CN114989322B - 一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，属于杏鲍菇多糖技术领域。该方法按照以下步骤制备：将杏鲍菇多糖粉末溶于甲酰胺溶液中，制得杏鲍菇多糖溶液；将离子液体加入到杏鲍菇多糖溶液中，搅拌均匀得到溶液A，向溶液A中加入酯化剂，在60‑65℃下进行硫酸酯化反应、冷却得到反应液；将步骤2制备的反应液调节pH为8‑9，进行后处理，得到硫酸酯化杏鲍菇多糖。该方法使得硫酸酯化取代度更高。

Description

一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法

技术领域

本发明涉及杏鲍菇多糖技术领域，更具体的涉及一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法。

背景技术

杏鲍菇(Pleurotus eryngii)又名刺芹侧耳，隶属层菌纲，侧耳属，是一种珍贵药食两用真菌，其肉质脆嫩，营养价值丰富，富含人体所需氨基酸，且脂肪含量低，有着“平菇王”的美誉。杏鲍菇多糖(polysaccharides from P.eryngii)在抗菌、抗氧化、调节血脂、调节免疫功能、抗肿瘤、抗放射等方面都有着显著的药理作用，具有很高的药用价值和开发前景。

多糖是指由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，广泛存在于植物、微生物、藻类和动物体内。多糖作为生命活动四大基本物质之一，具有多种生物活性，如抗病毒、增值、免疫调节功能等。但多糖的生物活性主要取决于其分子结构，包括糖单元和主链的糖苷键、支链的类型、聚合度及链的灵活性和空间构象等。大量研究表明，多糖的分子修饰可以显著增加其生物活性。

多糖的结构修饰是通过化学、物理学及生物学等手段对多糖分子进行结构改造，主要通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置而对其活性产生影响。目前多糖的分子改性修饰主要有微生物法、物理方法和化学方法。微生物法主要是利用微生物进行发酵，将原料中的淀粉、蛋白质等成分分解，将多糖大分子分解成小分子的化合物，改变多糖的功能特性。物理方法是利用超声波作用，将大分子的多糖降解为小分子的多糖片段，改变了多糖的空间结构，减小了多糖复杂的空间结构对多糖活性的发挥。而化学方法是通过取代反应将多糖中的氨基、羟基、羧基等官能团改变，使糖链上结合新的官能团，进而影响多糖相关活性。化学方法目前主要有硒化、硫酸化、磷酸化、乙酰化、羧甲基化、磺酰化等不同方法。

多糖的硫酸化是多糖分子链上的单糖分子中的羟基与酯化试剂中的硫酸基团发生取代反应，从而形成的半合成多糖。常用的多糖硫酸化方法有Nagasawa法、Wolfrom法、浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-二甲基甲酰胺(DMF)法等多种方法。研究表明多糖经过硫酸酯化修饰后，其生物活性会发生改变。如张秋平以桦褐孔菌多糖为原料在经过硫酸化修饰之后，产品对DPPH清除活性比未硫酸化的多糖明显提高。陈晓庆等对枸杞多糖进行硫酸酯化，所得到的硫酸化枸杞多糖相比于未硫酸化的枸杞多糖，其体外抗肿瘤活性明显增强。陈士国等对鱿鱼墨多糖采用硫酸化修饰改性后，发现其能延长部分的凝血活酶时间和凝血酶原时间，对凝血因子FⅡa和FXa均有明显的抑制作用。Chen等用对乌贼体液多糖进行硫酸酯化修饰，并分别进行体内外试验对其抗癌活性进行评价，结果发现，硫酸酯化后乌贼体液多糖对体外培养的肝癌细胞He PG2的抑制活性与未硫酸化的多糖无显著性差异，但对体内肝癌细胞He PG2的入侵和转移均有表现出一定的抑制效果；且有许多类型的多糖因其生物活性较低，致使其应用范围受限，为此多糖的改性研究就成为研究热点之一；其中硫酸酯化改性多糖就是研究方向之一，但是，目前多糖的硫酸酯化改性方法存在取代度较低的缺点，而且改性后造成多糖活性提升不大。如朱永红公等人在《天然产物研究与开发》发表的“蒲公英根多糖硫酸酯化工艺条件优化及其对HepaRG细胞氧化损伤的保护作用”中取代度为1.05。陈小红在《湖北农业科学》发表的“响应面法优化茯苓多糖硫酸酯化合成工艺及其抗凝血活性分析”中硫酸基团取代度值最大仅为1.02，梁英等人在《食品与机械》发表的“平菇多糖硫酸酯制备工艺优化及抗氧化活性研究”中的取代度最高仅为0.47。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，该方法使得多糖硫酸酯化取代度更高，且改性后的多糖其抗氧化性能与抑菌性能均得到显著提高。

