定
实验动物：动物实验获得中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准后，采购40只6-8周龄的C57BL/6J雄性小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），经专业清洁级包装处理后送至中国农业大学西校区无特定病原体及SPF级动物房，饲养环境相对湿度为55 ± 10%，饲养环境温度为22±2℃，严格遵循光照条件为12 h的昼夜交替间隔照明。
动物分组：将动物随机分成6组，每组8只，自由采食与饮水，进行为期一周的环境适应性饲养。适应期结束后，除空白组，其余组小鼠均自由饮水含3.0%的葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）连续7天以建立溃疡性结肠炎模型。随后，进行为期7天的治疗方案，每天测定小鼠的摄食量、体重。空白组：每天灌胃200 μL的PBS；DSS组：每天灌胃200 μL的PBS；BB12组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的BB12菌液作为阳性对照菌株；H15组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的H15菌液；富硒H15组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的富硒H15菌液（100 μg/mL亚硒酸钠添加量）；H15+亚硒酸钠组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的H15菌液（800 ng/kg亚硒酸钠添加量）；柳氮磺吡啶（SASP）组：每天灌胃200 μL含300 mg/kg的SASP作为阳性药物组。
疾病活动指数（DAI）评分：DAI是评价结肠炎炎症程度的指标之一。根据特定评分标准，将每日观察记录的动物体重变化、大便性状以及便血情况进行相加评分，得到溃疡性结肠炎的DAI评分。
小鼠结肠组织处理：解剖后立即取出结肠组织，记录结肠长度及病变情况后使用PBS缓冲溶液漂洗并用滤纸吸干，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分置于液氮中保存。将置于4%多聚甲醛中的结肠组织经过修块、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、透明、封固等步骤，制成常规HE染色的组织切片，厚约4 μm。光镜观察并显微拍照，用于观察组织学变化。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明的动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis） H15具有良好的纳米硒转化能力及有机硒的富集能力，是一种新型的动物双歧杆菌益生菌株。
2、本发明所述菌株H15能够在20~100 μg/mL亚硒酸钠存在的条件下实现生物纳米硒的转化，且转化率较高，最高可达53.63 ± 2.00%。
3、本发明所述菌株H15具有卓越的抗氧化能力，并对溃疡性结肠炎显示良好的治疗效果，这对于开发高效的结肠炎治疗药物具有重要的实际意义。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为动物双歧杆菌的鉴定。（A）为革兰氏染色图；（B）为琼脂糖凝胶电泳图，泳道1：H13，泳道1：H14，泳道1：H15，泳道1：H16；（C）为系统发育树。
图2为具有潜在富硒能力的动物双歧杆菌的筛选。（A）为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后菌液的颜色变化与菌落数量；（B）为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后的活菌数；（C）为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后纳米硒的产量；（D）为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后纳米硒的转化率。
图3为动物双歧杆菌H15最佳富硒浓度的确定。（A）为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后菌液的颜色变化；（B）为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后纳米硒的产量；（C）为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后纳米硒的转化率；（D）为添加不同浓度的亚硒酸钠培养后菌体蛋白浓度；（E）为模拟胃肠液培养后活菌数的变化。
