CN114717157A - 一株预防婴幼儿链球菌感染的副干酪乳酪杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株预防婴幼儿链球菌感染的副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）及其应用。所述副干酪乳酪杆菌对β‑溶血链球菌具有很强的抗菌效果，已于2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021591。该菌株可有效预防链球菌感染，尤其是婴幼儿链球菌感染，能显著降低体内炎症因子水平，减轻肠黏膜层脱落程度，保持肠系膜结构完整，减轻炎性细胞浸润和脾脏肿大，效果突出。所述副干酪乳酪杆菌可用于制备具有预防链球菌感染功能的食品、保健品、药品或护肤品，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株预防婴幼儿链球菌感染作用的副干酪乳酪杆菌及其应用。
背景技术
链球菌是化脓性球菌的另一类常见的细菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，其中B族链球菌又称β溶血性链球菌（GBS），可以间断性、一过性、持续性地定植于消化道或生殖道，属于条件性致病菌，当人体的免疫功能低下的时候，可以导致感染，或者引起变态反应性肾炎、风湿病、心肌炎等病症。据研究统计，约10%～30%的孕妇伴有GBS感染，约50%GBS定植的孕妇会将细菌传播给新生儿。另外，由于婴儿免疫系统不健全，极易通过皮肤或黏膜感染环境中的链球菌。婴儿的GBS相关疾病主要表现为：高热、抽搐、肺炎、败血症、脑膜炎、骨关节炎等，如果不及时治疗，可能导致器官衰竭而死亡。一项大型Meta分析结果提示，全球0～89 d的婴儿GBS相关疾病的发病率估计为0.53‰，且在出生后的前3个月是GBS相关疾病的高发期。婴儿GBS感染已成为导致其感染患病率及病死率升高的主要原因之一。目前婴幼儿链球菌感染的预防和治疗主要是做好围产期保健、婴幼儿护理、经验性预防性使用抗生素，然而抗生素的使用增加了患儿坏死性小肠炎、肝肾损伤或者听力损伤等的发病率，甚至增加住院患儿病死率。
益生菌是一类活的微生物，当有足够量的活菌体到达宿主肠道、定植从而改变宿主肠道菌落平衡，进而对宿主起着健康效应。益生菌能够分泌有机酸、过氧化氢、苯乳酸和抗菌肽等抑菌物质，其自身结构如肽聚糖、脂磷壁酸等成分可作为抗原直接发挥免疫激活作用。益生菌对肠道的益处包括维持黏膜屏障完整性、通过对病原菌占位的竞争性抑制作用调节细菌定植、启动肠道免疫防御系统和调节肠道炎症等。乳酸杆菌属和双歧杆菌属已经被广泛使用（如作为添加剂添加在酸奶内），益生菌也已在不同的临床应用中得到越来越多的应用和研究，如上呼吸道感染、溃疡性结肠炎、乳腺炎、皮炎等。
肠道菌群失调、肠道屏障功能障碍是链球菌感染疾病如败血症、妊娠晚期GBS感染等发生的部分原因，包括肠道粘膜通透性增加、组织水肿、肠道微生物组移位以及细菌易位等。有研究在检测ICU的败血病患者肠道微生物组时发现，其肠道微生物丰富度和多样性丧失，同时存在优势的单一分类单元（通常是潜在的病原体）。李晗宇等在小鼠脓血症模型中预防性地使用益生菌可以有效降低小鼠死亡率。在预先使用鼠李糖乳杆菌处理的动物模型中，肠道机会性致病菌减少甚至消失而有益菌增加，从而抑制了肠道上皮细胞凋亡和促进紧密连接的形成。新西兰Clinicians科立纯研究发现口服鼠李糖乳杆菌GR-1和罗伊氏乳杆菌RC-14，能够增加女性阴道内益生菌的定植，抑制溶血性链球菌GBS，减少新生儿肺炎、败血症的发生率。Pinaki Panigrahi团队在印度偏远地区开展了一项大型临床试验，结果显示，服用益生菌儿童败血症的发病率降低了40%，同时，肺炎等其他呼吸道感染的风险下降了34%。Francesco等发现完成 90 天 Bactoblis® 试验的儿童的链球菌咽部感染显著减少 (>90%)，口腔病毒感染发生率显著降低。众多研究结果表明肠道菌群益生菌疗法可能作为一种平价的治疗手段预防婴幼儿链球菌感染。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei ）及其应用。所述副干酪乳酪杆菌对β-溶血性链球菌具有很强的抗菌效果，能有效提高机体免疫力，减轻炎症反应，可广泛用于预防链球菌感染，尤其是婴幼儿链球菌感染。
本发明所提供的副干酪乳酪杆菌，为VHPribo O44（Lacticaseibacillus paracasei VHPribo O44），已于2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021591。