本发明的目的是提供一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，按照以下步骤制备：

步骤1、将杏鲍菇多糖粉末溶于甲酰胺溶液中，制得杏鲍菇多糖溶液；

步骤2、将离子液体加入到杏鲍菇多糖溶液中，搅拌均匀得到溶液A，向溶液A中加入酯化剂，在60-65℃下进行硫酸酯化反应、冷却得到反应液；

步骤3、将步骤2制备的反应液调节pH为8-9，进行后处理，得到硫酸酯化杏鲍菇多糖。

优选的，步骤1中，杏鲍菇多糖粉末与甲酰胺的比例为2-10mg：100mL。

优选的，步骤2中，反应时间为2-3.5h；其中，溶液A中，杏鲍菇多糖溶液中离子液体的添加量为1.5-2.0g/L；溶液A与酯化剂的体积比为1:1.5-2.5；

硫酸酯化反应后，冷却至0-2℃得到反应液。

优选的，步骤2中，酯化剂按照以下步骤进行制备：将无水吡啶冷却至0-2℃，加入氯磺酸，室温下搅拌得到酯化剂，冷藏备用。

优选的，无水吡啶与氯磺酸的体积比为3-4:1，搅拌时间为35-40min。

优选的，步骤3中采用0-2℃的碱性溶液调节步骤2制备的反应液的pH为8-9。

优选的，碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，浓度为3-5mol/L。

优选的，步骤3中，后处理步骤为离心，透析后进行浓缩、沉降、离心洗涤。

优选的，采用去离子水透析48-50h后，将反应液浓缩至1/3-1/4体积后加入无水乙醇进行沉降，并在3500-4000r/min转速下离心5min，移取沉淀物用50mL无水乙醇洗涤3次后，真空干燥。

优选的，沉降时间为18-24h，沉降用无水乙醇的添加量为反应液浓缩后的体积的4-5倍。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明中多糖硫酸酯化的反应机理为多糖分子链上的单糖分子中的羟基与酯化试剂中的硫酸基团发生取代反应，从而形成的半合成多糖；通过加入离子液体催化剂，一方面使多糖的溶解性增大，降低分子间作用力；另一方面使得多糖分子链上的羟基与主链的结合力降低，增大取代反应的几率。

(1)与传统方法相比，本发明以杏鲍菇多糖为原料，利用离子液体为催化剂，对其进行硫酸酯化改性，减少了有机溶剂的使用，所得样品硫酸酯化取代度可达1.8-2.7mg/g，比传统方法的取代度增加60％以上。

(2)本发明充分利用离子液体高的溶解性能、催化性能使得杏鲍菇多糖的硫酸酯化操作条件更温和，溶剂使用量更少，取代度更高，所得硫酸酯化杏鲍菇多糖的抗氧化性能、抑菌性能更高。

附图说明

图1为杏鲍菇多糖与硫酸酯化多糖、Vc对羟自由基清除率；

图2为杏鲍菇多糖与硫酸酯化多糖、Vc对超氧阴离子清除率；

图3为杏鲍菇多糖与硫酸酯化多糖、Vc对DPPH自由基清除率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用离子液体为[HNMP]HSO₄，合成方法参照杨文发表的“三种多糖的硒化修饰、结构表征及体外抑制肿瘤的研究”。所用氮甲基吡咯烷酮[NMP]为分析纯，购自于上海晶纯生化科技股份有限公司。

实施例1

步骤1、取10mg杏鲍菇多糖粉末溶于100mL甲酰胺中，磁搅拌混合均匀，得多糖溶液A；

步骤2、将酸性离子液体[HNMP]HSO₄加入所制备的多糖溶液A，杏鲍菇多糖溶液中离子液体的添加量为1.5g/L；搅拌均匀后按1:2(体积比v/v)滴加酯化剂B，控制酯化反应温度为60℃，反应时间2h；反应结束后，置于冰水混合物冷却至0℃，得反应液C；