图4为富硒动物双歧杆菌H15所产生物纳米硒的理化性质。（A）为生物纳米硒微观形貌示意图；（B）为生物纳米硒的元素分析；（C）为水合粒径；（D）为PDI值；（E）为Zeta电位；（F）为生物纳米硒中Se的化合价；（G）为生物纳米硒中官能团变化。
图5为动物双歧杆菌H15的抗氧化能力。（A）为MDA水平；（B）为DPPH自由基清除率；（C）为SOD酶活水平。
图6为动物双歧杆菌H15的肠道定植能力。（A）为实验流程图；（B）为活死菌染色图；（C）为小动物荧光成像图；（D）为荧光强度；（E）为肠道内容物总DNA浓度；（F）为肠道内容物总乳酸菌表达倍数。
图7为动物双歧杆菌H15对溃疡性结肠炎的治疗实验。（A）为小鼠实验方案；（B）为体重变化趋势；（C）为体重增减变化；（D）为DAI评分；（E）为结肠长度变化；（F）为结肠光学照片；（G）为结肠HE染色，比例尺为100 μm。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例说明。
本发明涉及的培养基：
（1）大便稀释液：Na2HPO4·12H2O 6 g/L、K2HPO4·3H2O 4.5 g/L、吐温80 1 mL/L、琼脂0.5 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐 0.5 g/L、pH 6.8~7.0；
（2）新物质溶液：抗生素（硫酸巴龙霉素0.1 g、硫酸新霉素0.4 g）、丙酸钠15 g、氯化锂3 g、无菌水40 mL；
（3）MRSc培养基：K2HPO4·3H2O 2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、酵母浸粉5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、牛肉膏10 g/L、柠檬酸铵2 g/L、胰蛋白胨10 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L、葡萄糖20 g/L、一水合硫酸盐0.25 g/L、吐温80 1mL/L、pH 6.5。
实施例1 缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌的分离、筛选及鉴定
采集五份来自北京地区的母乳喂养的健康婴儿新鲜粪便样本置于无菌采样袋中，厌氧4℃暂存，取样后及时分离。将称好的1 g婴儿粪便与9 mL的大便稀释液充分混匀，此溶液作为稀释1次的悬浮液，从中吸取1 mL悬浮液于另一支9 mL大便稀释液中，制成稀释2次的悬浮液，以此操作为标准制备梯度稀释液，最终稀释7次。将1 mL合适梯度的稀释液涂布于含有新物质溶液的MRSc培养基中，37℃厌氧培养48 h。培养结束后选取不同生长位置、菌落大小、菌落形态的单菌落进行革兰氏染色、16S rDNA基因测序及同源性分析，并将单一的菌株保存于-80℃冰箱中。
形态学鉴定：根据革兰氏染色的显微镜结果，如图1A所示，挑取培养好的固体培养基上的疑似菌落进行革兰氏染色，其中有4株菌的形态疑似为动物双歧杆菌，革兰氏染色结果为阳性菌，呈现弯曲、棒状的短杆菌状。
分子生物学鉴定：提取基因组DNA，通过16S rDNA基因通用引物（如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示）对保守目的片段进行PCR扩增，随后进行测序分析。通过PCR扩增、测序以及BLAST比对，利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。如图1B所示，进一步将4株疑似菌落提取基因组DNA，16S rDNA扩增后的产物长度约为1500 bp，将16S rDNA测序结果（如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示）进行BLAST比对，确认4株菌均为动物双歧杆菌，将其分别编号为H13、H14、H15和H16，最后构建四株动物双歧杆菌的系统发育树分析其亲缘关系（图1C）。
实施例2 缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌的耐受性评价
1）动物双歧杆菌的亚硒酸钠耐受性评价。
将双歧杆菌液体活化至二代，以2%的接种量接种于含有不同浓度亚硒酸钠的厌氧管中（0~400 μg/mL），37℃培养24 h。随后，观察厌氧管中培养基颜色变化，并梯度稀释进行活菌计数。
取1 mL不同硒浓度富集后的双歧杆菌菌液，12000 rpm离心1 min，去除上清液，利用PBS缓冲液洗3次。将菌体沉淀重悬于1 mL含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，超声破碎1min后，12000 rpm离心1 min，取上清液测定细菌蛋白浓度。