本发明所提供的副干酪乳酪杆菌VHPribo O44株，其Riboprinter 指纹图谱如图4所示；其RAPD指纹图谱如图5所示，rep-PCR指纹图谱如图6所示，MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱如图7所示。
本发明所提供的副干酪乳酪杆菌VHPribo O44株在制备链球菌抗菌剂中的应用。
本发明所提供的副干酪乳酪杆菌VHPribo O44株在制备具有降低胆固醇功能的制品中的应用。
本发明所提供的副干酪乳酪杆菌VHPribo O44株在制备具有预防链球菌感染功能的制品中的应用。
本发明还提供了一种用于预防链球菌感染的制品，包含副干酪乳酪杆菌VHPriboO44株和/或其发酵产物。
本发明还提供了一种用于预防链球菌感染的制品，包含副干酪乳酪杆菌VHPriboO44株的裂解液。
所述的制品，为功能性食品、保健品、药品或护肤品。
本发明提供的副干酪乳酪杆菌VHProbi O44对β-溶血性链球菌具有很强的抗菌效果，能在体外显著抑制链球菌的生长和繁殖。该菌株对人工肠胃液具有较强的耐受性；对红霉素和四环素等常见的抗生素敏感，不产生溶血素，不能够溶解血细胞，具有良好的生物安全性。该菌株含胆盐水解酶。
所述副干酪乳酪杆菌VHProbi O44具有较强的抗氧化能力和降解胆固醇能力，DPPH清除率达到25.57%，胆固醇降解率达到41.85%。
所述副干酪乳酪杆菌VHProbi O44可有效预防链球菌感染，降低体内炎症因子水平，减轻肠黏膜层脱落程度，保持肠系膜结构完整，减轻炎性细胞浸润和脾脏肿大；尤其是通过在体外环境中对链球菌进行拮抗处理，能显著降低链球菌的感染水平，与正常组差异极小，预防效果突出。
所述副干酪乳酪杆菌VHProbi O44可用于制备具有预防链球菌感染功能的食品、保健品、药品或护肤品，应用前景广阔。
附图说明
图1为O44菌株抑菌和凝集实验现象图；
图2为O44菌株碳源代谢图谱；
图3为O44菌株胆盐酶活性图；
图4为O44菌株Riboprinter 指纹图谱；
图5为O44菌株的RAPD指纹图谱；
图6为O44菌株的rep-PCR指纹图谱；
图7为MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱；
图8各组别大鼠炎症因子水平结果；
图9为各组别大鼠小肠HE染色结果；其中，A 为正常组，B 模型组，C 阳性组，D 益生菌预处理组，E 益生菌后处理组，F 益生菌体外拮抗组；
图10为各组别大鼠脾脏HE染色结果；其中，A 为正常组，B 模型组，C 阳性组，D 益生菌预处理组，E 益生菌后处理组，F 益生菌体外拮抗组。
具体实施方式
本发明提供的副干酪乳酪杆菌VHProbi O44符合法规要求，可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险。经多相分类学鉴定，副干酪乳酪杆菌VPHrobi O44为一株新发现的菌株。本发明提供的副干酪乳酪杆菌VHProbi O44 具有预防链球菌感染的功效，单独使用该菌株且无需与益生元和/或其它益生菌复配即可对链球菌感染起到预防功效，具有重要的应用价值。
申请人于2021年5月24日将所述副干酪乳酪杆菌VHProbi O44（Lacticaseibacillus paracasei VHPribo O44）保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021591。
本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。
实施例1 副干酪乳酪杆菌VHProbi O44的筛选
1、菌株分离
配制MRS (Man Rogosa Sharpe) 肉汤：纯水1L，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母提取物 5.0g, 乙酸钠5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温80 1.0mL，柠檬酸二胺 2.0g, 碳酸钙20g，七水硫酸镁0. 58g，七水硫酸锰0. 25g，调pH 6.2-6.5。
配置MRS琼脂培养基：1LMRS肉汤添加15g琼脂。
依据2019版《人类遗传资源库伦理规范》，与样本提供者签订项目承诺书和知情同意书后，按照生物样本库标准操作规范，取1g半年内未食用过益生菌制剂的健康婴儿新鲜粪便样本，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出60株潜在乳酸菌，分别命名为O01、O02、……、O58、O59、O60。
2、抗β-溶血性链球菌乳酸菌筛选
乳酸菌菌液制备：将分离得到的60株潜在乳酸菌分别接种至MRS肉汤，37℃静置氧培养48h。
致病菌活化：β-溶血性链球菌（CMCC（B）32210）接种至BHI+5%牛血清培养基中，37℃培养48h。