步骤3、在反应液C中加入已预先冷却至0℃的4mol/LNaOH溶液中和至pH＝8，离心，清液装入透析袋中用去离子水透析48h；将透析袋中溶液移至真空旋转蒸发器浓缩至1/3体积后加入4倍体积的无水乙醇，沉降18h，在4000r/min转速下离心5min，移取沉淀物用50mL无水乙醇洗涤3次后，真空干燥可得白色的硫酸酯化杏鲍菇多糖。

本实施例所用的酯化剂按照以下步骤制备：

取300mL的无水吡啶于500mL圆底烧瓶中，冰水浴冷却至0℃，磁力搅拌下按3:1(体积比v/v)缓慢地加入氯磺酸，室温下持续搅拌35min，密封后冰箱中冷藏，得酯化剂B(1周内有效)，备用。

实施例2

步骤1、取2mg杏鲍菇多糖粉末溶于100mL甲酰胺中，磁搅拌混合均匀，得多糖溶液A；

步骤2、将离子液体加入所制备的多糖溶液A，杏鲍菇多糖溶液中离子液体的添加量为2.0g/L；搅拌均匀后按1:1.5(体积比v/v)滴加酯化剂B，控制酯化反应温度为65℃，反应时间2.5h；反应结束后，置于冰水混合物冷却至1℃，得反应液C；

步骤3、在反应液C中加入已预先冷却至1℃的3mol/LNaOH溶液中和至pH＝9，离心，清液装入透析袋中用去离子水透析50h；将透析袋中溶液移至真空旋转蒸发器浓缩至1/4体积后加入5倍体积的无水乙醇，沉降24h，在3500r/min转速下离心5min，移取沉淀物用50mL无水乙醇洗涤3次后，真空干燥可得白色的硫酸酯化杏鲍菇多糖。

本实施例所用的酯化剂按照以下步骤制备：

取300mL的无水吡啶于500mL圆底烧瓶中，冰水浴冷却至1℃，磁力搅拌下按4:1(体积比v/v)缓慢地加入氯磺酸，室温下持续搅拌40min，密封后冰箱中冷藏，得酯化剂B(1周内有效)，备用。

实施例3

步骤1、取8mg杏鲍菇多糖粉末溶于100mL甲酰胺中，磁搅拌混合均匀，得多糖溶液A；

步骤2、将离子液体加入所制备的多糖溶液A，杏鲍菇多糖溶液中离子液体的添加量为1.8g/L；搅拌均匀后按1:2.5(体积比v/v)滴加酯化剂B，控制酯化反应温度为63℃，反应时间3.5h；反应结束后，置于冰水混合物冷却至2℃，得反应液C；

步骤3、在反应液C中加入已预先冷却至2℃的5mol/LNaOH溶液中和至pH＝8.5，离心，清液装入透析袋中用去离子水透析49h；将透析袋中溶液移至真空旋转蒸发器浓缩至1/4体积后加入4.5倍体积的无水乙醇，沉降20h，在3800r/min转速下离心5min，移取沉淀物用50mL无水乙醇洗涤3次后，真空干燥可得白色的硫酸酯化杏鲍菇多糖。

本实施例所用的酯化剂按照以下步骤制备：

取300mL的无水吡啶于500mL圆底烧瓶中，冰水浴冷却至2℃，磁力搅拌下按3.5:1(体积比v/v)缓慢地加入氯磺酸，室温下持续搅拌37min，密封后冰箱中冷藏，得酯化剂B(1周内有效)，备用。

实施例4

步骤1、取6mg杏鲍菇多糖粉末溶于100mL甲酰胺中，磁搅拌混合均匀，得多糖溶液A；

步骤2、将离子液体加入所制备的多糖溶液A，杏鲍菇多糖溶液中离子液体的添加量为1.7g/L；搅拌均匀后按1:2(体积比v/v)滴加酯化剂B，控制酯化反应温度为60℃，反应时间3.5h；反应结束后，置于冰水混合物冷却至0℃，得反应液C；

步骤3、在反应液C中加入已预先冷却至0℃的4mol/LKOH溶液中和至pH＝8，离心，清液装入透析袋中用去离子水透析48h；将透析袋中溶液移至真空旋转蒸发器浓缩至1/3体积后加入5倍体积的无水乙醇，沉降18h，在4000r/min转速下离心5min，移取沉淀物用50mL无水乙醇洗涤3次后，真空干燥可得白色的硫酸酯化杏鲍菇多糖。