如图2A所示，将筛选得到的四株动物双歧杆菌分别置于添加了0~100 μg/mL亚硒酸钠的MRSc培养基中培养24 h，在0~20 μg/mL时，培养后四株菌液颜色无明显变化，菌株增殖发酵后均呈现黄色。在40~100 μg/mL时，四株菌开始还原亚硒酸钠形成纳米硒颗粒，菌液逐渐趋于红色。其中，H13、H14和H16在80 μg/mL条件下比在100 μg/mL时菌液颜色深，表明三株菌可能在80 μg/mL条件下还原形成纳米硒的浓度最高。然而，H15在100 μg/mL时菌液颜色最深，表明H15可能在此条件下还原形成纳米硒的浓度最高。
其次，如图2B所示，进一步测定了四株菌对亚硒酸钠的耐受性评价。在40 μg/mL条件下，四株菌的活菌数均高于108CFU/mL，组间无显著性差异；在60 μg/mL和80 μg/mL条件下，H16的活菌数（7.87 lgCFU/mL, 8.16 lgCFU/mL,p<0.05）同其他组相比显著降低，表明H16耐受亚硒酸钠的能力较弱；而在100 μg/mL条件下，H13、H14和H16的活菌数同H15相比均显著下降，H15的活菌数（9.46 lgCFU/mL,p>0.05）无显著性变化，表明H15对亚硒酸钠的耐受能力最强，100 μg/mL的亚硒酸钠不会对H15产生毒性。
进一步，如图2C所示，测定了四株双歧杆菌在0~100 μg/mL亚硒酸钠条件下还原形成纳米硒的产量。其中，四株菌在10 μg/mL条件下均无法还原形成纳米硒；H13在20~60 μg/mL条件下还原形成纳米硒的产量逐渐升高，在60~100 μg/mL条件下达到平台期，纳米硒产量无显著性变化；H14在20~60 μg/mL条件下纳米硒产量趋于稳定并产量较低，在80 μg/mL条件下纳米硒产量最高，在100 μg/mL条件下纳米硒产量显著下降；H15在20~80 μg/mL条件下纳米硒产量缓慢增加，在100 μg/mL条件下纳米硒产量达到最高（311.74 ± 3.60 μmol）；H16在20~60 μg/mL条件下纳米硒产量趋于稳定并产量较低，在100 μg/mL条件下纳米硒产量最高（182.02 ± 3.20 μmol）。此外，如图2D所示，计算了四株双歧杆菌在0~100 μg/mL亚硒酸钠条件下纳米硒的转化效率。其中，H13在60 μg/mL时纳米硒转化率最高（41.39± 3.14%），随后显著下降；H14在80 μg/mL时纳米硒转化率最高（34.65 ± 1.79%），随后显著下降；H15在100 μg/mL时纳米硒转化率最高（53.63 ± 2.00%）；H16在80 μg/mL时转化效率最高（36.26 ± 1.77%）。
综上，初步筛选得到了富硒能力较强的动物双歧杆菌H15，其在100 μg/mL亚硒酸钠条件下转化形成纳米硒的能力较强并可用于后续实验。
2）动物双歧杆菌富硒后的纳米硒产量与转化率。
首先，根据硒含量与吸光度的关系绘制纳米硒的测定标准曲线，用去离子水分别配置0.1 mol/L的亚硒酸钠溶液，0.1 mol/L的HN2OH·HCl溶液，1 mol/L的Na2S溶液。分别取0, 10, 20, 40, 60, 80 μL的0.1 mol/L的亚硒酸钠溶液依次加入至7个1.5 mL离心管内，每个离心管内加入250 μL的0.1 mol/L的HN2OH·HCl溶液，充分混匀后，静置反应2 h。其中，每个处理设置三个重复。将反应后的离心管放在氮吹仪下，直至样品被吹干，离心管内只剩下红色单质硒。向每个离心管内加入1 mL 1 mol/L的Na2S溶液，轻轻混匀，充分反应1h后，在多功能波长扫描仪500 nm处测定溶液吸光度。
将不同硒浓度富集后的双歧杆菌菌液充分悬浮，吸取500 μL后，12000 rpm离心15min，弃除上清液。随后，使用500 μL 0.8% NaCl溶液重新悬浮清洗，12000 rpm离心10 min后，去除上清液，重复3次。最后，加入250 μL 1 mol/L Na2S溶液，充分混匀，反应1 h后，12000 rpm离心10 min，取上清液200 μL至96孔板中。测定溶液在500 nm处的吸光度，根据绘制的标准曲线将测定值换算成样品中纳米硒的含量，进而计算出转化率，转化率(%)=纳米硒含量/亚硒酸钠添加量100。
实验测定了120~400 μg/mL亚硒酸钠添加量条件下纳米硒的产量与转化率。如图3A-C所示，在120 μg/mL亚硒酸钠条件下，纳米硒转化效率最高（28.33 ± 1.82%），随着亚硒酸钠浓度的升高，纳米硒产量趋于平稳，纳米硒转化率显著下降。接着，如图3D所示，测定了H15在0~400 μg/mL亚硒酸钠条件下的菌体蛋白浓度。其中，H15在0~100 μg/mL亚硒酸钠存在时菌体蛋白浓度无显著性变化，表明在此范围内H15生长状态不会受到影响，这与图2B的实验结果一致；而在120~400 μg/mL亚硒酸钠条件下，菌体蛋白浓度显著下降，表明H15的生长受到了显著的抑制。综上，证明了动物双歧杆菌H15的最佳富硒条件为100 μg/mL亚硒酸钠添加量。