铺下层培养基，营养琼脂灭菌后倒入平板中，铺满平板即可。待琼脂凝固后，均匀放置无菌牛津杯；铺上层培养基，将培养48h的β-溶血性链球菌取0.4%（v/v）加入BHI牛血清半固体培养基中；菌与培养基混匀后，取14mL倾注到下层培养基上；待凝固后取出牛津杯，并取混匀的100μL乳酸菌发酵液加入牛津杯孔中；在37℃下，培养24h后观察有无抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。
结果显示，本发明分离得到的 60株潜在乳酸菌中有7株菌的抑菌圈直径超过15mm，分别为O08、O17、O20、O22、O43、O44、O60。
3、凝集吸附实验
进一步采用共孵育法对上述7株具有抑菌效果的乳酸菌进行凝集吸附实验。取活化好的乳酸菌菌悬液和β-溶血性链球菌新鲜菌液一起混合加入24孔板的孔中。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，振荡孵育。振荡孵育至少24h，期间观察是否有凝集现象。
结果显示，O44菌株对β-溶血性链球菌的凝集吸附作用最强，抑菌圈和凝集现象如图1所示。
综上，本发明筛选出的O44菌株对β-溶血性链球菌的抗菌效果最佳。
实施例2、O44菌株鉴定
1、菌落形态鉴定
将O44菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见O44单菌落呈乳白色，菌落直径大多1.0mm以上，表面光滑，显微镜下菌体呈长杆状，长短不均一，成单或成对、成链排列。
2、生理生化特性鉴定
本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜O44菌液，5000rpm/min离心5 min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重菌体后稀释50倍，作为接种液。
2.1、盐度耐受性试验
在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μL盐浓度为1%、2%、3%、4% 、5%、6%、7%、8%的BSM液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10μL接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μL高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。结果显示O44菌株最大耐受盐浓度为6%。
2.2、温度耐受性试验
取适量新鲜菌液（24h，37℃），5000rpm 离心5 min ，用PSP溶液洗一次，再用同体积PSP溶液重悬后稀释50倍，作为接种液。
将接种液按10% 的接种量接种到10mL MRS液体培养基中，不接菌的5mL MRS液体培养基作为对照，分别置于15℃恒温培养箱培养7天，45℃恒温培养箱培养2天，观察菌液是否变浑浊。
结果显示，O44 菌株在15℃和45℃耐受性较好。
2.3、碳源代谢试验
利用API 50CHL试剂条对O44菌株进行碳源代谢实验，实验方法及结果判读具体参见API 50CHL试剂盒说明书。O44菌株鉴定结果为：%ID=99.7且T值=0.67，API结果为副干酪乳酪杆菌，结果见图2。
2.4、葡萄糖产酸产气试验
本实施例中所用的培养基配方如下：
蛋白胨 0.5g；酵母提取物 0.3g；吐温 80 0.1mL；盐溶液 A 0.5ml；盐溶液 B0.5ml；乙酸钠 0.5g；葡萄糖 2.5g；2%溴甲酚绿（w/v）0.05mL；蒸馏水 100ml； pH6.8～7.0。
将配制好的培养基分装至含有倒置小试管的大试管中，3mL/管，121℃，高
压灭菌 15min。
盐溶液 A 成分：KH2PO4 10g、K2HPO4 1.0g，溶于蒸馏水，定容至 100mL。
盐溶液 B 成分：MgSO4·7H2O 11.5g、MnSO4·2H2O 2.4g、FeSO4·7H2O 0.68g，溶于蒸馏水，定容至 100mL。
在无菌条件下，将接种液按 10%的接种量接种培养基，不接菌的培养基作为对照，然后用 2mL 无菌液体石蜡封住顶部，置于 37℃培养24h,观察培养基颜色有无变化。
结果显示：37℃培养 24h后，培养基由绿色变为黄色，小倒管内无气体，说明 O44菌株发酵葡萄糖产酸，不产气。
2.5 胆盐酶活性定性试验
在新鲜配制的MRS液体培养基中添加0.2%TCA、0.2%的巯基乙酸钠、0.37 g/LCaCl2和1.5%琼脂。121℃ 15min灭菌，倒入平板中，直至平板中MRS凝固倒置放入厌氧罐中备用。把无菌滤纸片均匀的放入制作好的平板中，用移液枪在滤纸片上滴加10 μL O44新鲜培养的菌液，平板再次正放入厌氧罐中，37 ℃培养72 h后观察结果。
结果显示，滤纸片周围出现钙圈，说明O44菌株胆盐酶活性为阳性，结果如图3所示.