本实施例所用的酯化剂按照以下步骤制备：

取300mL的无水吡啶于500mL圆底烧瓶中，冰水浴冷却至0℃，磁力搅拌下按3:1(体积比v/v)缓慢地加入氯磺酸，室温下持续搅拌35min，密封后冰箱中冷藏，得酯化剂B(1周内有效)，备用。

为了验证本发明的效果，下面对实施例1-实施例4制备出的硫酸酯化杏鲍菇多糖的取代度进行试验检测，具体过程如下。

一、硫酸酯化杏鲍菇多糖中硫含量的测定

测定原理：利用盐酸将杏鲍菇多糖样品水解，将硫酸基从糖链上游离出来并留在明胶溶液中，再使硫酸根与钡离子结合，保持悬浮状态。该悬浮液在360nm处吸光度与硫酸基质量分数在一定范围内线性相关，由此可测样品中硫酸基质量分数。

1、试剂的配制

明胶：将2g明胶在60-70℃溶解在400mL水中，保存在4℃；

氯化钡-明胶溶液：将1g氯化钡溶于100mL明胶溶液中，4℃保存；

硫酸根标准液：精密称取105℃干燥至衡重的K₂SO₄108.75mg，以1mol/L的盐酸水解，定容至100mL容量瓶中，摇匀，即得硫酸基标准贮存液(0.6mg/mL)。

2、标准曲线的绘制

准确吸取标准硫酸钾溶液(含硫酸基0.6mg/mL)0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0mL于2.0mL比色管中，以1mol/L盐酸溶液补至2.0mL，以2.0mol/L盐酸溶液作为空白，加入3％三氯乙酸4mL及氯化钡-明胶溶液1mL，摇匀，室温静置15min，于360nm测吸光度A₁，以1mL明胶溶液代替氯化钡-明胶溶液，测吸光度A₂，以硫酸基毫克数为横坐标，吸光度差A＝(A₁一A₂)为纵坐标，绘制标准曲线，数据处理可得标准曲线方程为：y＝0.8137x+0.0145，R²＝0.9983.

3、样品中硫酸根含量的测定

取一定量的酯化多糖样品，用4mol/L HCl溶液完全水解后，减压旋转旋干，再用1mol/L的HCl溶解并补至2.0mL，其余步骤同上，测定吸光度，代入标准曲线计算硫酸根浓度，结合酯化多糖的质量，计算酯化多糖中硫酸根的含量。

硫酸酯化取代度的计算：

式中DS为取代度，S％且为硫酸基的百分含量。

结果：所得样品硫酸酯化取代度可达1.8-2.7mg/g，实施例1、2、3、4所得硫酸酯化多糖的取代度分别为2.4mg/g、1.8mg/g、2.6mg/g和2.7mg/g，比传统方法的取代度增加60％以上。

二、下面对实施例1制备得到的硫酸酯化杏鲍菇多糖进行生物活性的研究

1、抗氧化性对比研究

原料液配配置：准确量取一定量的精制杏鲍菇多糖、硫酸酯化多糖和Vc配置浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的不同浓度梯度的水溶液，备用。

(1)杏鲍菇多糖硫酸酯化前后羟自由基清除活性的对比研究

采用Fenton体系法：取三种样品溶液各1mL于试管中，分别加入浓度均为1.8mmol/L的硫酸亚铁溶液和水杨酸-乙醇显色剂各1.5mL，最后加入0.1mL浓度为0.3％的H₂O₂溶液启动反应，振荡混合，在37℃水浴保温30min，冷却至室温，放入高速离心机离心10分钟，取出上层清液，在波长为510nm处测吸光度(A_s)，以1.0mL去离子水代替样品液作空白(A₀)。羟自由基清除率按下面公式进行计算：

图1为杏鲍菇多糖与硫酸酯化多糖、Vc对羟自由基清除率，由图1可以看出：①相同浓度下三种样品对羟自由基清除率由小到大依次为杏鲍菇多糖<硫酸酯化杏鲍菇多糖<Vc；②最高浓度下Vc对羟自由基清除率比杏鲍菇多糖超出45％左右，而硫酸酯化杏鲍菇多糖对对羟自由基清除率比Vc仅低5％左右；③三种样品液对羟自由基清除率随浓度的增加呈增大趋势。