3）动物双歧杆菌在模拟胃肠液中的耐受性评价
将活化至二代的阳性对照菌株动物双歧杆菌BB12、动物双歧杆菌H15以及100 μg/mL亚硒酸钠培养的富硒双歧杆菌H15置于模拟胃液培养4 h后，转移至模拟肠液中继续培养8 h，在每一个时间点取样检测样品中的活菌数。
实验测定了H15富硒前后在模拟胃液的环境中培养后的活菌数变化，并以动物双歧杆菌BB12作为阳性对照菌株。如图3E所示，富硒后的H15在模拟胃液环境中培养4 h后活菌数显著高于H15组（富硒H15: 7.21± 0.05 lgCFU/mL，H15: 7.59 ± 0.07 lgCFU/mL，p<0.05），表明富硒后的动物双歧杆菌H15增强了对胃液环境的耐受能力。
实施例3 缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌所产生的生物纳米硒的鉴定
（1）富硒动物双歧杆菌H15所产生物纳米硒的分离
将培养好的二代动物双歧杆菌H15进行富硒培养24 h（亚硒酸钠添加量为100 μg/mL）后通过0.45 μm滤膜去除菌体，6500 rpm离心10 min，无菌PBS洗涤3次后重悬于PBS并调整浓度。
（2）生物纳米硒的形态、粒径与Zeta电位表征
滴加5 μL纯化的生物纳米硒于200目碳支持铜网上，干燥2 h后，利用透射电子显微镜测量样品的表观形貌，加速电压为15 KV。其次，用马尔文激光粒度仪在25℃测定生物纳米硒溶液的水合粒径、Zeta电位和聚合物分散性指数（PDI），每个样品测量3次，每次测量扫描10次。
如图4A所示，对富硒动物双歧杆菌H15所产生物纳米硒进行理化性质分析，透射电镜结果显示富硒动物双歧杆菌H15所产生物纳米硒粒径大小均一、分散度良好，呈现规则球形纳米硒颗粒，粒径大小约为200 nm。进一步，对生物纳米硒的组成元素进行分析（图4B），分析发现由N、O、Se元素构成，其中N元素可能来源于菌株特异性蛋白结构结合在生物纳米硒表面所构成，可能起到稳定纳米硒结构的作用。如图4C-4E，动态光散射结果进一步证实了富硒动物双歧杆菌H15所产生物纳米硒粒径大小均一，水合粒径大小为246 nm；分散度良好，PDI值约为0.03；表面zeta电位约为-1.0 mV，可能由于菌体分泌的特异性蛋白包裹与纳米颗粒表面所致。
（3）生物纳米硒的元素分析
利用X-射线光电子能谱探究生物纳米硒中Se的化合价。取样品用导电胶固定在样品台上，进样抽真空进行测试，结合能采用C1s=284.8 eV为基准校正。主要参数：500 μm束斑、功率150 W、单色Al Ka （其中hv =1486.6 eV）
如图4F所示，X-射线光电子能谱结果表明Se的3d轨道出现单一峰，其结合能在55.3 eV左右，表明该生物纳米硒中Se元素的化合价为0价态，不存在其他价态的Se，证明了该纳米颗粒为含硒纳米颗粒。
（4）生物纳米硒的官能团分析
利用傅里叶变换红外光谱测试并分析官能团的结构。将生物纳米硒与KBr研磨并混合（比例约1：50）后压片，在红外灯下烘烤后，进样采集KBr背景；波数范围为800~4000cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描32次。
如图4G所示，在1500-1690 cm-1波数范围内存在峰值，此区域为双键伸缩振动，表明该生物纳米硒中新化学键的形成；在3250-3500 cm-1波数范围内形成峰值，此区域代表-NH和-OH伸缩振动，说明Se···H-O及Se···H-N形成，起到稳定纳米硒的作用。
实施例4 缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌的抗氧化能力的体外评估
菌株无细胞提取物的制备：将培养好的二代富硒菌液6000 rpm离心10 min，除去上清液，保留菌体沉淀，利用无菌PBS缓冲液洗涤3次后重悬于1 mL的PBS缓冲液中。将菌液添加至装有0.3 g的100 μm玻璃珠的螺口管中，利用珠磨式研磨器高速破碎15 s，共2次。12000 rpm离心5 min后，取上清液即为无细胞提取物，冻于-80℃待用。
抗氧化水平的测定：使用试剂盒测量富硒菌株无细胞提取物的超氧化物歧化酶（SOD）、1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基（DPPH）和脂质氧化（MDA）水平。
如图5所示，BB12、H15与富硒H15组之间菌株胞内MDA水平无显著差异，且均为负值，表明菌株本身不会产生任何氧化损伤；其中，富硒H15与H15组相比，显著提高了胞内DPPH自由基清除率和SOD酶活水平，且均优于商业菌株BB12，表明富硒后的H15增加了菌株胞内的抗氧化能力。
实施例5 缓解溃疡性结肠炎的富硒动物双歧杆菌的体内应用
（1）肠道定植实验