3、分子生物学鉴定
3.1 16s rDNA 基因序列分析
3.1.1、基因组DNA提取
参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP302）操作。
3.1.2、16s rDNA 基因扩增
引物序列：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
通过测序获得O44菌株的16s rDNA序列，并将该序列在NCBI 数据库中进行比对，初步确定O44菌株为副干酪乳酪杆菌。
3.2 Riboprinter指纹图谱
用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter 系统中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，O44菌株为副干酪乳酪杆菌，其Riboprinter指纹图谱结果见图4。
3.3 RAPD和rep-PCR指纹图谱鉴定
3.3.1、RAPD指纹图谱鉴定
引物序列： GAGGGTGGCGGTTCT。
表1 RAPD 反应体系
| 反应成分 | 体积 |
| TaqDNA 聚合酶(5U/μL) | 0.2 μl |
| 10×Buffer（含Mg2+） | 2 μl |
| 引物（10 uM） | 1 μl |
| dNTPs（2.5 mM） | 0.8 μl |
| DNA模板 | 2 μl |
| 无菌双蒸水 | 14 μl |
| 总体积 | 20 μl |
制备1.5%的琼脂糖凝胶板，DL2000DNA Marker 作为结果对照，稳压100V电80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。O44菌株的RAPD指纹图谱如图5所示。
3.3.2、rep-PCR指纹图谱
引物序列：CTACGGCAAGGCGACGCTGACG。
rep-PCR 的反应体系
表2 rep-PCR 的反应体系
| 反应成分 | 体积 |
| r TaqDNA聚合酶 | 0.2 μl |
| 10×Ex Taq DNA Buffer（含Mg2+） | 2 μl |
| 引物（10 uM） | 1 μl |
| dNTPs（2.5 mM） | 2 μl |
| DNA模板 | 2 μl |
| 无菌双蒸水 | 12.8 μl |
DL2000 DNA Marker 作为结果对照。电压100 V，电泳时间80min 检测扩增结果。O44菌株的rep-PCR 指纹图谱如图6所示。
3.4 MALDI-TOF-MS检测菌株核糖体蛋白表达
按照0.1%的接种量在MRS液体培养基中接种新鲜菌液，37℃，150rpm培养48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μL裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μL基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10～20KV电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测蛋白质的分子量。利用Autofms 1000 分析软件Autof Analyzer v1.0获取蛋白指纹图谱，O44菌株主要核糖体蛋白的离子峰为：m/z4700.168、5893.391、9400.959。鉴定结果如图7所示。
综上，将O44菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.htmL， 同时结合文献De Clerck E，et al.Systematic and applied microbiology, 2004, 27(1)50公布的结果，进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，确定O44菌株为一株新的副干酪乳酪杆菌，将其命名为副干酪乳酪杆菌VHProbi O44（Lacticaseibacillus paracasei VHPribo O44）。
实施例3 副干酪乳酪杆菌VHProbi O44对人工胃液和人工肠液的耐受性试验
1、人工胃液的配制
分别称取蛋白胨 5g、酵母提取物 2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000mL蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
2、人工肠液的配制
分别称取蛋白胨5g、 酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH2PO4 6.8g和牛胆盐 3.0g，加入77mL 的0.2mol/L的NaOH溶液，定容至1000mL，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调pH6.8±0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
3、实验方法