(2)杏鲍菇多糖硫酸酯化前后超氧阴离子自由基清除活性对比研究

采取邻苯三酚自氧化法：取三种样品溶液各1mL于试管中，各加入5mL浓度为0.05mol/LTris-HCl(pH8.2)缓冲溶液，在25℃时水浴20min后，再加入0.3mmol/L邻苯三酚-HCl显色剂0.5mL，精确反应4min后加入0.1mL4mol/LHCI溶液终止反应，在325nm波长处测定吸光度(A₁)，以去离子水代替多糖液作对照组(A₀)。超氧阴离子自由基清除率以下列公式计算：

图2为杏鲍菇多糖与硫酸酯化多糖、Vc对超氧阴离子清除率，由图2可以看出：①相同浓度下三种样品对超氧阴离子自由基清除率由小到大依次为杏鲍菇多糖<硫酸酯化杏鲍菇多糖<Vc；②最高浓度下Vc对超氧阴离子清除率比杏鲍菇多糖超出40％左右，而硫酸酯化杏鲍菇多糖对对羟自由基清除率比Vc仅低8％左右；③三种样品液对超氧阴离子清除率随浓度的增加呈增大趋势。

(3)杏鲍菇多糖硫酸酯化前后DPPH自由基清除活性对比研究

取三种样品溶液各2mL于试管中，分别加入浓度为0.1g/L的DPPH溶液(95％乙醇溶液配制)体积2mL，振荡混合均匀后，于常温避光30min，然后在517nm波长处检测吸光度(A₁)；用去离子水代替DPPH-乙醇溶液，重复上述操作，测得吸光度数据(A₂)；用去离子水代替样品溶液，重复上述操作，测得吸光度数据(A₀)；对比三种样品液对DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率计算公式如下：

图3为杏鲍菇多糖与硫酸酯化多糖、Vc对DPPH自由基清除率，由图3可以看出：①相同浓度下三种样品对DPPH自由基清除率由小到大依次为杏鲍菇多糖<硫酸酯化杏鲍菇多糖<Vc；②最高浓度下Vc对DPPH清除率比杏鲍菇多糖超出45％左右，而硫酸酯化杏鲍菇多糖对对羟自由基清除率比Vc仅低6％左右；③三种样品液对DPPH清除率随浓度的增加呈增大趋势。

2、抑菌性能对比

采用滤纸片法测定；大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)；陕西理工大学微生物实验室提供。

(1)菌种活化与菌悬液制备：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基接种(接种量为5％)后，于37℃培养24h，制备105cfu/mL菌悬液，备用。

(2)杏鲍菇多糖及其硫酸酯化多糖供试液的制备：将制备的杏鲍菇多糖和硫酸酯化杏鲍菇多糖产物用蒸馏水溶解后，配制成浓度为20.0mg/mL的溶液，于120℃灭菌30min，冷却后作为储备液于4℃冰箱中保存，备用；取14支干燥无菌带有棉塞的5mL的小试管，分两组，每组7管；在无菌条件下第一组7管每管加入2mL无菌蒸馏水，然后取硫酸酯化杏鲍菇多糖贮备液2mL加入第1管中，摇匀，吸取2mL加入第2管中，依次稀释至第6管，第7支试管作为空白对照管，分别得到浓度为(10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL)的硫酸酯化杏鲍菇多糖供试液；另一组的7管用来制备杏鲍菇多糖供试液，其制备方法类同。

(3)滤纸片的制备：将定性滤纸用打孔器加工成直径为6mm的圆形纸片，置入干燥的平皿中干热灭菌30min后，再将其浸入不同浓度的杏鲍菇多糖和硫酸酯化杏鲍菇多糖的供试液中，浸泡2h，使其充分吸收。

(4)抑菌试验：吸取两种制备好的菌悬液各2mL涂布于平板中，制成含菌平板；用灭菌镊子夹出已经制备好的多糖滤纸片及由青霉素钠溶液制备好的滤纸片贴于布满菌液的培养基平板中，于37℃恒温培养箱中培养24h，取出，检测抑菌圈的直径大小，比较抑菌效果，确定最适抑菌浓度；每种菌株平行测定3次。