小动物荧光成像：异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记菌株：将动物双歧杆菌H15在4℃下4500 rpm离心10 min，收集菌体沉淀，利用PBS缓冲液洗3次。将109CFU/mL的菌液与0.2μL的FITC母液（10 mg/mL）厌氧避光涡旋30 min，利用PBS缓冲液洗3次，重悬于PBS缓冲液中。
实验动物：获得中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准后，采购24只6-8周龄的C57BL/6J雄性小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），经专业清洁级包装处理后送至中国农业大学西校区无特定病原体及SPF级动物房，饲养环境相对湿度为55 ± 10%，饲养环境温度为22 ± 2℃，严格遵循光照条件为12 h的昼夜交替间隔照明。
动物分组：将动物随机分成3组，每组8只，自由采食与饮水，进行为期一周的环境适应性饲养。适应期结束后，进行为期7天的灌胃处理。H15组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的FITC标记的H15菌液；空白组：每天灌胃200 μL的PBS缓冲液。实验结束后处死小鼠，避光解剖取完整肠段，小动物荧光成像在FITC滤光片下（488 nm/525 nm）观察荧光。
16S rDNA定量：上述实验结束后，解剖小鼠，收集小肠、结肠、直肠内容物，冻于-80℃备用。提取粪便DNA，通过16S rDNA基因通用引物（如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示）对保守目的片段进行PCR扩增，定量每克粪便中的乳酸菌含量。
实验方案如图6A所示。如图6B所示，对H15进行活死菌染色，确定对每只小鼠每日灌胃H15活菌数达109CFU/mL。如图6C-D所示，实验结束后立即处死小鼠，在避光条件下解剖完整肠段置于平皿中进行荧光成像。其中，灌胃PBS的对照组小鼠肠道无任何荧光显示，而灌胃H15的小鼠肠道在盲肠、结肠部位显示出较强的荧光信号，表明H15在灌胃一周后可以在结肠部位定植并进一步发挥益生功能。此外，对小鼠肠道内容物进行测定后分析发现（图6E-F），H15组（结肠：2.53 ± 0.94，直肠：5.52 ± 2.47）小鼠结肠和直肠的乳酸菌表达倍数比PBS组显著增加，表明灌胃H15后增加了在小鼠结肠和直肠部位的乳酸菌含量。综上，所筛选的具有富硒能力的动物双歧杆菌H15可以在结肠部位定植，可进行后续的动物实验。
（2）富硒动物双歧杆菌H15在体内缓解溃疡性结肠炎的鉴定
实验动物：动物实验获得中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准后，采购40只6-8周龄的C57BL/6J雄性小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），经专业清洁级包装处理后送至中国农业大学西校区无特定病原体及SPF级动物房，饲养环境相对湿度为55 ± 10%，饲养环境温度为22±2℃，严格遵循光照条件为12 h的昼夜交替间隔照明。
动物分组：将动物随机分成6组，每组8只，自由采食与饮水，进行为期一周的环境适应性饲养。适应期结束后，除空白组，其余组小鼠均自由饮水含3.0%的葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）连续7天以建立溃疡性结肠炎模型。随后，进行为期7天的治疗方案，每天测定小鼠的摄食量、体重。空白组：每天灌胃200 μL的PBS；DSS组：每天灌胃200 μL的PBS；BB12组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的BB12菌液作为阳性对照菌株；H15组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的H15菌液；富硒H15组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的富硒H15菌液（100 μg/mL亚硒酸钠添加量）；H15+亚硒酸钠组：每天灌胃200 μL含109CFU/mL的H15菌液（800 ng/kg亚硒酸钠添加量）；柳氮磺吡啶（SASP）组：每天灌胃200 μL含300 mg/kg的SASP作为阳性药物组。
疾病活动指数（DAI）评分：DAI是评价结肠炎炎症程度的指标之一。根据特定评分标准（表1），将每日观察记录的动物体重变化、大便性状以及便血情况进行相加评分，得到溃疡性结肠炎的DAI评分。
表1 DAI评分标准
小鼠结肠组织处理：解剖后立即取出结肠组织，记录结肠长度及病变情况后使用PBS缓冲溶液漂洗并用滤纸吸干，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分置于液氮中保存。将置于4%多聚甲醛中的结肠组织经过修块、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、透明、封固等步骤，制成常规HE染色的组织切片，厚约4 μm。光镜观察并显微拍照，用于观察组织学变化。