取2mL新鲜菌液，5000rpm/min 离心5min 收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL 生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到24mL人工胃液或肠液中，置于37℃水浴摇床（200rpm/min）3h，取样1mL，检测活菌量。
活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，该菌株经过人工胃液或肠液消化后的活菌量（Log CFU/mL）见表3。
表3 人工胃肠液消化后的活菌量
| 消化前 | 人工胃液消化后 | 人工肠液消化后 |
| 7.77±0.01 | 7.73±0.01 | 5.29±0.16 |
从表3可知，本发明筛选到的副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44 经人工胃液消化后活菌量基本没有变化，经人工肠液消化3h后，仍能检测到较高的活菌量，说明该菌株对胃肠液具有很强的耐受性。
实施例4 副干酪乳酪杆菌VHProbi O44的溶血性及抗生素耐受性试验
1、溶血性试验
称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121°C高压灭菌15 min，等培养基冷却到50℃的时候加入5%的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。将测试菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24 ～ 48h观察测试菌是否有溶血现象。
结果显示：副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44不能生长，血细胞平板没有变化，说明副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44不产生溶血素，不能够溶解血细胞。
2、抗生素耐受性试验
微量肉汤稀释法测定抗生素对副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44的最小抑菌浓度MIC值具体结果见表4。
表4 副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44的抗生素MIC值
MIC单位μg/mL。
从表4的结果可以看出，本发明提供的副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44对红霉素和四环素等常见抗生素敏感，生物安全性良好。
实施例5 副干酪乳酪杆菌VHProbi O44抗氧化功能测定
1、菌株清除DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）能力测定
取1mL待测菌株的PBS菌悬液，加入1mL 0.4 mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30 min，然后测定样品在波长 517nm处的吸光度A样本，测3次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和DPPH·乙醇混合液，并以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率%=[1-（A样品-A空白）/A对照]×100%。结果见表5。
表5 DPPH自由基清除率表
| 菌株 | 清除率% | 标准差 |
| 副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44 | 25.57% | 2.04% |
2、菌株抗脂质过氧化实验鉴定
亚油酸乳化液的制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween 20，19.7mL去离子水。
0.5 mL的PBS溶液（pH 7.4）中加入1 mL亚油酸的乳化液， 1 mLFeSO4 （1%），再加入0.5 mL样品，37℃水浴1.5 h，混合液加入0.2 mL TCA（4%），2 mL TBA（0.8%），100 ℃水浴30 min，迅速冷却，4000 rpm/min离心15 min，收集上清液在532 nm下测吸光度即为A；对照组以0.5 mL蒸馏水代替样品即为A0。抑制率/% ＝(A0－A)/ A0×100%
注： A为样品组吸光度；A0为对照组吸光度，结果见表6。
表6副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44抗脂质过氧化抑制率
| 抑制率 | 标准差 | |
| 发酵上清液 | 7.06% | 0.79% |
实施例6 副干酪乳酪杆菌VHProbi O44胆盐水解酶活力测试
胆盐板的准备： 在新鲜配制的MRS液体培养基中添加0.2%TCA、0.2%的 巯 基 乙酸 钠、0.37 g/LCaCl2 和1.5%琼脂；121℃15min灭菌，倾倒入已干热灭菌（180℃，2 h）平板中，直至平板中MRS凝固，倒置放入厌氧罐 中（BBL，Micrbiolog system）48 h。 再把无菌滤纸片均匀的放入平板中,用移液枪在每个滤纸片上滴加10 μL 菌液，平板再次正放入厌氧罐中，37 ℃培养72 h。