(5)最小抑菌浓度测定：吸取1mL不同浓度的杏鲍菇多糖溶液和硫酸酯化杏鲍菇多糖溶液置于19mL液体培养基中，混匀后涂布于平板上，制成抑菌平板后，分别吸取0.1mL两种菌液，接种于该平板上，另制备不加多糖的培养基平板作空白对照，于37℃培养24h，通过肉眼观察平板中有无菌落生长，以确定多糖的最小抑菌浓度。

表1杏鲍菇多糖及其硫酸酯化多糖的抑菌直径表(n＝3)

注：菌圈直径D﹤6.5mm，没有抑菌效果；抑菌圈直径在6.5mm≦D﹤8.0mm，有抑菌效果；菌圈直径在8.0mm≦D﹤10.0mm，抑菌效果比较显著；菌圈直径D≧10mm，抑菌效果显著；

“-”表示菌圈直径6mm≦D﹤6.5mm；“--”表示菌圈直径5.5mm≦D﹤6.0mm；

“---”表示菌圈直径5.0mm≦D﹤5.5mm；----表示菌圈直径﹤5.0mm。

表2杏鲍菇多糖/硫酸酯化杏鲍菇多糖的最小抑菌浓度(mg/mL)

供试菌/样品浓度	8.5	5.0	2.5	1.25	0.625
						大肠杆菌	+/+	+/+	+/+	+/+	-/+
金黄色葡萄球菌	+/+	+/+	-/+	-/+	-/-
						枯草杆菌	+/+	-/+	-/+	-/-	-/-

注：“+”表示有抑菌效果；“-”表示没有抑菌效果。

由表1和表2可以看出：(1)杏鲍菇多糖和硫酸酯化杏鲍菇多糖对三种细菌均有一定的抑制作用，其中抑制大肠杆菌的生长最为明显，多糖浓度为10.0mg/mL时其抑菌圈直径分别达到(10.07±1.22)mm和(14.07±1.62)mm；对金黄色葡萄球菌次之，分别达到(9.57±1.40)mm和(12.07±1.54)mm；杏鲍菇多糖对枯草杆菌的抑制效果一般，仅为(7.21±0.74)mm；但硫酸酯化杏鲍菇多糖对枯草杆菌有较为显著的效果，抑菌圈直径达到(8.87±1.26)mm。(2)杏鲍菇多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的最低抑菌浓度分别为1.25mg/mL、5.0mg/mL、8.5mg/mL；硫酸酯化杏鲍菇多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的最低抑菌浓度分别为0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，其特征在于，按照以下步骤制备：

步骤1、将杏鲍菇多糖粉末溶于甲酰胺溶液中，制得杏鲍菇多糖溶液；杏鲍菇多糖粉末与甲酰胺的比例为2-10mg：100mL；

步骤2、将离子液体加入到杏鲍菇多糖溶液中，搅拌均匀得到溶液A，向溶液A中加入酯化剂，在60-65℃下进行硫酸酯化反应2-3.5h、冷却0-2℃得到反应液；

其中，溶液A中，杏鲍菇多糖溶液中离子液体的添加量为1.5-2.0g/L；溶液A与酯化剂的体积比为1:1.5-2.5；离子液体是[HNMP]HSO₄；

酯化剂按照以下步骤进行制备：将无水吡啶冷却至0-2℃，加入氯磺酸，室温下搅拌得到酯化剂，冷藏备用；无水吡啶与氯磺酸的体积比为3-4:1，搅拌时间为35-40min；

步骤3、将步骤2制备的反应液调节pH为8-9，进行后处理，得到硫酸酯化杏鲍菇多糖。

2.根据权利要求1所述的一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，其特征在于，步骤3中采用0-2℃的碱性溶液调节步骤2制备的反应液的pH为8-9。

3.根据权利要求2所述的一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，其特征在于，碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，浓度为3-5mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，其特征在于，步骤3中，后处理步骤为离心，透析后进行浓缩、沉降、离心洗涤。

5.根据权利要求4所述的一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，其特征在于，采用去离子水透析48-50h后，将反应液浓缩至1/3-1/4体积后加入无水乙醇进行沉降，并在3500-4000r/min转速下离心5min，移取沉淀物用50mL无水乙醇洗涤3次后，真空干燥。

6.根据权利要求5所述的一种提高杏鲍菇多糖生物活性的方法，其特征在于，沉降时间为18-24h，沉降用无水乙醇的添加量为反应液浓缩后的体积的4-5倍。

Images