如图7A所示，以在饮水中添加3.0%的DSS饲喂小鼠5天诱导溃疡性结肠炎模型，期间连续灌胃各受试物7天。其中，BB12组作为阳性对照菌株组，SASP作为阳性药物组。如图7B-C所示，实验结束后称量各组小鼠体重分析发现，DSS模型组与空白组相比小鼠体重显著下降（4.30 ± 0.32 g,p<0.05），初步判断模型建立成功。动物双歧杆菌BB12来源于丹麦科汉森公司，是世界上临床研究最为充分的双歧杆菌菌株，其优良的免疫功能已临床研究中得到了验证；H15组同BB12组相比，小鼠体重显著下降（H15: 2.84 ± 0.52 g, BB12: 1.18± 0.35 g,p<0.05），而富硒H15组同BB12组相比，小鼠体重变化无显著性差异（富硒H15:1.04 ± 0.25 g），表明动物双歧杆菌H15本身具有一定的益生功能并可以缓解溃疡性结肠炎的症状，富硒后的H15增强了其对溃疡性结肠炎的治疗效果，这种有益效果可能来源于富硒后产生的生物纳米硒以及胞内抗氧化酶水平的增加。其次，H15+亚硒酸钠组同富硒H15组相比，小鼠体重显著下降（H15+亚硒酸钠：3.14 ± 1.09 g），表明在相同硒添加量的条件下，亚硒酸钠作为无机硒的毒性大于纳米硒和有机硒，在体内对溃疡性结肠炎的治疗效果不佳。此外，SASP是一种有机化合物，主要用作磺胺类抗菌药，吸收部分在肠微生物作用下分解成5-氨基水杨酸和磺胺吡啶，5-氨基水杨酸可与肠壁结缔组织络合后停留较长时间并起到抗菌消炎和免疫抑制作用。实验结果表明，SASP组与富硒H15组相比，小鼠体重显著下降（SASP: 2.32 ± 0.46 g），表明富硒H15对溃疡性结肠炎的治疗效果优于SASP。
如图7D-F所示，解剖小鼠后摘取完整肠段，测量肠道长度的变化。其中，DSS组小鼠肠道显著缩短、发生红肿、DAI评分最高、小鼠便血最严重；而富硒H15治疗组显著恢复了肠道长度、缓解了结肠炎症状。
最后，评价分析各受试物病理组织切片的损伤情况。如图7G所示，DSS模型组结肠黏膜层溃疡、坏死、脱落，固有层中度炎症细胞浸润，黏膜下层结构疏松，呈典型慢性溃疡性结肠炎炎症改变；H15组和H15+亚硒酸钠组部分结肠黏膜层溃疡，肠黏膜基底可见淋巴细胞及粒细胞灶性浸润；阳性对照菌株BB12组、SASP药物组和富硒H15组病理组织学结果同空白组相似，可显著降低上述病症，呈现正向治疗效果。综上，所筛选的动物双歧杆菌H15经富硒后可以显著缓解小鼠溃疡性结肠炎的症状。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株，其特征在于，属于动物双歧杆菌，名称为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis） H15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27654。
2.根据权利要求1所述的一种缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株，其特征在于，所述菌株H15为革兰氏阳性菌，呈线弯曲、棒状的短杆菌状形态。
3.根据权利要求1所述的一种缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株，其特征在于，对于亚硒酸钠和模拟胃液环境具有耐受性，且能够将无机硒转化为生物纳米硒。
4.根据权利要求1所述的一种缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株，其特征在于，其16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:5所示。
5.采用权利要求1所述缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株制备的菌剂或益生菌发酵物。
6.一种如权利要求1所述的缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株在制备抗氧化产品方面的应用。
7.一种如权利要求1所述缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株在制备治疗肠道炎症性疾病的药物中的应用。
8.一种如权利要求1所述缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株在制备纳米硒中的应用。
9.一种如权利要求1所述缓解溃疡性结肠炎的富硒菌株在制备药品或者饲料中的应用。
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