结果显示：本发明提供的副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44在滤纸片周围有白色沉淀物生成为阳性。
实施例7 副干酪乳酪杆菌VHProbi O44体外胆固醇降解试验
1、胆固醇胶束溶液的配制：准确称取1g 胆固醇，溶于无水乙醇中，并定容至100mL，在无菌条件下用 0.22 µm 微孔滤膜过滤除菌。
2、称取蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 10.0 g 酵母膏 5.0 g 柠檬酸氢二铵2.0 g 葡萄糖20.0 g， 吐温80 1.0 mL，乙酸钠 5.0 硫酸镁 0.1 硫酸锰 0.05 ，磷酸氢二钾 2.0 g ,胆盐1g，蒸馏水1000mL调节pH值 7.3，115℃灭菌30min，然后加入胆固醇溶液使胆固醇终浓度为0.1%。
按照0.1%的接种量接种新鲜菌液，37℃静止培养48h，然后取0.2mL菌液，加入1.8mL无水乙醇，混匀，静止10分钟，3000转离心5分钟，取上清液用于测定胆固醇含量。胆固醇测定方法按照GB/T 5009.128-2003 <食品中胆固醇的测定>。
结果显示：本发明提供的副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44对胆固醇的降解率达到41.85%（此为不含胆盐的数据）。
实施例8 副干酪乳酪杆菌VHProbi O44的肠道细胞粘附性测试
Caco-2细胞以2×106cells/孔的接种量接种于六孔板，二氧化碳培养箱培养24h，用于细胞粘附实验；将稳定期的菌株用MRS培养基重悬至5×107CFU/mL；取1mL上述菌株加入已有细胞贴壁的六孔板，二氧化碳培养箱培养2h；PBS反复洗涤3次，去除未粘附的细菌；加入500ul胰酶消化3分钟，再加入1.5mL细胞培养液终止消化，反复吹打，并将所得溶液收集至无菌EP管中，并将收集的溶液进行10倍，100倍，1000倍，10000倍梯度稀释，涂板计数。同时对空白组的细胞进行计数。根据以下公式计算供试菌株的粘附能力：
粘附能力（CFU/cells）=每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。
结果显示：副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44黏附能力为1，标准差为7.1%。
实施例9 副干酪乳酪杆菌VHProbi O44在预防乳鼠链球菌感染中的应用
1、实验动物
2周龄SPF级SD大鼠36只，雌雄各半。8只哺乳SD雌鼠，由青龙山动物繁殖中心提供，许可证号SCXK(苏)2017-0001，饲养于SPF级动物房，明暗交替时间为12/12h。动物饲养于标准小鼠笼具中，每笼6只。动物饲料、饮水：自由摄食、饮水。饲料为SPF级大小鼠生长繁育饲料。饮用水是经过高温消毒的城市自来水。
2、试剂耗材
TNF-α ELISA kit：BioSource ，货号：MBS175904；
IL-6 ELISA kit ：BioSource ，货号：MBS175908；
HE 染色试剂盒：Promega。
3、实验方法
3.1 菌液制备
3.1.1 益生菌菌液制备
将副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44划线 MRS平板上，37℃培养24～48h，挑取单菌落于MRS肉汤培养基扩大培养16h后，收集菌液。使用前计数调整其浓度为 1×109CFU/mL。
3.1.2 链球菌菌液制备
将冻干的溶血性链球菌菌种于超净工作台内，用适量营养肉汤培养液反复吹打，使菌种融化分散。取少许菌种悬液，滴入含5mL营养肉汤培养基的试管中，37℃培养过夜。取第一代培养的菌悬液，划线接种于血琼脂培养基，37℃培养过夜。使用前挑取典型菌落无菌PBS稀释计数调整为备用浓度 1×106CFU/mL。
3.1.3 体外拮抗菌液制备
配制模拟皮肤环境同时又能满足乳酸菌和链球菌生长需求的培养液，即每100ml培养液添加蛋白胨1g、酵母粉0.4g、牛肉粉0.8g、葡萄糖2g、K2HPO4 0.2g、角鲨烯20mg、辛酸/癸酸甘油三酯10mg 、丙氨酸1mg、尿素23mg、NaCl 100mg、MgSO4 20mg、MnSO4 4mg，调节pH5.7-6.0左右。
将副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44菌液、溶血性链球菌菌液分别按1×107CFU/mL和1×105CFU/mL的比例接种于上述培养液中，体外共培养24h后，收集菌液，备用。
3.2 分组
大鼠适应性饲养7天后随机分为正常组（Normal）、阳性组（Positive）、模型组（Model）、益生菌预处理组（PreG）、益生菌后处理组（PosG）和益生菌体外拮抗组（ComG），每组6只。
3.3、造模及干预措施
链球菌造模：乙型溶血性链球菌菌液浓度 1×106CFU/ml，体积0.1ml，连续灌胃2天；
正常组：不做特殊处理；
模型组：1-7d适应性生长，8-17d常规饲养，18-19d链球菌造模，20-29d常规饲养，30d处理取材；
阳性组：1-7d适应性生长，8-17d常规饲养，18-19d链球菌造模，20-29d氨苄青霉素给药，浓度150mg/kg体重，体积0.1ml，30d处理取材；
益生菌预处理组：1-7d适应性生长，8-29d每天两次灌胃副干酪乳酪杆菌 VHProbiO44菌液，浓度为1×109 CFU/ml，体积0.1ml，18-19d链球菌造模，30d处理取材；
益生菌后处理组：1-7d适应性生长，8-17d常规饲养，18-19d链球菌造模，20-29d每天灌胃两次副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44菌液，浓度为 1×109 CFU/ml，体积0.1ml，30d处理取材；
益生菌体外拮抗组：1-7d适应性生长，8-16d常规饲养，17-19d灌胃上述制备的体外拮抗菌液，体积0.1ml，20-29d常规饲养，30d处理取材。
4、检测指标
4.1一般观察
观察动物有无萎靡、躁动、腹泻等，并观察其呼吸、饮食和活动情况。
4.2血常规检测
0.1ml抗凝全血用全自动生化分析仪分析血液白细胞计数及分类；采血时间：17天、23天、29天所有组采血检测。
4.3 Elisa检测大鼠血清细胞因子水平
取终末血清用于 IL-6及TNF-α含量测定。
4.4组织病理学
大鼠处死后取小肠组织、脾脏组织多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色观察组织病理变化。
5、数据统计处理方法
应用SPSS 22.0进行数据统计分析，所有实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，方差齐时再进一步用最小显著差数法进行两两比较，方差不齐时采用秩和检验，以P<0.05判定为有显著性差异。
6、实验结果
6.1 一般观察
溶血性链球菌造模后大鼠逐渐出现萎靡、腹泻、饮食量少等症状。
6.2 血常规检测
结果如表7所示，大鼠造模后白细胞（WBC）升高39.5%、中性粒细胞（Neut）百分比升高50%，淋巴细胞（Lym）百分比下降32.5%，单核细胞（MONO）百分比和血小板（PLT）差别不大。治疗后各治疗组WBC、Neut检测水平均低于治疗前，淋巴细胞（Lym）百分比高于治疗前，且差异有统计学意义（p<0.05）。其中WBC指标，阳性组降低了25.6%，益生菌预处理组降低21.1%，益生菌后处理组降低18.0%，益生菌体外拮抗组降低33.9%。以上结果说明，本发明提供的副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44能够有效缓解链球菌感染后大鼠的炎症水平。
表7 各组大鼠血常规指标
注：治疗后与治疗前比较 ＊P<0.05。
6.3 IL-6 、TNF-α含量测定结果
IL-6是一种功能广泛的多效性细胞因子，其作为促炎细胞因子和抗炎性肌球蛋白起作用。TNF-α是一种涉及系统性炎症的细胞因子，同时也是属于引起急性反应的众多细胞因子中的一员。细胞因子IL-6、TNF-α被认为是机体全身性感染时所产生的主要炎症介质。
结果如图8所示，造模后，大鼠促炎性因子TNF-α、IL-6含量分别升高26.9%和41.5%，与正常组比较有显著性差异（p<0.05）。治疗后，与模型组相比，阳性组、益生菌预处理组和益生菌体外拮抗组各因子水平显著降低（p<0.05），其中阳性组TNF-α、IL-6 分别降低18.1%和19.2%；益生菌预处理组TNF-α、IL-6 分别降低11.6%和16.7%，益生菌体外拮抗组TNF-α、IL-6分别降低18.3%和22.3%。以上结果说明副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44能有效缓解链球菌感染大鼠机体的炎症状态。
6.4组织病理检测
6.4.1大体解剖结果分析：
模型组大鼠解剖可见腹腔肠管肿胀，肠系膜有轻微出血，脾脏肿大。益生菌预处理组和后处理组未可见肠管轻微胀气，未见肠系膜出血，脾脏比正常对照组暗红，肿大相比模型组好转，肾脏无淤血点。益生菌体外拮抗组各组织器官均未见明显病变。以上结果说明副干酪乳酪杆菌 VHProbi O44较好地缓解了链球菌感染大鼠的器官损伤。
6.4.2小肠HE 染色结果：
如图9所示，在光学显微镜下观察，正常组肠粘膜各层结构完整，肠绒毛排列整齐，肠粘膜微绒毛形态正常，排列整齐，肠上皮细胞结构完整，细胞间紧密连接清楚，结构未见异常。模型组黏膜层有大量炎性细胞浸润，肠绒层结构不完整，有严重黏膜上皮脱落，同时可见浆膜层。与模型组相比，各益生菌处理组黏膜层脱落程度明显减轻，且肠系膜结构完整，炎性细胞浸润减少；其中益生菌体外拮抗组的改善效果最明显。
6.4.3脾脏HE染色结果：
如图10所示，在光学显微镜下观察，正常脾脏组织切片HE染色镜下见红髓白髓界限清晰，白髓淋巴细胞丰富，生发中心明显；模型组脾脏组织结构不清，白髓萎缩，脾小体结构不清；阳性组脾脏红白髓界限清晰，白髓萎缩，脾小体结构尚清；益生菌预处理和后处理组大鼠脾组织结构尚清，白髓萎缩，脾小体结构不清；益生菌体外拮抗组脾组织结构可见，红髓、白髓结构尚清，与正常组病理结构差异较小。
上述动物实验结果表明，本发明提供的副干酪乳酪杆菌VHProbi O44能够有效降低链球菌感染大鼠体内的炎症因子水平，减轻患病鼠的器官损伤，尤其是通过在体外环境中对链球菌进行拮抗处理，能显著降低链球菌的感染水平，与正常组差异极小，预防效果突出。
本发明所述副干酪乳酪杆菌VHProbi O44可广泛用于预防和治疗链球菌引发的感染，尤其适用于婴幼儿链球菌感染的预防。具体使用方式包括：（1）婴幼儿持续服用该益生菌预防链球菌感染；（2）当婴幼儿受到链球菌侵袭时，服用该益生菌控制感染的蔓延和加重；（3）围产期孕产妇通过在皮肤或乳房持续外用该益生菌，能在体表抑制链球菌的生长繁殖，最大程度避免或减轻婴幼儿通过吸吮等途径感染链球菌带来的损伤。
综上所述，本发明提供的副干酪乳酪杆菌VHProbi O44 对常见抗生素敏感，不产溶血素，生物安全性良好。经动物实验验证了副干酪乳酪杆菌VHProbi O44 具有缓解链球菌感染大鼠炎症水平，减轻机体器官损伤的作用。所述副干酪乳酪杆菌VHProbi O44可广泛用于制备具有预防链球菌感染功能的食品、保健品、药品或护肤品。
序列表
<110> 山东百沃生物科技有限公司
<120> 一株预防婴幼儿链球菌感染的副干酪乳酪杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei )
<400> 1
ggttacgcca ccggcttcgg gtgttacaaa ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 60
ggcccgggaa cgtattcacc gcggcgtgct gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg 120
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tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 540
ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg aatgcttaat gcgttagctg cggcactgaa 600
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gtcctcttct gcactcaagt ttcccagttt ccgatgcgct tcctcggtta agccgagggc 840
tttcacatca gacttaaaaa accgcctgcg ctcgctttac gcccaataaa tccggataac 900
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acgacccgaa agccttcttc actcacgcgg cgttgctcca tcagacttgc gtccattgtg 1080
gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc 1140
cgatcaacct ctcagttcgg ctacgtatca tcgccttggt gagccattac ctcaccaact 1200
agctaatacg ccgcgggtcc atccaaaagc gatagcttac gccatctttc agccaagaac 1260
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agggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccactc gttccatgtg aatctcggtg 1380
caagcaccga tcatcaacga gaactcgttc gactt 1415
Claims (8)
1.一种副干酪乳酪杆菌，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2021591。
2.如权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌的Riboprinter 指纹图谱如图4所示，RAPD指纹图谱如图5所示，rep-PCR指纹图谱如图6所示，MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱如图7所示。
3.权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌在制备链球菌抗菌剂中的应用。
4.权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌在制备具有降低胆固醇功能的制品中的应用。
5.权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌在制备具有预防链球菌感染功能的制品中的应用。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的制品为功能性食品、保健品、药品或护肤品。
7.一种用于预防链球菌感染的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌和/或其发酵产物。
8.一种用于预防链球菌感染的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌的裂解液。
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